Analiza funkcjonalna sekwencji różnicujących linie ogórka

advertisement
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
w Warszawie
Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu
Mgr inż. Cezary Paweł Kowalczuk
Analiza funkcjonalna sekwencji
różnicujących linie ogórka
(Cucumis sativus L.)
o odmiennych typach płci
Autoreferat pracy doktorskiej
Praca wykonana pod kierunkiem
Prof. Dr hab. Zbigniewa Przybeckiego
Katedra Genetyki Hodowli i Biotechnologii
Roślin
Recenzenci:
Prof. dr hab. Jan Szopa-Skórkowski
Zakład Biochemii Genetycznej
Wydział biotechnologii
Uniwersytet Wrocławski
Dr hab. Grzegorz Bartoszewski
Katedra Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin
Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i
Architektury Krajobrazu
SGGW w Warszawie
Warszawa, 2014
Wstęp i cel pracy.
Szybki postęp w biologii molekularnej pozwala na upowszechnienie precyzyjnych metod
badawczych pozwalających na dokładną lokalizację i pomiar ekspresji genów w wybranym
regionie badanych organów. Upowszechnienie sekwencjonowania, a co za tym idzie
wykorzystanie analiz in silico wykonujących globalne analizy podobieństwa oraz
modelowania struktur sekwencji nukleotydów pozwoliło na stworzenie wielowymiarowej
mapy ekspresji genów regulujących rozwój organizmów.
Prezentowana praca jest elementem szerszego projektu mającego na celu poznanie
mechanizmów
zaangażowanych
w
kształtowanie
się
płci
kwiatów
u
roślin
okrytozalążkowych. Jako obiekt badawczy wybrano roślinę ogórka (Cucumis stativu), ze
względu na jej wysokie zróżnicowanie w obrębie typów płci w ramach jednego gatunku.
W badaniach posłużono się klasycznymi metodami analiz ekspresji (in vitro), w powiązaniu
ze znajomością sekwencji genomu (in silico). Bazuje ona również na dotychczasowych
osiągnięciach Katedry Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin w tym wyselekcjonowanych
sekwencjach ekspresyjnych i genomowych różnicujących linie ogórka, a także stworzonych
ich profilach ekspresyjnych uzyskanych metodą makromacierzy oraz Real Time PCR. W
identyfikacji powiazań pomiędzy genami wsparto się również danymi uzyskanymi dzięki
sekwencjonowaniu genomu ogórka.
Celem pracy była lokalizacja ekspresji wybranych sekwencji w organach kwiatowych we
wstępnym stadium rozwoju ( 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm) oraz określenie jej siły w okółkach
trzecim i czwartym. Uzyskane wyniki oraz wyniki z poprzednich badań skonfrontowano z
literaturą w celu weryfikacji zaangażowania danej sekwencji w procesy inicjacji lub kontroli
rozwoju organów generatywnych kwiatu.
Kolejnym elementem pracy było powiązanie dotychczasowych wyników w celu stworzenia
szerszego obrazu kaskad zależności pomiędzy poszczególnymi genami. Obraz ten miałby w
przyszłości pozwolić na wytypowanie genu Gy/gy.
Materiały i Metody
Pochodzenie i charakterystyka badanych linii NIL ogórka (Cucumis sativus L).
Materiał do badań stanowiły liście i pąki kwiatowe w stadium wielkości 1 – 2 mm
oraz 3 – 5 mm, jak również grupy komórek z regionów trzeciego (s) i czwartego (c) okółka
wyżej wymienionych pąków kwiatowych, pochodzących z dwóch par linii izogenicznych
(NIL) ogórka (Cucumis sativus L.), różniących się pod względem płci. Linie pochodzą z
kolekcji Katedry Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin.
Pierwsze para linii NIL: B10 (genotyp: ff/MM/GyGy), jednopienna, sublinia odmiany
Borszczagowski; 2gg (genotyp: ff/MM/gygy) recesywnie żeńska, (Kubicki, 1974)
Druga para linii NIL: Gy3 (genotyp: FF/MM/GyGy) - dominująca żeńska,; HGy3 (genotyp:
FF/mm/GyGy) hermafrodytyczna,
Pochodzenie i charakterystyka testowanych sekwencji
Sekwencje wykorzystane w poniższych badaniach pochodzą z kolekcji sekwencji
różnicowych uzyskanych w ramach wcześniejszych prac nad poznaniem mechanizmów
determinacji płci u ogórka (C. sativus) prowadzonych w Katedrze Genetyki Hodowli i
Biotechnologii Roślin
Analiza podobieństw
Lokalizacji sekwencji różnicowych w genomie dokonano wykorzystując bazy danych
ze
strony
Polish
Consortium
of
Cucumber
Genome
Sequencing
(PCCGS)
(http://csgenome.sggw.pl/). Numeracja contigów oraz scafoldów zgodna jest z numeracją
przyjętą w bazie danych. Do lokalizacji sekwencji w genach ogórka posłużono się programem
BioEdit oraz utworzoną lokalną bazą genów z w/w strony, przy spodziewanej wartości E 1,0
oraz macierzy BLOSUM62. Program BioEdit posłużył również to wykonania analiz
porównawczych grup sekwencji za pomocą algorytmu typu ClustalW (European
Bioinformatics Institute EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/).
Dzięki uprzejmości PCCGS możliwe było uzyskanie danych dotyczących predykcji
białkowych genów ogórkowych.
Identyfikację sekwencji różnicujących wykonano z użyciem baz danych dostępnych
na stronie NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) i algorytmów: Blastn, Blastx, Tbalastx. Baza
danych genomu ogórka była również źródłem sekwencji promotorowych (tkz. 1000_up
stream). Analizy strukturalnej tych sekwencji dokonano algorytmem Plant CARE:
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/).
Laser capture microdissection
W celu scharakteryzowania ekspresji w trzecim oraz czwartym okółku pąków
wielkości 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm, materiał ten w został pobrany techniką laser capture
microdissection (LCM) w Instytucie Onkologii im. Marii Skłodowskiej – Curie w Warszawie,
z
wykorzystaniem
urządzenia
typu
PALM
MicroBeam
(Zeiss).
Mikrodysekcja
przeprowadzona była w trybie Auto LPC przy energii lasera ~80%, skupieniu wiązki ~67%, i
powiększeniu 20x (Kerk, et al., 2003).
Reakcja RT- PCR
Do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji wraz z amplifikacją użyto zestaw
zawierający rTth DNA Polymerase, GeneAmp® EZ rTth RNA PCR Kit oraz rTth DNA
Polymerase and EZ Buffer Pack (Applied Biosystems). Temeratury topnienienia starterów
obejmowały przedział 58°C – 62°C i zostały zaprojektowane za pomocą programu Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) oraz Primer Express® (Primer Express® software v2.0
from Applied Biosystems).
Reakcja in situ RT – PCR
Analizy in situ RT-PCR wykonano wg Urbańczyk-Wochniak (2000). Roztwory
sporządzono na podstawie „Molecular cloning. A laboratory manual” (Sambrook & Russell,
2001). Do reakcji zastosowano polimerazę typu rTth (rTth DNA Polymerase) (Applied
Biosystems). Reakcję przeprowadzano na preparatach otoczonych ramką Frame-Seal
Incubation Chambers (BioRad) o pojemności 65μl.
Analiza QRT-PCR
Do oceny ilościowej transkryptów użyto urządzenia 7500 Fast Real-Time PCR
(Applied Biosystems). Ilości amplifikatu mierzono przy pomocy systemu SYBER Green
(SYBER Green PCR Master Mix – Applied Biosytems). Wyniki analizowano za pomocą
oprogramowania REST 2009 (http://rest-2009.gene-quantification.info/) ,
Wyniki i Dyskusja
Ewaluacja genów referencyjnych użytych do analizy zmian ekspresji
Celem tej części pracy było wytypowanie i ocena stabilności ekspresji genów
referencyjnych w regionie trzeciego i czwartego okółka kwiatowego kwiatów. Wybrano
potencjalne geny referencyjne cyclophilin [GenBank: AY942800]; elongation factor 1-alpha
[GenBank: EF446145]; alpha tubulin [GenBank: AJ715498] i ubiquitin extension protein
[GenBank: AY372537]. Wymienione geny zostały zlokalizowane w genomie ogórka odmiany
Borszczagowski (Linia B10) (Wóycicki, et al., 2011).
Wybrane geny referencyjne są powszechnie używanymi genami typu housekeeping i są
dobrze scharakteryzowane dla różnych gatunków roślin i zwierząt. Wszystkie dotychczasowe
badania potwierdzały ich stabilność oraz zasadność stosowania jako geny referencyjne.
Do przeprowadzenia testu stabilności ekspresji kandydatów genów referencyjnych posłużyła
linia hermafrodytyczna HGy3. Pozytywne wyniki uzyskano jedynie w przypadku genu alpha
tubulin. Punkt Ct został przekroczony przy wartości 39,47 a produkt reakcji denaturował w
temperaturze 76o C. Startery dla transkryptów genów elongation faktor alpha oraz cyclophilin
nie dawały żadnego produktu. Powodem tego mogła być zbyt niskie stężenie cDNA użytego
do reakcji, wynikające z technicznych ograniczeń izolacji niezwykle małych ilości RNA z
prób LCM (Kerk, et al., 2003; Zhang, et al., 2010). Powodem dla którego w przypadku genu
alpha tubulin udało się uzyskać produkt przy tak niskim stężeniu cDNA może być silne
powiązanie tego genu z rozwojem kwiatów (McCormick, 1993).
Ze względu na brak możliwości wykonania analizy porównawczej względem na brak innych
genów referencyjnych, konieczne było znalezienie miarodajnej metody oceny stabilności
genu alpha tubulin w trzecim i czwarty okółku kwiatów ogórka. W tym celu wybrano
jednoczynnikową analizę ANOVA oraz wyznaczono krzywą regresji bazując na wartościach
Ct we wszystkich badanych typach prób. Analiza statystyczna użyta do oceny stabilności
bazuje na metodzie jaką zastosowano u topoli Populus spp gdzie dla alpha tubulin uzyskano
indeksie stabilności wartości 0,54) (Brunner, et al., 2004). Stosując ten algorytm do oceny
stabilności ekspresji genu alpha tubulin w prezentowanych badaniach otrzymano indeksy:
0,00 dla 3 i 4 okółka, oraz 0,35 dla pąków i liści.
Wszystkie te geny są genami konserwatywnymi u ogórka i charakteryzują się wysoką
stabilnością ekspresji w dużych strukturach, takich jak całe liście, całe pąki kwiatowe oraz
stożki wzrostu. Uzyskane wyniki wskazują, że w analizowanych oddzielnie małych
elementach takich struktur, np. zawiązki pręcików lub słupków uzyskuje się odmienne wyniki
(co przeczyłoby jednak ich konstutywności). Początkowo zakładano, że nie wystąpią żadne
różnice w ekspresji pomiędzy całymi pąkami kwiatowymi a ich okółkami – trzecim i
czwartym. Jednak doświadczenie kontrolne wykonane dla tych okółków w linii
hermafrodytycznej wykazało, że jedynie gen alpha tubuliny ulegał ekspresji w tych organach
na poziomie umożliwiającym użycie go w szczegółowych badaniach ekspresji genów
powiązanych z kwitnieniem. Gen ten również cechował się wyjątkowo dobrym indeksem
stabilności, wyrażonym iloczynem współczynnika zmienności oraz wartości nachylenia linii
regresji bliskim 0,00.
Uzyskane wyniki wskazują, że choć geny w dużych, złożonych strukturach, wykazują
stabilną ekspresję, to w elementach składowych tych organów może być ona zróżnicowana.
Przypuszcza się, że jest to związane z izolacją samego RNA. Ponadto, mogą tam występować
bardzo silne procesy, czasem stojące w opozycji do siebie, np. w trzecim i czwartym okółku
(promowanie jednych organów i hamowanie w rozwoju drugich). Może to owocować niskim
udziałem produktów genów konstytutywnych.
Rola białek z grupy LBP w rozwoju kwiatów męskich ogórka
Bazując na wynikach badań dla sekwencji CsB10dhB2_70 i 342 udało się wytypować
gen będący ściśle powiązany z dominującym allelem genu Gy/gy. Był to gen CsLBP-1.
Pierwotnie gen ten był reprezentowany przez grupę ekspresyjnych sekwencji różnicujących
transkryptomy pąków kwiatowych jednopiennej linii B10 oraz recesywnie żeńskiej linii NIL 2gg, ustalono, że dziewięć z tych sekwencji pochodzi z genu CsLBP-1.
Wyniki reakcji in situ RT-PCR potwierdziły specyficzność ekspresji tych sekwencji dla linii
B10 oraz brak transkryptów dla linii 2gg. Lokalizacja produktów transkrypcji genu CsLBP-1
wykazała ich obecność w płatkach korony, okółkach pylników słupka 1 – 2 mm oraz 3 – 5
mm pąków linii B10. W 1 – 2 mm pąkach sygnał był wyraźnie silniejszy niż
w stadium 3 – 5 mm. W 1 – 2 mm pąkach linii B10 niemożliwa była identyfikacja sygnału
w obrębie okółka 4 w przypadku sekwencji CsB10dhB2_70, jednakże w przypadku sekwencji
CsB10dhB2_342 (obydwie sekwencje pochodzą z genu CsLBP-1) sygnał w tym okółku był
wyraźny. W linii 2gg sygnał był niewykrywalny.
