Analiza funkcjonalna sekwencji różnicujących linie ogórka
advertisement
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu Mgr inż. Cezary Paweł Kowalczuk Analiza funkcjonalna sekwencji różnicujących linie ogórka (Cucumis sativus L.) o odmiennych typach płci Autoreferat pracy doktorskiej Praca wykonana pod kierunkiem Prof. Dr hab. Zbigniewa Przybeckiego Katedra Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin Recenzenci: Prof. dr hab. Jan Szopa-Skórkowski Zakład Biochemii Genetycznej Wydział biotechnologii Uniwersytet Wrocławski Dr hab. Grzegorz Bartoszewski Katedra Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin Wydział Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu SGGW w Warszawie Warszawa, 2014 Wstęp i cel pracy. Szybki postęp w biologii molekularnej pozwala na upowszechnienie precyzyjnych metod badawczych pozwalających na dokładną lokalizację i pomiar ekspresji genów w wybranym regionie badanych organów. Upowszechnienie sekwencjonowania, a co za tym idzie wykorzystanie analiz in silico wykonujących globalne analizy podobieństwa oraz modelowania struktur sekwencji nukleotydów pozwoliło na stworzenie wielowymiarowej mapy ekspresji genów regulujących rozwój organizmów. Prezentowana praca jest elementem szerszego projektu mającego na celu poznanie mechanizmów zaangażowanych w kształtowanie się płci kwiatów u roślin okrytozalążkowych. Jako obiekt badawczy wybrano roślinę ogórka (Cucumis stativu), ze względu na jej wysokie zróżnicowanie w obrębie typów płci w ramach jednego gatunku. W badaniach posłużono się klasycznymi metodami analiz ekspresji (in vitro), w powiązaniu ze znajomością sekwencji genomu (in silico). Bazuje ona również na dotychczasowych osiągnięciach Katedry Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin w tym wyselekcjonowanych sekwencjach ekspresyjnych i genomowych różnicujących linie ogórka, a także stworzonych ich profilach ekspresyjnych uzyskanych metodą makromacierzy oraz Real Time PCR. W identyfikacji powiazań pomiędzy genami wsparto się również danymi uzyskanymi dzięki sekwencjonowaniu genomu ogórka. Celem pracy była lokalizacja ekspresji wybranych sekwencji w organach kwiatowych we wstępnym stadium rozwoju ( 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm) oraz określenie jej siły w okółkach trzecim i czwartym. Uzyskane wyniki oraz wyniki z poprzednich badań skonfrontowano z literaturą w celu weryfikacji zaangażowania danej sekwencji w procesy inicjacji lub kontroli rozwoju organów generatywnych kwiatu. Kolejnym elementem pracy było powiązanie dotychczasowych wyników w celu stworzenia szerszego obrazu kaskad zależności pomiędzy poszczególnymi genami. Obraz ten miałby w przyszłości pozwolić na wytypowanie genu Gy/gy. Materiały i Metody Pochodzenie i charakterystyka badanych linii NIL ogórka (Cucumis sativus L). Materiał do badań stanowiły liście i pąki kwiatowe w stadium wielkości 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm, jak również grupy komórek z regionów trzeciego (s) i czwartego (c) okółka wyżej wymienionych pąków kwiatowych, pochodzących z dwóch par linii izogenicznych (NIL) ogórka (Cucumis sativus L.), różniących się pod względem płci. Linie pochodzą z kolekcji Katedry Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin. Pierwsze para linii NIL: B10 (genotyp: ff/MM/GyGy), jednopienna, sublinia odmiany Borszczagowski; 2gg (genotyp: ff/MM/gygy) recesywnie żeńska, (Kubicki, 1974) Druga para linii NIL: Gy3 (genotyp: FF/MM/GyGy) - dominująca żeńska,; HGy3 (genotyp: FF/mm/GyGy) hermafrodytyczna, Pochodzenie i charakterystyka testowanych sekwencji Sekwencje wykorzystane w poniższych badaniach pochodzą z kolekcji sekwencji różnicowych uzyskanych w ramach wcześniejszych prac nad poznaniem mechanizmów determinacji płci u ogórka (C. sativus) prowadzonych w Katedrze Genetyki Hodowli i Biotechnologii Roślin Analiza podobieństw Lokalizacji sekwencji różnicowych w genomie dokonano wykorzystując bazy danych ze strony Polish Consortium of Cucumber Genome Sequencing (PCCGS) (http://csgenome.sggw.pl/). Numeracja contigów oraz scafoldów zgodna jest z numeracją przyjętą w bazie danych. Do lokalizacji sekwencji w genach ogórka posłużono się programem BioEdit oraz utworzoną lokalną bazą genów z w/w strony, przy spodziewanej wartości E 1,0 oraz macierzy BLOSUM62. Program BioEdit posłużył również to wykonania analiz porównawczych grup sekwencji za pomocą algorytmu typu ClustalW (European Bioinformatics Institute EMBL-EBI) (http://www.ebi.ac.uk/). Dzięki uprzejmości PCCGS możliwe było uzyskanie danych dotyczących predykcji białkowych genów ogórkowych. Identyfikację sekwencji różnicujących wykonano z użyciem baz danych dostępnych na stronie NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) i algorytmów: Blastn, Blastx, Tbalastx. Baza danych genomu ogórka była również źródłem sekwencji promotorowych (tkz. 1000_up stream). Analizy strukturalnej tych sekwencji dokonano algorytmem Plant CARE: (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/). Laser capture microdissection W celu scharakteryzowania ekspresji w trzecim oraz czwartym okółku pąków wielkości 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm, materiał ten w został pobrany techniką laser capture microdissection (LCM) w Instytucie Onkologii im. Marii Skłodowskiej – Curie w Warszawie, z wykorzystaniem urządzenia typu PALM MicroBeam (Zeiss). Mikrodysekcja przeprowadzona była w trybie Auto LPC przy energii lasera ~80%, skupieniu wiązki ~67%, i powiększeniu 20x (Kerk, et al., 2003). Reakcja RT- PCR Do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji wraz z amplifikacją użyto zestaw zawierający rTth DNA Polymerase, GeneAmp® EZ rTth RNA PCR Kit oraz rTth DNA Polymerase and EZ Buffer Pack (Applied Biosystems). Temeratury topnienienia starterów obejmowały przedział 58°C – 62°C i zostały zaprojektowane za pomocą programu Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) oraz Primer Express® (Primer Express® software v2.0 from Applied Biosystems). Reakcja in situ RT – PCR Analizy in situ RT-PCR wykonano wg Urbańczyk-Wochniak (2000). Roztwory sporządzono na podstawie „Molecular cloning. A laboratory manual” (Sambrook & Russell, 2001). Do reakcji zastosowano polimerazę typu rTth (rTth DNA Polymerase) (Applied Biosystems). Reakcję przeprowadzano na preparatach otoczonych ramką Frame-Seal Incubation Chambers (BioRad) o pojemności 65μl. Analiza QRT-PCR Do oceny ilościowej transkryptów użyto urządzenia 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Ilości amplifikatu mierzono przy pomocy systemu SYBER Green (SYBER Green PCR Master Mix – Applied Biosytems). Wyniki analizowano za pomocą oprogramowania REST 2009 (http://rest-2009.gene-quantification.info/) , Wyniki i Dyskusja Ewaluacja genów referencyjnych użytych do analizy zmian ekspresji Celem tej części pracy było wytypowanie i ocena stabilności ekspresji genów referencyjnych w regionie trzeciego i czwartego okółka kwiatowego kwiatów. Wybrano potencjalne geny referencyjne cyclophilin [GenBank: AY942800]; elongation factor 1-alpha [GenBank: EF446145]; alpha tubulin [GenBank: AJ715498] i ubiquitin extension protein [GenBank: AY372537]. Wymienione geny zostały zlokalizowane w genomie ogórka odmiany Borszczagowski (Linia B10) (Wóycicki, et al., 2011). Wybrane geny referencyjne są powszechnie używanymi genami typu housekeeping i są dobrze scharakteryzowane dla różnych gatunków roślin i zwierząt. Wszystkie dotychczasowe badania potwierdzały ich stabilność oraz zasadność stosowania jako geny referencyjne. Do przeprowadzenia testu stabilności ekspresji kandydatów genów referencyjnych posłużyła linia hermafrodytyczna HGy3. Pozytywne wyniki uzyskano jedynie w przypadku genu alpha tubulin. Punkt Ct został przekroczony przy wartości 39,47 a produkt reakcji denaturował w temperaturze 76o C. Startery dla transkryptów genów elongation faktor alpha oraz cyclophilin nie dawały żadnego produktu. Powodem tego mogła być zbyt niskie stężenie cDNA użytego do reakcji, wynikające z technicznych ograniczeń izolacji niezwykle małych ilości RNA z prób LCM (Kerk, et al., 2003; Zhang, et al., 2010). Powodem dla którego w przypadku genu alpha tubulin udało się uzyskać produkt przy tak niskim stężeniu cDNA może być silne powiązanie tego genu z rozwojem kwiatów (McCormick, 1993). Ze względu na brak możliwości wykonania analizy porównawczej względem na brak innych genów referencyjnych, konieczne było znalezienie miarodajnej metody oceny stabilności genu alpha tubulin w trzecim i czwarty okółku kwiatów ogórka. W tym celu wybrano jednoczynnikową analizę ANOVA oraz wyznaczono krzywą regresji bazując na wartościach Ct we wszystkich badanych typach prób. Analiza statystyczna użyta do oceny stabilności bazuje na metodzie jaką zastosowano u topoli Populus spp gdzie dla alpha tubulin uzyskano indeksie stabilności wartości 0,54) (Brunner, et al., 2004). Stosując ten algorytm do oceny stabilności ekspresji genu alpha tubulin w prezentowanych badaniach otrzymano indeksy: 0,00 dla 3 i 4 okółka, oraz 0,35 dla pąków i liści. Wszystkie te geny są genami konserwatywnymi u ogórka i charakteryzują się wysoką stabilnością ekspresji w dużych strukturach, takich jak całe liście, całe pąki kwiatowe oraz stożki wzrostu. Uzyskane wyniki wskazują, że w analizowanych oddzielnie małych elementach takich struktur, np. zawiązki pręcików lub słupków uzyskuje się odmienne wyniki (co przeczyłoby jednak ich konstutywności). Początkowo zakładano, że nie wystąpią żadne różnice w ekspresji pomiędzy całymi pąkami kwiatowymi a ich okółkami – trzecim i czwartym. Jednak doświadczenie kontrolne wykonane dla tych okółków w linii hermafrodytycznej wykazało, że jedynie gen alpha tubuliny ulegał ekspresji w tych organach na poziomie umożliwiającym użycie go w szczegółowych badaniach ekspresji genów powiązanych z kwitnieniem. Gen ten również cechował się wyjątkowo dobrym indeksem stabilności, wyrażonym iloczynem współczynnika zmienności oraz wartości nachylenia linii regresji bliskim 0,00. Uzyskane wyniki wskazują, że choć geny w dużych, złożonych strukturach, wykazują stabilną ekspresję, to w elementach składowych tych organów może być ona zróżnicowana. Przypuszcza się, że jest to związane z izolacją samego RNA. Ponadto, mogą tam występować bardzo silne procesy, czasem stojące w opozycji do siebie, np. w trzecim i czwartym okółku (promowanie jednych organów i hamowanie w rozwoju drugich). Może to owocować niskim udziałem produktów genów konstytutywnych. Rola białek z grupy LBP w rozwoju kwiatów męskich ogórka Bazując na wynikach badań dla sekwencji CsB10dhB2_70 i 342 udało się wytypować gen będący ściśle powiązany z dominującym allelem genu Gy/gy. Był to gen CsLBP-1. Pierwotnie gen ten był reprezentowany przez grupę ekspresyjnych sekwencji różnicujących transkryptomy pąków kwiatowych jednopiennej linii B10 oraz recesywnie żeńskiej linii NIL 2gg, ustalono, że dziewięć z tych sekwencji pochodzi z genu CsLBP-1. Wyniki reakcji in situ RT-PCR potwierdziły specyficzność ekspresji tych sekwencji dla linii B10 oraz brak transkryptów dla linii 2gg. Lokalizacja produktów transkrypcji genu CsLBP-1 wykazała ich obecność w płatkach korony, okółkach pylników