(11) PL/EP 2333076 PL/EP 2333076 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
19.09.2006 10004151.6
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
2333076
T3
Int.Cl.
C12N 15/82 (2006.01)
C12N 9/00 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
29.04.2015 Europejski Biuletyn Patentowy 2015/18
EP 2333076 B1
A23L 1/217 (2006.01)
C12N 9/82 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Żywność o niskiej zawartości akrylamidu
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
20.09.2005 US 718335 P
28.07.2006 US 833788 P
Zgłoszenie ogłoszono:
15.06.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/24
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.08.2015 Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/08
(73)
Uprawniony z patentu:
PL/EP 2333076 T3
J.R. Simplot Company, Boise, US
(72)
Twórca(y) wynalazku:
CAIUS ROMMENS, Boise, US
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Alicja Rumpel
RUMPEL SP. K.
Al. Śmigłego-Rydza 29 m. 11
93-281 Łódź
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1
Żywność o niskiej zawartości akrylamidu
Opis
DZIEDZINA WYNALAZKU
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy genetycznych sposobów regulacji w dół i
w górę genów w roślinie, na przykład w bogatych w skrobię organach
spichrzowych tych roślin, w celu zmniejszenia poziomu akrylamidu, który
gromadzi się podczas przetwarzania związanego z ogrzewaniem tych
organów.
Stan techniki
[0002] Ogrzewanie żywności, która zawiera zarówno wolną asparaginę, jak i
cukry redukujące prowadzi do wytworzenia akrylamidu. Akrylamid jest
przemysłową substancją chemiczną stosowaną na całym świecie do syntezy
poliakrylamidu. Narażenie na ten reaktywny związek powoduje szybkie
wchłanianie, a nawet rozprowadzenie go wśród tkanek (Barber et al.,
Neurotoxicology 2001, 22, 341-353). U gryzoni, efekty toksykologiczne
wysokich stężeń akrylamidu (> 2 mg/kg masy ciała) obejmują objawy
neurologiczne, obniżoną płodność i raka (Friedman, J. Agric. Food Chem.,
2003, 51, 4504-4526).
[0003] Wiadomo także, że narażenie zawodowe na wysokie poziomy
akrylamidu
podnosi
częstość
(LoPachin,
Neurotoxicology,
wypadków
2004,
25,
neurotoksyczności
617-630),
ale
u
ludzi
brak
jest
udokumentowanego doniesień o wpływie akrylamidu na ludzką reprodukcję
lub kancerogenezę. Zarówno akrylamid, jak i jego utleniony metabolit
glicydoamid, reagują poprzez walinę na końcu aminowym, z hemoglobiną,
tworząc związki addycyjne. Wysoki stopień tworzenia związków addycyjnych
jest dobrym markerem poziomów ekspozycji i wskazuje na dzienną dawkę
zbliżoną do 100 µg (Tareke et al., J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 49985006). Chociaż początkowo sądzono, że tylko woda pitna, kosmetyki i
palenie stanowią główne źródła narażenia na akrylamid (Bergmark, Chem.
Res. Toxicol., 1997, 10, 78-84), to ostatnie analizy wskazują, że spożywanie
smażonych i pieczonych produktów skrobiowych przyczynia się do około
2
36% spożycia akrylamidu (Becker and Pearson, Dietary habits and nutrient
intake in Sweden 1997-98. Riksmaten 1997-98, 1999).
[0004] Akrylamid w diecie w dużym stopniu pochodzi z indukowanych przez
ogrzewanie reakcji pomiędzy grupą aminową wolnych aminokwasów
asparaginy i grupą karbonylową cukrów redukujących (Mottram et al.,
Nature, 2002, 419, 448-449 ; Stadler et al., Nature, 2002, 419, 449-450).
Bulwy świeżych ziemniaków zawierają bardzo wysokie poziomy asparaginy
lecz stosunkowo niskie stężenia cukrów redukujących fruktozy i glukozy.
Jednakże, cukry redukujące gromadzą się w czasie przechowywania na
zimno przez ekspresję indukowanej zimnem inwertazy, która katalizuje
przekształcenie sacharozy w glukozę i fruktozę.
[0005] Wcześniejsze próby mające na celu ograniczenie gromadzenia
akrylamidu w żywności zawierającej skrobię nie przyniosły uzyskania
praktycznego i opłacalnego zastosowania. Pierwszy sposób znany ze stanu
techniki jest oparty na modyfikacji parametrów przetwarzania, takich jak
stosunek powierzchni do objętości, temperatura i czas smażenia. Mimo, że
zastosowanie takich metod może być częściowo skuteczne w zmniejszaniu
akumulacji akrylamidu, to zmienia charakterystykę sensoryczną końcowego
produktu żywnościowego przez redukcję koloru, modyfikację kształtu oraz
zmianę smaku i faktury. Takie zmiany są niepożądane.
[0006] Druga metoda jest oparta na inkubacji częściowo przetworzonych
produktach żywnościowych z asparaginazą (EC 3.5.1.1) lub gluminazą (EC
3.4.1.2) przed ogrzewaniem (patrz międzynarodowe zgłoszenia patentowe
2004/030468 A3 i 2004/026042 A1). Metoda ta jest droga i łatwa do
stosowania jedynie w przypadku materiałów, takich jak mąka pszenna, którą
można łatwo zmieszać z enzymem.
[0007] Trzecia metoda polega na dodaniu konkurenta asparaginy, np. glicyny
do
częściowo
przetworzonej
żywności
(zgłoszenia
patentowe
WO
2005/025330 A1 dla bulw ziemniaka, US 2004/0081724 A1 dla palonych
ziaren kawy, WO 2005/004620 A1 dla ziaren kakao, WO 2005/004628 A1 dla
żywności opartej na kukurydzy). Metoda ta jest skuteczna tylko częściowo,
3
wymaga wysokich stężeń dodatku i jest zbyt kosztowna do szerokiego
stosowania.
[0008] Czwarty sposób polega na dodaniu enzymu zmieniającego cukier
redukujący, obejmujący reduktazę aldozy, do materiału żywnościowego
przed ogrzewaniem (patrz patent US 6989167). Metoda ta nie jest bardzo
skuteczna i zbyt kosztowna do szerokiego stosowania.
[0009] Piąty sposób polega na pokrywaniu żywności reagentem wybranym z
grupy obejmującej: związki zawierające aminokwas, sole aminokwasu, amid
aminokwasu, ester aminokwasu i ich mieszaniny, przed ogrzewaniem (patrz
zgłoszenie patentowe WO 2005/077203A3). Metoda ta jet tylko częściowo
skuteczna i zbyt kosztowna do szerokiego stosowania.
[0010] Metoda szósta opiera się na wyborze plazmy zarodkowej, która
zawiera niezwykle niskie poziomy zarówno cukrów redukujących, jak i
asparaginy.