Analiza Real Time PCR dla trzeciego i czwartego okółka potwierdziła wcześniejsze
obserwacje. Najwyższy poziom ekspresji wystąpił w regionie rozwijających się pylników
(kwiaty męskie) linii B10 w pąkach wielkości 3 – 5 mm, a najniższy poziom
w zahamowanych w rozwoju pylnikach linii 2gg w pąkach tej samej wielkości.
Zidentyfikowany gen CsLBP-1 prawdopodobnie koduje wielofunkcyjne białko
roślinne wiążące lipidy o podwójnej funkcji inhibitora proteaz oraz transferu lipidów,
należące do nadrodziny AAI_LTSS (AAI_LTSS: Alpha-Amylase Inhibitors (AAI), Lipid
Transfer (LT) and Seed Storage (SS) Protein family). Jest to nadrodzina białek specyficzna dla
roślin wyższych. Białka z tej rodziny pełnią ważną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie
miedzy błonami, przy magazynowaniu składników odżywczych oraz ochronie roślin przed
patogenami i insektami (Marchler-Bauer, et al., 2011).
W prezentowanych badaniach wykazano specyficzną ekspresję genu kodującego
białko typu LTP w trzecim okółku męskich kwiatów jednopiennej linii ogórka,
z dominującym allelami genu Gy/gy. Sugeruje to jego rolę w regulacji rozwoju pylników.
Teza ta znajduje potwierdzenie zarówno w badaniach nad białkami z tej rodziny jak i tych
skupiających się na poznaniu mechanizmów rozwoju kwiatów.
Okres rozwoju męskiego gametofitu od tetrad do zwakuolizowanej mikrospory uważany jest
za wysoce aktywny (Mandaron, et al., 1990). Białka transportujące białka, są kluczowymi
elementami formowania się mikrospor. Ponadto białka typu LTP konieczne w tych procesach
wykrywane są podczas formowania się pylników we wczesnym okresie rozwoju mikrospor
przy komórkach tapetum (Park, et al., 2000; Zhang, et al., 2010). Sugerowaną rolą LTP w tym
miejscu jest transport kutyn oraz wosków z tapetum i deponowanie ich w ścianie komórkowej
mikrospory.
Badania nad genem Wax-deficient anther1 z ryżu (O.sativa) (Jung, et al., 2006)
wykazały, że w stadium młodych mikrospor w normalnych pylnikach orbikule otoczone są
cienką warstwę lipidów. W lokulach pojawiają się w tym czasie również cytoplazmatyczne
ciałka lipidowe. Uszkodzenie tego genu zaburza prawidłowy rozwój ziaren pyłku.
W późniejszym rozwoju tapetum pojawia się inny rodzaj ciałek lipidowych, określony
mianem tapetosomów. Komponentem lipidowym tapetosomu jest w większości TAG
(trigliceryd), jak również powiązana z nimi i heterogenicznie dopasowana populacja białek,
zawierających domeny typu oleosin-like na końcu N. Tapetosom jest uwalniany z komórek
tapetum w ich letalnym stadium, gdy aktywowany jest mechanizm programowanej śmierci
komórek oraz ich liza (Murphy, 2001).
Przykładem genu typu LTP wykazującego ekspresję tapetum specyficzną jest gen
OsC6 pochodzący z O. sativa. Sugeruje się jego rolę w postmejotycznym rozwoju pylników
poprzez wiązanie kwasów tłuszczowych oraz regulację formowania się struktur lipidowych,
orbikulos (np. ciałek Ubischa), oraz warstwy egzyny na powierzchni ziaren pyłku. W liniach z
defektem
tego
genu
zaobserwowano
słabą
koncentrację
komórek
tapetum
i
zwakuolizowanych ziaren pyłku, co ostatecznie prowadzi do aborcji ziaren pyłku (Zhang, et
al., 2010).
Gen OsC6 jest regulowany poprzez czynniki transkrypcyjne Tapetum Degeneration
Retardation (TDR) oraz GAMYB powiązane z E-Box (CANNTG) (Zhang, et al., 2010). Gen
TDR ulega silnej ekspresji w tapetum od stadium mejozy to stadium młodych mikrospor.
Rośliny o genotypie tdr/tdr wyglądają normalnie w stadium wegetatywnym oraz podczas
kwitnienia, jednak nie produkują żywotnego pyłku. Prowadzi to do całkowitej męskiej
sterylności. U mutantów tdr powstaje wrażenie nadmiernie rozrośniętego tapetum bez oznak
degradacji, co w późniejszym stadium powoduje zapadnięcie się ścian mikrospor. Mechanizm
regulacji
rozwoju
i
degradacji
tapetum
przez
TDR
jest
silnie
powiązany
z mechanizmem programowanej śmierci komórki (PCD), komórek tapetum podczas rozwoju
pyłku (Zhang, et al., 2010). Kolejne badania również sugerują iż transport lipidów oraz ich
metabolizm odgrywają znaczącą rolę podczas rozwoju pylników, a brak funkcjonalnego
elementu TDR powoduje zmiany w ekspresji 236 genów (154 ulega wzmożonej ekspresji, a
przypadku 82 obserwowano jej spadek), co wskazuje, iż TDR jest nadrzędnym regulatorem
PCD w komórkach tapetum oraz innych podstawowych procesów powiązanych
z dojrzewaniem pyłku (Zhanga, et al., 2008).
W tym samym okresie rozwojowym pylników uwalniane są plastydowe oraz
elaiplastydowe ciałka lipidowe wraz z białkami z nimi powiązanymi. Są one następnie
przenoszone do najbardziej skrajnej warstwy ziaren pyłku, okrywy pyłku, odgrywającej
ważną rolę podczas zapylenia, począwszy od możliwości przyczepienia się do wektorów
(owadów zapylających) po rehydrataję pyłku (Murphy, 2001). Badania nad białkiem typu LTP
(lipid transfer-like protein) z pyłku lilii wykazały tą aktywność dokładanie jako adhezję
pomiędzy receptorem w ścianie/kanale membranowym pyłku a zewnątrzkomórkową
macierzą pylników (Park, et al., 2000).
Analiza sekwencji promotorowych genów typu LBP u ogórka, wykazała, iż unikalnym
czynnikiem regulatorowym dla genu CsLBP-1 (pierwszy na configu 2263) jest regulator
transkrypcji MBSI – MYB powiązany z regulacją biosyntezy flawonoidów. W genomie
ogórka zidentyfikowano dwa takie geny. Pierwszy to gen piąty na contigu 2558 (CsMYB12) o
wysokim podobieństwie do czynnika transkrypcyjnego MYB12 z A. thalina zawianego
z flawono specyficzną regulacją biosyntezy fenylopropanoidów. Drugi to gen pierwszy na
configu 9568 (CsMYBR2R3) podobny do czynnika transkrypcji R2R3 – MYB z winorośli
VvMYBF1 związanego z regulacją syntezy flawonów w rozwijających się winogronach.
Promotorowa analiza porównawcza powyższych genów w genomie ogórka wykazała, że dla
genu CsMYB12 unikalnymi elementami regulatorowymi są ATCC-motif – cześć
konserwowanej domeny DNA zaangażowanej w odpowiedz na sygnał świetlny, CTAG –
motif – czynnik o dotychczas niepoznanej funkcji oraz rbcS-CMA7a - składowa elementu
odpowiedzialnego za odpowiedź na sygnał świetlny. Dla genu CsMYBR2R3 unikalnym
elementem był MBSI – MYB posiadający miejsce wiązania czynników regulacji genów
powiązanych z biosyntezą flawonoidów.
Gen CsLBP-1 ulega zwiększonej ekspresji w obecności dominującego allelu genu
Gy/gy (linia B10, z wyjątkiem liści). U homozygoty recesywnej (linia 2gg) ekspresji nie
zaobserwowano. Gen ten koduje białko należące do rodziny LTP a powyższe badania
ekspresji korespondują z rolą jaką przypisuje się białkom z tej rodziny w rozwoju pylników.
Wyniki naszych badań sugerują silny z wiązek genu CsLBP-1 z rozwojem kwiatów męskich.
Dokładny mechanizm regulacji powyższego genu typu LTP-like pozostaje jednak nieznany.
Sugerowany mechanizm może być związany z regulatorami transkrypcji typu MYB12,
zaangażowanymi w flawono-specyficzną regulację biosyntezy fenylopropanoidów, których
ekspresja może być skorelowana również z rozwojem kwiatów.
Metallothionein typ II (CsGy3dhGH_250)
Sekwencja
CsGy3dhGH_250
stanowi
fragment
kodujący
genu
CsMT2
-
metallothionein typ II, która w różnym stopniu jest eksprymowana w liniach Gy3 i HGy3.
Metalotioniny stanowią rodzinę małych (500 – 14000 Da) białek zlokalizowanych
w aparatach Golgiego. Charakteryzują się one dużo liczbą cystein w łańcuchu oraz zdolnością
do wiązania metali, zarówno fizjologicznych (cynk, miedź, selen) jak i ksenobityków (kadm,
rtęć, srebro, arsen) (Marchler-Bauer, et al., 2011).
Przeprowadzone reakcje in situ RT-PCR w celu lokalizacji ekspresji w pąkach nie
dostarczyły danych rozstrzygających dotyczących profilu ekspresyjnego. Metoda in situ RTPCR przeprowadzona w ramach prezentowanej pracy, może być niewystarczająco czuła, żeby
wykryć niewielkie ilości transkryptu.
Metalotionin w procesach kwitnienia powiązane są z etylenem (Coupe, et al., 1995)
Dlatego zmiaeszczana jest w modelach regulacji płci z udziałem etylenu u ogórka. Gen F
u ogórka kodujący sytnazę ACC pełni istotną role w biosyntezie etylenu (Trebitsh, et al.,
1997). Natomiast gen M powiązany jest z genem kodującym białko typu ETHYLENEINSENSITIVE3-like (Liu, et al., 2008), a według ostatnich badań sam gen M koduje CsACS2
(również synatazy ACC) (Li, et al., 2012). Ta funkcja jednak nie w pełni koresponduje
z silniejszą ekspresją w liniach ogórka wytwarzających w kwiatach organy męskie.
U kukurydzy metalthionina występowała w tapetum, we wczesnym stadium rozwojowym
kwiatów. Ekspresja genu kodującego metalothioninę obserwowana była również w stadium
komórek macierzystych pyłku, a najwyższy jej poziom występował w trakcie mejozy
(Charbonnel-Campaa, et al., 2000). Wyniki tych badań mogą tłumaczyć braku sygnału
w reakcji in – situ RT-PCR w pąkach w stadium 3 – 5 mm gdzie ziarna pyłku są już wyraźnie
wykształcone. Spadek poziomu metalothiony widać również z badaniach Real Time
przeprowadzonych na całych pąkach.
Na tym etapie określenie dokładnej roli, jaką pełni metalohionia typu 2 w rozwoju
kwiatów jest ryzykowne. Konieczne jest potwierdzenie ekspresji tego genu w męskich typach
kwiatów ogórka w okresie od komórek macierzystych pyłku do mejozy.
Fasciclin-like arabinogalactan family protein (CsB10dhB2_113)
Białka
z
grupy
fasciclino
podobnych
arabinogalactanów
(Fasciclin-like
arabinogalactan family protein) nie maja jeszcze zdefiniowanej funkcji molekularnej i nie
wiadomo, w jakich procesach biorą udział (Marchler-Bauer et al., 2011).
Techniką in situ RT-PCR nie wykryto obecności produktów ekspresji genu CsFLA.
Profil ekspresyjny do dyskusji bazuje na wynikach uzyskanych dla tego genu w ramach
wcześniejszych badań, gdzie wykazano korelacje ekspresji w obecności męskich organów
w kwiatach (Witkowicz, nieopublikowane)
Białka typu fasciclin zaliczane są do rodziny arabinogalactanów, białek powszechnie
występujących u Eucariota. Ze względu na tak powszechne ich występowanie trudno
jednoznacznie nakreślić ich rolę. Przyjmuje się, że u roślin są one komponentem ścian
komórkowych, biorącym udział w adhezji komórek, rozwoju organów oraz reakcji na stres
(Seifert & Roberts, 2007). Biorą one również udział w tworzeniu wtórnych ścian
komórkowych (Dahiya, et al., 2006). Białka typu FLAs są lokalizowane w różnych częściach
roślin, ale najbardziej charakterystyczne miejsca to stożek wzrostu łodygi oraz korzenie, a
także okolice aparatów szparkowych, włosków, oraz korzeni bocznych. Aktywność tej grupy
białek została również opisana w kontekście rozwoju kwiatów, a w szczególności
prawidłowego rozwoju gametofitu żeńskiego i męskiego (Acosta-García & Vielle-Calzada,
2004; Coimbra & Pereira, 2012).