słupka 1 – 2 mm oraz 3 – 5 mm pąków linii B10. W 1 – 2 mm pąkach sygnał był wyraźnie silniejszy niż w stadium 3 – 5 mm. W 1 – 2 mm pąkach linii B10 niemożliwa była identyfikacja sygnału w obrębie okółka 4 w przypadku sekwencji CsB10dhB2_70, jednakże w przypadku sekwencji CsB10dhB2_342 (obydwie sekwencje pochodzą z genu CsLBP-1) sygnał w tym okółku był wyraźny. W linii 2gg sygnał był niewykrywalny. Analiza Real Time PCR dla trzeciego i czwartego okółka potwierdziła wcześniejsze obserwacje. Najwyższy poziom ekspresji wystąpił w regionie rozwijających się pylników (kwiaty męskie) linii B10 w pąkach wielkości 3 – 5 mm, a najniższy poziom w zahamowanych w rozwoju pylnikach linii 2gg w pąkach tej samej wielkości. Zidentyfikowany gen CsLBP-1 prawdopodobnie koduje wielofunkcyjne białko roślinne wiążące lipidy o podwójnej funkcji inhibitora proteaz oraz transferu lipidów, należące do nadrodziny AAI_LTSS (AAI_LTSS: Alpha-Amylase Inhibitors (AAI), Lipid Transfer (LT) and Seed Storage (SS) Protein family). Jest to nadrodzina białek specyficzna dla roślin wyższych. Białka z tej rodziny pełnią ważną rolę w wewnątrzkomórkowym transporcie miedzy błonami, przy magazynowaniu składników odżywczych oraz ochronie roślin przed patogenami i insektami (Marchler-Bauer, et al., 2011). W prezentowanych badaniach wykazano specyficzną ekspresję genu kodującego białko typu LTP w trzecim okółku męskich kwiatów jednopiennej linii ogórka, z dominującym allelami genu Gy/gy. Sugeruje to jego rolę w regulacji rozwoju pylników. Teza ta znajduje potwierdzenie zarówno w badaniach nad białkami z tej rodziny jak i tych skupiających się na poznaniu mechanizmów rozwoju kwiatów. Okres rozwoju męskiego gametofitu od tetrad do zwakuolizowanej mikrospory uważany jest za wysoce aktywny (Mandaron, et al., 1990). Białka transportujące białka, są kluczowymi elementami formowania się mikrospor. Ponadto białka typu LTP konieczne w tych procesach wykrywane są podczas formowania się pylników we wczesnym okresie rozwoju mikrospor przy komórkach tapetum (Park, et al., 2000; Zhang, et al., 2010). Sugerowaną rolą LTP w tym miejscu jest transport kutyn oraz wosków z tapetum i deponowanie ich w ścianie komórkowej mikrospory. Badania nad genem Wax-deficient anther1 z ryżu (O.sativa) (Jung, et al., 2006) wykazały, że w stadium młodych mikrospor w normalnych pylnikach orbikule otoczone są cienką warstwę lipidów. W lokulach pojawiają się w tym czasie również cytoplazmatyczne ciałka lipidowe. Uszkodzenie tego genu zaburza prawidłowy rozwój ziaren pyłku. W późniejszym rozwoju tapetum pojawia się inny rodzaj ciałek lipidowych, określony mianem tapetosomów. Komponentem lipidowym tapetosomu jest w większości TAG (trigliceryd), jak również powiązana z nimi i heterogenicznie dopasowana populacja białek, zawierających domeny typu oleosin-like na końcu N. Tapetosom jest uwalniany z komórek tapetum w ich letalnym stadium, gdy aktywowany jest mechanizm programowanej śmierci komórek oraz ich liza (Murphy, 2001). Przykładem genu typu LTP wykazującego ekspresję tapetum specyficzną jest gen OsC6 pochodzący z O. sativa. Sugeruje się jego rolę w postmejotycznym rozwoju pylników poprzez wiązanie kwasów tłuszczowych oraz regulację formowania się struktur lipidowych, orbikulos (np. ciałek Ubischa), oraz warstwy egzyny na powierzchni ziaren pyłku. W liniach z defektem tego genu zaobserwowano słabą koncentrację komórek tapetum i zwakuolizowanych ziaren pyłku, co ostatecznie prowadzi do aborcji ziaren pyłku (Zhang, et al., 2010). Gen OsC6 jest regulowany poprzez czynniki transkrypcyjne Tapetum Degeneration Retardation (TDR) oraz GAMYB powiązane z E-Box (CANNTG) (Zhang, et al., 2010). Gen TDR ulega silnej ekspresji w tapetum od stadium mejozy to stadium młodych mikrospor. Rośliny o genotypie tdr/tdr wyglądają normalnie w stadium wegetatywnym oraz podczas kwitnienia, jednak nie produkują żywotnego pyłku. Prowadzi to do całkowitej męskiej sterylności. U mutantów tdr powstaje wrażenie nadmiernie rozrośniętego tapetum bez oznak degradacji, co w późniejszym stadium powoduje zapadnięcie się ścian mikrospor. Mechanizm regulacji rozwoju i degradacji tapetum przez TDR jest silnie powiązany z mechanizmem programowanej śmierci komórki (PCD), komórek tapetum podczas rozwoju pyłku (Zhang, et al., 2010). Kolejne badania również sugerują iż transport lipidów oraz ich metabolizm odgrywają znaczącą rolę podczas rozwoju pylników, a brak funkcjonalnego elementu TDR powoduje zmiany w ekspresji 236 genów (154 ulega wzmożonej ekspresji, a przypadku 82 obserwowano jej spadek), co wskazuje, iż TDR jest nadrzędnym regulatorem PCD w komórkach tapetum oraz innych podstawowych procesów powiązanych z dojrzewaniem pyłku (Zhanga, et al., 2008). W tym samym okresie rozwojowym pylników uwalniane są plastydowe oraz elaiplastydowe ciałka lipidowe wraz z białkami z nimi powiązanymi. Są one następnie przenoszone do najbardziej skrajnej warstwy ziaren pyłku, okrywy pyłku, odgrywającej ważną rolę podczas zapylenia, począwszy od możliwości przyczepienia się do wektorów (owadów zapylających) po rehydrataję pyłku (Murphy, 2001). Badania nad białkiem typu LTP (lipid transfer-like protein) z pyłku lilii wykazały tą aktywność dokładanie jako adhezję pomiędzy receptorem w ścianie/kanale membranowym pyłku a zewnątrzkomórkową macierzą pylników (Park, et al., 2000). Analiza sekwencji promotorowych genów typu LBP u ogórka, wykazała, iż unikalnym czynnikiem regulatorowym dla genu CsLBP-1 (pierwszy na configu 2263) jest regulator transkrypcji MBSI – MYB powiązany z regulacją biosyntezy flawonoidów. W genomie ogórka zidentyfikowano dwa takie geny. Pierwszy to gen piąty na contigu 2558 (CsMYB12) o wysokim podobieństwie do czynnika transkrypcyjnego MYB12 z A. thalina zawianego z flawono specyficzną regulacją biosyntezy fenylopropanoidów. Drugi to gen pierwszy na configu 9568 (CsMYBR2R3) podobny do czynnika transkrypcji R2R3 – MYB z winorośli VvMYBF1 związanego z regulacją syntezy flawonów w rozwijających się winogronach. Promotorowa analiza porównawcza powyższych genów w genomie ogórka wykazała, że dla genu CsMYB12 unikalnymi elementami regulatorowymi są ATCC-motif – cześć konserwowanej domeny DNA zaangażowanej w odpowiedz na sygnał świetlny, CTAG – motif – czynnik o dotychczas niepoznanej funkcji oraz rbcS-CMA7a - składowa elementu odpowiedzialnego za odpowiedź na sygnał świetlny. Dla genu CsMYBR2R3 unikalnym elementem był MBSI – MYB posiadający miejsce wiązania czynników regulacji genów powiązanych z biosyntezą flawonoidów. Gen CsLBP-1 ulega zwiększonej ekspresji w obecności dominującego allelu genu Gy/gy (linia B10, z wyjątkiem liści). U homozygoty recesywnej (linia 2gg) ekspresji nie zaobserwowano. Gen ten koduje białko należące do rodziny LTP a powyższe badania ekspresji korespondują z rolą jaką przypisuje się białkom z tej rodziny w rozwoju pylników. Wyniki naszych badań sugerują silny z wiązek genu CsLBP-1 z rozwojem kwiatów męskich. Dokładny mechanizm regulacji powyższego genu typu LTP-like pozostaje jednak nieznany. Sugerowany mechanizm może być związany z regulatorami transkrypcji typu MYB12, zaangażowanymi w flawono-specyficzną regulację biosyntezy fenylopropanoidów, których ekspresja może być skorelowana również z rozwojem kwiatów. Metallothionein typ II (CsGy3dhGH_250) Sekwencja CsGy3dhGH_250 stanowi fragment kodujący genu CsMT2 - metallothionein typ II, która w różnym stopniu jest eksprymowana w liniach Gy3 i HGy3. Metalotioniny stanowią rodzinę małych (500 – 14000 Da) białek zlokalizowanych w aparatach Golgiego. Charakteryzują się one dużo liczbą cystein w łańcuchu oraz zdolnością do wiązania metali, zarówno fizjologicznych (cynk, miedź, selen) jak i ksenobityków (kadm, rtęć, srebro, arsen) (Marchler-Bauer, et al., 2011). Przeprowadzone reakcje in situ RT-PCR w celu lokalizacji ekspresji w pąkach nie dostarczyły danych rozstrzygających dotyczących profilu ekspresyjnego. Metoda in situ RTPCR przeprowadzona w ramach prezentowanej pracy, może być niewystarczająco czuła, żeby wykryć niewielkie ilości transkryptu. Metalotionin w procesach kwitnienia powiązane są z etylenem (Coupe, et al., 1995) Dlatego zmiaeszczana jest w modelach regulacji płci z udziałem etylenu u ogórka. Gen F u ogórka kodujący sytnazę ACC pełni istotną role w biosyntezie etylenu (Trebitsh, et al., 1997). Natomiast gen M powiązany jest z genem kodującym białko typu ETHYLENEINSENSITIVE3-like (Liu, et al., 2008), a według ostatnich badań sam gen M koduje CsACS2 (również synatazy ACC) (Li, et al., 2012). Ta funkcja jednak nie w pełni koresponduje z silniejszą ekspresją w liniach ogórka wytwarzających w kwiatach organy męskie. U kukurydzy metalthionina występowała w tapetum, we wczesnym stadium rozwojowym kwiatów. Ekspresja genu kodującego metalothioninę obserwowana była również w stadium komórek macierzystych pyłku, a najwyższy jej poziom występował w trakcie mejozy (Charbonnel-Campaa, et al., 2000). Wyniki tych badań mogą tłumaczyć braku sygnału w reakcji in – situ RT-PCR w pąkach w stadium 3 – 5 mm gdzie ziarna pyłku są już wyraźnie wykształcone. Spadek poziomu metalothiony widać również z badaniach Real Time przeprowadzonych na całych pąkach. Na tym etapie określenie dokładnej roli, jaką pełni metalohionia typu 2 w rozwoju kwiatów jest ryzykowne. Konieczne jest potwierdzenie ekspresji tego genu w męskich typach kwiatów ogórka w okresie od komórek macierzystych pyłku do mejozy. Fasciclin-like arabinogalactan family protein (CsB10dhB2_113) Białka z grupy fasciclino podobnych arabinogalactanów (Fasciclin-like arabinogalactan family protein) nie maja jeszcze zdefiniowanej funkcji molekularnej i nie wiadomo, w jakich procesach biorą udział (Marchler-Bauer et al., 2011). Techniką in situ RT-PCR nie wykryto obecności produktów ekspresji genu CsFLA. Profil ekspresyjny do dyskusji bazuje na wynikach uzyskanych dla tego genu w ramach wcześniejszych badań, gdzie wykazano korelacje ekspresji w obecności męskich organów w kwiatach (Witkowicz, nieopublikowane) Białka typu fasciclin zaliczane są do rodziny arabinogalactanów, białek powszechnie występujących u Eucariota. Ze względu na tak powszechne ich występowanie trudno jednoznacznie nakreślić ich rolę. Przyjmuje się, że u roślin są one komponentem ścian komórkowych, biorącym udział w adhezji komórek, rozwoju organów oraz reakcji na stres (Seifert & Roberts, 2007). Biorą one również udział w tworzeniu wtórnych ścian komórkowych (Dahiya, et al., 2006). Białka typu FLAs są lokalizowane w różnych częściach roślin, ale najbardziej charakterystyczne miejsca to stożek wzrostu łodygi oraz korzenie, a także okolice aparatów szparkowych, włosków, oraz korzeni bocznych. Aktywność tej grupy białek została również opisana w kontekście rozwoju kwiatów, a w szczególności prawidłowego rozwoju gametofitu żeńskiego i męskiego (Acosta-García & Vielle-Calzada, 2004; Coimbra & Pereira, 2012). W przypadku badanie ekspresji genu CsFLAP zaobserwowano silną korelację z kwiatami zwierającym męskie organy płciowe. Jak już wcześniej wspomniano białka typu FLAs maga brać udział w rozwoju gametofitu męskiego, co zostało potwierdzone u wielu gatunków. Zaobserwowano, że niepłodność roślin z mutacją