Dostępność
wprowadzenie
cech
takiej
"niskiego
plazmy
poziomu
zarodkowej
cukru"
i
pozwoliłaby
"niskiego
na
poziomu
asparaginy" do odmian, które można szeroko stosować w przemyśle
spożywczym. Jednak dotychczas nie zidentyfikowano roślin uprawnych z
nikim poziomem asparaginy. Nawet jeśli taka plazma zarodkowa zostałaby
odkryta w przyszłości, wprowadzenie pożądanych cech do odmian
handlowych zajęłoby co najmniej 15 do 20 lat .
[0011] Siódmy sposób polega na modyfikacji genetycznej w celu
zmniejszenia poziomów cukrów redukujących. Metoda ta opiera się na
regulacji w dół ekspresji genów zaangażowanych w rozkład skrobi, takich jak
związane ze skrobią ziemniaczaną gen R1 i gen fosforylazy L (patrz, na
przykład, zgłoszenie patentowe US 2003/0221213 A1). Chociaż sposób jest
częściowo
skuteczny,
przetworzona
żywność
pochodząca
z
roślin
modyfikowanych nadal zawiera około jednej trzeciej poziomów akrylamidu,
które znajdują się w produktach kontrolnych.
[0012] Tak więc, istnieje istotne zapotrzebowanie na sposoby redukcji
poziomów akrylamidu w przetworzonej żywności, otrzymywanej z roślin
skrobiowych. Metody takie powinny być efektywnd pod względem kosztów,
4
bez obniżania właściwości sensorycznych żywności. Niniejszy wynalazek
przedstawia takie sposoby.
Skrót opisu wynalazku
[0013] W pierwszym aspekcie wynalazek przedstawia produkt z poddanych
obróbce termicznej bulw, otrzymanych z rośliny ziemniaka, w których poziom
biosyntezy asparaginy jest obniżony przez zmniejszenie ekspresji genu
syntetazy asparaginowej I kodowanego przez sekwencję SEQ ID NR: 1, przy
czym wyrób z bulw poddanych obróbce cieplnej ma co najmniej 70% niższe
stężenie akrylamidu niż produkty z bulw poddanych obróbce termicznej,
wykonany z odpowiedniej tkanki identycznej rośliny nietransgenicznej.
[0014] Korzystne przykłady wykonania niniejszego wynalazku, w ramach
różnych aspektów są takie, jak opisano poniżej lub jak zdefiniowano w
zastrzeżeniach patentowych.
[0015] W jednym aspekcie wynalazku, poziom biosyntezy asparaginy jest
obniżony
przez
redukcję
ekspresji
co
najmniej
jednego
genu
zaangażowanego w biosyntezę asparaginy.
[0016] W jednym z aspektów, obniżenie ekspresji genu zaangażowanego w
biosyntezę asparaginy jest osiągnięte przez wprowadzenie do rośliny kasety
ekspresyjnej obejmującej, od 5' do 3', (i) promotor, (ii) co najmniej jedną
kopię sekwencji obejmującej co najmniej fragment co najmniej jednego genu
zaangażowanego w metabolizm asparaginy i ewentualnie, (iii) drugi promotor
lub terminator, gdzie pierwszy i ewentualnie drugi promotor są położone w
zbieżnej orientacji.
[0017] W jednym aspekcie, kaseta ekspresyjna, stosowana w celu
zmniejszenia ekspresji genu zaangażowanego w biosyntezę asparaginy
zawiera dwie kopie sekwencji obejmującej co najmniej fragment genu
zaangażowanego w metabolizm asparaginy.
[0018] W jednym aspekcie, dwie kopie są umieszczone jako (i) powtórzenie
odwrócone lub (ii) powtórzenie bezpośrednie.
[0019] W jednym aspekcie, gen zaangażowany w biosyntezę asparaginy jest
wyizolowany z ziemniaka i koduje syntetazę asparaginową.
5
[0020] W jednym aspekcie, gen syntetazy asparaginowej obejmuje
sekwencję, która ma co najmniej 70% identyczności z co najmniej
fragmentem sekwencji pokazanej w SEKW NR ID .: 1
[0021] W jednym aspekcie, promotor jest promotorem (i) genu syntazy skrobi
związanej z granulkami ziemniaka, (ii) genu pirofosforylazy ADP glukozy
ziemniaka, (iii) genu ubikwityny 7 ziemniaka, (iv) genu patatyny ziemniaka (v)
genu monooksygenazy flawonoidów ziemniaka.
[0022] W innym aspekcie, promotor jest promotorem genu, który ulega
ekspresji w bulwach roślin skrobiowych, przeznaczonych do przetwarzania
żywności.
[0023] W innym przykładzie wykonania, wynalazek przedstawia sposób
redukcji
poziomów
akrylamidu
w
żywności,
otrzymanego
poprzez
podgrzewanie tkanek roślin uprawnych, przez jednoczesne zmniejszenie
poziomów zarówno asparaginy, jak i cukrów redukujących w tkankach. W
jednym z przykładów wykonania, tkanka jest tkanką skrobiową warzywa lub
rośliny.
[0024] W jednym aspekcie, jednoczesna redukcja poziomów asparaginy i
cukrów redukujących uzyskiwana jest poprzez (i) obniżenie ekspresji genu
zaangażowanego
w
biosyntezę
asparaginy
lub
nadekspresję
genu
zaangażowanego w metabolizm asparaginy oraz (ii) obniżenie ekspresji co
najmniej jednego genu zaangażowanego w degradację skrobi.
[0025] W jednym z aspektów, obniżenie ekspresji genu zaangażowanego w
rozkład skrobi jest osiągnięte przez wprowadzenie do rośliny kasety
ekspresyjnej obejmującej, od 5' do 3', (i) promotor, (ii) co najmniej jedną
kopię sekwencji obejmującej co najmniej fragment co najmniej jednego genu
zaangażowanego w rozkład skrobi i ewentualnie, (iii) drugi promotor lub
terminator, gdzie pierwszy i ewentualnie drugi promotor są położone w
zbieżnej orientacji.
[0026] W jednym aspekcie, gen zaangażowany w rozkład skrobi jest
wybrany z grupy składającej się z (i) genu R1 związanego ze skrobią, oraz
(ii) genu związanej ze skrobią fosforylazy L
6
[0027] W jednym z przykładów wykonania bulwą transgeniczną jest
ziemniak.
W
ziemniaczana.
innym
W
przykładzie
jeszcze
innym
wykonania,
wyrobem
jest
frytka
wyrobem
jest
czips
wykonaniu,
ziemniaczany.
[0028] Przyjmując przy określaniu zawartości ilość cząsteczek na miliard
(ang. parts per billion - ppb) , pieczone ziemniaki, lub chipsy lub placki
ziemniaczane wytwarzane z bulw według niniejszego wynalazku mogą
zawierać pomiędzy 1-20 ppb, 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60- 80 ppb, 80-100 ppb,
100-120 ppb, 120-140 ppb, 140-160 ppb, 160-180 ppb lub 180-200 ppb
akrylamidu.
[0029] Zastosowanie metod opisanych w niniejszym wynalazku obniża
poziomy akrylamidu o co najmniej 5%, co najmniej około 10%, co najmniej
około 15%, co najmniej około 20%, co najmniej około 25%, co najmniej około
30%, co najmniej około 35%, co najmniej około 40%, co najmniej około 45%,
50%, o co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około
80%, co najmniej około 90 % albo o więcej niż o 90%.