W przypadku badanie ekspresji genu CsFLAP zaobserwowano silną korelację
z kwiatami zwierającym męskie organy płciowe. Jak już wcześniej wspomniano białka typu
FLAs maga brać udział w rozwoju gametofitu męskiego, co zostało potwierdzone u wielu
gatunków. Zaobserwowano, że niepłodność roślin z mutacją agp6 i agp11 była wynikiem
przerwanie rozwoju ziaren pyłku (Coimbra, et al., 2009). Dalsza charakterystyka pylników
oraz pyłku roślin agp6 i agp11 wykazała, że oba geny AGPs: AGP6 i AGP11, są niezbędne
dla prawidłowego wzrostu łagiewki pyłkowej, a także do zapobieganiu przedwczesnemu
kiełkowaniu ziaren pyłku (Coimbra, et al., 2010). Kolejnym ważnym elementem jest również
ich zdolność do transportu lipidów (nsLTP-like AGPs) (Ma & Zhao, 2010) co koresponduje z
wynikami ekspresji sekwencji CsB10dhB2_70/342 powiązanej z genem o predykcji z rodziny
białka transportującego lipidy LTP.
Badania przeprowadzone dla Arabidopsis wykazały rolę białek z rodziny
arabinogalactanów w rozwoju pyłku. Ponadto, wykazano korelację tej rodziny białek z
rodziną białek LPB. Tłumaczy to silny związek ekspresji genu CsFLAP z kwiatami męskimi i
hermafrodytycznymi (wyniki Real Time PCR). Wyniki te wskazują również na koekspresję
tego genu z genem CsLBP-1. Potwierdzenie tego wymaga jednak dalszych badań
Gen CsC56 -proteazy C56, (CsB10cdB2_34) .
Sekwencja CsB10cdB2_34 podobnie jak 8 innych z biblioteki sekwencji różnicowych
jest fragmentem unikalnego genu CsC56 (gen 1 na contigu 798 na chromosomie 1)
kodującego białko podobne do proteazy C56 (protease C56) z R. communis.
Proteaza typu C56 należy do rodziny PfpI pochodzącej z Pyrococcus furiosus. Jest to
wewnątrz komórkowa proteaza niezależna od ATP, posiada ona aktywność hydrolityczną a jej
sugerowana funkcja to degradacja małych peptydów. Enzym GSP 18 pochodzący z Bacillus
subitilis należący do tej rodziny, ulegał ekspresji pod wpływem różnych form stresu.
Charakterystyczną domeną dla białek podobnych do PfpI z P. furiosus jest 1 glutamine
amidotransferase. Sugeruje się, że produkty degradacji małych peptydów, są substancjami
odżywczymi dla komórek (Marchler-Bauer, et al., 2011).
Metodą in situ RT-PCR stwierdzono obecność transkryptu genu CsC56 w linii B10
pąkach 1 – 2 mm (w płatkach korony oraz pylnikach). W przypadku linii 2gg można
domniemywać obecności sygnału w pąkach wielkości 1 – 2 mm jedynie w płatkach korony.
Proteazy
jako
enzymy
degradujące
peptydy
odgrywają
kluczową
rolę
w programowanej śmierci komórek wywołanej starzeniem i czynnikami stresogennymi
(Garcia-Lorenzo, 2007). PCD jest również kluczowym elementem regulacji rozwoju organów,
a jego rola w kształtowaniu płci kwiatów została szeroko opisana, często w kontekście
hamowania rozwoju organów generatywnych (Kuriyama & Fukuda, 2002). PCD odgrywa też
kluczową rolę w rozwoju pylników oraz pyłku, gdzie prowadzi do degradacji tapetum i
uwolnienia ziaren pyłku (Zhanga, et al., 2008; Xu & Zhang, 2009). Ponadto w procesie
rozwoju i degradacji tapetum u Brassica napus biorą udział proteazy cysteinowe (Zhou, et al.,
2012).
Produkt białkowy genu CsC56 jest proteazą cysteinową posiadającą domenę tupu PfpI
z cysteiną w miejscu aktywnym. Sekwencja ta jest silnie związana z kwiatami posiadającymi
pylniki. Wyniki reakcji in situ RT-PCR sugerują ekspresję w pylnikach osiągającą najwyższą
wartość w późnym stadium rozwojowym. Może to sugerować udział tego genu w procesie
degradacji tapetum w rozwijających się pylnikach kwiatów ogórka.
Gen CsQM - QM – like protein (CsGy3cdGH_33)
Gen CsQM (gen 2 na contigu 699) koduje białka QM – like. W genomie ogórka
znaleziono jeszcze dwa niehomologiczne geny o tej samej predykcji.
Rodzina białek typu QM została zidentyfikowana jako supresory guza Wilmsa. Gen
QM koduje rybosomalne białko L10, które jest powiązane z podjednostką 60S i jest
kluczowym elementem łączącym podjednostki 40S oraz 60S tworząc funkcjonalną
podjednostkę 80S. Coraz większa ilość dowodów sugeruje, iż poza udziałem w biosyntezie
białek, białka typy QM mogą posiadać również wiele poza rybosomalnych funkcji. Wysoko
konserwatywna sekwencja QM wskazuje na ich fundamentalną i niezbędną funkcję dla
wszystkich gatunków. Jednak ich rola fizjologiczna nie została dotychczas poznana (Singh, et
al., 2009).
Analiza in situ RT-PCR wykazała ekspresję genu CsQM w płatkach korony, okółku
pylników oraz okółku słupka G35. W linii HGy3 ekspresję wykryto w płatkach korony oraz
okółku słupka w linii HGy 3 pąkach 3 – 5 mm. Analiza Real Time PCR ekspresji wykazała jej
obecność w regionie słupka linie Gy3 pąków wielkości 3 – 5 mm, oraz pylnikach linie HGy3
w pąkach 3 – 5 mm. Przy czym ekspresja w słupkach linii Gy3 była wyższa niż pylnikach
linii HGy3 w tych stadiach.
Dotychczasowa wiedza na temat roli genów QM jest bardzo skąpa. Początkowo
ograniczała się ona jedynie do supresji guza Wilmsa (Dowdy, et al., 1991). Kolejne prace
wykazały, iż białka tego typu są obecne również u roślin (Ferreyra, et al., 2010; Low, et al.,
2008). Przypuszcza się, że geny typu QM mogą być również zaangażowane w rozwój
organów roślinnych, szczególnie w ich wczesnym stadium. Może na to wskazywać ich
obecność w kulturach tkankowych (Elaeis guineensis Jacq.) (Low, et al., 2008), jak również
badania dotyczące regulacji białek L10 u kukurydzy i Arabidopsis (Ferreyra, et al., 2010) oraz
nad rolą genów QM w starzeniu się liści herbaty (Camelia sinensis) (Singh, et al., 2009).
W badaniach nad regulacją genów typu QM u herbaty (C. sinensis) zaobserwowano,
że w okresie wzrostu liści ekspresja jest wysoka (najwyższa w stożkach wzrostu) a jej poziom
maleje wraz z dojrzewaniem liści. W okresie dojrzałym ekspresja genu CsQM ulegała
wyraźnej represji we wszystkich typach badanych liści. Transkrypcja genu CsQM uległa
również wyraźnej represji w odpowiedzi na susze oraz kwas abscysynowy. Natomiast pod
wpływem giberelin ulegał nadekspresji. Zarówno wysoka ekspresja w stożkach wzrostu
w fazie silnych podziałów jak i wrażliwość na gibereliny co sugerują rolę genu CsQM
we wzroście i rozwoju roślin (Singh, et al., 2009).
Powyższe badania dotyczące C. sinensis są niezmiernie pomocne w interpretacji
wyników uzyskanych dla ogórkowego genu CsQM. Kluczowym elementem jest fakt
wrażliwości roślinnych genów QM na gibereliny będące fitohormonem nasilającym męskość
u niektórych roślin (Atal, 1959) w tym u ogórka (Galun, 1959; Bucovac & Wittwer, 1961).
Ponadto w regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM, zlokalizowano unikalny region
regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element) będący elementem odpowiedzi
na gibereliny. Obecność tego motywu wraz z informacjami dotyczącymi giberelin u ogórka
oraz zachowaniem się gnu CsQM u C. sinensis, mogą tłumaczyć obecność sygnału dla
ogórkowego CsQM w (makromacierz) w liniach o kwiatach zawierających pylniki
(Witkowicz, nieopublikowane).
W regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM zlokalizowano unikalny region
regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element), będący elementem odpowiedzi
na gibereliny wzmagające męskość. Obecność tego motywu, wraz z informacjami
dotyczącymi giberelin u ogórka oraz zachowaniem się genu QM u Camelia sinensis mogą
tłumaczyć obecność sygnału dla ogórkowego CsQM w liniach o kwiatach zawierających
pylniki (głównie w samych pylnikach). Otwarta kwestią pozostaje jednak ekspresja w linii
Gy3 wykazana przez reakcje Real Time PCR oraz in situ RT-PCR w całym pąku z wyjątkiem
okwiatu.
Gen CsAP-1 - Antyport Ca2+ (CsGy3dhGH_93)
Gen CsAP-1 (drugi na contigu 935 na chromosomie 2 w odległości 68,065 cM) koduje
białko antyport Ca2+/ wymienniki kationowe. W genomie ogórka zlokalizowano jeszcze 2
tego typu, nie są jednak strukturalnie homologiczne.
Metodą in situ RT-PCR stwierdzono obecność transkryptu genu CsAP-1 w płatkach
korony, okółku pylników oraz okółku słupka pąka linie Gy3 wielkości 3 – 5 mm. W linii
HGy3 sygnał był bardzo słaby w płatkach korony, okółku pylników i słupka w obu stadiach
wielkości. W pąkach linii HGy3 3 – 5 mm słaby sygnał był w działkach kielicha; natomiast
w pąkach wielkości 1 – 2 mm nie wykryto sygnału w tej części pąka
Ilościowa ocena ekspresji trzeciego i czwartego okółka linii Gy3 możliwa była
w pąkach 3 – 5 mm, przy czym nie było różnic między okółkami. W przypadku linii HGy3
ekspresja możliwa do oceny była w regionie pylników 3 – 5 mm pąków i była niższa od
ekspresji w regionie słupka i pylników linii Gy3 w tej samej wielkości pąkach.
Białka typu antyportów wapniowych występują bardzo powszechnie i są
zaangażowane w liczne procesy. Z tego względu precyzyjne określenie roli CsAP-1
w rozwoju kwiatów jest problematyczne. Pomocą w interpretacji funkcji, jaką może pełnić
CsAP-1 są badania nad rolą jonów wapniowych w regulacji morfogenezy kwiatów (Kudla, et
al., 2010).
Jony wapniowe są zaangażowane również we wzrost łagiewki pyłkowej. U Arabidopsis
zidentyfikowano trzy geny (NPG1, NPGR1 i NPGR2) kodujące białka z rodziny kalmodulin
zaangażowane w rozwój pyłku (Kudla, et al., 2010). U Brassica zidentyfikowano białko typu
calcium-binding protein (PCP), ulegające specyficznej ekspresji w pylnikach i słupkach
pąków tuż przed rozkwitem i zaraz po rozkwicie, przy czym w słupkach obserwowana był
wyższa ekspresja (Furuyama & Dzelzkalns, 1999). W badaniach nad morfogenezą kwiatów
ogórka zidentyfikowano sekwencję EST z genu kodującego homologa nukleazy zależnej od
wapnia (CAN), pochodzącej z Arabidopsis, nazwano ją CsCaN. Sekwencja ta wykazywała
konstytutywną ekspresję, jednak wyższy poziom obserwowano w pręcikach żeńskich
kwiatów w tak zwanym stadium 6 (obecne są w pąku jeszcze organy obu płci) niż w męskich.
Gen kodujący CsCaN był wyraźnie indukowany w obecności etylenu. Może to wskazywać na
udział tego genu w hamowaniu rozwoju pylników w kwiatach żeńskich (Emery, et al., 2012).
Ponad to wyniki badań ekspresji genów CAX 1 i CAX 3 w kwiatach Arabidopsis (Cheng, et
al., 2005) korespondują z uzyskanymi wynikami dla sekwencji CsGy3GH_93 pochodzącej z
transkryptu genu CsAP-1. Sekwencja ta została uzyskana na drodze hybrydyzacji różnicowej
pomiędzy linią Gy3 zawierającej dominujący allelem genu M oraz linią HGy3 z recesywnym
allelem genu m (Przybecki et al., 2003).
Wyniki ekspresji genu CsAP-1 korespondują z wynikami badań nad ogórkową wapniowo
zależną nukleazą (CsCaN), silnie powiązaną z regulacją rozwoju kwiatów żeńskich. Obydwa
geny są etylenowo zależne. W regionie poprzedzającym gen CsAP-1 zlokalizowano unikalne
elementy regulatorowe odpowiedzi etylenowej ERE (ethylene-responsive elemnt). Powyższe
wyniki sugerują, że gen CsAP-1 regulowany jest przez etylen i dostarcza jonów wapniowych
dla wapniowo-zależnej nukleazy, odpowiedzialnej za rozwój kwiatów żeńskich u roślin
ogórka posiadających dominujący allel genu M.
Gen CsRCOM_0621420-1 - Regulator transkrypcji: negative cofactor 2 transcriptional
co-repressor, putative (CsB10dhB2_28)
Sekwencja genu CsRCOM_0621420-1 charakteryzował się silnym podobieństwem do
sekwencji genu kodującego białko drugiego negatywnego kofaktora, korepresora transkrypcji
(XP_002525554
negative
cofactor
2
transcriptional
co-repressor,
putative):
gen
RCOM_0621420, z R. communis.