agp6 i agp11 była wynikiem przerwanie rozwoju ziaren pyłku (Coimbra, et al., 2009). Dalsza charakterystyka pylników oraz pyłku roślin agp6 i agp11 wykazała, że oba geny AGPs: AGP6 i AGP11, są niezbędne dla prawidłowego wzrostu łagiewki pyłkowej, a także do zapobieganiu przedwczesnemu kiełkowaniu ziaren pyłku (Coimbra, et al., 2010). Kolejnym ważnym elementem jest również ich zdolność do transportu lipidów (nsLTP-like AGPs) (Ma & Zhao, 2010) co koresponduje z wynikami ekspresji sekwencji CsB10dhB2_70/342 powiązanej z genem o predykcji z rodziny białka transportującego lipidy LTP. Badania przeprowadzone dla Arabidopsis wykazały rolę białek z rodziny arabinogalactanów w rozwoju pyłku. Ponadto, wykazano korelację tej rodziny białek z rodziną białek LPB. Tłumaczy to silny związek ekspresji genu CsFLAP z kwiatami męskimi i hermafrodytycznymi (wyniki Real Time PCR). Wyniki te wskazują również na koekspresję tego genu z genem CsLBP-1. Potwierdzenie tego wymaga jednak dalszych badań Gen CsC56 -proteazy C56, (CsB10cdB2_34) . Sekwencja CsB10cdB2_34 podobnie jak 8 innych z biblioteki sekwencji różnicowych jest fragmentem unikalnego genu CsC56 (gen 1 na contigu 798 na chromosomie 1) kodującego białko podobne do proteazy C56 (protease C56) z R. communis. Proteaza typu C56 należy do rodziny PfpI pochodzącej z Pyrococcus furiosus. Jest to wewnątrz komórkowa proteaza niezależna od ATP, posiada ona aktywność hydrolityczną a jej sugerowana funkcja to degradacja małych peptydów. Enzym GSP 18 pochodzący z Bacillus subitilis należący do tej rodziny, ulegał ekspresji pod wpływem różnych form stresu. Charakterystyczną domeną dla białek podobnych do PfpI z P. furiosus jest 1 glutamine amidotransferase. Sugeruje się, że produkty degradacji małych peptydów, są substancjami odżywczymi dla komórek (Marchler-Bauer, et al., 2011). Metodą in situ RT-PCR stwierdzono obecność transkryptu genu CsC56 w linii B10 pąkach 1 – 2 mm (w płatkach korony oraz pylnikach). W przypadku linii 2gg można domniemywać obecności sygnału w pąkach wielkości 1 – 2 mm jedynie w płatkach korony. Proteazy jako enzymy degradujące peptydy odgrywają kluczową rolę w programowanej śmierci komórek wywołanej starzeniem i czynnikami stresogennymi (Garcia-Lorenzo, 2007). PCD jest również kluczowym elementem regulacji rozwoju organów, a jego rola w kształtowaniu płci kwiatów została szeroko opisana, często w kontekście hamowania rozwoju organów generatywnych (Kuriyama & Fukuda, 2002). PCD odgrywa też kluczową rolę w rozwoju pylników oraz pyłku, gdzie prowadzi do degradacji tapetum i uwolnienia ziaren pyłku (Zhanga, et al., 2008; Xu & Zhang, 2009). Ponadto w procesie rozwoju i degradacji tapetum u Brassica napus biorą udział proteazy cysteinowe (Zhou, et al., 2012). Produkt białkowy genu CsC56 jest proteazą cysteinową posiadającą domenę tupu PfpI z cysteiną w miejscu aktywnym. Sekwencja ta jest silnie związana z kwiatami posiadającymi pylniki. Wyniki reakcji in situ RT-PCR sugerują ekspresję w pylnikach osiągającą najwyższą wartość w późnym stadium rozwojowym. Może to sugerować udział tego genu w procesie degradacji tapetum w rozwijających się pylnikach kwiatów ogórka. Gen CsQM - QM – like protein (CsGy3cdGH_33) Gen CsQM (gen 2 na contigu 699) koduje białka QM – like. W genomie ogórka znaleziono jeszcze dwa niehomologiczne geny o tej samej predykcji. Rodzina białek typu QM została zidentyfikowana jako supresory guza Wilmsa. Gen QM koduje rybosomalne białko L10, które jest powiązane z podjednostką 60S i jest kluczowym elementem łączącym podjednostki 40S oraz 60S tworząc funkcjonalną podjednostkę 80S. Coraz większa ilość dowodów sugeruje, iż poza udziałem w biosyntezie białek, białka typy QM mogą posiadać również wiele poza rybosomalnych funkcji. Wysoko konserwatywna sekwencja QM wskazuje na ich fundamentalną i niezbędną funkcję dla wszystkich gatunków. Jednak ich rola fizjologiczna nie została dotychczas poznana (Singh, et al., 2009). Analiza in situ RT-PCR wykazała ekspresję genu CsQM w płatkach korony, okółku pylników oraz okółku słupka G35. W linii HGy3 ekspresję wykryto w płatkach korony oraz okółku słupka w linii HGy 3 pąkach 3 – 5 mm. Analiza Real Time PCR ekspresji wykazała jej obecność w regionie słupka linie Gy3 pąków wielkości 3 – 5 mm, oraz pylnikach linie HGy3 w pąkach 3 – 5 mm. Przy czym ekspresja w słupkach linii Gy3 była wyższa niż pylnikach linii HGy3 w tych stadiach. Dotychczasowa wiedza na temat roli genów QM jest bardzo skąpa. Początkowo ograniczała się ona jedynie do supresji guza Wilmsa (Dowdy, et al., 1991). Kolejne prace wykazały, iż białka tego typu są obecne również u roślin (Ferreyra, et al., 2010; Low, et al., 2008). Przypuszcza się, że geny typu QM mogą być również zaangażowane w rozwój organów roślinnych, szczególnie w ich wczesnym stadium. Może na to wskazywać ich obecność w kulturach tkankowych (Elaeis guineensis Jacq.) (Low, et al., 2008), jak również badania dotyczące regulacji białek L10 u kukurydzy i Arabidopsis (Ferreyra, et al., 2010) oraz nad rolą genów QM w starzeniu się liści herbaty (Camelia sinensis) (Singh, et al., 2009). W badaniach nad regulacją genów typu QM u herbaty (C. sinensis) zaobserwowano, że w okresie wzrostu liści ekspresja jest wysoka (najwyższa w stożkach wzrostu) a jej poziom maleje wraz z dojrzewaniem liści. W okresie dojrzałym ekspresja genu CsQM ulegała wyraźnej represji we wszystkich typach badanych liści. Transkrypcja genu CsQM uległa również wyraźnej represji w odpowiedzi na susze oraz kwas abscysynowy. Natomiast pod wpływem giberelin ulegał nadekspresji. Zarówno wysoka ekspresja w stożkach wzrostu w fazie silnych podziałów jak i wrażliwość na gibereliny co sugerują rolę genu CsQM we wzroście i rozwoju roślin (Singh, et al., 2009). Powyższe badania dotyczące C. sinensis są niezmiernie pomocne w interpretacji wyników uzyskanych dla ogórkowego genu CsQM. Kluczowym elementem jest fakt wrażliwości roślinnych genów QM na gibereliny będące fitohormonem nasilającym męskość u niektórych roślin (Atal, 1959) w tym u ogórka (Galun, 1959; Bucovac & Wittwer, 1961). Ponadto w regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM, zlokalizowano unikalny region regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element) będący elementem odpowiedzi na gibereliny. Obecność tego motywu wraz z informacjami dotyczącymi giberelin u ogórka oraz zachowaniem się gnu CsQM u C. sinensis, mogą tłumaczyć obecność sygnału dla ogórkowego CsQM w (makromacierz) w liniach o kwiatach zawierających pylniki (Witkowicz, nieopublikowane). W regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM zlokalizowano unikalny region regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element), będący elementem odpowiedzi na gibereliny wzmagające męskość. Obecność tego motywu, wraz z informacjami dotyczącymi giberelin u ogórka oraz zachowaniem się genu QM u Camelia sinensis mogą tłumaczyć obecność sygnału dla ogórkowego CsQM w liniach o kwiatach zawierających pylniki (głównie w samych pylnikach). Otwarta kwestią pozostaje jednak ekspresja w linii Gy3 wykazana przez reakcje Real Time PCR oraz in situ RT-PCR w całym pąku z wyjątkiem okwiatu. Gen CsAP-1 - Antyport Ca2+ (CsGy3dhGH_93) Gen CsAP-1 (drugi na contigu 935 na chromosomie 2 w odległości 68,065 cM) koduje białko antyport Ca2+/ wymienniki kationowe. W genomie ogórka zlokalizowano jeszcze 2 tego typu, nie są jednak strukturalnie homologiczne. Metodą in situ RT-PCR stwierdzono obecność transkryptu genu CsAP-1 w płatkach korony, okółku pylników oraz okółku słupka pąka linie Gy3 wielkości 3 – 5 mm. W linii HGy3 sygnał był bardzo słaby w płatkach korony, okółku pylników i słupka w obu stadiach wielkości. W pąkach linii HGy3 3 – 5 mm słaby sygnał był w działkach kielicha; natomiast w pąkach wielkości 1 – 2 mm nie wykryto sygnału w tej części pąka Ilościowa ocena ekspresji trzeciego i czwartego okółka linii Gy3 możliwa była w pąkach 3 – 5 mm, przy czym nie było różnic między okółkami. W przypadku linii HGy3 ekspresja możliwa do oceny była w regionie pylników 3 – 5 mm pąków i była niższa od ekspresji w regionie słupka i pylników linii Gy3 w tej samej wielkości pąkach. Białka typu antyportów wapniowych występują bardzo powszechnie i są zaangażowane w liczne procesy. Z tego względu precyzyjne określenie roli CsAP-1 w rozwoju kwiatów jest problematyczne. Pomocą w interpretacji funkcji, jaką może pełnić CsAP-1 są badania nad rolą jonów wapniowych w regulacji morfogenezy kwiatów (Kudla, et al., 2010). Jony wapniowe są zaangażowane również we wzrost łagiewki pyłkowej. U Arabidopsis zidentyfikowano trzy geny (NPG1, NPGR1 i NPGR2) kodujące białka z rodziny kalmodulin zaangażowane w rozwój pyłku (Kudla, et al., 2010). U Brassica zidentyfikowano białko typu calcium-binding protein (PCP), ulegające specyficznej ekspresji w pylnikach i słupkach pąków tuż przed rozkwitem i zaraz po rozkwicie, przy czym w słupkach obserwowana był wyższa ekspresja (Furuyama & Dzelzkalns, 1999). W badaniach nad morfogenezą kwiatów ogórka zidentyfikowano sekwencję EST z genu kodującego homologa nukleazy zależnej od wapnia (CAN), pochodzącej z Arabidopsis, nazwano ją CsCaN. Sekwencja ta wykazywała konstytutywną ekspresję, jednak wyższy poziom obserwowano w pręcikach żeńskich kwiatów w tak zwanym stadium 6 (obecne są w pąku jeszcze organy obu płci) niż w męskich. Gen kodujący CsCaN był wyraźnie indukowany w obecności etylenu. Może to wskazywać na udział tego genu w hamowaniu rozwoju pylników w kwiatach żeńskich (Emery, et al., 2012). Ponad to wyniki badań ekspresji genów CAX 1 i CAX 3 w kwiatach Arabidopsis (Cheng, et al., 2005) korespondują z uzyskanymi wynikami dla sekwencji CsGy3GH_93 pochodzącej z transkryptu genu CsAP-1. Sekwencja ta została uzyskana na drodze hybrydyzacji różnicowej pomiędzy linią Gy3 zawierającej dominujący allelem genu M oraz linią HGy3 z recesywnym allelem genu m (Przybecki et al., 2003). Wyniki ekspresji genu CsAP-1 korespondują z wynikami badań nad ogórkową wapniowo zależną nukleazą (CsCaN), silnie powiązaną z regulacją rozwoju kwiatów żeńskich. Obydwa geny są etylenowo zależne. W regionie poprzedzającym gen CsAP-1 zlokalizowano unikalne elementy regulatorowe odpowiedzi etylenowej ERE (ethylene-responsive elemnt). Powyższe wyniki sugerują, że gen CsAP-1 regulowany jest przez etylen i dostarcza jonów wapniowych dla wapniowo-zależnej nukleazy, odpowiedzialnej za rozwój kwiatów żeńskich u roślin ogórka posiadających dominujący allel genu M. Gen CsRCOM_0621420-1 - Regulator transkrypcji: negative cofactor 2 transcriptional co-repressor, putative (CsB10dhB2_28) Sekwencja genu CsRCOM_0621420-1 charakteryzował się silnym podobieństwem do sekwencji genu kodującego białko drugiego negatywnego kofaktora, korepresora transkrypcji (XP_002525554 negative cofactor 2 transcriptional co-repressor, putative): gen RCOM_0621420, z R. communis. Metodą in situ RT-PCR wykazano obecność transkryptu w płatkach korony, okółku pylników oraz okółku słupka pąków linii 2gg 1 – 2 mm. W linii B10 sygnał wykryto w płatkach korony oraz okółku pylników pąków linii B10 wielkości 1 – 2 i 3 – 5 mm. Sygnałów nie wykryto w działkach kielicha w żadnym z badanych preparatów jak również