PCR
advertisement
Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowym Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Spożycie (z płynami) NOROWIRUS NOROVIRUS ROTAWIRUS ROTAVIRUS Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. JJ ADENOWIRUS ADENOVIRUS Oddechowa L L Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Kontakt (podczas mycia) Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Struktura ramowa analizy ryzyka Ocena ryzyka *Podstawy naukowe odpowiednie metody Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka Źródło: WHO Food Safety EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dzisiaj nie będę mówić o… Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Liczba kolonii E. coli DIN EN ISO 6222 DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 Pseudomonas aeruginosa DIN EN 12780 Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach DIN EN ISO 9308-3 DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2 ... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka - badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNA - pobieranie próbek wody do analizy wirusów - oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu filtra z włókna szklanego - ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa - rola inhibitorów środowiskowych - wykrywanie wirusów metodami PCR Phage MS2 - badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001 Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001 Fagi B. fragilis DIN EN ISO 10705-4:2001 Fagi F+RNA F-Pilus Fagi somatyczne Bacterium F+ Bacterium EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- FagiF+RNA Fagi somatyczne DIN 10705-1 10705-02 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 ) Dolny agar: Górny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar (TYGA) ssTYGA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml Modif. Scholten‘s Agar ( MSA ) ssMSA (0,8% agar) 250 µg/ml 1 pfu/50 ml Fag wzorcowy: MS2 PhiX174 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Fag138 PRD1 PhiX174 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 MS2 Selinka Morfologia płytek bakteriofagów Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: C.Fuchs zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego „Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri 110 100 pfu / ml 90 80 70 60 50 40 30 16.12.08 26.11.08 6.11.08 17.10.08 27.9.08 7.9.08 18.8.08 29.7.08 9.7.08 19.6.08 30.5.08 10.5.08 20.4.08 20 Data x-3s x-2s x x+2s x+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Monitorowanie wirusów – pobieranie prób Związki chemiczne Wirusy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Rozkład statystyczny Skupiska! Selinka Próbobranie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej 10-litrowa próba wody Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów ( DNA / RNA ) próbka wody surowej Wykrywanie wirusa metodą PCR 1. 2. 3. 4. Pobieranie prób wody o dużej objętości Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów Testy wykrywające wirusy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Infectivity assays Selinka Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody Cechy wirusa Polarność powierzchniowa kapsydu Rozmiar cząsteczki Gęstość Metody Adsorpcja / Wymywanie Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Ultrawirowanie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka W terenie… EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Włókno szklane – badania polowe dużych objętości Próba wody: 10 litrów 1000 litrów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Oczyszczanie DNA i RNA liza etapy mycia Bufor do lizy kroki powtarzane 5 razy elucja 2x 50 µl Bufor do elucji Krzemionka Próbka 5ml EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 5 min 60°,1400 rpm Selinka Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi Wirus RNA Wirus DNA Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów DNA Białko RNA DNA 5’---CTCAGCGTTACCAT---3’ 3’---GAGTCGCAATGGTA---5’ Odwrotna transkrypcja RNA Transkrypcja 5’---CUCAGCGUUACCAU---3’ Translacja BIAŁKO N---Leu-Ser-Val-Thr---C EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Wykrywanie wirusów metodami PCR konwencjonalne PCR (jakościowe) DNA / RNA PCR czasu rzeczywistego (ilościowe) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) Wirusy DNA PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Wirusy RNA RT-PCR Selinka Nested (RT)-PCR NOROWIRUS (nested RT-PCR) ADENOWIRUS (nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-Time TaqManTM PCR Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu Adenowirus 41 wzorzec 102 - 106 kopii - Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA) (2) nieoznaczona para dla starterów (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana 2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA) (4) Mastermix (koktail odczynników) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Real-time PCR Testy / próbki: 1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10 Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiska często negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności adenowirusa • Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa • zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach • następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR) (A. Heim) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Metody wykrywania wirusa Metoda wykrywania Hodowla komórkowa Skraca czas wykrywania Wykrywa zakaźnego wirusa Wykrywa jedynie żywe organizmy Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli Odporna na wpływ substancji hamujących PCR O zwiększonej czułości L J L L J J RT-PCR ICC-PCR J J L L J L L J J J J J J EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Badanie zakaźności enterowirusa a) Test TCID50 b) Test łysinkowy kontrolna CVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Podstawowe techniki monitorowania wirusów - wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA - systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) - systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności Techniki zaawansowane: - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka Dziękuję Państwu! EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