Metodą in situ RT-PCR wykazano obecność transkryptu w płatkach korony, okółku
pylników oraz okółku słupka pąków linii 2gg 1 – 2 mm. W linii B10 sygnał wykryto w
płatkach korony oraz okółku pylników pąków linii B10 wielkości 1 – 2 i 3 – 5 mm. Sygnałów
nie wykryto w działkach kielicha w żadnym z badanych preparatów jak również w okółku
słupka pąka linie B10 wielkości 1 – 2 mm.
Badania Real Time PCR wykazały stały poziom ekspresji genu CsRCOM_0621420-1
w linii B10. Zróżnicowanie natomiast wystąpiło w linii 2gg gdzie niższy poziom odnotowano
w słupkach paków wielkości 3 – 5 mm niż w 1 – 2 mm. Pomiędzy linią B10 i 2gg również
zaobserwowano różnicę w poziomie ekspresji. W pylnikach linii 2gg pąków wielkości 3 – 5
mm zaobserwowano niższy poziom ekspresji niż adekwatnych próbach linii B10. W
zahamowanych w rozwoju organach linii B10 pąków wielkości 3 – 5 mm więcej było
transkryptu niż takich samych linii 2gg. Niemierzalny natomiast był poziom transkryptu
w pąkach linie 2gg wielkości 1 – 2 mm.
Elementem składowym białka Negative cofactor 2 (NC2) jest histon H2A, pełniący
istotne role w utrzymaniu strukturalnej integralności nukleosomu i kondensacji chromatyny,
oraz wiązaniu specyficznych białek chromatyny (Warren, 2002). NC2 jest regulatorom
transkrypcji ewolucyjnie konserwowanym, pierwotnie zidentyfikowanym jako inhibitor
transkrypcji podstawowej (Gangloff, et al., 2001).
Najciekawsze badania z punktu widzenia morfogenezy kwiatów i regulacji kwitnienia,
dotyczą zaangażowania histonu H2A.Z w regulację czasu kwitnienia roślin Arabidopsis.
Wariant histonu H2A histon H2A.Z pośredniczy w wielu procesach związanych z edycją
chromatyny w tym aktywacją transkrypcji, konwersją euchromatyny lub formowaniem
heterochromatyny. U drożdży i u człowieka histon H2A.Z przyłącza się do chromatyny wraz
z kompleksem SWR1 i SRCAP. Wykazano, że mutacje w obrębie homologów tych
kompleksów u A. thaliana ACTIN-RELATED PROTEIN6 (ARP6) oraz PHOTOPERIODINDEPENDENT EARLY FLOWERING1 (PIE1), wytwarzają fenotypowo identyczne
roślinny i prowadzą do kooperacji zestawu genów. Dalsza analiza wykazała, iż ARP6 i PIE1
wymagane są do umiejscowienia histonu H2A.Z w różnych loci w tym loci genu FLC
odpowiedzialnego za regulację kwitnienia. Brak H2A.Z w chromatynie mutantów arp6 i pie1
prowadziło do obniżenia ekspresji genu FLC i przedwczesnego kwitnienia roślin, co
wskazywałoby ważna rolę tego histonu w regulacji kwitnienia (Deal, et al., 2007).
Uzyskane wyniki badań nad ekspresją genu CsRCOM_0621420-1 o predykcji do
regulatora transkrypcji typu NC2, a także obecna wiedza na temat procesów, w jakich ten
mechanizm regulacji jest zaangażowany, nie pozwala na postawienie jednoznacznej hipotezy
na temat roli jaką pełni NC2 w morfogenezie kwiatów ogórka. Jednak pozytywne wyniki w
reakcji in situ RT-PCR oraz reakcji Real Time dla trzeciego i czwartego okółka, choć
różnicują w niewielkim stopniu, stanowią mocną podstawę do gruntownych badań nad rolą
tego mechanizmu w procesach kształtowania różnych form kwiatu.
Geny białek zawierających domenę leucine rich repeat (LRR) na końcu N (CsPIP-1,
CsPIP-1 i CsLR-1).
Domena LRR występuje w ponad 2000 białek. W tej grupie białek znajdują się
receptory hormonów, receptory kinaz tyrozynowych, cząsteczki związane z adhezja komórek,
czynniki wirulencji u bakterii, enzymy oraz wewnątrz komórkowe glikoproteiny wiążące
macierz (Enkhbayar, et al., 2003).
Wśród badanych sekwencji transkryptomowych różnicujących linie o odmiennych
typach płci przebadano dwie sekwencje zawierające domenę LRR. Pierwsza był sekwencja
CsB10dhB2_150 różująca linie B10 i 2gg, znaleziona w genie na contigu 14488 chr 1 (gen
CsPIP-1), druga sekwencja CsGy3dhGH_98 znaleziona w genie CsLR-1 na contigu 4994 chr.
1 różnicująca linie Gy3 i HGy3.
Białko genu CsPIP-1 charakteryzowało się silnym podobieństwem do białka
inhibitującego poligalakturonazy (inhibiting protein z C. melo). Białko genu CsLR-1
charakteryzowało się silnym podobieństwem do białka z potworzonymi regionami bogatymi
w leucyny G. max. W genomie ogórka znaleziono jeszcze pięć genów o tej samej
charakterystyce kodowanych białek (strukturalnie odległe).
Analiza in situ RT-PCR wykazała obecność transkryptów sekwencji CsB10dhB2_150
jedynie w linii B10. W pąkach linii B10 wielkości 1 – 2 mm sygnał wykryto w płatkach
korony oraz okółku pylników, słaby sygnał w działkach kielicha. W pakach tej samej linii, ale
wielkości 3 – 5 mm sygnał wykryto jedynie w okółku pylników, W linii 2gg nie wykryto
transkryptów. Ekspresję sekwencji CsGy3dhGH_98 tą metodą zaobserwowano w płatkach
korony, okółku pylników oraz okółku słupka pąków linii Gy3 w stadium 3 – 5mm, słaby
sygnał wykryto również w działkach kielicha. W pąkach linii HGy3 w stadium 1 – 2 mm nie
wykryto sygnału.
Najciekawsza z punktu widzenia powyższych badań jest rola białek LLR
w determinacji płci. Powiązane są one z krytycznymi dla prawidłowego rozwoju kwiatów
procesami począwszy od przejścia stożka wzrostu ze stanu wegetatywnego w generatywny
(Suzaki, et al., 2004), przez kształtowanie się kwiatów (Gamboa, et al., 2001), po rozwój
poszczególnych elementów w kwiecie (Huang, et al., 2011).
Białka LRR zostały zidentyfikowane w procesach związanych z przejściem z fazy
wegetatywnej w generatywną u Arabidopsis gdzie gen FLOR1 kodujący białko z tej rodziny
był indukowany w bardzo młodych merystemach kwiatostanowych, ponadto mutant typu
flor1 cechował się opóźnionym kwitnieniem (Torti, et al., 2012), FLOR1 należy do roślino
specyficznych białek LRR (Acevedo, et al., 2004; Gamboa, et al., 2001). Jak większość tego
typu białek, które dotychczas zostały scharakteryzowane FLOR1 zlokalizowany jest
wewnątrz komórki w cytoplazmie i jądrze. FLOR1 pierwotnie został wyizolowany ze
względu na jego interakcję w kulturach in vitro oraz w kulturach drożdżowych z genem
AGAMOUS (AG), czynnikiem transkrypcyjnym typu MADS-box, zaangażowanym w rozwój
pylników oraz słupka. (Acevedo, et al., 2004). W badaniach nad mechanizmem kwitnienia
u Arabidopsis wykazano bardzo słabą ekspresję w merystemie wierzchołkowym w fazie
wegetatywnej za to bardzo wysoką nadekspresję w merystemach kwiatostanowych. Tak samo
jak w przypadku AG, FLOR1 może wchodzić w interakcję z innymi białkami MADS-box
eksprymowanych w merystemie kwiatostanowym podczas fazy przejścia. Nieznane są jednak
biochemiczne podstawy interakcji pomiędzy FLOR1 a MADS box (Torti, et al., 2012).
Innymi równie ważnymi w kształtowaniu kwiatów genami, są geny typu CLAVATA.
U mutanta typu clavata1 zarówno merystem, wegetatywny, kwiatostanowy i kwiatowy
ulegają powiększeniu względem typu dzikiego. Kombinacje podwójnych mutantów clavata1
wraz z agamous, apetala2, apetala 3 i pistillata wykazały, że CLAVATA1 leży u podstaw
regulacji struktury merystemu kwiatowego. Natomiast kombinacje podwójnych mutantów
clavata1 z apetala1 i leafy wykazały role CLAVATA1 w ustanowieniu tożsamości merystemu
kwiatowego (Clark, et al., 1993). Produkt genu CLAVATA1 został zidentyfikowany jako
białko typu LRR o aktywność kinazy, zawierające konserwatywną domenę charakterystyczną
dla kinaz serine/threonine (Clark, et al., 1997). Ponadto wykazano, rolę genu CLAVATA2
(CLV2) w regulacji zarówno rozwoju merystemu jak i organów u Arabidopsis. Wyizolowanie
genu CLV2 pozwoliło wykazać, że koduje on biało typu receptorowego (receptor like protein
RLP), zawierające domenę LRR o wysokim podobieństwie do tego typu białek
receptorowych u roślin i zwierząt, ale w odróżnieniu od nich posiada ono bardzo krótki ogon
łączący je z cytoplazmą. Gen CLV2 jest niezbędny do akumulacji produktów CLV1. Produkty
obu tych genów łącza się tworząc kompleks typu heterodimer biorący udział
w przekazywaniu pozakomórkowego sygnał (Jeong, et al., 1999). Do prawidłowego
funkcjonowania CLV1 niezbędny jest również gen typu CLV3. Prawdopodobnie CLV1
występuje w formie nieaktywnego heterodimeru, a funkcją CLV3 jest inicjowanie powstania
większego kompleksu, posiadającego zdolności do przekazywania sygnału za pomocą
GTPazy Rho (Trotochaud, et al., 1999).
Również u roślin jednoliściennych opisano gen kodujący białko należące do
nadrodziny LRR FLORAL ORGAN NUMBER1 (FON1) regulujący rozwój kwiatostanu.
Mutacja w obrębie tego genu, prowadzi do powiększenia się merystemów kwiatowych u O.
sativa (ryż), w efekcie czego dochodzi do wzrostu liczby wszystkich organów kwiatowych.
Nadliczbowe organy rozwija się we wszystkich okółkach jak również w dodatkowo
powstałych. Wewnętrzne organy kwiatowe są bardziej zmodyfikowane niż zewnętrzne a wiele
primordiów słupkowych rozwija się w sposób chaotyczny w centrum praktycznie dojrzałych
kwiatów. Pomimo dużych zmian w merystemach kwiatowych, merystemy wegetatywne
pozostają niezmienione. Gen FON1 został zidentyfikowany jako leucine-rich repeat receptorlike kinase o wysokim podobieństwie do CLAVATA1 (CLV1) z Arabidopsis, co sugeruje
ścieżkę sygnalną podobną do CLV również u jednoliściennych. W odróżnieniu jednak od
CLV ulegającego ekspresji w warstwie L3 merystemu, FON1 ulega ekspresji w cały
merystemie kwiatowym (Suzaki, et al., 2004).
Białka z grupy LRR biorą również udział w innych procesach związanych z rozwojem
kwiatów, a ich aktywność została zaobserwowano także w wykształconych już pąkach
kwiatowych, a nie tylko w merystemie kwiatowym. W badaniach nad morfogenezą
kwitnienia Antirrhinum majus wyizolowano, opisano strukturę i określono wzór ekspresji
genu FIL2 kodującego białko z grupy LRR i potencjalnie zaangażowanego w komunikację
między komórkową niezbędną do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania płatków korony,
pylników oraz słupka (Steinmayr, et al., 1994).
Również należący do nadrodziny LRR sam inhibitor poligalkturonazy, jest związany z
prawidłowym rozwojem kwiatów. Białka tego typu często są opisywane w kontekście ich roli,
jako elementu odpowiedzi roślin na atak patogena (Sicilia, et al., 2005)
Gen OsFOR1 (Oryza sativa floral organ regulator 1) koduje białko zawierające
domenę LRR posiada strukturę oraz liczbę powtórzeń regionów bogatych w leucyny
charakterystyczną dla białek typu PGIPs inhibitorów poligalakturonazy z innych gatunków.
Ponadto zrekombinowane biało OsFOR1 połączone białkiem wiążącym maltozę (MBP)
wykazuje aktywność PGIP przeciwko poligalakturonazie Aspergillus niger. Nie mniej jednak
sam OsFOR1 ulega wysokiej ekspresji w kalusie oraz niedojrzałych wiechach, a tylko
w nieznacznym stopniu w korzeniach siewek oraz dojrzałych łodygach. Antysensowna
ekspresja genu OsFOR1 prowadzi do wzrostu ilości organów w kwiecie, co sugeruje rolę tego
genu w formowaniu i kontroli rozwoju tych organów (Jang, et al., 2003).