w okółku słupka pąka linie B10 wielkości 1 – 2 mm. Badania Real Time PCR wykazały stały poziom ekspresji genu CsRCOM_0621420-1 w linii B10. Zróżnicowanie natomiast wystąpiło w linii 2gg gdzie niższy poziom odnotowano w słupkach paków wielkości 3 – 5 mm niż w 1 – 2 mm. Pomiędzy linią B10 i 2gg również zaobserwowano różnicę w poziomie ekspresji. W pylnikach linii 2gg pąków wielkości 3 – 5 mm zaobserwowano niższy poziom ekspresji niż adekwatnych próbach linii B10. W zahamowanych w rozwoju organach linii B10 pąków wielkości 3 – 5 mm więcej było transkryptu niż takich samych linii 2gg. Niemierzalny natomiast był poziom transkryptu w pąkach linie 2gg wielkości 1 – 2 mm. Elementem składowym białka Negative cofactor 2 (NC2) jest histon H2A, pełniący istotne role w utrzymaniu strukturalnej integralności nukleosomu i kondensacji chromatyny, oraz wiązaniu specyficznych białek chromatyny (Warren, 2002). NC2 jest regulatorom transkrypcji ewolucyjnie konserwowanym, pierwotnie zidentyfikowanym jako inhibitor transkrypcji podstawowej (Gangloff, et al., 2001). Najciekawsze badania z punktu widzenia morfogenezy kwiatów i regulacji kwitnienia, dotyczą zaangażowania histonu H2A.Z w regulację czasu kwitnienia roślin Arabidopsis. Wariant histonu H2A histon H2A.Z pośredniczy w wielu procesach związanych z edycją chromatyny w tym aktywacją transkrypcji, konwersją euchromatyny lub formowaniem heterochromatyny. U drożdży i u człowieka histon H2A.Z przyłącza się do chromatyny wraz z kompleksem SWR1 i SRCAP. Wykazano, że mutacje w obrębie homologów tych kompleksów u A. thaliana ACTIN-RELATED PROTEIN6 (ARP6) oraz PHOTOPERIODINDEPENDENT EARLY FLOWERING1 (PIE1), wytwarzają fenotypowo identyczne roślinny i prowadzą do kooperacji zestawu genów. Dalsza analiza wykazała, iż ARP6 i PIE1 wymagane są do umiejscowienia histonu H2A.Z w różnych loci w tym loci genu FLC odpowiedzialnego za regulację kwitnienia. Brak H2A.Z w chromatynie mutantów arp6 i pie1 prowadziło do obniżenia ekspresji genu FLC i przedwczesnego kwitnienia roślin, co wskazywałoby ważna rolę tego histonu w regulacji kwitnienia (Deal, et al., 2007). Uzyskane wyniki badań nad ekspresją genu CsRCOM_0621420-1 o predykcji do regulatora transkrypcji typu NC2, a także obecna wiedza na temat procesów, w jakich ten mechanizm regulacji jest zaangażowany, nie pozwala na postawienie jednoznacznej hipotezy na temat roli jaką pełni NC2 w morfogenezie kwiatów ogórka. Jednak pozytywne wyniki w reakcji in situ RT-PCR oraz reakcji Real Time dla trzeciego i czwartego okółka, choć różnicują w niewielkim stopniu, stanowią mocną podstawę do gruntownych badań nad rolą tego mechanizmu w procesach kształtowania różnych form kwiatu. Geny białek zawierających domenę leucine rich repeat (LRR) na końcu N (CsPIP-1, CsPIP-1 i CsLR-1). Domena LRR występuje w ponad 2000 białek. W tej grupie białek znajdują się receptory hormonów, receptory kinaz tyrozynowych, cząsteczki związane z adhezja komórek, czynniki wirulencji u bakterii, enzymy oraz wewnątrz komórkowe glikoproteiny wiążące macierz (Enkhbayar, et al., 2003). Wśród badanych sekwencji transkryptomowych różnicujących linie o odmiennych typach płci przebadano dwie sekwencje zawierające domenę LRR. Pierwsza był sekwencja CsB10dhB2_150 różująca linie B10 i 2gg, znaleziona w genie na contigu 14488 chr 1 (gen CsPIP-1), druga sekwencja CsGy3dhGH_98 znaleziona w genie CsLR-1 na contigu 4994 chr. 1 różnicująca linie Gy3 i HGy3. Białko genu CsPIP-1 charakteryzowało się silnym podobieństwem do białka inhibitującego poligalakturonazy (inhibiting protein z C. melo). Białko genu CsLR-1 charakteryzowało się silnym podobieństwem do białka z potworzonymi regionami bogatymi w leucyny G. max. W genomie ogórka znaleziono jeszcze pięć genów o tej samej charakterystyce kodowanych białek (strukturalnie odległe). Analiza in situ RT-PCR wykazała obecność transkryptów sekwencji CsB10dhB2_150 jedynie w linii B10. W pąkach linii B10 wielkości 1 – 2 mm sygnał wykryto w płatkach korony oraz okółku pylników, słaby sygnał w działkach kielicha. W pakach tej samej linii, ale wielkości 3 – 5 mm sygnał wykryto jedynie w okółku pylników, W linii 2gg nie wykryto transkryptów. Ekspresję sekwencji CsGy3dhGH_98 tą metodą zaobserwowano w płatkach korony, okółku pylników oraz okółku słupka pąków linii Gy3 w stadium 3 – 5mm, słaby sygnał wykryto również w działkach kielicha. W pąkach linii HGy3 w stadium 1 – 2 mm nie wykryto sygnału. Najciekawsza z punktu widzenia powyższych badań jest rola białek LLR w determinacji płci. Powiązane są one z krytycznymi dla prawidłowego rozwoju kwiatów procesami począwszy od przejścia stożka wzrostu ze stanu wegetatywnego w generatywny (Suzaki, et al., 2004), przez kształtowanie się kwiatów (Gamboa, et al., 2001), po rozwój poszczególnych elementów w kwiecie (Huang, et al., 2011). Białka LRR zostały zidentyfikowane w procesach związanych z przejściem z fazy wegetatywnej w generatywną u Arabidopsis gdzie gen FLOR1 kodujący białko z tej rodziny był indukowany w bardzo młodych merystemach kwiatostanowych, ponadto mutant typu flor1 cechował się opóźnionym kwitnieniem (Torti, et al., 2012), FLOR1 należy do roślino specyficznych białek LRR (Acevedo, et al., 2004; Gamboa, et al., 2001). Jak większość tego typu białek, które dotychczas zostały scharakteryzowane FLOR1 zlokalizowany jest wewnątrz komórki w cytoplazmie i jądrze. FLOR1 pierwotnie został wyizolowany ze względu na jego interakcję w kulturach in vitro oraz w kulturach drożdżowych z genem AGAMOUS (AG), czynnikiem transkrypcyjnym typu MADS-box, zaangażowanym w rozwój pylników oraz słupka. (Acevedo, et al., 2004). W badaniach nad mechanizmem kwitnienia u Arabidopsis wykazano bardzo słabą ekspresję w merystemie wierzchołkowym w fazie wegetatywnej za to bardzo wysoką nadekspresję w merystemach kwiatostanowych. Tak samo jak w przypadku AG, FLOR1 może wchodzić w interakcję z innymi białkami MADS-box eksprymowanych w merystemie kwiatostanowym podczas fazy przejścia. Nieznane są jednak biochemiczne podstawy interakcji pomiędzy FLOR1 a MADS box (Torti, et al., 2012). Innymi równie ważnymi w kształtowaniu kwiatów genami, są geny typu CLAVATA. U mutanta typu clavata1 zarówno merystem, wegetatywny, kwiatostanowy i kwiatowy ulegają powiększeniu względem typu dzikiego. Kombinacje podwójnych mutantów clavata1 wraz z agamous, apetala2, apetala 3 i pistillata wykazały, że CLAVATA1 leży u podstaw regulacji struktury merystemu kwiatowego. Natomiast kombinacje podwójnych mutantów clavata1 z apetala1 i leafy wykazały role CLAVATA1 w ustanowieniu tożsamości merystemu kwiatowego (Clark, et al., 1993). Produkt genu CLAVATA1 został zidentyfikowany jako białko typu LRR o aktywność kinazy, zawierające konserwatywną domenę charakterystyczną dla kinaz serine/threonine (Clark, et al., 1997). Ponadto wykazano, rolę genu CLAVATA2 (CLV2) w regulacji zarówno rozwoju merystemu jak i organów u Arabidopsis. Wyizolowanie genu CLV2 pozwoliło wykazać, że koduje on biało typu receptorowego (receptor like protein RLP), zawierające domenę LRR o wysokim podobieństwie do tego typu białek receptorowych u roślin i zwierząt, ale w odróżnieniu od nich posiada ono bardzo krótki ogon łączący je z cytoplazmą. Gen CLV2 jest niezbędny do akumulacji produktów CLV1. Produkty obu tych genów łącza się tworząc kompleks typu heterodimer biorący udział w przekazywaniu pozakomórkowego sygnał (Jeong, et al., 1999). Do prawidłowego funkcjonowania CLV1 niezbędny jest również gen typu CLV3. Prawdopodobnie CLV1 występuje w formie nieaktywnego heterodimeru, a funkcją CLV3 jest inicjowanie powstania większego kompleksu, posiadającego zdolności do przekazywania sygnału za pomocą GTPazy Rho (Trotochaud, et al., 1999). Również u roślin jednoliściennych opisano gen kodujący białko należące do nadrodziny LRR FLORAL ORGAN NUMBER1 (FON1) regulujący rozwój kwiatostanu. Mutacja w obrębie tego genu, prowadzi do powiększenia się merystemów kwiatowych u O. sativa (ryż), w efekcie czego dochodzi do wzrostu liczby wszystkich organów kwiatowych. Nadliczbowe organy rozwija się we wszystkich okółkach jak również w dodatkowo powstałych. Wewnętrzne organy kwiatowe są bardziej zmodyfikowane niż zewnętrzne a wiele primordiów słupkowych rozwija się w sposób chaotyczny w centrum praktycznie dojrzałych kwiatów. Pomimo dużych zmian w merystemach kwiatowych, merystemy wegetatywne pozostają niezmienione. Gen FON1 został zidentyfikowany jako leucine-rich repeat receptorlike kinase o wysokim podobieństwie do CLAVATA1 (CLV1) z Arabidopsis, co sugeruje ścieżkę sygnalną podobną do CLV również u jednoliściennych. W odróżnieniu jednak od CLV ulegającego ekspresji w warstwie L3 merystemu, FON1 ulega ekspresji w cały merystemie kwiatowym (Suzaki, et al., 2004). Białka z grupy LRR biorą również udział w innych procesach związanych z rozwojem kwiatów, a ich aktywność została zaobserwowano także w wykształconych już pąkach kwiatowych, a nie tylko w merystemie kwiatowym. W badaniach nad morfogenezą kwitnienia Antirrhinum majus wyizolowano, opisano strukturę i określono wzór ekspresji genu FIL2 kodującego białko z grupy LRR i potencjalnie zaangażowanego w komunikację między komórkową niezbędną do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania płatków korony, pylników oraz słupka (Steinmayr, et al., 1994). Również należący do nadrodziny LRR sam inhibitor poligalkturonazy, jest związany z prawidłowym rozwojem kwiatów. Białka tego typu często są opisywane w kontekście ich roli, jako elementu odpowiedzi roślin na atak patogena (Sicilia, et al., 2005) Gen OsFOR1 (Oryza sativa floral organ regulator 1) koduje białko zawierające domenę LRR posiada strukturę oraz liczbę powtórzeń regionów bogatych w leucyny charakterystyczną dla białek typu PGIPs inhibitorów poligalakturonazy z innych gatunków. Ponadto zrekombinowane biało OsFOR1 połączone białkiem wiążącym maltozę (MBP) wykazuje aktywność PGIP przeciwko poligalakturonazie Aspergillus niger. Nie mniej jednak sam OsFOR1 ulega wysokiej ekspresji w kalusie oraz niedojrzałych wiechach, a tylko w nieznacznym stopniu w korzeniach siewek oraz dojrzałych łodygach. Antysensowna ekspresja genu OsFOR1 prowadzi do wzrostu ilości organów w kwiecie, co sugeruje rolę tego genu w formowaniu i kontroli rozwoju tych organów (Jang, et al., 2003). Inhibitor poligalturonazy (PGIP) może ulegać również specyficznej ekspresji podczas rozwoju pyłku, chociaż jego rola w tym procesie nie jest jeszcze poznana. Geny BcMF19 kodujący białko typu PGIP, ulega nadekspresji w pąkach płodnych kwiatach kapusty odmiany Pak Choi (Barssica campestris L. spp . chinensis Makino), posiadającej genetyczną męską sterylność typu AB (Bajh97-01A/B). Produkt genu BcMF19 posiada charakterystyczny dla PGIP motyw, zawierający na końcu N peptyd sygnalny oraz kilka potencjalnych miejsc Nglikolizacji, a także dwa mostki siarczkowe flankujące N- i C- końce jak również dziesięć powtórzeń sekwencji LRR (Huang, et al., 2011). W kontekście obecnej wiedzy dotyczącej roli białek z rodziny LRR regulacji morfogenezy kwiatów, uzyskane wyniki dla genów CsPIP i CsLr-1 stanowią bardzo dobrą bazę do dalszych badań w celu wyjaśnienia tego procesu. Obydwie sekwencje choć posiadają