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
[0030]
Figura 1: Diagram (A) pSIM1148, (B) pSIM1151 i (C) pSIM658. LB =
lewa granica T-DNA, P: Agp promotor Agp ziemniaka, 2a =
antysensowna kopia fragmentu genu ast2, 1a = antysensowna kopia
fragmentu genu ast1, 1b = sensowna kopia fragmentu genu ast1, 2b =
sensowna kopia fragmentu genu ast2, P:Gbss promotor Gbss
ziemniaka, T:nos = terminator genu syntazy nopaliny Agrobacterium,
P:nos = promotor genu syntazy nopaliny Agrobacterium, RB = prawa
granica T-DNA, P:Ubi7 = promotor genu ubikwityny-7 ziemniaka.
Figura 2: Konstrukt Russeta Boise'a. PF = fragment promotora, GF =
fragment genu.
SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH PRZYKŁADÓW WYKONANIA
[0031] W niniejszym dokumencie opisano sekwencje polinukleotydowe i
sposoby redukcji poziomów akrylamidu.
7
[0032] Niniejszy wynalazek wykorzystuje terminy i zwroty dobrze znane
specjalistom w tej dziedzinie. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie
określenia techniczne i naukowe użyte w niniejszym opisie, mają takie samo
znaczenie, jak powszechnie rozumiane przez fachowców w dziedzinie, do
której należy wynalazek. Ogólnie, stosowana tu nomenklatura oraz
procedury laboratoryjne dotyczące hodowli komórek, genetyki molekularnej
oraz kwasów nukleinowych, chemii kwasu i hybrydyzacji opisane w
niniejszym wynalazku są dobrze znane i powszechnie stosowane w stanie
techniki.
W
metodach
polinukleotydów,
hodowli
rekombinacji
kwasów
drobnoustrojów,
nukleinowych,
hodowli
komórek,
syntezie
hodowli
tkankowej, transformacji, transfekcji, transdukcji, chemii analitycznej, chemii
syntezy organicznej, syntezach chemicznych, analizie chemicznej oraz
formulacji i podawania farmaceutycznego stosowane są standardowe
techniki. Ogólnie, reakcje enzymatyczne i etapy oczyszczania i/lub izolacji są
wykonywane zgodnie z zaleceniami producenta. Techniki i procedury
przeprowadza się na ogół według konwencjonalnych metod (Klonowanie
molekularne, instrukcja doświadczalna, 3. wydanie, red. Sambrook i Russel
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).
[0033] Akrylamid: Akrylamid jest monomerem, uważanym za toksyczny,
bezpośrednio wpływający na układ nerwowy. Może być uznany za czynnik
rakotwórczy. Akrylamid jest z łatwością absorbowany przez nieuszkodzoną
skórę z roztworów wodnych. Wzór cząsteczkowy to C3H5NO; struktura:
CH2=CH-CO-NH2.
[0034] Transformacja Agrobacterium lub za pomocą bakterii: jak dobrze
wiadomo w tej dziedzinie, Agrobacteria, które są stosowane do transformacji
komórek roślinnych są rozbrojonymi i zakaźnymi pochodnymi, zazwyczaj,
Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes. Po infekcji roślin,
eksplantatów, komórek lub protoplastów Agrobacterium przenosi segment
DNA z wektora plazmidowego do jądra komórek roślinnych. Wektor
zazwyczaj zawiera pożądany polinukleotyd, który jest umieszczony pomiędzy
granicami T-DNA lub P-DNA. Można stosować dowolne bakterie, zdolne do
transformowania komórek roślinnych, takie jak Rhizobium trifolii, Rhizobium
8
leguininosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, Sinorhizobium meliloti i
Mesorhizobium loti.
[0035] Okrytozalążkowe: rośliny naczyniowe posiadające nasiona zamknięte
w zalążni. Roślinami okrytozalążkowymi są rośliny nasienne, które produkują
kwiaty, które wydają owoce. Rośliny okrytozalążkowe dzielą się na rośliny
dwuliścienne i jednoliścienne.
[0036] Biosynteza asparaginy: reakcje katalizowane enzymatycznie, które
zachodzą w roślinie w celu wytwarzania asparaginy
[0037] Metabolizm asparaginy: reakcje katalizowane enzymatycznie, które
zachodzą w roślinie w celu konwersji asparaginy w inne związki
[0038]
Asparaginaza: Asparaginaza,
która
znajduje
się
w
różnych
komórkach roślinnych, zwierzęcych i bakteryjnych, jest enzymem biorącym
udział w metabolizmie asparaginy. Katalizuje ona deaminację asparaginy z
wytworzeniem kwasu asparaginowegoy i jonu amonowego, dając w wyniku
wyczerpanie krążącej wolnej asparaginy.
[0039] Syntetaza asparaginy: Enzym ten jest zaangażowany w biosyntezę
asparaginy i katalizuje syntezę asparaginy z asparaginianu.
[0040] Odporność na antybiotyk: zdolność komórki do przeżycia w
obecności antybiotyku, oporność na antybiotyk, w użytym tu znaczeniu,
wynika z ekspresji genu oporności na antybiotyk w komórce gospodarza.
Komórki może cechować oporność wobec dowolnego antybiotyku. Przykłady
powszechnie
stosowanych
antybiotyków
obejmują
kanamycynę
i
higromycynę.
[0041] Rośliny dwuliścienne (dwuliścienne): roślina kwitnąca, której zarodki
posiadają dwie połówki nasion lub liścienie, rozgałęzione żyły liści i części
kwiatowe
w
wielokrotności
czterech
lub
pięciu.
Przykłady
roślin
dwuliściennych obejmują, ale nie są do nich ograniczone, ziemniaka, buraka
cukrowego, brokuły, maniok, ziemniaki, słodką paprykę, poinsecję, fasolę,
lucernę, soję i awokado.
[0042] Endogenny: kwas nukleinowego, gen, polinukleotyd, DNA, RNA,
mRNA lub cDNA, wyizolowany z genomu rośliny lub gatunku rośliny, który
ma zostać poddany transformacji lub wyizolowany z rośliny lub gatunku,
9
który jest płciowo zgodny lub zdolny do rozmnażania z gatunkiem rośliny
który ma zostać poddany transformacji, jest "natywnym" to, znaczy
miejscowym gatunkiem roślin.
[0043] Kaseta ekspresyjna: polinukleotyd obejmujący, od 5' do 3', (a)
pierwszy promotor, (b) sekwencję zawierającą (i) co najmniej jedną kopię
genu lub fragmentu genu, lub (ii) co najmniej jeden kopię fragmentu
promotora genu i (c) albo terminator lub drugi promotor, który umieszczony
jest w kierunku przeciwnym do pierwszego kierunku, co promotor.