Inhibitor poligalturonazy (PGIP) może ulegać również specyficznej ekspresji podczas
rozwoju pyłku, chociaż jego rola w tym procesie nie jest jeszcze poznana. Geny BcMF19
kodujący białko typu PGIP, ulega nadekspresji w pąkach płodnych kwiatach kapusty odmiany
Pak Choi (Barssica campestris L. spp . chinensis Makino), posiadającej genetyczną męską
sterylność typu AB (Bajh97-01A/B). Produkt genu BcMF19 posiada charakterystyczny dla
PGIP motyw, zawierający na końcu N peptyd sygnalny oraz kilka potencjalnych miejsc Nglikolizacji, a także dwa mostki siarczkowe flankujące N- i C- końce jak również dziesięć
powtórzeń sekwencji LRR (Huang, et al., 2011).
W kontekście obecnej wiedzy dotyczącej roli białek z rodziny LRR regulacji
morfogenezy kwiatów, uzyskane wyniki dla genów CsPIP i CsLr-1 stanowią bardzo dobrą
bazę do dalszych badań w celu wyjaśnienia tego procesu. Obydwie sekwencje choć posiadają
predykcję typu LRR nie są homologami.
W przypadku genu CsPIP, profil ekspresji uzyskany techniką in situ RT- PCR
koresponduje w z wynikami uzyskanymi dla genu BcMF19 pochodzącego z B. campestris i
również kodującego białko typu PGIP. Sugeruje to, iż genu CsPIP jest zaangażowany w
rozwój pylników w męskich kwiatach ogórka podobnie jak i gen BcMF19 u B. campestris,
choć oba geny są sekwencyjnie odległe.
Rola genu CsLR-1 pozostaje nadal otwarta. Sugerowane dalsze badania powinny
również objąć lokalizacje ekspresji tego genu w bardzo wczesnych merystemach kwiatowych
ze względu na bardzo ważną rolę genów typu CLAVATA należących do rodziny LRR w
kształtowaniu kwiatów we wczesnej morfogenezie.
Rola białek rybosomalnych w morfogenezie kwiatów
W badaniach nad białkami rybosomalnymi stwierdzono silniejszą ekspresję domeny
S4 rybosomu w kwiatach męskich. Wyniki badań ekspresji pomiędzy okółkami nie dają
jednak jasności w kwestii powiązania tego genu z rozwojem konkretnych organów
płciowych. Niemniej jednak, aktywność domeny S4 w powiązaniu z kwitnieniem oraz
podwyższona ekspresja w kwiatach męskich jest wcześniej niepublikowanym doniesieniem,
w związku z czym sugerowane jest powtórzenie badań z uwzględnieniem wcześniejszych
stadiów rozwojowych. Wyniki badań nad pozostałymi białkami rybosomalnymi, chociaż
wykazującymi bardzo ciekawe właściwości mogące mieć związek z wykształcaniem płci
kwiatów, nie umożliwiają wyciągnięcia jednoznacznych wniosków co do ich roli w kwiatach.
Białka UV zależne
Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235)
Białko genu CsUV131 wykazuje wysokie podobieństwo z białkami tworzącymi
klastry żelazo-siarkowe (klastry Fe-S). U roślin tego typu struktury spotykane są
w plastydach, mitochondriach cytozolu i jądrze. Struktury te są niezbędne w wielu procesach
fizjologicznych oraz tych związanych z rozwojem. Klastry Fe-S często są kofaktorami białek
pełniących funkcji niezbędne dla przebiegu witalnych dla roślin procesów, takich jak
respiracja, fotosynteza, asymilacji siarki i azotu, metabolizm aminokwasów, hormonów
roślinnych oraz syntezie koenzymów (Balk & Pilon, 2011). Białkowe klastry żelazowosiarkowe pełnią również różnorodne role biologiczne powiązania z transportem elektronów,
katalizą, regulacją ekspresji genów oraz wychwytywaniem jonów żelaza i tlenu (Ye, et al.,
2006). Ponadto pełnią one istotną rolę w fotosyntezie, w tylakoidach zdecydowana większość
jonów żelaza znajduje się w białkowych klastrach żelazowo-siarkowych uczestniczących w
fotosyntetycznym transporcie elektronów (Raven, et al., 1999).
W obrębie białka genu CsUV131 zidentyfikowano dwie konserwatywne domeny
powiązanie z metabolizmem żelaza i siarki: SufE oraz BolA. Podobną strukturę posiada
chloroplastowe białko CpSufE pochodzące z A. thaliana. Zawiera ono domenę SufE na Nkońcu oraz domenę BolA unikatową dla roślin wyższych na C-końcu. Białko to lokalizowane
jest w stromie chloroplastów. CpSufE ulega ekspresji we wszystkich ważniejszych tkankach,
przy czym podwyższonej ekspresji ulega w częściach zielonych a jego ekspresja jest zależna
od światła i regulowana na poziomi mRNA. Prawdopodobnie CpSufE wraz z białkiem
CpNifS tworzę desulfurazę cysteinową, niezbędną do syntezy klastrów żelazowo-siarkowych
w chloroplastach (Ye, et al., 2006).
genu CsUV131 oprócz podobieństwa domen kodowanego białka do białka CpSufE z
A. thaliana charakteryzuje się identycznym profilem ekspresji w liniach B10 i 2gg, co niżej
opisany gen CsA/Bcb-1 z identyfikowany jako kodujący białko w wiążące chlorofil a/b
w fotosytemach u R. communis.
Gen CsA/Bcb-1 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_453)
Sekwencja CsB10dhB2_453 została zidentyfikowana jako fragment genu kodującego
białko wiążące chlorofil a i b w kompleksach zbierających światło LHC. Składają się one z
chlorofilu a i b oraz białek je wiążących. Naczelną funkcja tego kompleksu jest
wychwytywania i dostarczanie energii do fotosytemów I i II. N-koniec białek wiążących
chlorofil a i b jest osadzony w stromie, gdzie wiąże się z błonami tylakoidów, tam na drodze
foto-regulacji
prowadzi
do
odwracalnej
fosforylacji
reszt
treoninowych.
Czego
przypuszczalnym efektem jest pośredniczenie w przekazywani energii wzbudzonej pomiędzy
fotosytmem I i II (Amunts, et al., 2007).
Obok naczelnej funkcji białek wiążących chlorofil a i b, obserwuje się również
zróżnicowaną ekspresje genów je kodujących w odniesieniu do procesów związanych
z kwitnieniem. Najciekawszym zagadnieniem z tego punktu widzenia jest powiązanie genów
typu Cab (chlorophyll a/b biding protein) z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura.
Ten typ cytoplazmatycznej sterylności jest jednym z lepiej opisanych u Raphanus sativus i
objawia się we wczesnym stadium mikrosporogenezy w wyniku przedwczesnej degeneracji
tapetum. Ponadto deficyt chlorofilu jak i męska sterylności są najczęstszymi przykładami
z funkcjonalnej niekompatybilności pomiędzy jądrem a cytoplazmą. Czasem występują one
jednocześnie jak na przykład, gdy cytoplazma typu Ogura została przeniesiona do Brassica,
męsko sterylne potomstwo przejawiał również deficyt chlorofilu. W tym kontekście
różnicowy gen Cab, choć nie może być traktowany jak gen restorer, nie można wykluczyć
jego roli w prawidłowym rozwoju mikrospor, jego wzór ekspresji jest również zgodny
z ekspresją domniemanego genu restora, Gen Cab ulega ekspresji w liściach oraz kwiatach
w tym w pylnikach, ale nie w korzeniach (Wu, et al., 2001).
Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235), oprócz kodowania regionu
podobnego do domen białka CpSufE z A. thaliana charakteryzuje się identycznym profilem
ekspresji co gen CsA/Bcb-1(sekwencje CsB10dhB2_453), kodujący białko wiążące chlorofil
a/b w fotosytemach u R. communi, która również różnicuje linie B10 i 2gg.
Na szczególną uwagę zasługuj fakt, że białka typu Cab (chlorophyll a/ binding protein)
powiązane są z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura, objawiającą się we
wczesnym stadium mikrosporogenezy przedwczesną degradacją pyłku. Pokrywa się to z
wynikami ekspresji uzyskanymi dla CsA/Bcb-1, wyższej w męskich kwiatach niż w kwiatach
typowo żeńskich, posiadających całkowicie zredukowane organy w trzecim okółku. W
świetle tych wyników można przypuszczać, iż produkt genu grupy Lhc (białka składowe
kompleksu zbierającego światło) jest niezbędny do prawidłowego rozwoju męskich organów
kwiatowych, przypuszczalnie biorąc udział w prawidłowym przebiegu mikrosporogenezy
oraz/lub prawidłowym rozwoju tapetum.
Geny regionu CsMS3_G – Gy
Analizę genów tego regionu obejmującego jeden contig (2720) wykonano ze względu
na ich bezpośrednie sąsiedztwo z markerem CsMS3_G (SCAR) sprzężonym bardzo blisko
z genem Gy/gy - recesywnej żeńskości roślin ogórka, (Wóycicki nieopublikowane), który
znajduje się w odległości 4 cM od genu F/f - dominującej żeńskości (Kubicki 1974). Marker
został zlokalizowany pomiędzy 3 a 4 genem na contigu 2720
Gen CsSKKL
Gen pierwszy na contigu 2720 koduje białko należące do grupy kinaz
serynowo/treoninowe typu 3 związanych z syntezą glikogenu nazywane powszechni również
kinazami typu shaggy (glycogen synthase kinase 3 (GSK3)/SHAGGY-like kinases (GSKs)).
Białka z tej rodziny występują powszechnie u roślin, zwierząt i drożdży. U Arabidopsis
zidentyfikowano dziesięć typów białek w obrębie tej rodziny. Najczęściej opisywane są one
w kontekście metabolizmu brasinosteroidów, ale również odnotowuje się ich aktywność
w procesach związanych z morfogeneza kwiatów jak i w odpowiedzi roślin na stres (Claisse,
et al., 2007; Charrier, et al., 2002; Yan, et al., 2009).
Dotychczas wykazano związek różnych roślinnych GSK 3 w regulacji przekazywania
sygnałów za pomocą brasinosteroidów (BR). Brasinosteroidy są roślinnymi hormonami
pochodnymi steroli i regulującymi ekspresje wielu genów. Powiązane są one ściśle
z procesami związanymi z wydłużaniem komórek, regulacją ich podziałów i różnicowania,
jak również w innych procesach rozwojowych roślin. Regulują one także wzrost łagiewki
pyłkowej, rozwój tkanek naczyniowych oraz fotomorfogenezę. Brasinosteroidy uważa się za
transbłonowe receptory kinaz inicjujące kaskadę sygnalną na drodze fosforylacji. Jednym
z inicjatorów kaskady jest BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2 (BIN2 znany jest również
jako ASKg, DWARF12 and UCU1) należący do rodziny białek GSK3/SHAGGY-like kinases
(Rozhon, et al., 2010; Yan, et al., 2009).
Białka z rodziny SHAGGY-like mają również bezpośredni wpływ na morfogenezę
kwiatów. Porównanie wykonane dla roślin dzikich Arabidopsis oraz z wprowadzoną
antysensowną sekwencją AtSK wykazały, że obniżona ekspresja genów AtSK11 i AtSK 12
powoduje zmiany w obrębie zalążni, słupka i znamienia. Zmiany w obrębie owocolistków
uwidaczniały się już we wczesnym stadium formowania kwiatów i prowadził do silnej
rearanżacji tego regionu w kwiecie (Dornelas, et al., 2000). Natomiast zmiany w genie
AtSK32 prowadziły do powstawania zredukowanych niektórych elementów kwiatów,
głównie szypułek, działek i płatków korony (Claisse, et al., 2007).
Gen CsSKKL jednak nie wykazywał istotnego podobieństwa do żadnego z
powyższych genów. Najbliższym podobnym genem z A. thaliana był gen AtSK42 (dane
nieprezentowane), brak jednak badań dotyczących udział tego typu białek z rodziny
SHAGGY – like w morfogenezie kwiatów. Dotychczas wykazano ich zmienną ekspresję pod
wypływem stresów osmotycznych (podwyższona ekspresja) i zmian w długości naświetlanie
(obniżona ekspresja) (Charrier, et al., 2002).
Gen CsJL
W obrębie tego genu drugiego znajdującego się na contigu 2720 nie zlokalizowano
żadnej z sekwencji różnicowych. Nie posiada on również strukturalnie homologicznego genu
w genomie ogórka. Najbliższe podobieństwo wykazywał on do genu kodująco josephin-like
protein-like z V. vinifera, dlatego nazwano go CsJL.
Gen CsDIV
Gen trzeci (poprzedzający marker SCAR) znajdujący się na contigu 2720 został
uznany za kodujący białko wiążące DNA podobne doMYB 51 DIVARICATA-like (C.sativus)
(DIV). Najwyższe podobieństwo gen ten wykazał z genem HIG1/MYB51 z A. thaliana, który
jest zaangażowany w biosyntezę indolowych glukozynolanów. Związki te są metabolitami
wtórnymi i pełnią rolę czynnika przeciwwirusowego w mechanizmach obronnych roślin.