predykcję typu LRR nie są homologami. W przypadku genu CsPIP, profil ekspresji uzyskany techniką in situ RT- PCR koresponduje w z wynikami uzyskanymi dla genu BcMF19 pochodzącego z B. campestris i również kodującego białko typu PGIP. Sugeruje to, iż genu CsPIP jest zaangażowany w rozwój pylników w męskich kwiatach ogórka podobnie jak i gen BcMF19 u B. campestris, choć oba geny są sekwencyjnie odległe. Rola genu CsLR-1 pozostaje nadal otwarta. Sugerowane dalsze badania powinny również objąć lokalizacje ekspresji tego genu w bardzo wczesnych merystemach kwiatowych ze względu na bardzo ważną rolę genów typu CLAVATA należących do rodziny LRR w kształtowaniu kwiatów we wczesnej morfogenezie. Rola białek rybosomalnych w morfogenezie kwiatów W badaniach nad białkami rybosomalnymi stwierdzono silniejszą ekspresję domeny S4 rybosomu w kwiatach męskich. Wyniki badań ekspresji pomiędzy okółkami nie dają jednak jasności w kwestii powiązania tego genu z rozwojem konkretnych organów płciowych. Niemniej jednak, aktywność domeny S4 w powiązaniu z kwitnieniem oraz podwyższona ekspresja w kwiatach męskich jest wcześniej niepublikowanym doniesieniem, w związku z czym sugerowane jest powtórzenie badań z uwzględnieniem wcześniejszych stadiów rozwojowych. Wyniki badań nad pozostałymi białkami rybosomalnymi, chociaż wykazującymi bardzo ciekawe właściwości mogące mieć związek z wykształcaniem płci kwiatów, nie umożliwiają wyciągnięcia jednoznacznych wniosków co do ich roli w kwiatach. Białka UV zależne Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235) Białko genu CsUV131 wykazuje wysokie podobieństwo z białkami tworzącymi klastry żelazo-siarkowe (klastry Fe-S). U roślin tego typu struktury spotykane są w plastydach, mitochondriach cytozolu i jądrze. Struktury te są niezbędne w wielu procesach fizjologicznych oraz tych związanych z rozwojem. Klastry Fe-S często są kofaktorami białek pełniących funkcji niezbędne dla przebiegu witalnych dla roślin procesów, takich jak respiracja, fotosynteza, asymilacji siarki i azotu, metabolizm aminokwasów, hormonów roślinnych oraz syntezie koenzymów (Balk & Pilon, 2011). Białkowe klastry żelazowosiarkowe pełnią również różnorodne role biologiczne powiązania z transportem elektronów, katalizą, regulacją ekspresji genów oraz wychwytywaniem jonów żelaza i tlenu (Ye, et al., 2006). Ponadto pełnią one istotną rolę w fotosyntezie, w tylakoidach zdecydowana większość jonów żelaza znajduje się w białkowych klastrach żelazowo-siarkowych uczestniczących w fotosyntetycznym transporcie elektronów (Raven, et al., 1999). W obrębie białka genu CsUV131 zidentyfikowano dwie konserwatywne domeny powiązanie z metabolizmem żelaza i siarki: SufE oraz BolA. Podobną strukturę posiada chloroplastowe białko CpSufE pochodzące z A. thaliana. Zawiera ono domenę SufE na Nkońcu oraz domenę BolA unikatową dla roślin wyższych na C-końcu. Białko to lokalizowane jest w stromie chloroplastów. CpSufE ulega ekspresji we wszystkich ważniejszych tkankach, przy czym podwyższonej ekspresji ulega w częściach zielonych a jego ekspresja jest zależna od światła i regulowana na poziomi mRNA. Prawdopodobnie CpSufE wraz z białkiem CpNifS tworzę desulfurazę cysteinową, niezbędną do syntezy klastrów żelazowo-siarkowych w chloroplastach (Ye, et al., 2006). genu CsUV131 oprócz podobieństwa domen kodowanego białka do białka CpSufE z A. thaliana charakteryzuje się identycznym profilem ekspresji w liniach B10 i 2gg, co niżej opisany gen CsA/Bcb-1 z identyfikowany jako kodujący białko w wiążące chlorofil a/b w fotosytemach u R. communis. Gen CsA/Bcb-1 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_453) Sekwencja CsB10dhB2_453 została zidentyfikowana jako fragment genu kodującego białko wiążące chlorofil a i b w kompleksach zbierających światło LHC. Składają się one z chlorofilu a i b oraz białek je wiążących. Naczelną funkcja tego kompleksu jest wychwytywania i dostarczanie energii do fotosytemów I i II. N-koniec białek wiążących chlorofil a i b jest osadzony w stromie, gdzie wiąże się z błonami tylakoidów, tam na drodze foto-regulacji prowadzi do odwracalnej fosforylacji reszt treoninowych. Czego przypuszczalnym efektem jest pośredniczenie w przekazywani energii wzbudzonej pomiędzy fotosytmem I i II (Amunts, et al., 2007). Obok naczelnej funkcji białek wiążących chlorofil a i b, obserwuje się również zróżnicowaną ekspresje genów je kodujących w odniesieniu do procesów związanych z kwitnieniem. Najciekawszym zagadnieniem z tego punktu widzenia jest powiązanie genów typu Cab (chlorophyll a/b biding protein) z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura. Ten typ cytoplazmatycznej sterylności jest jednym z lepiej opisanych u Raphanus sativus i objawia się we wczesnym stadium mikrosporogenezy w wyniku przedwczesnej degeneracji tapetum. Ponadto deficyt chlorofilu jak i męska sterylności są najczęstszymi przykładami z funkcjonalnej niekompatybilności pomiędzy jądrem a cytoplazmą. Czasem występują one jednocześnie jak na przykład, gdy cytoplazma typu Ogura została przeniesiona do Brassica, męsko sterylne potomstwo przejawiał również deficyt chlorofilu. W tym kontekście różnicowy gen Cab, choć nie może być traktowany jak gen restorer, nie można wykluczyć jego roli w prawidłowym rozwoju mikrospor, jego wzór ekspresji jest również zgodny z ekspresją domniemanego genu restora, Gen Cab ulega ekspresji w liściach oraz kwiatach w tym w pylnikach, ale nie w korzeniach (Wu, et al., 2001). Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235), oprócz kodowania regionu podobnego do domen białka CpSufE z A. thaliana charakteryzuje się identycznym profilem ekspresji co gen CsA/Bcb-1(sekwencje CsB10dhB2_453), kodujący białko wiążące chlorofil a/b w fotosytemach u R. communi, która również różnicuje linie B10 i 2gg. Na szczególną uwagę zasługuj fakt, że białka typu Cab (chlorophyll a/ binding protein) powiązane są z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura, objawiającą się we wczesnym stadium mikrosporogenezy przedwczesną degradacją pyłku. Pokrywa się to z wynikami ekspresji uzyskanymi dla CsA/Bcb-1, wyższej w męskich kwiatach niż w kwiatach typowo żeńskich, posiadających całkowicie zredukowane organy w trzecim okółku. W świetle tych wyników można przypuszczać, iż produkt genu grupy Lhc (białka składowe kompleksu zbierającego światło) jest niezbędny do prawidłowego rozwoju męskich organów kwiatowych, przypuszczalnie biorąc udział w prawidłowym przebiegu mikrosporogenezy oraz/lub prawidłowym rozwoju tapetum. Geny regionu CsMS3_G – Gy Analizę genów tego regionu obejmującego jeden contig (2720) wykonano ze względu na ich bezpośrednie sąsiedztwo z markerem CsMS3_G (SCAR) sprzężonym bardzo blisko z genem Gy/gy - recesywnej żeńskości roślin ogórka, (Wóycicki nieopublikowane), który znajduje się w odległości 4 cM od genu F/f - dominującej żeńskości (Kubicki 1974). Marker został zlokalizowany pomiędzy 3 a 4 genem na contigu 2720 Gen CsSKKL Gen pierwszy na contigu 2720 koduje białko należące do grupy kinaz serynowo/treoninowe typu 3 związanych z syntezą glikogenu nazywane powszechni również kinazami typu shaggy (glycogen synthase kinase 3 (GSK3)/SHAGGY-like kinases (GSKs)). Białka z tej rodziny występują powszechnie u roślin, zwierząt i drożdży. U Arabidopsis zidentyfikowano dziesięć typów białek w obrębie tej rodziny. Najczęściej opisywane są one w kontekście metabolizmu brasinosteroidów, ale również odnotowuje się ich aktywność w procesach związanych z morfogeneza kwiatów jak i w odpowiedzi roślin na stres (Claisse, et al., 2007; Charrier, et al., 2002; Yan, et al., 2009). Dotychczas wykazano związek różnych roślinnych GSK 3 w regulacji przekazywania sygnałów za pomocą brasinosteroidów (BR). Brasinosteroidy są roślinnymi hormonami pochodnymi steroli i regulującymi ekspresje wielu genów. Powiązane są one ściśle z procesami związanymi z wydłużaniem komórek, regulacją ich podziałów i różnicowania, jak również w innych procesach rozwojowych roślin. Regulują one także wzrost łagiewki pyłkowej, rozwój tkanek naczyniowych oraz fotomorfogenezę. Brasinosteroidy uważa się za transbłonowe receptory kinaz inicjujące kaskadę sygnalną na drodze fosforylacji. Jednym z inicjatorów kaskady jest BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 2 (BIN2 znany jest również jako ASKg, DWARF12 and UCU1) należący do rodziny białek GSK3/SHAGGY-like kinases (Rozhon, et al., 2010; Yan, et al., 2009). Białka z rodziny SHAGGY-like mają również bezpośredni wpływ na morfogenezę kwiatów. Porównanie wykonane dla roślin dzikich Arabidopsis oraz z wprowadzoną antysensowną sekwencją AtSK wykazały, że obniżona ekspresja genów AtSK11 i AtSK 12 powoduje zmiany w obrębie zalążni, słupka i znamienia. Zmiany w obrębie owocolistków uwidaczniały się już we wczesnym stadium formowania kwiatów i prowadził do silnej rearanżacji tego regionu w kwiecie (Dornelas, et al., 2000). Natomiast zmiany w genie AtSK32 prowadziły do powstawania zredukowanych niektórych elementów kwiatów, głównie szypułek, działek i płatków korony (Claisse, et al., 2007). Gen CsSKKL jednak nie wykazywał istotnego podobieństwa do żadnego z powyższych genów. Najbliższym podobnym genem z A. thaliana był gen AtSK42 (dane nieprezentowane), brak jednak badań dotyczących udział tego typu białek z rodziny SHAGGY – like w morfogenezie kwiatów. Dotychczas wykazano ich zmienną ekspresję pod wypływem stresów osmotycznych (podwyższona ekspresja) i zmian w długości naświetlanie (obniżona ekspresja) (Charrier, et al., 2002). Gen CsJL W obrębie tego genu drugiego znajdującego się na contigu 2720 nie zlokalizowano żadnej z sekwencji różnicowych. Nie posiada on również strukturalnie homologicznego genu w genomie ogórka. Najbliższe podobieństwo wykazywał on do genu kodująco josephin-like protein-like z V. vinifera, dlatego nazwano go CsJL. Gen CsDIV Gen trzeci (poprzedzający marker SCAR) znajdujący się na contigu 2720 został uznany za kodujący białko wiążące DNA podobne doMYB 51 DIVARICATA-like (C.sativus) (DIV). Najwyższe podobieństwo gen ten wykazał z genem HIG1/MYB51 z A. thaliana, który jest zaangażowany w biosyntezę indolowych glukozynolanów. Związki te są metabolitami wtórnymi i pełnią rolę czynnika przeciwwirusowego w mechanizmach obronnych roślin. Aktywność sekwencji promotorowej dla genu HIG1/MYB51 zaobserwowano w liściach dojrzałej rozety liściowej. Ekspresję gen HIG/MYB51 zaobserwowano jeszcze w korzeniach, pakach kwiatach w późnym stadium i łuszczynach. Podwyższona ekspresję tego genu zaobserwowano również w przypadku zranienia rośliny, co może mieć związek z jego rolą w biosyntezie indolowych glukozynolanów będących mechanizmem obrony przed infekcją wirusami roślinnymi podczas zranienia (Berger, 2007). Gen CsAAAT Gen czwarty – CsAAAT (zlokalizowany za markerem SCAR) zidentyfikowany został jako kodujący acyltransferazę antocyjanin 5-aromatyczną (Anthocyanin 5-aromatic acyltransferase, putative - 5AT). W genomie ogórka zidentyfikowano sześć genów o powyższej predykcji. 