[0044] Obcy: "obcy", w odniesieniu do kwasu nukleinowego oznacza, że
kwas nukleinowy pochodzi z organizmów nieroślinnych, lub pochodzi z
rośliny, która nie jest tego samego gatunku, co roślina która ma być poddana
transformacji lub pochodzi z rośliny, która nie jest płciowo zgodna z rośliną
do transformacji, nie należy do gatunku rośliny docelowej. Odpowiednio,
obce DNA lub RNA, oznacza kwasy nukleinowe naturalnie występujące w
kodzie genetycznym grzybów, bakterii, wirusów, ssaków, ryb lub ptaków, lecz
nie występujące naturalnie w roślinie, która ma być transformowana. Zatem,
obcy kwas nukleinowy to taki, który koduje, na przykład, polipeptyd, który nie
jest naturalnie produkowany przez transformowane rośliny. Obcy kwas
nukleinowy nie musi kodować produktu białkowego.
[0045] Gen: gen jest segmentem cząsteczki DNA, który zawiera wszystkie
informacje wymagane do syntezy produktu, łańcucha polipeptydowego lub
cząsteczki RNA, które mogą zawierać zarówno sekwencje kodujące i
niekodujące. Gen może też reprezentować wiele sekwencji, z których każda
może być niezależnie eksprymowana i może kodować nieco różne białka,
które wykazują taką samą aktywność funkcjonalną. Na przykład, geny
syntetazy asparaginowej 1 i 2 mogą być wspólnie określane jako gen.
[0046] Element genetyczny: "element genetyczny" jest dowolną dyskretną
sekwencją nukleotydową, taką jak, ale nie wyłącznie, promotor, gen,
terminator, intron, sekwencja wzmacniająca (enhancer), wstawka, nie
podlegający translacji region 5', nie podlegający translacji region 3' lub
miejsce rozpoznawania rekombinazy.
10
[0047] Modyfikacja genetyczna: stabilne wprowadzenie DNA do genomu
określonych organizmów, przy zastosowaniu metod biologii molekularnej i
komórkowej.
[0048] Nagonasienne: w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie,
odnosi się do nasion rośliny, która nosi nasiona bez zalążni. Przykłady
nagonasiennych obejmują drzewa iglaste, sagowce, miłorzębowate i
przęślowate.
[0049] Wprowadzenie: w użytym tu znaczeniu, odnosi się do insercji
sekwencji kwasu nukleinowego do komórki, metodami obejmującymi,
zakażenie, transfekcję, transformację lub transdukcję.
[0050] Rośliny jednoliścienne (jednoliścienne): roślina kwitnąca, o zarodkach
z jednym liścieniem lub liściem nasienia, równoległymi żyłami liści i częściami
kwiatowymi w wielokrotności trzech. Przykładami roślin jednoliściennych są,
między innymi, kukurydza, ryż, owies, pszenica, jęczmień i sorgo.
[0051] Natywny (rodzimy): kwas nukleinowy, gen, polinukleotyd, DNA, RNA,
mRNA lub cDNA, wyizolowany z genomu rośliny lub gatunku rośliny, który
ma zostać poddany transformacji lub wyizolowany z rośliny lub gatunku,
który jest płciowo zgodny lub zdolny do rozmnażania z gatunkiem rośliny
który ma zostać poddany transformacji, jest "natywnym" to, znaczy
miejscowym gatunkiem roślin.
[0052]
Natywny
(rodzimy)
DNA:
dowolny
kwas
nukleinowy,
gen,
polinukleotyd, DNA, RNA, mRNA lub cDNA, wyizolowany z genomu rośliny
lub gatunku rośliny, który ma zostać poddany transformacji lub wyizolowany
z rośliny lub gatunku, który jest płciowo zgodny lub zdolny do rozmnażania z
gatunkiem rośliny który ma zostać poddany transformacji, jest "natywnym" to,
znaczy miejscowym gatunkiem roślin. Innymi słowy, natywny (rodzimy)
element genetyczny reprezentuje cały materiał genetyczny, który jest
dostępny dla hodowców roślin dla udoskonalania roślin za pomocą
klasycznej hodowli roślin. Wszelkie odmiany natywnego kwasu nukleinowego
są również uważane za "natywne" według niniejszego wynalazku. Na
przykład, rodzimy DNA może obejmować mutację punktową, ponieważ takie
mutacje punktowe występują naturalnie. Możliwe jest również połączenie
11
dwóch różnych rodzimych cząsteczek DNA przez zastosowanie miejsc
restrykcyjnych, ponieważ takie miejsca występują powszechnie w genomach
roślinnych.
[0053] Natywny konstrukt kwasu nukleinowego: polinukleotyd obejmujący
co najmniej jeden rodzimy DNA.
[0054] Funkcjonalnie połączony: łączenie dwóch lub większej liczby
cząsteczek w taki sposób, że połączone funkcjonują prawidłowo w komórce
roślinnej. Na przykład, promotor jest funkcjonalnie połączony z genem
strukturalnym, kiedy promotor kontroluje transkrypcję genu strukturalnego.
[0055] Nadekspresja: ekspresja genu do poziomów, które są wyższe niż te
w roślinach, które nie są transgeniczne.
[0056] P-DNA: transferowe DNA pochodzenia roślinnego ("P-DNA"),
sekwencja graniczna niniejszego wynalazku nie jest identyczna w sekwencji
nukleotydowej z dowolną znaną sekwencją graniczną T-DNA pochodzącą z
bakterii, lecz działa zasadniczo w tym samym celu. To znaczy, P-DNA
można stosować do transferu i integracji jednego polinukleotydu do innego.
P-DNA można wstawić do plazmidu indukującego guza, takiego jak plazmid
Ti z Agrobacterum w miejsce tradycyjnego T-DNA i utrzymywać w szczepie
bakterii, tak jak konwencjonalne plazmidy do transformacji. P-DNA można
poddawać manipulacjom tak, aby zawierał pożądany polinukleotyd, który jest
przeznaczony do integracji do genomu roślinnego przez transformację roślin
za pośrednictwem bakterii. Patrz Rommens i in. w WO2003/069980,US2003-0221213, US-2004-0107455, and WO2005/004585.
[0057] Fenotyp: fenotyp jest wyróżniającą lub charakterystyczną cechą
rośliny, którą można zmienić, poprzez włączenie jednego lub większej liczby
"pożądanych polinukleotydów" i/lub markerów uzyskanych przez badania
przesiewowe/selekcję do genomu co najmniej jednej komórki roślinnej
transformowanej rośliny. "Pożądany polinukleotyd (y)" i/lub markery mogą
powodować
zmianę
zmodyfikowanie
fenotypu
dowolnej
z
transformowanej
wielu
rośliny,
genetycznych,
poprzez
molekularnych,
biochemicznych, fizjologicznych, morfologicznych lub agronomicznych cech
charakterystycznych lub własności komórki transformowanej rośliny lub
12
rośliny jako całości. Zatem, ekspresja jednego lub większej liczby stabilnie
zintegrowanego pożądanego polinukleotydu (ów) w genomie roślin, które
dają w wyniku fenotyp o zredukowanych stężeniach akrylamidu w tkankach
roślinnych.