Aktywność sekwencji promotorowej dla genu HIG1/MYB51 zaobserwowano w liściach
dojrzałej rozety liściowej. Ekspresję gen HIG/MYB51 zaobserwowano jeszcze w korzeniach,
pakach kwiatach w późnym stadium i łuszczynach. Podwyższona ekspresję tego genu
zaobserwowano również w przypadku zranienia rośliny, co może mieć związek z jego rolą w
biosyntezie indolowych glukozynolanów będących mechanizmem obrony przed infekcją
wirusami roślinnymi podczas zranienia (Berger, 2007).
Gen CsAAAT
Gen czwarty – CsAAAT (zlokalizowany za markerem SCAR) zidentyfikowany został
jako kodujący acyltransferazę antocyjanin 5-aromatyczną (Anthocyanin 5-aromatic
acyltransferase, putative - 5AT). W genomie ogórka zidentyfikowano sześć genów o
powyższej predykcji. 5AT została wyizolowana z płatków kwiatowych Gentiana triflora i
dość wszechstronnie opisana. Odpowiada ona za acylowanie kwasów hydroksycjanowych
zapewniając ich stabilność przez co intensyfikuje udział niebieskiego barwnika w organach u
G. triflora. Możliwy jest również udział tego związku w stabilizowaniu antocyjanów
biorących udział w wybarwianiu płatków korony u innych roślin (Fujiwara, et al., 1997).
Wstępne wyniki uzyskane dla genu CsSKKL nie sugerują jeg roli w samej
morfogenezie, jednak nie można jej wykluczyć ze względu na rolę brasinosteroidów w
regulacji syntezy etylenu oraz wrażliwości na światło. Dalsze badania powinny dotyczyć
struktur w fazie bardzo wczesnego kształtowania się kwiatów oraz w stożkach wzrostu.
Wyniki ekspresji pozostałych genów regionu na obecnym etapie badań są nieinterpretowalne
co do ich roli w rozwoju kwiatów
Geny kompleksu _CsMed21 (z otoczenia sekwencji Gy3dhGH_35.
Na podstawie wyników badań profilu ekspresji sekwencji CsGy3dhGH_35
(Przybecki, et al., 2003) oraz hipotez dotyczących silnej aktywności ekspresyjnej w
kwiatowych organach generatywnych zarówno o zahamowanym jak i o prawidłowym
rozwoju zdecydowano się na prześledzenie również ekspresji genów znajdujących się w
bezpośrednim sąsiedztwie genu CsMed21, na którym ją zlokalizowano.
Gen CsMed21
Ilość transkryptu Gy3dhGH_35 (BU791059) była zmienna w blisko izgenicznych
liniach występowaniem allelu dominującego genu M/m. Pierwotnie zidentyfikowano tą
sekwencję, jako kodującą hipotetyczne białko. Analiza in situ ekspresji dla tej sekwencji
wykazała jej specyficzność dla żeńskiego typu kwiatów. Sygnału natomiast nie obserwowano
w żadnym z regionów kwiatów obupłciowych linii HGy3. W przypadku kwiatów żeńskich
wyraźna była silna ekspresja w okolicach inhibowanych zawiązków pręcików (Przybecki, et
al., 2003).
Jak już wcześniej zaznaczono zarówno gen 2 na contigu 5106, jaki i sekwencja
CsGy3dhGH_35 wykazują silne podobieństwo genu kodującego podjednostkę 21 mediatora z
A. thaliana. Heterodimer składający się z podjednostek Med 7 i Med21 może pełnić rolę
zawiasu ulokowanego między połową mediatora a jego końcem (Marchler-Bauer, et al.,
2011). Mediatory to silnie konserwowany regulatory transkrypcji związane z polimeraza II,
ich występowania zostało potwierdzone zarówno u drożdży jak i ludzie na podstawie badań
struktury tych białek (Boube, et al., 2002). Obecnie przyjmuje się, że jest on modułowym,
dynamicznie adaptującym się kompleksem białkowym o zdolności do łączenia różnorodnych
gen specyficznych białek regulatorowych do podstawowego aparatu transkrypcji polimerazy
II, pełniąc funkcję sensora integracji oraz regulatora tego procesu (Lariviére, et al., 2012)
Badania nad mediatorami roślinnymi wykazały ich obecność oraz znaczącą rolę u
Arabidopsis. Mediatory roślinne wykazują jednak niska homologię to tego typ kompleksów u
innych gatunków. Badaniach tych zidentyfikowano dwa białka STRUWWELPETER (SWP) i
PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1 (PFT1), jako podjednostki mediatora
odpowiednio, Med14 i Med25. Wskazuje to istotną role mediatora w regulacji proliferacji
komórek oraz regulacji czasu kwietnie w odpowiedzi na intensywność światła. (Bäckström, et
al., 2007).
Uzyskane wyniki w analizie in situ wykonane dla genu CsMed21pokrywają się w
pąkach kwiatowych z linii Gy3 z uzyskanymi wcześniej wynikami dla sekwencji
CsGy3dhGH_35 (Przybecki, et al., 2003), jednak w przypadku linii HGy3 pozostają w
opozycji ze względu na obecność sygnału w pylnikach w pąkach kwiatowych w stadium 3 – 5
mm.
Przeprowadzono analiza ekspresji Real Time PCR wykazał, że startery projektowane
do genu 2 na contigu 5106 oraz startery użyte dla sekwencji CsGy3dhGH_35 dały bardzo
zbliżone wyniki (prawie identyczne pod względem tendencji). Wyniki te jednak podważają
specyficzność ekspresji sekwencji CsGy3dhGH_35 do linii Gy3. W linii HGy3 w pąkach
kwiatowych w stadium 1 – 2 mm zaobserwowano większą ekspresję niż w linii Gy3.
W pąkach kwiatowych 3 – 5 mm tendencja jest odwrotna. W obrębie linii Gy3 ekspresja jest
wyraźnie wyższa w pąkach 3 – 5 mm niż 1 – 2 mm podobną tendencję można zaobserwować
w linii HGy3. W przypadku obu linii ekspresja w pąkach kwiatowych w stadium 1 – 2 mm
jest niższa niż liściach.
Uzyskane wyniki mogą sugerować powiązanie genu CsMed21z trzecim okółkiem, ale
nie jest to reakcja specyficzna tylko dla kwiatów żeńskich jak wcześniej sugerowano.
Podobieństwo do podjednostki 21 mediatora A. thaliana, nie potwierdza związku tego genu
z kwitnieniem. Dlatego też istotna jest dokładniejsze charakterystyka tego genu.
Wyjaśnieniem różnic wyników obecnych i wcześniejszych może być zmienność
w zaawansowaniu rozwoju pąków tej samej wielkości. Obserwowano różny stopień
wykształcenia organów w różnych pąkach tej samej wielkości i tej samej linii.
Gen CsBp
Unikalny w genomie ogórka gen CsBp poprzedzający CsMed21 to bliżej
niescharakteryzowany gen podobny do genu kodującego białko wiążące białka pochodzącego
z R. communis zawierające powtórzony region tetratricopeptide (TPR), dlatego też nazwano
je CsBp.
Lokalizacji produktów dla genu 1 na contigu 5106 w pąkach kwiatowych za pomocą
techniki in situ RT-PCR wykazała brak ekspresji obu liniach Gy3 oraz HGy3 w dla obydwu
badanych stadiów wielkości pąków kwiatowych. Natomiast analizy ekspresji Real Time PCR
wykazują, zmienność ekspresji genu CsBp zarówno wewnątrz linii jak i między liniami.
Badania nad struktura i funkcji białkowych kompleksów związanych z białkami
posiadającymi domeną TPR, wykazały, że mutacja w obrębie motywu TPR u różnego rodzaju
tego typu białek nie tylko wywołują zmiany lub prowadzą do utraty specyficzności do
interakcji z innymi białkami, ale ma również mają poważne konsekwencja dla prawidłowego
funkcjonowania samej komórki (Gounalaki, et al., 2000).
Bardzo powszechny udział białek z domeną TPR oraz bark szczegółowej
charakterystyki gen CsBp, ja również uzyskane wyniki ekspresji nie pozwalają na
jednoznaczne powiązanie go z regulację kwitnienia, bądź w rozwoju kwiatów. Z drugiej
strony wyraźna zmienność wewnątrzliniowa jak i międzyliniowa w Real Time PCR (metoda o
wiele bardziej czuła niż in situ) może wskazywać na istnienie takiej roli. Ciekawym i wartym
dalszej analizy jest wątek powiązania białek z domeną TPR z czaparonami oraz w procesach
związanych ubikwitynizajcą, szczególnie z czynnikiem E3. Choć CsBp nie został powiązany
z żadną z sekwencji różnicujących linii ogórka o różnych typach płci, to wśród tych sekwencji
znajdują się białka należące do czaparonów oraz ubikwityny w tym ubikwityna E3 (Kosik,
2009).
Gen CsATnusB
Gen znajdującym się za genem CsMed21 jest gen prawdopodobnie kodujący białko
zawierające anty-terminującą domenę NusB (antitermination NusB domain-containing
protein), przez co nazwany CsATnusB. W obrębie tego genu nie zlokalizowano żadnej z
sekwencji różnicowych i jest on unikalny w genomie ogórka. Dokładniejsza identyfikacja
wykazała on, że gen ten jest podobny do genu beta-galaktozydazy Medicago truncatula
(MTR_2g094690) uznanej za element mediatora powiązanego z polimerazą II, więc może
być funkcjonalnie powiązany z genem CsMed21
Dla genu CsATnusB ze względu na brak jego pełnej sekwencji w genomowej bazie nie
przeanalizowano sekwencji 1000 nukleotydów poprzedzających gen.
Ze względu na strukturę genu CsATnusB (zależnie od programu annotującego
pokazywany jest jako jeden z podwójną funkcją, lub dwa oddzielne geny) zdecydowano się
przeprowadzić oddzielne analizy ekspresji dla ekzonów drugiego oraz czwartego.
Dotychczasowe badania nad antyterminatorem transkrypcji typu NusB dotyczyły jego
roli w E. coli gdzie reguluje biosyntezie rRNA na drodze antytermiancji transkrypcji
Carlomagno & Nappo, 2003). Brak jest publikacji na temat roli genu MTR_2g094690
pochodzącego z Medicago truncatula, jednak na podstawie danych z bazy danych UniProt
przyjmuje się, że jest on zaangażowany w proces regulacji transkrypcji z udziałem polimerazy
II, posiada on aktywność kofaktora transkrypcji i wchodzi w skład kompleksu mediatora
(Young, et al., 2011).
Brak dokładniejszych danych nie pozwala na precyzyjne powiązanie tego genu lub
genów z procesami związanymi z kwitnieniem. Nie mniej jednak bardzo prawdopodobne, że
białko kodowane przez nie, razem z MED21 oraz białkiem TPR stanowią element kompleksu
mediatora transkrypcji, a więc mogą być funkcjonalnie powiązane. Uzyskane wyniki
ekspresji sugerują również, że gen CsATnusB może składać się z dwóch genów gdyż
rozbieżne wyniki uzyskane dla obu końców tego genu na to wskazują, ale może to być
również alternatywny splicing możliwe, że oba wschodzą w składa mediatora. Brak szerszej
charakterystyki tego genu u roślin nie pozwala na weryfikacje tej hipotezy. Powyższe wyniki
uzyskane dla genów na contigu 5106 powinny być rozszerzone na conitigi okalające w
poszukiwaniu innych genów kandydatów mogących być podjednostkami mediatora.
Uzyskana ekspresja w kwiatach również po winna być prześledzona, ale pod kątem działania
całego kompleksu mediatora i udziału jego poszczególnych podjednostek w regulacji
procesów kwitnienia.
Podsumowanie i Wnioski
Ewaluacja genów referencyjnych użytych do analizy zmian ekspresji
Uzyskane wyniki wskazują, że choć geny w dużych, złożonych strukturach, jak pąki
kwiatowe, liście, korzenie lub stożki wzrostu, wykazują stabilną ekspresję, to w elementach
składowych tych organów może być ona zróżnicowana. Przypuszcza się, że jest to związane z
izolacją samego RNA. Ponadto, mogą tam występować bardzo silne procesy, czasem stojące
w opozycji do siebie, np. w trzecim i czwartym okółku (promowanie jednych organów i
hamowanie w rozwoju drugich). Może to owocować niskim udziałem produktów genów
konstytutywnych.
Rola białek z grupy LBP w rozwoju kwiatów męskich ogórka
Gen CsLBP-1 ulega zwiększonej ekspresji w obecności dominującego allelu genu
Gy/gy (linia B10, z wyjątkiem liści). U homozygoty recesywnej (linia 2gg) ekspresji nie
zaobserwowano. Gen ten koduje białko należące do rodziny LTP a powyższe badania
ekspresji korespondują z rolą jaką przypisuje się białkom z tej rodziny w rozwoju pylników.
Wyniki naszych badań sugerują silny z wiązek genu CsLBP-1 z rozwojem kwiatów męskich.
Dokładny mechanizm regulacji powyższego genu typu LTP-like pozostaje jednak nieznany.
Sugerowany mechanizm może być związany z regulatorami transkrypcji typu MYB12,
zaangażowanymi w flawono-specyficzną regulację biosyntezy fenylopropanoidów, których
ekspresja, bazując na wiedzy z innych prac, wydaje się być skorelowana również z rozwojem
kwiatów.