5AT została wyizolowana z płatków kwiatowych Gentiana triflora i dość wszechstronnie opisana. Odpowiada ona za acylowanie kwasów hydroksycjanowych zapewniając ich stabilność przez co intensyfikuje udział niebieskiego barwnika w organach u G. triflora. Możliwy jest również udział tego związku w stabilizowaniu antocyjanów biorących udział w wybarwianiu płatków korony u innych roślin (Fujiwara, et al., 1997). Wstępne wyniki uzyskane dla genu CsSKKL nie sugerują jeg roli w samej morfogenezie, jednak nie można jej wykluczyć ze względu na rolę brasinosteroidów w regulacji syntezy etylenu oraz wrażliwości na światło. Dalsze badania powinny dotyczyć struktur w fazie bardzo wczesnego kształtowania się kwiatów oraz w stożkach wzrostu. Wyniki ekspresji pozostałych genów regionu na obecnym etapie badań są nieinterpretowalne co do ich roli w rozwoju kwiatów Geny kompleksu _CsMed21 (z otoczenia sekwencji Gy3dhGH_35. Na podstawie wyników badań profilu ekspresji sekwencji CsGy3dhGH_35 (Przybecki, et al., 2003) oraz hipotez dotyczących silnej aktywności ekspresyjnej w kwiatowych organach generatywnych zarówno o zahamowanym jak i o prawidłowym rozwoju zdecydowano się na prześledzenie również ekspresji genów znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie genu CsMed21, na którym ją zlokalizowano. Gen CsMed21 Ilość transkryptu Gy3dhGH_35 (BU791059) była zmienna w blisko izgenicznych liniach występowaniem allelu dominującego genu M/m. Pierwotnie zidentyfikowano tą sekwencję, jako kodującą hipotetyczne białko. Analiza in situ ekspresji dla tej sekwencji wykazała jej specyficzność dla żeńskiego typu kwiatów. Sygnału natomiast nie obserwowano w żadnym z regionów kwiatów obupłciowych linii HGy3. W przypadku kwiatów żeńskich wyraźna była silna ekspresja w okolicach inhibowanych zawiązków pręcików (Przybecki, et al., 2003). Jak już wcześniej zaznaczono zarówno gen 2 na contigu 5106, jaki i sekwencja CsGy3dhGH_35 wykazują silne podobieństwo genu kodującego podjednostkę 21 mediatora z A. thaliana. Heterodimer składający się z podjednostek Med 7 i Med21 może pełnić rolę zawiasu ulokowanego między połową mediatora a jego końcem (Marchler-Bauer, et al., 2011). Mediatory to silnie konserwowany regulatory transkrypcji związane z polimeraza II, ich występowania zostało potwierdzone zarówno u drożdży jak i ludzie na podstawie badań struktury tych białek (Boube, et al., 2002). Obecnie przyjmuje się, że jest on modułowym, dynamicznie adaptującym się kompleksem białkowym o zdolności do łączenia różnorodnych gen specyficznych białek regulatorowych do podstawowego aparatu transkrypcji polimerazy II, pełniąc funkcję sensora integracji oraz regulatora tego procesu (Lariviére, et al., 2012) Badania nad mediatorami roślinnymi wykazały ich obecność oraz znaczącą rolę u Arabidopsis. Mediatory roślinne wykazują jednak niska homologię to tego typ kompleksów u innych gatunków. Badaniach tych zidentyfikowano dwa białka STRUWWELPETER (SWP) i PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1 (PFT1), jako podjednostki mediatora odpowiednio, Med14 i Med25. Wskazuje to istotną role mediatora w regulacji proliferacji komórek oraz regulacji czasu kwietnie w odpowiedzi na intensywność światła. (Bäckström, et al., 2007). Uzyskane wyniki w analizie in situ wykonane dla genu CsMed21pokrywają się w pąkach kwiatowych z linii Gy3 z uzyskanymi wcześniej wynikami dla sekwencji CsGy3dhGH_35 (Przybecki, et al., 2003), jednak w przypadku linii HGy3 pozostają w opozycji ze względu na obecność sygnału w pylnikach w pąkach kwiatowych w stadium 3 – 5 mm. Przeprowadzono analiza ekspresji Real Time PCR wykazał, że startery projektowane do genu 2 na contigu 5106 oraz startery użyte dla sekwencji CsGy3dhGH_35 dały bardzo zbliżone wyniki (prawie identyczne pod względem tendencji). Wyniki te jednak podważają specyficzność ekspresji sekwencji CsGy3dhGH_35 do linii Gy3. W linii HGy3 w pąkach kwiatowych w stadium 1 – 2 mm zaobserwowano większą ekspresję niż w linii Gy3. W pąkach kwiatowych 3 – 5 mm tendencja jest odwrotna. W obrębie linii Gy3 ekspresja jest wyraźnie wyższa w pąkach 3 – 5 mm niż 1 – 2 mm podobną tendencję można zaobserwować w linii HGy3. W przypadku obu linii ekspresja w pąkach kwiatowych w stadium 1 – 2 mm jest niższa niż liściach. Uzyskane wyniki mogą sugerować powiązanie genu CsMed21z trzecim okółkiem, ale nie jest to reakcja specyficzna tylko dla kwiatów żeńskich jak wcześniej sugerowano. Podobieństwo do podjednostki 21 mediatora A. thaliana, nie potwierdza związku tego genu z kwitnieniem. Dlatego też istotna jest dokładniejsze charakterystyka tego genu. Wyjaśnieniem różnic wyników obecnych i wcześniejszych może być zmienność w zaawansowaniu rozwoju pąków tej samej wielkości. Obserwowano różny stopień wykształcenia organów w różnych pąkach tej samej wielkości i tej samej linii. Gen CsBp Unikalny w genomie ogórka gen CsBp poprzedzający CsMed21 to bliżej niescharakteryzowany gen podobny do genu kodującego białko wiążące białka pochodzącego z R. communis zawierające powtórzony region tetratricopeptide (TPR), dlatego też nazwano je CsBp. Lokalizacji produktów dla genu 1 na contigu 5106 w pąkach kwiatowych za pomocą techniki in situ RT-PCR wykazała brak ekspresji obu liniach Gy3 oraz HGy3 w dla obydwu badanych stadiów wielkości pąków kwiatowych. Natomiast analizy ekspresji Real Time PCR wykazują, zmienność ekspresji genu CsBp zarówno wewnątrz linii jak i między liniami. Badania nad struktura i funkcji białkowych kompleksów związanych z białkami posiadającymi domeną TPR, wykazały, że mutacja w obrębie motywu TPR u różnego rodzaju tego typu białek nie tylko wywołują zmiany lub prowadzą do utraty specyficzności do interakcji z innymi białkami, ale ma również mają poważne konsekwencja dla prawidłowego funkcjonowania samej komórki (Gounalaki, et al., 2000). Bardzo powszechny udział białek z domeną TPR oraz bark szczegółowej charakterystyki gen CsBp, ja również uzyskane wyniki ekspresji nie pozwalają na jednoznaczne powiązanie go z regulację kwitnienia, bądź w rozwoju kwiatów. Z drugiej strony wyraźna zmienność wewnątrzliniowa jak i międzyliniowa w Real Time PCR (metoda o wiele bardziej czuła niż in situ) może wskazywać na istnienie takiej roli. Ciekawym i wartym dalszej analizy jest wątek powiązania białek z domeną TPR z czaparonami oraz w procesach związanych ubikwitynizajcą, szczególnie z czynnikiem E3. Choć CsBp nie został powiązany z żadną z sekwencji różnicujących linii ogórka o różnych typach płci, to wśród tych sekwencji znajdują się białka należące do czaparonów oraz ubikwityny w tym ubikwityna E3 (Kosik, 2009). Gen CsATnusB Gen znajdującym się za genem CsMed21 jest gen prawdopodobnie kodujący białko zawierające anty-terminującą domenę NusB (antitermination NusB domain-containing protein), przez co nazwany CsATnusB. W obrębie tego genu nie zlokalizowano żadnej z sekwencji różnicowych i jest on unikalny w genomie ogórka. Dokładniejsza identyfikacja wykazała on, że gen ten jest podobny do genu beta-galaktozydazy Medicago truncatula (MTR_2g094690) uznanej za element mediatora powiązanego z polimerazą II, więc może być funkcjonalnie powiązany z genem CsMed21 Dla genu CsATnusB ze względu na brak jego pełnej sekwencji w genomowej bazie nie przeanalizowano sekwencji 1000 nukleotydów poprzedzających gen. Ze względu na strukturę genu CsATnusB (zależnie od programu annotującego pokazywany jest jako jeden z podwójną funkcją, lub dwa oddzielne geny) zdecydowano się przeprowadzić oddzielne analizy ekspresji dla ekzonów drugiego oraz czwartego. Dotychczasowe badania nad antyterminatorem transkrypcji typu NusB dotyczyły jego roli w E. coli gdzie reguluje biosyntezie rRNA na drodze antytermiancji transkrypcji Carlomagno & Nappo, 2003). Brak jest publikacji na temat roli genu MTR_2g094690 pochodzącego z Medicago truncatula, jednak na podstawie danych z bazy danych UniProt przyjmuje się, że jest on zaangażowany w proces regulacji transkrypcji z udziałem polimerazy II, posiada on aktywność kofaktora transkrypcji i wchodzi w skład kompleksu mediatora (Young, et al., 2011). Brak dokładniejszych danych nie pozwala na precyzyjne powiązanie tego genu lub genów z procesami związanymi z kwitnieniem. Nie mniej jednak bardzo prawdopodobne, że białko kodowane przez nie, razem z MED21 oraz białkiem TPR stanowią element kompleksu mediatora transkrypcji, a więc mogą być funkcjonalnie powiązane. Uzyskane wyniki ekspresji sugerują również, że gen CsATnusB może składać się z dwóch genów gdyż rozbieżne wyniki uzyskane dla obu końców tego genu na to wskazują, ale może to być również alternatywny splicing możliwe, że oba wschodzą w składa mediatora. Brak szerszej charakterystyki tego genu u roślin nie pozwala na weryfikacje tej hipotezy. Powyższe wyniki uzyskane dla genów na contigu 5106 powinny być rozszerzone na conitigi okalające w poszukiwaniu innych genów kandydatów mogących być podjednostkami mediatora. Uzyskana ekspresja w kwiatach również po winna być prześledzona, ale pod kątem działania całego kompleksu mediatora i udziału jego poszczególnych podjednostek w regulacji procesów kwitnienia. Podsumowanie i Wnioski Ewaluacja genów referencyjnych użytych do analizy zmian ekspresji Uzyskane wyniki wskazują, że choć geny w dużych, złożonych strukturach, jak pąki kwiatowe, liście, korzenie lub stożki wzrostu, wykazują stabilną ekspresję, to w elementach składowych tych organów może być ona zróżnicowana. Przypuszcza się, że jest to związane z izolacją samego RNA. Ponadto, mogą tam występować bardzo silne procesy, czasem stojące w opozycji do siebie, np. w trzecim i czwartym okółku (promowanie jednych organów i hamowanie w rozwoju drugich). Może to owocować niskim udziałem produktów genów konstytutywnych. Rola białek z grupy LBP w rozwoju kwiatów męskich ogórka Gen CsLBP-1 ulega zwiększonej ekspresji w obecności dominującego allelu genu Gy/gy (linia B10, z wyjątkiem liści). U homozygoty recesywnej (linia 2gg) ekspresji nie zaobserwowano. Gen ten koduje białko należące do rodziny LTP a powyższe badania ekspresji korespondują z rolą jaką przypisuje się białkom z tej rodziny w rozwoju pylników. Wyniki naszych badań sugerują silny z wiązek genu CsLBP-1 z rozwojem kwiatów męskich. Dokładny mechanizm regulacji powyższego genu typu LTP-like pozostaje jednak nieznany. Sugerowany mechanizm może być związany z regulatorami transkrypcji typu MYB12, zaangażowanymi w flawono-specyficzną regulację biosyntezy fenylopropanoidów, których ekspresja, bazując na wiedzy z innych prac, wydaje się być skorelowana również z rozwojem kwiatów. CsMT2 - Metallothionein typ II (CsGy3dhGH_250) Na tym etapie określenie dokładnej roli jaką pełni gen CsMT (zidentyfikowany jako gen kodujący metalohioninę typu 2) w rozwoju kwiatów nie jest możliwa. Konieczne jest również potwierdzenie ekspresji tego genu w męskich typach kwiatów ogórka w okresie od komórek macierzystych pyłku do mejozy. CsFLAP Fasciclin-like arabinogalactan family protein (CsB10dhB2_113) Badania przeprowadzone dla Arabidopsis wykazały rolę białek z rodziny arabinogalactanów w rozwoju pyłku. Ponadto, wykazano korelację tej rodziny białek z rodziną białek LPB. Tłumaczy to silny związek ekspresji genu CsFLAP z kwiatami męskimi i hermafrodytycznymi (wyniki Real Time PCR). Wyniki te wskazują również na koekspresję tego genu z genem CsLBP-1. Potwierdzenie tego wymaga jednak dalszych badań. Gen