[0058] Tkanka roślinna: "roślina" jest dowolnym z różnych organizmów
fotosyntetyzujących,
eukariotycznych,
wielokomórkowych
organizmów
należących do królestwa Plantae charakterystycznie wytwarzających zarodki,
zawierających chlorofil i posiadających ścianki z komórek celulozy. Część
rośliny, tzn. "tkankę rośliny" można poddać obróbce w celu wytworzenia
rośliny
transgenicznej.
Odpowiednie
tkanki
roślinne,
które
można
transformować , obejmują, ale nie są ograniczone do nich, zarodki
somatyczne, pyłek kwiatowy, liście, łodygi, kalus, rozłogi, mikrobulwy i pędy.
Tak więc wynalazek przewiduje transformację roślin okrytonasiennych i
nagonasiennych, takich jak pszenica, kukurydza, ryż, jęczmień, owies, burak
cukrowy, ziemniak, pomidor, lucerna, maniok, batat i soja. Zgodnie z
niniejszym wynalazkiem określenie "tkanka roślinna" obejmuje także komórki
roślinne. Komórki roślinne obejmują hodowle zawiesinowe, kalusa, zarodki,
regiony merystematyczne, tkanki kalusa, liście, korzenie, pędy, gametofity,
sporofity, pyłki roślin, nasiona i mikrospory. Tkanki roślinne mogą znajdować
się w różnych stadiach dojrzałości i mogą rosnąć w hodowli płynnej lub stałej,
lub w glebie, lub odpowiednich pożywkach w doniczkach, szklarniach lub na
polach. Tkanka roślinna odnosi się także do dowolnego klonu takiej rośliny,
nasiona, potomstwa, propaguli wytworzonej drogą płciową lub drogą
bezpłciową i potomków dowolnego z nich, takich jak części cięte lub nasiono.
Przedmiotem szczególnego zainteresowania są ziemniak, kukurydza i
pszenica.
[0059] Transformacja roślin i hodowla komórek: zasadniczo odnosi się do
procesu, w którym komórki roślinne są modyfikowane genetycznie i
przenoszone
do
odpowiedniej
pożywki
hodowli
roślinnych
w
celu
konserwacji, dalszego wzrostu i/lub dalszego rozwoju w roślinach. Takie
sposoby są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
13
[0060] Przetwarzanie: proces wytwarzania żywności z (1) materiału
siewnego, na przykład, pszenicy, kukurydzy, rośliny kawy lub drzewa kakao,
(2) bulwy, na przykład, ziemniaka lub (3) korzenia, na przykład, słodkich
ziemniaków i yamów, obejmujący ogrzewanie do co najmniej 120 °C.
Przykłady przetworzonej żywności obejmują chleb, płatki śniadaniowe,
ciastka, ciasta, tosty, pizzę, precle, tortille, frytki, frytki pieczone w piekarniku,
chipsy ziemniaczane, placki ziemniaczane, paloną kawę i kakao.
[0061]
Potomstwo:
"potomstwo"
,
takie
jak
potomstwo
rośliny
transgenicznej, jest narodzone, spłodzone lub pochodzi z rośliny lub rośliny
transgenicznej. Zatem "potomna" roślina , tzn. roślina pokolenia "F1" jest
potomstwem lub potomkiem rośliny transgenicznej.
[0062] Potomstwo rośliny transgenicznej może zawierać co najmniej jedną,
kilka lub wszystkie z jej genomów komórkowych, pożądany polinukleotyd,
który zintegrowano z komórką macierzystej rośliny transgenicznej za pomocą
metod opisanych w niniejszym dokumencie. Zatem, pożądany polinukleotyd
jest "przekazywany" lub "odziedziczony" przez roślinę potomną. Pożądany
polinukleotyd, który jest tak dziedziczony przez roślinę potomną może
znajdować się w obrębie konstruktu T-DNA lub P-DNA, który jest także
dziedziczony przez roślinę potomną od rodzica. Termin "potomstwo", jak
stosowany w niniejszym dokumencie, może być także uważany za
potomstwo grupy roślin.
[0063] Promotor: przez promotor należy rozumieć kwas nukleinowy,
korzystnie DNA, który wiąże polimerazę RNA i/lub inne elementy regulacji
transkrypcji. Tak jak dowolny promotor, promotory według niniejszego
wynalazku będą ułatwiać lub kontrolować transkrypcję DNA lub RNA w celu
wytworzenia cząsteczki mRNA z cząsteczki kwasu nukleinowego, który jest
funkcjonalnie
połączony
z
promotorem. Jak
wspomniano wcześniej,
wytworzone RNA może kodować białko lub polipeptyd lub może kodować
interferujący RNA lub cząsteczkę antysensowną.
[0064] Promotor oznacza sekwencję kwasu nukleinowego, która umożliwia
transkrypcję genu, z którym jest związana. W komórkach prokariotycznych,
promotor składa się zazwyczaj z dwóch krótkich sekwencji w pozycji -10 i -35
14
powyżej genu, to znaczy, przed genem, w kierunku transkrypcji. Sekwencja
w pozycji -10 jest nazywana kasetą Pribnowa i zazwyczaj składa się z
sześciu nukleotydów TATAAT. Kaseta Pribnowa jest niezbędna do startu
transkrypcji u prokariotów. Sekwencja w pozycji -35 zazwyczaj składa się z
sześciu nukleotydów TTGACA, jej obecność ułatwia szybkość transkrypcji.
[0065] Promotory eukariotyczne są bardziej zróżnicowane, a zatem
trudniejsze do scharakteryzowania, ale istnieją pewne podstawowe cechy.
Na przykład, promotory eukariotyczne zazwyczaj leżą powyżej genu, z
którymi są najczęściej bezpośrednio związane. Promotory mogą mieć
elementy regulacyjne położone kilka tysięcy par zasad od miejsca startu ich
transkrypcji,
ponieważ
niektóre
formacje
struktur
trzeciorzędowych
kompleksu transkrypcyjnego mogą powodować składanie DNA, które
przenosi te elementy regulacyjne bliżej do faktycznego miejsca transkrypcji.
Wiele promotorów eukariotycznych zawiera sekwencję "kasety TATA",
zazwyczaj oznaczaną przez sekwencję nukleotydów, TATAAA. Element ten
wiąże białko wiążące TATA, które wspomaga tworzenie się kompleksu
transkrypcyjnego polimerazy RNA. Kaseta TATA zazwyczaj leży w odległości
50 zasad od miejsca startu transkrypcji.
[0066] Promotory eukariotyczne charakteryzują się także obecnością
pewnych sekwencji regulatorowych, które wiążą czynniki transkrypcyjne
zaangażowane w tworzenie kompleksu transkrypcyjnego. Przykładem jest
kaseta E oznaczana przez sekwencję CACGTG, która wiąże czynniki
transkrypcyjne z rodziny zasada-helisa-pętla-helisa. Przykładem są również
regiony, które mają wysoką zawartość nukleotydu GC.
[0067] Zatem, sekwencja częściowa albo specyficzny "fragment" promotora,
powiedzmy na przykład genu syntetazy asparaginowej, które mogą być
wykorzystane
przy
projektowaniu
pożądanego
polinukleotydu,
mogą
zawierać jeden lub większą ilość z tych elementów lub mogą nie zawierać
żadnego z tych elementów. Sekwencja fragmentu promotora może nie być
funkcjonalna i może nie zawierać kasety TATA.