CsMT2 - Metallothionein typ II (CsGy3dhGH_250)
Na tym etapie określenie dokładnej roli jaką pełni gen CsMT (zidentyfikowany jako
gen kodujący metalohioninę typu 2) w rozwoju kwiatów nie jest możliwa. Konieczne jest
również potwierdzenie ekspresji tego genu w męskich typach kwiatów ogórka w okresie od
komórek macierzystych pyłku do mejozy.
CsFLAP Fasciclin-like arabinogalactan family protein (CsB10dhB2_113)
Badania przeprowadzone dla Arabidopsis wykazały rolę białek z rodziny
arabinogalactanów w rozwoju pyłku. Ponadto, wykazano korelację tej rodziny białek z
rodziną białek LPB. Tłumaczy to silny związek ekspresji genu CsFLAP z kwiatami męskimi i
hermafrodytycznymi (wyniki Real Time PCR). Wyniki te wskazują również na koekspresję
tego genu z genem CsLBP-1. Potwierdzenie tego wymaga jednak dalszych badań.
Gen CsC56 -proteazy C56, (CsB10cdB2_34)
Produkt białkowy genu CsC56 jest proteazą cysteinową posiadającą domenę tupu PfpI
z cysteiną w miejscu aktywnym. Sekwencja ta jest silnie związana z kwiatami posiadającymi
pylniki. Wyniki reakcji in situ RT-PCR sugerują ekspresję w pylnikach osiągającą najwyższą
wartość w późnym stadium rozwojowym. Może to sugerować udział tego genu w procesie
degradacji tapetum w rozwijających się pylnikach kwiatów ogórka.
Gen CsQM - QM – like protein (CsGy3cdGH_33)
W regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM zlokalizowano unikalny region
regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element), będący elementem odpowiedzi
na gibereliny wzmagające męskość. Obecność tego motywu, wraz z informacjami
dotyczącymi giberelin u ogórka oraz zachowaniem się genu QM u Camelia sinensis mogą
tłumaczyć obecność sygnału dla ogórkowego CsQM w liniach o kwiatach zawierających
pylniki (głównie w samych pylnikach). Otwarta kwestią pozostaje jednak ekspresja w linii
Gy3 wykazana przez reakcje Real Time PCR oraz in situ RT-PCR w całym pąku z wyjątkiem
okwiatu.
Gen CsAP-1 - Antyport Ca2+ (CsGy3dhGH_93)
Wyniki ekspresji genu CsAP-1 korespondują wynikami badań nad ogórkową
wapniowo zależną nukleazą (CsCaN), silnie powiązaną z regulacją rozwoju kwiatów
żeńskich. Obydwa geny są etylenowo zależne. W regionie poprzedzającym gen CsAP-1
zlokalizowano unikalne elementy regulatorowe odpowiedzi etylenowej ERE (ethyleneresponsive elemnt). Powyższe wyniki sugerują, że gen CsAP-1 regulowany jest przez etylen i
dostarcza jonów wapniowych dla wapniowo-zależnej nukleazy, odpowiedzialnej za rozwój
kwiatów żeńskich u roślin ogórka posiadających dominujący allel genu M.
CsRCOM_0621420-1
Uzyskane wyniki badań nad ekspresją genu CsRCOM_0621420-1 o predykcji do
regulatora transkrypcji typu NC2, oraz obecna wiedza na temat procesów, w jakich ten
mechanizm regulacji jest zaangażowany, nie pozwala na postawienie jednoznacznej hipotezy
na temat roli jaką pełni NC2 w morfogenezie kwiatów ogórka. Jednak pozytywne wyniki w
reakcji in situ RT-PCR oraz reakcji Real Time PCR dla trzeciego i czwartego okółka, choć
różnicują w niewielkim stopniu, stanowią mocną podstawę do gruntownych badań nad rolą
tego mechanizmu w procesach kształtowania różnych form kwiatu.
CsPIP-1 i CsLR-1
W przypadku genu CsPIP-1 o predykcji do białka typu PGIP, profil ekspresji
uzyskany techniką in situ RT- PCR koresponduje z wynikami uzyskanymi dla genu BcMF19
pochodzącego od Barssica campestris, scharakteryzowanego również jako kodujący białko
typu PGIP. Sugeruje to, iż CsPIP-1 zaangażowany jest w rozwój pylników w męskich
kwiatach ogórka, podobnie jak BcMF19 u Barssica campestris, choć oba te geny są
sekwencyjnie odległe.
Rola genu drugiego CsLR-1, w obrębie, którego zlokalizowano sekwencję
CsGy3dhGH_98, pozostaje nadal otwarta. Sugerowane dalsze badania powinny objąć
lokalizację ekspresji tego genu w bardzo wczesnych merystemach kwiatowych, ze względu
na bardzo ważną rolę genów typu CLAVATA z rodziny LRR w kształtowaniu kwiatów we
wczesnej morfogenezie.
Rola białek rybosomalnych w morfogenezie kwiatów
W badaniach nad białkami rybosomalnymi stwierdzono silniejszą ekspresję domeny S4
rybosomu w kwiatach męskich. Wyniki badań ekspresji pomiędzy okółkami nie dają jednak
jasności w kwestii powiązania tego genu z rozwojem konkretnych organów płciowych.
Niemniej jednak, aktywność domeny S4 w powiązaniu z kwitnieniem oraz podwyższona
ekspresja w kwiatach męskich jest wcześniej niepublikowanym doniesieniem, w związku z
czym sugerowane jest powtórzenie badań z uwzględnieniem wcześniejszych stadiów
rozwojowych.
Wyniki badań nad pozostałymi białkami rybosomalnymi, chociaż wykazującymi
bardzo ciekawe właściwości mogące mieć związek z wykształcaniem płci kwiatów, nie
umożliwiają wyciągnięcia jednoznacznych wniosków co do ich roli w kwiatach.
Rola białek UV zależnych
Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235), oprócz kodowania regionu
podobnego do domen białka CpSufE z Arabidopsis thaliana charakteryzuje się identycznym
profilem ekspresji co gen CsA/Bcb-1(sekwencje CsB10dhB2_453), kodujący białko wiążące
chlorofil a/b w fotosytemach u Ricinus communi, która również różnicuje linie B10 i 2gg.
Na szczególną uwagę zasługuj fakt, że białka typu Cab (chlorophyll a/ binding protein)
powiązane są z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura, objawiającą się we
wczesnym stadium mikrosporogenezy przedwczesną degradacją pyłku. Pokrywa się to z
wynikami ekspresji uzyskanymi dla CsA/Bcb-1, wyższej w męskich kwiatach niż w kwiatach
typowo żeńskich, posiadających całkowicie zredukowane organy w trzecim okółku. W
świetle tych wyników można przypuszczać, iż produkt genu grupy Lhc (białka składowe
kompleksu zbierającego światło) jest niezbędny do prawidłowego rozwoju męskich organów
kwiatowych, przypuszczalnie biorąc udział w prawidłowym przebiegu mikrosporogenezy
oraz/lub prawidłowym rozwoju tapetum
Geny regionu CsMS3_G
Wstępne wyniki uzyskane dla genu CsSKKL nie sugerują jeg roli w samej
morfogenezie, jednak nie można jej wykluczyć ze względu na rolę brasinosteroidów w
regulacji syntezy etylenu oraz wrażliwości na światło. Dalsze badania powinny dotyczyć
struktur w fazie bardzo wczesnego kształtowania się kwiatów oraz w stożkach wzrostu.
Wyniki ekspresji pozostałych genów regionu na obecnym etapie badań są nieinterpretowalne
co do ich roli w rozwoju kwiatów.
Geny znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie sekwencji różnicowej Gy3dhGH_35 o
ekspresji różnicując kwiaty żeńskie do hermafrodytycznych
Uzyskane wyniki mogą sugerować powiązanie genu 2 z contigu 5106 z trzecim
okółkiem, ale nie jest to reakcja specyficzna dla kwiatów żeńskich, jak wcześniej
sugerowano. Podobieństwo do podjednostki 21 mediatora Arabidopsis thaliana nie
potwierdza związku tego genu z kwitnieniem, dlatego też istotna jest jego dokładniejsza
charakterystyka.
W przypadku podjednostki 21 (MED21) uważa się, że jest ona kluczowym elementem
w aktywacji mechanizmów obronnych roślin na atak patogenów grzybowych.
W przypadku genu CsBp, prawdopodobnie kodującego białko domeną TPR, powszechność
występowania tego typu białek, jak również uzyskane wyniki ekspresji nie pozwalają na
jednoznaczne powiązanie go z regulacją kwitnienia bądź z rozwojem kwiatów. Ciekawym i
wartym dalszej analizy jest wątek powiązania białek z domeną TPR z czaperonami w
procesach związanych z ubikwitynizajcą, szczególnie z czynnikiem E3. Choć sam gen CsBp
nie został powiązany z żadną z sekwencji różnicujących linie ogórka o różnych typach płci, to
wśród tych sekwencji znajdują się białka należące do czaperonów oraz ubikwityny, w tym
ubikwityna E3.
Brak dokładniejszych danych nie pozwala na precyzyjne powiązanie tego genu (lub
genów) z procesami związanymi z kwitnieniem. Niemniej jednak, bardzo prawdopodobne
jest, że razem z MED21 oraz białkiem TPR stanowią one element kompleksu mediatora
transkrypcji.
W przypadku genu CsATnusB, uzyskane wyniki ekspresji sugerują, że składa się on z
dwóch genów, ze względu rozbieżne wyniki obserwowane dla obu końców tego genu.
Możliwe, że oba wchodzą w składa mediatora, a transkrypty ulegają alternatywnemu
splicingowi. Powyższe wyniki uzyskane dla genów na contigu 5106 powinny być rozszerzone
na conitgi go okalające, celem znalezienia innych genów kandydatów mogących być
podjednostkami mediatora. Uzyskana ekspresja w kwiatach powinna być również
prześledzona, ale pod kątem działania całego kompleksu mediatora i udziału jego
poszczególnych podjednostek w regulacji procesów kwitnienia.
Spis literatury:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
Acevedo, F. et al., 2004. FLOR1, a putative interaction partner of the floral homeotic protein
AGAMOUS, is a plant-specific intracellular LRR. Plant Science, Tom 167, pp. 225-231.
Acosta-García, G. & Vielle-Calzada, J.-P., 2004. A Classical Arabinogalactan Protein Is Essential
for the Initiation of Female Gametogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell, Tom 16, pp. 26142628.
Amunts, A., Drory, O. & Nelson, N., 2007. The structure of a plant photosystem I supercomplex at
3.4A resolution. Nature, Tom 447, pp. 58-63.
Atal, C., 1959. Sex reversal in hemp by application of gibberellin. Current Science, 28(10), pp.
408-409.
Bäckström, S. et al., 2007. Purification of a Plant Mediator from Arabidopsis thaliana Identifies
PFT1 as the Med25 Subunit. Molecular Cell , Tom 26, pp. 717-729.
Balk, J. & Pilon, M., 2011. Ancient and essential: the assembly of iron–sulfur clusters in plants.
Trends in Plant Science, 16(4), pp. 218-226.
Berger, B., 2007. The role of HIG1/MYB51 in the regulation of indolic glucosinolate biosynthesis,
Inaugural-Dissertation.
Blatch, G. & Lässle, M., 1999. The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating proteinprotein interactions. BioEssays, Tom 21, pp. 932-939.
Boube, M., Joulia, L., Cribbs, D. & Bourbon, H.-M., 2002. Evidence for a Mediator of RNA
Polymerase II Transcriptional Regulation Conserved from Yeast to Man. The Cell, Tom 110, pp.
143-151.
Brunner, A., Yakovlev, I. & Strauss, S., 2004. Validating internal controls for quantitative plant
gene expression studies. BMC Plant Biology, Tom 4, p. 14.
Brunner, A., Yakovlev, I. & Strauss, S., 2004. Validating internal controls for quantitative plant
gene expression studies. BMC Plant Biology, Tom 4, p. 14.
Bucovac, M. & Wittwer, S., 1961. Gibberellin modification of flower sex expression in Cucumis
sativus L. Advances in Chemistry, 28(Gibberellins), pp. 80-88.
Carlomagno, M. & Nappo, A., 2003. NusA modulates intragenic termination by different
pathways. Gene , Tom 308, pp. 115-128.
Charbonnel-Campaa, L., Lauga, B. & Combes, D., 2000. Isolation of a type 2 metallothionein-like
gene preferentially expressed in the tapetum in Zea mays. Gene, Tom 254, pp. 199-208.
Charrier, B., Champion, A., Henry, Y. & Kreis, M., 2002. Expression Profiling of the Whole
Arabidopsis Shaggy- Like Kinase Multigene Family by Real-Time Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction. Plant Physiology , Tom 130, pp. 577-590.
Chen, C., Wanduragala, S., DF, B. & MD, D., 2006. Tomato QM-like protein protects
Saccharomyces cerevisiae cells against oxidative stress by regulating intracellular proline levels.
Applied and Environmental Microbiology, 72(6), pp. 4001-4006.
Cheng, N.-H.et al., 2005. Functional Association of Arabidopsis CAX1 and CAX3 Is Required for
Normal Growth and Ion Homeostasis. Plant Physiology, Tom 138, p. 2048–2060 .