CsC56 -proteazy C56, (CsB10cdB2_34) Produkt białkowy genu CsC56 jest proteazą cysteinową posiadającą domenę tupu PfpI z cysteiną w miejscu aktywnym. Sekwencja ta jest silnie związana z kwiatami posiadającymi pylniki. Wyniki reakcji in situ RT-PCR sugerują ekspresję w pylnikach osiągającą najwyższą wartość w późnym stadium rozwojowym. Może to sugerować udział tego genu w procesie degradacji tapetum w rozwijających się pylnikach kwiatów ogórka. Gen CsQM - QM – like protein (CsGy3cdGH_33) W regionie promotorowym ogórkowego genu CsQM zlokalizowano unikalny region regulatorowy GARE-motif (gibberellin-responsive element), będący elementem odpowiedzi na gibereliny wzmagające męskość. Obecność tego motywu, wraz z informacjami dotyczącymi giberelin u ogórka oraz zachowaniem się genu QM u Camelia sinensis mogą tłumaczyć obecność sygnału dla ogórkowego CsQM w liniach o kwiatach zawierających pylniki (głównie w samych pylnikach). Otwarta kwestią pozostaje jednak ekspresja w linii Gy3 wykazana przez reakcje Real Time PCR oraz in situ RT-PCR w całym pąku z wyjątkiem okwiatu. Gen CsAP-1 - Antyport Ca2+ (CsGy3dhGH_93) Wyniki ekspresji genu CsAP-1 korespondują wynikami badań nad ogórkową wapniowo zależną nukleazą (CsCaN), silnie powiązaną z regulacją rozwoju kwiatów żeńskich. Obydwa geny są etylenowo zależne. W regionie poprzedzającym gen CsAP-1 zlokalizowano unikalne elementy regulatorowe odpowiedzi etylenowej ERE (ethyleneresponsive elemnt). Powyższe wyniki sugerują, że gen CsAP-1 regulowany jest przez etylen i dostarcza jonów wapniowych dla wapniowo-zależnej nukleazy, odpowiedzialnej za rozwój kwiatów żeńskich u roślin ogórka posiadających dominujący allel genu M. CsRCOM_0621420-1 Uzyskane wyniki badań nad ekspresją genu CsRCOM_0621420-1 o predykcji do regulatora transkrypcji typu NC2, oraz obecna wiedza na temat procesów, w jakich ten mechanizm regulacji jest zaangażowany, nie pozwala na postawienie jednoznacznej hipotezy na temat roli jaką pełni NC2 w morfogenezie kwiatów ogórka. Jednak pozytywne wyniki w reakcji in situ RT-PCR oraz reakcji Real Time PCR dla trzeciego i czwartego okółka, choć różnicują w niewielkim stopniu, stanowią mocną podstawę do gruntownych badań nad rolą tego mechanizmu w procesach kształtowania różnych form kwiatu. CsPIP-1 i CsLR-1 W przypadku genu CsPIP-1 o predykcji do białka typu PGIP, profil ekspresji uzyskany techniką in situ RT- PCR koresponduje z wynikami uzyskanymi dla genu BcMF19 pochodzącego od Barssica campestris, scharakteryzowanego również jako kodujący białko typu PGIP. Sugeruje to, iż CsPIP-1 zaangażowany jest w rozwój pylników w męskich kwiatach ogórka, podobnie jak BcMF19 u Barssica campestris, choć oba te geny są sekwencyjnie odległe. Rola genu drugiego CsLR-1, w obrębie, którego zlokalizowano sekwencję CsGy3dhGH_98, pozostaje nadal otwarta. Sugerowane dalsze badania powinny objąć lokalizację ekspresji tego genu w bardzo wczesnych merystemach kwiatowych, ze względu na bardzo ważną rolę genów typu CLAVATA z rodziny LRR w kształtowaniu kwiatów we wczesnej morfogenezie. Rola białek rybosomalnych w morfogenezie kwiatów W badaniach nad białkami rybosomalnymi stwierdzono silniejszą ekspresję domeny S4 rybosomu w kwiatach męskich. Wyniki badań ekspresji pomiędzy okółkami nie dają jednak jasności w kwestii powiązania tego genu z rozwojem konkretnych organów płciowych. Niemniej jednak, aktywność domeny S4 w powiązaniu z kwitnieniem oraz podwyższona ekspresja w kwiatach męskich jest wcześniej niepublikowanym doniesieniem, w związku z czym sugerowane jest powtórzenie badań z uwzględnieniem wcześniejszych stadiów rozwojowych. Wyniki badań nad pozostałymi białkami rybosomalnymi, chociaż wykazującymi bardzo ciekawe właściwości mogące mieć związek z wykształcaniem płci kwiatów, nie umożliwiają wyciągnięcia jednoznacznych wniosków co do ich roli w kwiatach. Rola białek UV zależnych Gen CsUVI31 (zawierający sekwencję CsB10dhB2_235), oprócz kodowania regionu podobnego do domen białka CpSufE z Arabidopsis thaliana charakteryzuje się identycznym profilem ekspresji co gen CsA/Bcb-1(sekwencje CsB10dhB2_453), kodujący białko wiążące chlorofil a/b w fotosytemach u Ricinus communi, która również różnicuje linie B10 i 2gg. Na szczególną uwagę zasługuj fakt, że białka typu Cab (chlorophyll a/ binding protein) powiązane są z cytoplazmatyczną męską sterylnością typu Ogura, objawiającą się we wczesnym stadium mikrosporogenezy przedwczesną degradacją pyłku. Pokrywa się to z wynikami ekspresji uzyskanymi dla CsA/Bcb-1, wyższej w męskich kwiatach niż w kwiatach typowo żeńskich, posiadających całkowicie zredukowane organy w trzecim okółku. W świetle tych wyników można przypuszczać, iż produkt genu grupy Lhc (białka składowe kompleksu zbierającego światło) jest niezbędny do prawidłowego rozwoju męskich organów kwiatowych, przypuszczalnie biorąc udział w prawidłowym przebiegu mikrosporogenezy oraz/lub prawidłowym rozwoju tapetum Geny regionu CsMS3_G Wstępne wyniki uzyskane dla genu CsSKKL nie sugerują jeg roli w samej morfogenezie, jednak nie można jej wykluczyć ze względu na rolę brasinosteroidów w regulacji syntezy etylenu oraz wrażliwości na światło. Dalsze badania powinny dotyczyć struktur w fazie bardzo wczesnego kształtowania się kwiatów oraz w stożkach wzrostu. Wyniki ekspresji pozostałych genów regionu na obecnym etapie badań są nieinterpretowalne co do ich roli w rozwoju kwiatów. Geny znajdujące się w bezpośrednim sąsiedztwie sekwencji różnicowej Gy3dhGH_35 o ekspresji różnicując kwiaty żeńskie do hermafrodytycznych Uzyskane wyniki mogą sugerować powiązanie genu 2 z contigu 5106 z trzecim okółkiem, ale nie jest to reakcja specyficzna dla kwiatów żeńskich, jak wcześniej sugerowano. Podobieństwo do podjednostki 21 mediatora Arabidopsis thaliana nie potwierdza związku tego genu z kwitnieniem, dlatego też istotna jest jego dokładniejsza charakterystyka. W przypadku podjednostki 21 (MED21) uważa się, że jest ona kluczowym elementem w aktywacji mechanizmów obronnych roślin na atak patogenów grzybowych. W przypadku genu CsBp, prawdopodobnie kodującego białko domeną TPR, powszechność występowania tego typu białek, jak również uzyskane wyniki ekspresji nie pozwalają na jednoznaczne powiązanie go z regulacją kwitnienia bądź z rozwojem kwiatów. Ciekawym i wartym dalszej analizy jest wątek powiązania białek z domeną TPR z czaperonami w procesach związanych z ubikwitynizajcą, szczególnie z czynnikiem E3. Choć sam gen CsBp nie został powiązany z żadną z sekwencji różnicujących linie ogórka o różnych typach płci, to wśród tych sekwencji znajdują się białka należące do czaperonów oraz ubikwityny, w tym ubikwityna E3. Brak dokładniejszych danych nie pozwala na precyzyjne powiązanie tego genu (lub genów) z procesami związanymi z kwitnieniem. Niemniej jednak, bardzo prawdopodobne jest, że razem z MED21 oraz białkiem TPR stanowią one element kompleksu mediatora transkrypcji. W przypadku genu CsATnusB, uzyskane wyniki ekspresji sugerują, że składa się on z dwóch genów, ze względu rozbieżne wyniki obserwowane dla obu końców tego genu. Możliwe, że oba wchodzą w składa mediatora, a transkrypty ulegają alternatywnemu splicingowi. Powyższe wyniki uzyskane dla genów na contigu 5106 powinny być rozszerzone na conitgi go okalające, celem znalezienia innych genów kandydatów mogących być podjednostkami mediatora. Uzyskana ekspresja w kwiatach powinna być również prześledzona, ale pod kątem działania całego kompleksu mediatora i udziału jego poszczególnych podjednostek w regulacji procesów kwitnienia. Spis literatury: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Acevedo, F. et al., 2004. FLOR1, a putative interaction partner of the floral homeotic protein AGAMOUS, is a plant-specific intracellular LRR. Plant Science, Tom 167, pp. 225-231. Acosta-García, G. & Vielle-Calzada, J.-P., 2004. A Classical Arabinogalactan Protein Is Essential for the Initiation of Female Gametogenesis in Arabidopsis. The Plant Cell, Tom 16, pp. 26142628. Amunts, A., Drory, O. & Nelson, N., 2007. The structure of a plant photosystem I supercomplex at 3.4A resolution. Nature, Tom 447, pp. 58-63. Atal, C., 1959. Sex reversal in hemp by application of gibberellin. Current Science, 28(10), pp. 408-409. Bäckström, S. et al., 2007. Purification of a Plant Mediator from Arabidopsis thaliana Identifies PFT1 as the Med25 Subunit. Molecular Cell , Tom 26, pp. 717-729. Balk, J. & Pilon, M., 2011. Ancient and essential: the assembly of iron–sulfur clusters in plants. Trends in Plant Science, 16(4), pp. 218-226. Berger, B., 2007. The role of HIG1/MYB51 in the regulation of indolic glucosinolate biosynthesis, Inaugural-Dissertation. Blatch, G. & Lässle, M., 1999. The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating proteinprotein interactions. BioEssays, Tom 21, pp. 932-939. Boube, M., Joulia, L., Cribbs, D. & Bourbon, H.-M., 2002. Evidence for a Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Regulation Conserved from Yeast to Man. The Cell, Tom 110, pp. 143-151. Brunner, A., Yakovlev, I. & Strauss, S., 2004. Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies. BMC Plant Biology, Tom 4, p. 14. Brunner, A., Yakovlev, I. & Strauss, S., 2004. Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies. BMC Plant Biology, Tom 4, p. 14. Bucovac, M. & Wittwer, S., 1961. Gibberellin modification of flower sex expression in Cucumis sativus L. Advances in Chemistry, 28(Gibberellins), pp. 80-88. Carlomagno, M. & Nappo, A., 2003. NusA modulates intragenic termination by different pathways. Gene , Tom 308, pp. 115-128. Charbonnel-Campaa, L., Lauga, B. & Combes, D., 2000. Isolation of a type 2 metallothionein-like gene preferentially expressed in the tapetum in Zea mays. Gene, Tom 254, pp. 199-208. Charrier, B., Champion, A., Henry, Y. & Kreis, M., 2002. Expression Profiling of the Whole Arabidopsis Shaggy- Like Kinase Multigene Family by Real-Time Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction. Plant Physiology , Tom 130, pp. 577-590. Chen, C., Wanduragala, S., DF, B. & MD, D., 2006. Tomato QM-like protein protects Saccharomyces cerevisiae cells against oxidative stress by regulating intracellular proline levels. Applied and Environmental Microbiology, 72(6), pp. 4001-4006. Cheng, N.