[0068] Inną cechą charakterystyczną konstruktu według niniejszego
wynalazku jest to, że wywołuje zbieżną transkrypcją jednej lub większej
15
liczby kopii polinukleotydu, które są lub nie są bezpośrednio funkcjonalnie
połączone z terminatorem, przez dwa przeciwstawne promotory. Ze względu
na brak sygnału terminacji, długość cząsteczek RNA w puli, które są
transkrybowane z pierwszego i drugego promotora, może być różna.
[0069] Czasami, na przykład, maszyny transkrypcyjna może kontynuować
transkrypcję za ostatni nukleotyd, który oznacza "koniec" sekwencji
pożądanego polinukleotydu. Zatem, w tym szczególnym układzie, terminacja
transkrypcji może zachodzić albo przez słabe i niezamierzone działanie
dalszych sekwencji, które, na przykład, ułatwiające tworzenie formacji spinki
do włosów lub dzięki działaniu niezamierzonych terminatorów transkrypcji
położonych w DNA rośliny flankującym miejsce integracji transferowego
DNA.
[0070] Pożądany polinukleotyd może być połączony z promotorem w dwóch
różnych orientacjach. W jednym kierunku, na przykład "sensownym", co
najmniej część 5' otrzymanego transkryptu RNA będzie miała częściowa
identyczność sekwencji z co najmniej częścią przynajmniej jednego
transkryptu
docelowego.
W
przeciwnym
kierunku
wskazanym
jako
"antysensowny", co najmniej część 5' przewidywanego transkryptu będzie
identyczna
lub
homologiczna
z
co
najmniej
częścią
odwrotnie
komplementarną przynajmniej jednego transkryptu docelowego.
[0071] Promotor roślinny jest promotorem zdolnym do inicjacji transkrypcji w
komórkach roślinnych, niezależnie od tego czy pochodzi z komórki roślinnej.
Przykładowe promotory roślinne obejmują, lecz nie są ograniczone do tych,
które są otrzymywane z roślin, wirusów roślinnych i bakterii, takich jak
Agrobacterium lub Rhizobium, które zawierają geny wyrażane w komórkach
roślinnych. Przykłady promotorów pod kontrolą rozwojową obejmują
promotory, które preferencyjnie inicjują transkrypcję w pewnych tkankach,
takich jak ksylem, liście, korzenie lub nasiona. Promotory takie określane są
jako promotory tkankowo korzystne. Promotory, które inicjują transkrypcję
tylko w pewnych tkankach są określane jako promotory tkankowo
specyficzne. Promotor specyficzny tkomórkowo głównie kieruje ekspresją w
pewnych rodzajach komórek, w jednym lub większej liczbie narządów, na
16
przykład, komórkach naczyniowych korzeni lub liści Promotor indukowalny
lub represji jest promotorem, który jest pod kontrolą środowiska. Przykłady
warunków środowiskowych, które mogą wpływać na transkrypcję przez
promotory indukowalne obejmują warunki beztlenowe lub obecność światła.
Promotory
tkankowo
specyficzne,
tkankowo
specyficzne i i promotory indukowalne
korzystne,
stanowią
komórkowo
klasę promotorów
niekonstytutywnych. Promotor konstytutywny jest promotorem, który jest
aktywny w większości warunków środowiskowych i w większości części
rośliny.
[0072]
Polinukleotyd
oznacza
sekwencję
nukleotydową
obejmującą
sekwencję kodującą gen lub jego fragment (obejmujący co najmniej 15
kolejnych nukleotydów, korzystnie co najmniej 30 kolejnych nukleotydów i
korzystniej co najmniej 50 kolejnych nukleotydów), promotor, intron, region
enhancera,miejsce poliadenylacji, miejsce inicjacji translacji, 5'i 3' obszary
nie ulegające translacji, gen reporterowy, marker selekcyjny lub im podobne.
Polinukleotyd może obejmować jednoniciowy lub dwuniciowy DNA lub RNA.
Polinukleotyd może obejmować zmodyfikowane zasady lub zmodyfikowany
szkielet. Polinukleotyd może zawierać genomowe DNA, transkrypt RNA (taki
jak mRNA) lub przetworzoną sekwencję nukleotydową (taką jak cDNA).
Polinukleotyd może obejmować sekwencję w orientacji sensownej lub
antysensownej.
[0073] Izolowany polinukleotyd oznacza sekwencję polinukleotydową, która
nie jest w swoim stanie naturalnym, na przykład, polinukleotyd składa się z
sekwencji nukleotydowej nie występującej w naturze lub polinukleotyd jest
oddzielony od sekwencji nukleotydowych, z którymi zazwyczaj sąsiaduje lub
znajduje się obok sekwencji nukleotydowych, z którymi zwykle nie sąsiaduje.
[0074] Nasiona: "nasiono" może być uważane za dojrzały zalążek rośliny
zawierający zarodek, oraz reproduktywne części rośliny, jak bulwa lub
zarodnik.
Nasiona
mogą
być
inkubowane
przed
transformacją
za
pośrednictwem Agrobacterium, w ciemności, na przykład, dla ułatwienia
kiełkowania. Nasiona mogą także być sterylizowane przed inkubacją, np.
17
przez
krótkie
traktowanie
wybielaczem.
Otrzymana
sadzonka
może
następnie być poddana działaniu pożądanego szczepu Agrobacterium.
[0075] Marker wyselekcjonowany/wybrany w badaniu przesiewowym : gen,
który po ekspresji w roślinach lub tkankach roślinnych, pozwala na
odróżnienie ich od innych roślin lub tkanek roślinnych, których nie zachodzi
ekspresja tego genu. Procedury przesiewowe mogą wymagać testów
ekspresji białek kodowanych przez gen markerowy uzyskany z badania
przesiewowego.
Przykłady
markerów
selekcyjnych
obejmują
gen
fosfotransferazy neomycyny (Nptll), gen kodujący odporność na kanamycynę
i genetycynę, fosfotransferaza higromycyny (HptII) gen kodujący oporność na
higromycynę lub inne podobne geny znane w tej dziedzinie.
[0076] Charakterystyka sensoryczna: panele profesjonalnie przeszkolonych
osób, które mogą oceniać produkty żywnościowe pod katem cech
sensorycznych takich jak wygląd, smak, aromat i tekstura. Ocenę frytek,
uzyskanych z bulw, które mają regulowane w dół poziomy ekspresji genów
R1 i fosforylazy-L opisano w przykładzie 4. Frytki z bulw opisane w
Przykładzie 5 również będą przejawiać lepszą charakterystykę sensoryczną.
Tak
więc,
niniejszy
wynalazek
rozważa
polepszenie
charakterystyki
sensorycznej produktu roślinnego uzyskanego z rośliny, która została
zmodyfikowana tak, aby zmienić jej ścieżki biosyntezy i metabolizmu
asparaginy.