Claisse, G., Charrier, B. & Kreis, M., 2007. The Arabidopsis thaliana GSK3/Shaggy like kinase
AtSK3-2 modulates floral cell expansion. Plant Molecular Biology, Tom 64, p. 113–124.
Clark, S., Running, M. & Meyerowitz, E., 1993. CLAVATA1, a regulator of meristem and flower
development in Arabidopsis. Development , Tom 119, pp. 397-418.
Clark, S., Williams, R. & Elliot, M. M. E., 1997. The CLAVATA1 Gene Encodes a Putative
Receptor Kinase That Controls Shoot and Floral Meristem Size in Arabidopsis. Cell, Tom 89, pp.
575-585.
Coimbra, S. & Pereira, L., 2012. Arabinogalactan Proteins in Arabidopsis thaliana Pollen
Development. Transgenic Plants - Advances and Limitations, Tom 16, pp. 329-352.
Coimbra, S. et al., 2009. Pollen grain development is compromised in Arabidopsis agp6 agp11 null
mutants. Journal of Experimental Botany, Tom 60, pp. 3133-3142.
Coimbra, S. et al., 2010. Early germination of Arabidopsis pollen in a double null mutant for the
arabinogalactan protein genes AGP6 and AGP11. Sexual Plant Reproduction, Tom 23, pp. 199205.
Coupe, S., Taylor, J. & Roberts, J., 1995. Charcterization of an mRNA encoding a metallothioneinlike protein that accumulates during ethylene-promoted abscissin of Sambucus nigra L. leaflets.
Planta, Tom 197, pp. 442-447.
Czechowski, T. et al., 2005. Genome-Wide Identification and Testing of Superior Reference Genes
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
for Transcript Normalization in Arabidopsis. Plant Physiology, Tom 139, pp. 5-17.
Dahiya, P., Findlay, K., Roberts, K. & McCann, M., 2006. A fasciclindomain containing gene,
ZeFLA11, is expressed exclusively in xylem elements that have reticulate wall thickenings in the
stem vascular system of Zinnia elegans cv Envy. Planta , Tom 223, pp. 1281-1291.
Deal, R., Topp, C., McKinney, E. & Meaghera, R., 2007. Repression of Flowering in Arabidopsis
Requires Activation of FLOWERING LOCUS C Expression by the Histone Variant H2A.Z. The
Plant Cell, Tom 19, p. 74–83.
Dornelas, M., VanLammeren, A. & Kreis, M., 2000. Arabidopsis thaliana SHAGGY-related
protein kinases (AtSK11 and 12) function in parianth and gynoecium development. The Plant
Journal , 21(5), pp. 419-429.
Dowdy, S. et al., 1991. The isolation and characterization of a novel cDNA demonstrating an
altered mRNA level in nontumorigenic Wilms’ microcell hybrid cells. Nucleic Acids Research,
Tom 19, pp. 5763-57-69.
Emery, L., Whelan, S. K. D., Hirschi, K. & Pittman, J., 2012. Protein phylogenetic analysis of
Ca2+/cation antiporters and insights into their evolution in plants. Frontiers in Plant Science, 3(1),
pp. 1-19.
Ferreyra, M. et al., 2010. Plant L10 Ribosomal Proteins Have Different Roles during Development
and Translation under Ultraviolet-B Stress. Plant Physiology, Tom 153, pp. 1878-1894.
Fujiwara, H. et al., 1997. Anthocyanin 5-aromatic acyltransferase from Gentiana triflora.
Purification, characterization and its role in anthocyanin biosynthesis. European Journal of
Biochemistry, Tom 249, pp. 45-51.
Furuyama, T. & Dzelzkalns, V., 1999. A novel calcium-binding protein is expressed in Brassica
pistils and anthers late in flower development. Plant Molecular Biology, Tom 39, p. 729–737.
Galun, E., 1959. Effects of gibberellic acide and naphtalene acetic acide on sex expression and
some morphological charakters in the cucumber plant. Phyton (Arg), Tom 12, pp. 1-8.
Gamboa, A. et al., 2001. Floral Transcription Factor AGAMOUS Interacts in Vitro with a LeucineRich Repeat and an Acid Phosphatase Protein Complex. Biochemical and Biophysical Research
Communications , Tom 288, pp. 1018-1026.
Gangloff, Y.-G.et al., 2001. The histone fold is a key structural motif of transcription factor TFIID.
TRENDS in Biochemical Sciences , 26(4), pp. 250-257.
Garcia-Lorenzo, M., 2007. The Role of Proteases in Plant Development. brak miejsca:Umea
University.
Gounalaki, N., Tzamarias, D. & Vlassi, M., 2000. Identication of residues in the TPR domain of
Ssn6 responsible for interaction with the Tup1 protein. FEBS Letters , Tom 473, pp. 37-41.
Huang, L. Liu Y., Yu X., Xiang X., Cao J., 2011. A polygalacturonase inhibitory protein gene
(BcMF19) expressed during pollen development in Chinese cabbage-pak-choi. Molecular Biology
Reports, Tom 38, pp. 545-552.
Jang, S. et al., 2003. The OsFOR1 gene encodes a polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) that
regulates floral organ number in rice. Plant Molecular Biology , Tom 53, p. 357–369.
Jeong, S., Trotochaud, A. & Clark, S., 1999. The Arabidopsis CLAVATA2 Gene Encodes a
Receptor-like Protein Required for the Stability of the CLAVATA1 Receptor-like Kinase. The
Plant Cell, Tom 11, p. 1925–1933.
Kerk, N. et al., 2003. Laser Capture Microdissection of Cell from Plant Tissues. Plant Physiology,
132(1), pp. 27-35.
Kim, B.-R.et al., 2003. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping
genes in rice. Biotechnology Letters, Tom 25, pp. 1869-1872.
Kosik, K., 2009. Characteristic of cDNA sequences placed in bacterial vectors in relation with sex
determination in cucumber. Warszawa: Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie .
Kubicki, B., 1974. New sex types in cucumber and their uses in breeding work. Warszawa , XIXth
International Horticultural Congress.
Kudla, J., Batistič, O. & Hashimoto, K., 2010. Calcium Signals: The Lead Currency of Plant
Information Processing. The Plant Cell, Tom 22, p. 541–563.
Kuriyama, H. & Fukuda, H., 2002. Developmental programmed cell death in plants. Current
Opinion in Plant Biology, Tom 5, pp. 568-573.
Lariviére, L., Seizl, M. & Cramer, P., 2012. A structural perspective on Mediator function. Current
Opinion in Cell Biology , Tom 24, pp. 305-313.
Li, Z. et al., 2012. A putative positive feedback regulation mechanism in CsACS2 expression
suggests a modified model for sex determination in cucumber (Cucumis sativus L.). Journal of
Experimental Botany, 63(12), pp. 4475-4484.
Li, Z. et al., 2012. A putative positive feedback regulation mechanism in CsACS2 expression
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
suggests a modified model for sex determination in cucumber (Cucumis sativus L.). Journal of
Experimental Botany, 63(12), pp. 4475-4484.
Liu, S. et al., 2008. Genetic association of ETHYLENE-INSENSITIVE3-like sequence with the
sex-determining M locus in cucumber (Cucumis sativus L.). Theoretical and Applied Genetics,
Tom 117, pp. 927-933.
Low, E.-T.et al., 2008. Oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) tissue culture ESTs: Identifying genes
associated with callogenesis and embryogenesis. BMC Plant Biology , Tom 8, p. 62.
Marchler-Bauer, A. et al., 2011. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation
of proteins.. Nucleic Acids Research, 39(D),
McCormick, S., 1993. Male gametophyte development. The Plant Cell , Tom 5, pp. 1265-1257.
Migocka, M. & Papierniak, A., 2010. Identification of suitable reference genes for sutdying gene
expression in cucumber plants subjected to abiotic stress and growth regulators. Molecular
Breeding, 28(3), pp. 343-357.
Murphy, D., 2001. The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and
microorganisms. Progress in Lipid Research, Tom 40, pp. 325-438.
Park, S.-Y.et al., 2000. A lipid transfer-like protein is necessaryfor lily pollen tube adhesion to an
in vitro stylar matrix. The Plant Cell, Tom 12, p. 151–164.
Persson, S. et al., 2005. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression
analysis of public microarray data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
Tom 102, pp. 8633-8638.
Przybecki, Z. et al., 2003. The isolation of cDNA clones from cucumber (Cucumis sativus L.)
floral buds coming from plants differing in sex. Cellular & Molecular Biology Letters, Tom 8, p.
421–438.
Raven, J., Evans, M. & Korb, R., 1999. The role of trace metals in photosynthetic electron
transport in O2-evolving organisms. Photosynthesis Research , Tom 60, pp. 111-149.
Rozhon, W. et al., 2010. ASKh, a group-III Arabidopsis GSK3, functions in the brassinosteroid
signalling pathway. The Plant Journal, Tom 215-223, p. 62.
Seifert, G. & Roberts, K., 2007. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant
Biology, Tom 58, pp. 137-161.
Sicilia, F. et al., 2005. The Polygalacturonase-Inhibiting Protein PGIP2 of Phaseolus vulgaris Has
Evolved a Mixed Mode of Inhibition of Endopolygalacturonase PG1 of Botrytis cinerea. Plant
Physiology, Tom 139, pp. 1380-1388.
Singh, K., Paul, A., Kumar, S. & Ahuja, P., 2009. Cloning and differential expression of QM like
protein homologue from tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]. Molecular Biology Reports, Tom
36, p. 921–927.
Steinmayr, M. et al., 1994. FIL2, an extracellular Leucine-Rich Repeat protein, is specifically
expressed in Antirrhinum flowers. Plant Journal , 5(4), pp. 459-467.
Suzaki, T. et al., 2004. The gene FLORAL ORGAN NUMBER1 regulates floral meristem size in
rice and encodes a leucine-rich repeat receptor kinase orthologous to Arabidopsis CLAVATA1.
Development , 131(22), pp. 5649 - 5657.
Torti, S. et al., 2012. Analysis of the Arabidopsis Shoot Meristem Transcriptome during Floral
Transition Identifies Distinct Regulatory Patterns and a Leucine-Rich Repeat Protein That
Promotes Flowering. The Plant Cell, Tom 24, pp. 444-462.
Trebitsh, T., Staub, J. & O‘Neill, S., 1997. Identification of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylic
acid synthase gene linked to the Female (F) locus that enhances female sex expression in
cucumber. Plant Physiology, Tom 113, p. 987–995.
Trotochaud, A. et al., 1999. The CLAVATA1 Receptor-like Kinase Requires CLAVATA3 for Its
Assembly into a Signaling Complex That Includes KAPP and a Rho-Related Protein. The Plant
Cell, Tom 11, pp. 393-405.
Wan, H. et al., 2010. Selection of appropriate reference genes for gene expression studies by
quantitative real-time polymerase chain reaction in cucumber. Analytical Biochemistry, Tom 399,
pp. 257-261.
Warren, A., 2002. Eukaryotic transcription factors. Current Opinion in Structural Biology, Tom 12,
p. 107–114.
Witkowicz, J. et al., nieopublikowane. Analysis of ESTs, differentially regulated during flower sex
determination in different cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines.
Wóycicki, R. et al., 2011. The Genome Sequence of the North-European Cucumber (Cucumis
sativus L.) Unravels Evolutionary Adaptation Mechanisms in Plants. PloS ONE, 6(7), p. e22728.
Wu, Y., Tulsieram, L. & Rothstein, S., 2001. Identification and characterization of a putative lightharvesting chlorophyll a/b-binding protein gene encoded at a fertility restorer locus for the Ogura
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
CMS in Brassica napus L. Theoretical and Applied Genetics, Tom 102, p. 759–766.
Xu, Q. & Zhang, L., 2009. Plant caspase-like proteases in plant programmed cell death. Plant
Signaling & Behavior , 4(9), pp. 902-904.
Yan, Z. et al., 2009. BIN2 Functions Redundantly with Other Arabidopsis GSK3-Like Kinases to
Regulate Brassinosteroid Signaling. Plant Physiology , Tom 150, pp. 710-721.
Ye, H. et al., 2006. CpSufE Activates the Cysteine Desulfurase CpNifS for Chloroplastic Fe-S
Cluster Formation. The Journal of Biological Chemistry , 281(13), p. 8958–8969.
Young, N. et al., 2011. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial
symbioses. Nature , Tom 480, pp. 520-524.
Zhang, D. et al., 2010. OsC6, Encoding a Lipid Transfer Protein, Is Required for Postmeiotic
Anther Development In Rice. Plant Physiology , Tom 154, pp. 149-162.
Zhang, D. et al., 2010. OsC6, encoding a lipid transfer protein, is required for postmeiotic anther
development in rice. Plant Physiology , Tom 154, pp. 149-162.
Zhanga, D.-S.et al., 2008. Tapetum Degeneration Retardation is Critical for Aliphatic Metabolism
and Gene Regulation during Rice Pollen Developmen. Molecular Plant, 1(4), pp. 599-610.
Zhou, Z. et al., 2012. BnMs3 is required for tapetal differentiation and degradation, microspore
separation, and pollen-wall biosynthesis in Brassica napus. Journal of Experimental Botany, 63(5),
pp. 2041-2058.
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

66+6+6+

2 Cards basiek49

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

Create flashcards