-H.et al., 2005. Functional Association of Arabidopsis CAX1 and CAX3 Is Required for Normal Growth and Ion Homeostasis. Plant Physiology, Tom 138, p. 2048–2060 . Claisse, G., Charrier, B. & Kreis, M., 2007. The Arabidopsis thaliana GSK3/Shaggy like kinase AtSK3-2 modulates floral cell expansion. Plant Molecular Biology, Tom 64, p. 113–124. Clark, S., Running, M. & Meyerowitz, E., 1993. CLAVATA1, a regulator of meristem and flower development in Arabidopsis. Development , Tom 119, pp. 397-418. Clark, S., Williams, R. & Elliot, M. M. E., 1997. The CLAVATA1 Gene Encodes a Putative Receptor Kinase That Controls Shoot and Floral Meristem Size in Arabidopsis. Cell, Tom 89, pp. 575-585. Coimbra, S. & Pereira, L., 2012. Arabinogalactan Proteins in Arabidopsis thaliana Pollen Development. Transgenic Plants - Advances and Limitations, Tom 16, pp. 329-352. Coimbra, S. et al., 2009. Pollen grain development is compromised in Arabidopsis agp6 agp11 null mutants. Journal of Experimental Botany, Tom 60, pp. 3133-3142. Coimbra, S. et al., 2010. Early germination of Arabidopsis pollen in a double null mutant for the arabinogalactan protein genes AGP6 and AGP11. Sexual Plant Reproduction, Tom 23, pp. 199205. Coupe, S., Taylor, J. & Roberts, J., 1995. Charcterization of an mRNA encoding a metallothioneinlike protein that accumulates during ethylene-promoted abscissin of Sambucus nigra L. leaflets. Planta, Tom 197, pp. 442-447. Czechowski, T. et al., 2005. Genome-Wide Identification and Testing of Superior Reference Genes 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. for Transcript Normalization in Arabidopsis. Plant Physiology, Tom 139, pp. 5-17. Dahiya, P., Findlay, K., Roberts, K. & McCann, M., 2006. A fasciclindomain containing gene, ZeFLA11, is expressed exclusively in xylem elements that have reticulate wall thickenings in the stem vascular system of Zinnia elegans cv Envy. Planta , Tom 223, pp. 1281-1291. Deal, R., Topp, C., McKinney, E. & Meaghera, R., 2007. Repression of Flowering in Arabidopsis Requires Activation of FLOWERING LOCUS C Expression by the Histone Variant H2A.Z. The Plant Cell, Tom 19, p. 74–83. Dornelas, M., VanLammeren, A. & Kreis, M., 2000. Arabidopsis thaliana SHAGGY-related protein kinases (AtSK11 and 12) function in parianth and gynoecium development. The Plant Journal , 21(5), pp. 419-429. Dowdy, S. et al., 1991. The isolation and characterization of a novel cDNA demonstrating an altered mRNA level in nontumorigenic Wilms’ microcell hybrid cells. Nucleic Acids Research, Tom 19, pp. 5763-57-69. Emery, L., Whelan, S. K. D., Hirschi, K. & Pittman, J., 2012. Protein phylogenetic analysis of Ca2+/cation antiporters and insights into their evolution in plants. Frontiers in Plant Science, 3(1), pp. 1-19. Ferreyra, M. et al., 2010. Plant L10 Ribosomal Proteins Have Different Roles during Development and Translation under Ultraviolet-B Stress. Plant Physiology, Tom 153, pp. 1878-1894. Fujiwara, H. et al., 1997. Anthocyanin 5-aromatic acyltransferase from Gentiana triflora. Purification, characterization and its role in anthocyanin biosynthesis. European Journal of Biochemistry, Tom 249, pp. 45-51. Furuyama, T. & Dzelzkalns, V., 1999. A novel calcium-binding protein is expressed in Brassica pistils and anthers late in flower development. Plant Molecular Biology, Tom 39, p. 729–737. Galun, E., 1959. Effects of gibberellic acide and naphtalene acetic acide on sex expression and some morphological charakters in the cucumber plant. Phyton (Arg), Tom 12, pp. 1-8. Gamboa, A. et al., 2001. Floral Transcription Factor AGAMOUS Interacts in Vitro with a LeucineRich Repeat and an Acid Phosphatase Protein Complex. Biochemical and Biophysical Research Communications , Tom 288, pp. 1018-1026. Gangloff, Y.-G.et al., 2001. The histone fold is a key structural motif of transcription factor TFIID. TRENDS in Biochemical Sciences , 26(4), pp. 250-257. Garcia-Lorenzo, M., 2007. The Role of Proteases in Plant Development. brak miejsca:Umea University. Gounalaki, N., Tzamarias, D. & Vlassi, M., 2000. Identication of residues in the TPR domain of Ssn6 responsible for interaction with the Tup1 protein. FEBS Letters , Tom 473, pp. 37-41. Huang, L. Liu Y., Yu X., Xiang X., Cao J., 2011. A polygalacturonase inhibitory protein gene (BcMF19) expressed during pollen development in Chinese cabbage-pak-choi. Molecular Biology Reports, Tom 38, pp. 545-552. Jang, S. et al., 2003. The OsFOR1 gene encodes a polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) that regulates floral organ number in rice. Plant Molecular Biology , Tom 53, p. 357–369. Jeong, S., Trotochaud, A. & Clark, S., 1999. The Arabidopsis CLAVATA2 Gene Encodes a Receptor-like Protein Required for the Stability of the CLAVATA1 Receptor-like Kinase. The Plant Cell, Tom 11, p. 1925–1933. Kerk, N. et al., 2003. Laser Capture Microdissection of Cell from Plant Tissues. Plant Physiology, 132(1), pp. 27-35. Kim, B.-R.et al., 2003. Normalization of reverse transcription quantitative-PCR with housekeeping genes in rice. Biotechnology Letters, Tom 25, pp. 1869-1872. Kosik, K., 2009. Characteristic of cDNA sequences placed in bacterial vectors in relation with sex determination in cucumber. Warszawa: Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie . Kubicki, B., 1974. New sex types in cucumber and their uses in breeding work. Warszawa , XIXth International Horticultural Congress. Kudla, J., Batistič, O. & Hashimoto, K., 2010. Calcium Signals: The Lead Currency of Plant Information Processing. The Plant Cell, Tom 22, p. 541–563. Kuriyama, H. & Fukuda, H., 2002. Developmental programmed cell death in plants. Current Opinion in Plant Biology, Tom 5, pp. 568-573. Lariviére, L., Seizl, M. & Cramer, P., 2012. A structural perspective on Mediator function. Current Opinion in Cell Biology , Tom 24, pp. 305-313. Li, Z. et al., 2012. A putative positive feedback regulation mechanism in CsACS2 expression suggests a modified model for sex determination in cucumber (Cucumis sativus L.). Journal of Experimental Botany, 63(12), pp. 4475-4484. Li, Z. et al., 2012. A putative positive feedback regulation mechanism in CsACS2 expression 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. suggests a modified model for sex determination in cucumber (Cucumis sativus L.). Journal of Experimental Botany, 63(12), pp. 4475-4484. Liu, S. et al., 2008. Genetic association of ETHYLENE-INSENSITIVE3-like sequence with the sex-determining M locus in cucumber (Cucumis sativus L.). Theoretical and Applied Genetics, Tom 117, pp. 927-933. Low, E.-T.et al., 2008. Oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) tissue culture ESTs: Identifying genes associated with callogenesis and embryogenesis. BMC Plant Biology , Tom 8, p. 62. Marchler-Bauer, A. et al., 2011. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins.. Nucleic Acids Research, 39(D), McCormick, S., 1993. Male gametophyte development. The Plant Cell , Tom 5, pp. 1265-1257. Migocka, M. & Papierniak, A., 2010. Identification of suitable reference genes for sutdying gene expression in cucumber plants subjected to abiotic stress and growth regulators. Molecular Breeding, 28(3), pp. 343-357. Murphy, D., 2001. The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and microorganisms. Progress in Lipid Research, Tom 40, pp. 325-438. Park, S.-Y.et al., 2000. A lipid transfer-like protein is necessaryfor lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix. The Plant Cell, Tom 12, p. 151–164. Persson, S. et al., 2005. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Tom 102, pp. 8633-8638. Przybecki, Z. et al., 2003. The isolation of cDNA clones from cucumber (Cucumis sativus L.) floral buds coming from plants differing in sex. Cellular & Molecular Biology Letters, Tom 8, p. 421–438. Raven, J., Evans, M. & Korb, R., 1999. The role of trace metals in photosynthetic electron transport in O2-evolving organisms. Photosynthesis Research , Tom 60, pp. 111-149. Rozhon, W. et al., 2010. ASKh, a group-III Arabidopsis GSK3, functions in the brassinosteroid signalling pathway. The Plant Journal, Tom 215-223, p. 62. Seifert, G. & Roberts, K., 2007. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology, Tom 58, pp. 137-161. Sicilia, F. et al., 2005. The Polygalacturonase-Inhibiting Protein PGIP2 of Phaseolus vulgaris Has Evolved a Mixed Mode of Inhibition of Endopolygalacturonase PG1 of Botrytis cinerea. Plant Physiology, Tom 139, pp. 1380-1388. Singh, K., Paul, A., Kumar, S. & Ahuja, P., 2009. Cloning and differential expression of QM like protein homologue from tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]. Molecular Biology Reports, Tom 36, p. 921–927. Steinmayr, M. et al., 1994. FIL2, an extracellular Leucine-Rich Repeat protein, is specifically expressed in Antirrhinum flowers. Plant Journal , 5(4), pp. 459-467. Suzaki, T. et al., 2004. The gene FLORAL ORGAN NUMBER1 regulates floral meristem size in rice and encodes a leucine-rich repeat receptor kinase orthologous to Arabidopsis CLAVATA1. Development , 131(22), pp. 5649 - 5657. Torti, S. et al., 2012. Analysis of the Arabidopsis Shoot Meristem Transcriptome during Floral Transition Identifies Distinct Regulatory Patterns and a Leucine-Rich Repeat Protein That Promotes Flowering. The Plant Cell, Tom 24, pp. 444-462. Trebitsh, T., Staub, J. & O‘Neill, S., 1997. Identification of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase gene linked to the Female (F) locus that enhances female sex expression in cucumber. Plant Physiology, Tom 113, p. 987–995. Trotochaud, A. et al., 1999. The CLAVATA1 Receptor-like Kinase Requires CLAVATA3 for Its Assembly into a Signaling Complex That Includes KAPP and a Rho-Related Protein. The Plant Cell, Tom 11, pp. 393-405. Wan, H. et al., 2010. Selection of appropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real-time polymerase chain reaction in cucumber. Analytical Biochemistry, Tom 399, pp. 257-261. Warren, A., 2002. Eukaryotic transcription factors. Current Opinion in Structural Biology, Tom 12, p. 107–114. Witkowicz, J. et al., nieopublikowane. Analysis of ESTs, differentially regulated during flower sex determination in different cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines. Wóycicki, R. et al., 2011. The Genome Sequence of the North-European Cucumber (Cucumis sativus L.) Unravels Evolutionary Adaptation Mechanisms in Plants. PloS ONE, 6(7), p. e22728. Wu, Y., Tulsieram, L. & Rothstein, S., 2001. Identification and characterization of a putative lightharvesting chlorophyll a/b-binding protein gene encoded at a fertility restorer locus for the Ogura 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. CMS in Brassica napus L. Theoretical and Applied Genetics, Tom 102, p. 759–766. Xu, Q. & Zhang, L., 2009. Plant caspase-like proteases in plant programmed cell death. Plant Signaling & Behavior , 4(9), pp. 902-904. Yan, Z. et al., 2009. BIN2 Functions Redundantly with Other Arabidopsis GSK3-Like Kinases to Regulate Brassinosteroid Signaling. Plant Physiology , Tom 150, pp. 710-721. Ye, H. et al., 2006. CpSufE Activates the Cysteine Desulfurase CpNifS for Chloroplastic Fe-S Cluster Formation. The Journal of Biological Chemistry , 281(13), p. 8958–8969. Young, N. et al., 2011. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature , Tom 480, pp. 520-524. Zhang, D. et al., 2010. OsC6, Encoding a Lipid Transfer Protein, Is Required for Postmeiotic Anther Development In Rice. Plant Physiology , Tom 154, pp. 149-162. Zhang, D. et al., 2010. OsC6, encoding a lipid transfer protein, is required for postmeiotic anther development in rice. Plant Physiology , Tom 154, pp. 149-162. Zhanga, D.-S.et al., 2008. Tapetum Degeneration Retardation is Critical for Aliphatic Metabolism and Gene Regulation during Rice Pollen Developmen. Molecular Plant, 1(4), pp. 599-610. Zhou, Z. et al., 2012. BnMs3 is required for tapetal differentiation and degradation, microspore separation, and pollen-wall biosynthesis in Brassica napus. Journal of Experimental Botany, 63(5), pp. 2041-2058.