[0077] Identyczność sekwencji: w użytym tu znaczeniu, "identyczność
sekwencji" lub "identyczność" w kontekście dwóch sekwencji kwasu
nukleinowego lub polipeptydów obejmuje odniesienie do reszt w tych dwóch
sekwencjach, które są takie same po dopasowaniu z maksimum zgodności w
określonym regionie . Gdy procent identyczności sekwencji stosuje się w
odniesieniu do białek, uznaje się, że pozycje reszt, które nie są identyczne
często różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, w
których
reszty
aminokwasowe
są
podstawione
innymi
resztami
aminokwasowymi o podobnych własnościach chemicznych (na przykład
ładunku lub hydrofobowości) i dlatego nie zmieniają funkcjonalnych
właściwości
cząsteczki.
W
przypadku
gdy
sekwencje
różnią
się
18
konserwatywnymi podstawieniami, procent identyczności sekwencji można
regulować w górę w celu korekcji konserwatywnej natury substytucji. Mówi,
się, że sekwencje, które różnią się takimi konserwatywnymi podstawieniami,
posiadają "podobieństwo sekwencji" lub "podobieństwo". Środki służące do
wykonania regulacji są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Zazwyczaj obejmuje to przypisanie konserwatywnemu podstawieniu wyniku
odpowiadającego raczej częściowemu, niż pełnemu niedopasowaniu, w ten
sposób zwiększając procent identyczności sekwencji. Tak więc, na przykład,
gdy identyczny aminokwas otrzymuje wynik 1, a nie konserwatywne
podstawienie otrzymuje wynik zero, konserwatywne podstawienia otrzymuje
wynik między zerem i 1. Wynik podstawień konserwatywnych jest obliczany,
np. zgodnie z algorytmem Meyers i Miller, Computer Applic. Biol. Sci, 4.: 11
17 (1988), np. zastosowanemu w programie PC/GENE (Intelligentics,
Mountain View, Kalifornia, USA).
[0078] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, procentowa
identyczność sekwencji oznacza wartość określoną przez porównanie dwóch
optymalnie dopasowanych sekwencji w oknie porównawczym, gdzie część
sekwencji polinukleotydowej w oknie porównawczym może obejmować
addycje lub delecje (tzn. luki) w porównaniu do sekwencji odniesienia (która
nie zawiera addycji lub delecji) w celu optymalnego dopasowania dwóch
sekwencji. Procent jest obliczany przez określenie liczby pozycji, w których w
obu sekwencjach występuje identyczna zasada kwasu nukleinowego lub
reszta aminokwasowa, co daje liczbę dopasowanych pozycji, dzieląc liczbę
pasujących pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównawczym i
mnożąc wynik przez 100 z uzyskaniem procentu identyczności sekwencji.
[0079] "Identyczność sekwencji" posiada znaczenie rozpoznawane w tej
dziedzinie i może być obliczona przy użyciu publikowanych technik.
Patrz COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, wyd. (Oxford
University Press, 1988),BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME
PROJECTS, Smith, wyd. (Academic Press, 1993), COMPUTER ANALYSIS
OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin & Griffin, wyd., (Humana Press,
1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje
19
wyd.., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov &
Devereux, wyd. (Macmillan Stockton Press, 1991), i Carillo & Lipton, SIAM J.
Applied Math. 48: 1073 (1988). Metody wykorzystywane powszechnie do
określania identyczności lub podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami
obejmują, ale nie są do nich ograniczone, ujawnione w GUIDE TO HUGE
COMPUTERS, Bishop, wyd., (Academic Press, 1994) i Carillo & Lipton,
powyżej. Metody określające identyczność i podobieństwo są zawarte w
programach komputerowych. Korzystne metody programów komputerowych
określające identyczność i podobieństwo pomiędzy dwiema sekwencjami
obejmują, między innymi, pakiet programu GCG (. Devereux i i., Nucleic
Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul i in., J.
Mol. Biol. 215: 403 (1990)) iFASTDB (Brutlag i in., Comp. App. Biosci. 6: 237
(1990)).
[0080] Wyciszanie: Jednokierunkowa i niewzruszona transkrypcja genów lub
fragmentów genów od promotora do terminatora może wywołać wyciszenie
po transkrypcji genów docelowych. Początkowe kasety ekspresyjne do
potranskrypcyjnego wyciszania genu u roślin zawierały pojedynczy fragment
genu umieszczony albo w antysensownej (McCormick et al., patent US
6617496 ; Shewmaker et al., patent US 5107065) lub sensownej (van der
Kroi et al, Plant Celi. 2: 291-299, 1990) orientacji, pomiędzy sekwencjami
regulatorowymi dla inicjacji i terminacji transkrypcji. U Arabidopsis,
rozpoznanie powstałych transkryptów przez RNA-zależną polimerazę RNA
prowadzi do wytworzenia dwuniciowego (ds) RNA. Odszczepienie tego
dsRNA przezbiałka podobne do Dicer (Dcl), takie jak Dcl4 daje 21
nukleotydów (nt), małego interferującego RNA (siRNA). Te kompleksy siRNA
z białkami obejmują członków rodziny Argonautów (Ago), w celu produkcji
kompleksów wyciszających wywołanych przez RNA (RISC). RISC następnie
są
ukierunkowane
na
homologiczne
RNA
w
celu
rozszczepienia
endonukleolitycznego.
[0081] Bardziej skuteczne konstrukty wyciszania zawierają zarówno składnik
sensowny i antysensowny, produkujące cząsteczki RNA, które składają się z
powrotem do struktury szpilki do włosów (Waterhouse et al, Proc Natl Acad
20
Sci USA 95,: 13959-13964, 1998). Przypuszczano, że wysokie poziomy
dsRNA wytwarzanego przez ekspresję odwróconych powtórzeń transgenów
wspierają aktywność wielu Dcl. Analizy kombinatorycznych usunięć Dcl w
Arabidopsis poparła ten pomysł, a także pozwoliła na zidentyfikowanie Dcl4
jako jednego z białek zaangażowanych w rozszczepianie RNA.
[0082] Jednym ze składników konwencjonalnych wyciszających konstruktów
genowych opartych na sensownym, antysensownym i dwuniciowym (ds)
RNA jest terminator transkrypcji. WO 2006/036739 pokazuje, że ten element
regulatorowy staje się szczątkowy, gdy fragmenty genowe są umieszczone
pomiędzy dwoma przeciwnie zorientowanymi i aktywnymi funkcjonalnie
promotorami. Otrzymana zbieżna transkrypcja wyzwala wyciszanie genów,
które jest co najmniej tak skuteczne jak jednokierunkowa transkrypcja
"promotora do terminatora". Oprócz krótkiego RNA o zmiennej wielkości i nie
poliadenylowanego, kaseta nie zawierająca terminatora wytwarzała rzadkie
wolne dłuższe transkrypty, które docierają do flankujacego promotora.
Zastąpienie fragmentów genów przez sekwencje pochodzące z promotora
dodatkowo zwiększa stopień wyciszania genu.
[0083] W
pożądany
korzystnym przykładzie
polinukleotyd
obejmuje
wykonania niniejszego
częściową
sekwencję
wynalazku
docelowego
promotora genu lub częściową sekwencję, która dzieli identyczność
sekwencji z częścią docelowego promotora genu. W związku z tym,
pożądany
polinukleotyd
zawiera
specyficzny
fragment
konkretnego
docelowego promotora genu będącego przedmiotem zainteresowania.
[0084] Pożądany polinukleotyd może być funkcjonalnie połączony z jednym
lub większą liczbą funkcjonalnych promotorów. Różne konstrukty rozważane
w niniejszym wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do: (1) konstrukt,
gdzie pożądany polinukleotyd obejmuje jedną lub większą liczbę sekwencji
fragmentu promotora i jest funkcjonalnie połączony na obydwu końcach z
funkcjonalnymi promotorami "kierowcami". Te dwa funkcjonalne promotory
są ułożone w zbieżnej orientacji, tak że każda nić pożądanego polinukleotydu
ulega transkrypcji; (2) konstrukt, gdzie pożądany polinukleotyd jest
funkcjonalnie połączony z jednym funkcjonalnym promotorem swoim końcem
21
5' lub końcem 3' i pożądany polinukleotyd jest funkcjonalnie połączony
również na końcu nie zawierającym promotora z sekwencją funkcjonalnego
terminatora; (3) konstrukt, gdzie pożądany polinukleotyd jest funkcjonalnie
połączony z jednym funkcjonalnym promotorem swoim końcem 5' lub
końcem 3', ale gdzie pożądany polinukleotyd nie jest funkcjonalnie połączony
z terminatorem; lub (4) kasetę, gdzie pożądany polinukleotyd obejmuje jeden
lub większą liczbę sekwencji fragmentu promotora lecz nie jest funkcjonalnie
połączony z żadnym funkcjonalnymi promotorami lub terminatorami.
[0085] W związku z tym, konstrukt może zawierać dwa lub więcej
promotorów "kierowców", które flankują jeden lub większą liczbę pożądanych
polinukleotydów lub które flankują kopie pożądanego polinukleotydu, tak, że
obie nici pożądanego polinukleotydu ulegają transkrypcji. To znaczy, jeden
promotor może być zorientowany tak, aby inicjować transkrypcję końca 5'
pożądanego polinukleotydu, podczas gdy drugi promotor może być
funkcjonalnie zorientowany tak, aby inicjować transkrypcję od końca 3' tego
samego
pożądanego
polinukleotydu.
Przeciwstawnie
zorientowane
promotory mogą flankować wiele kopii pożądanego polinukleotydu. Ponieważ
"liczba kopii" może być różna, konstrukt może obejmować 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 lub ponad 100 kopii lub
dowolną pośrednią liczbę całkowitą, pożądanego polinukleotydu, które moga
być flankowaną przez promotory "kierowców", które są zorientowane w celu
wywołania zbieżnej transkrypcji.
[0086] Jeśli żadna kaseta nie zawiera sekwencji terminatora, to taki
konstrukt, ze względu na układ zbieżnej transkrypcji, może wytwarzać
transkrypty RNA, które mają różne długości.
[0087] W tej sytuacji zatem, mogą istnieć subpopulacje częściowo lub
całkowicie przepisanych transkryptów RNA, które zawierają częściowe lub
pełnej długości sekwencje transkrybowanego, pożądanego polinukleotydu z
odpowiedniej kasety. Alternatywnie, przy braku funkcjonalnego terminatora,
maszyneria transkrypcyjna może kontynuować aktywność poza koniec
pożądanego polinukleotydu, w celu wytworzenia transkryptu, który jest
dłuższy niż długość pożądanego polinukleotydu.
22
[0088] A zatem w konstrukcie, który obejmuje dwie kopie pożądanego
polinukleotydu, gdzie jeden z polinukleotydów może, lecz nie musi, być
zorientowany w kierunku odwrotnym komplementarnym do drugiego i gdzie
polinukleotydy są funkcjonalnie związane z promotorami indukującymi
zbieżną transkrypcję, a w konstrukcie nie ma funkcjonalnego terminatora,
maszyneria
transkrypcyjna,
która
inicjuje
od
jednego
korzystnego
polinukleotydu może kontynuować transkrypcję do innej kopii pożądanego
polinukleotydu i na odwrót. Wielokrotne kopie pożądanego polinukleotydu
mogą być zorientowane w różnych permutacjach: w przypadku kiedy w
konstrukcie są obecne dwie kopie pożądanego polinukleotydu, obie kopie
mogą być, na przykład, zorientowane w tym samym kierunku, w kierunku
odwrotnym
w
stosunku
do
siebie
lub
w
odwrotnym
kierunku
komplementarnym względem siebie, na przykład.
[0089] W układzie, w którym jeden z pożądanych polinukleotydów jest
zorientowany
w
odwrotnym
kierunku
komplementarnym
do
innego
polinukleotydu, można wytworzyć transkrypt RNA, który obejmuje nie tylko
sekwencję "sensowną" pierwszego polinukleotydu, ale także sekwencję
"antysensowną"
drugiego
polinukleotydu.
Jeżeli
pierwszy
i
drugi
polinukleotyd obejmują te same lub zasadniczo te same sekwencje DNA, to
pojedynczy transkrypt RNA może obejmować dwa regiony, które są
komplementarne do siebie i które mogą, w związku z tym, hybrydyzować.
Stąd, pojedynczy transkrypt RNA, który jest tak przekształcony może tworzyć
część lub całą strukturę spinki do włosów dupleksu.
[0090] Z drugiej strony, jeśli wytworzono dwie kopie takiego długiego
transkryptu, po jednej z każdego promotora, to będą istnieć dwie cząsteczki
RNA, o wspólnych regionach komplementarności sekwencji.. W związku z
tym, "sensowny" region pierwszego transkryptu RNA może hybrydyzować z
regionem "antysensownym" drugiego transkryptu RNA i na odwrót. W
związku z tym, w tym układzie, można utworzyć inny dupleks RNA, który
składa się z dwóch oddzielnych transkryptów RNA, w przeciwieństwie do
dupleksu spinki do włosów, który tworzy się z pojedynczego wewnętrznie
komplementarnego transkryptu RNAi.
23
[0091] Alternatywnie, dwie kopie pożądanego polinukleotydu mogą być
zorientowane w tym samym kierunku, tak, że w przypadku transkrypcji przez
odczyt długi transkrypt RNA, który jest wytwarzany z jednego promotora,
może obejmować, na przykład, sekwencję sensowną pierwszej kopii
pożądanego polinukleotydu, a także sekwencję sensowną drugiej kopii
pożądanego polinukleotydu. Transkrypt RNA, który jest wytwarzany z innego
zbieżnie zorientowanego promotora, może zatem obejmować sekwencję
antysensowną drugiej kopii pożądanego polinukleotydu, a także sekwencję
antysensowną pierwszego polinukleotydu. W związku z powyższym, jest
prawdopodobne, że żaden transkrypt RNA nie będzie zawierał regionów o
dokładnej
komplementarności,
a
zatem
żaden
transkrypt
RNA
prawdopodobnie nie złożyć się tak, aby wytworzyć strukturę szpilki do
włosów. Z drugiej strony dwa osobne transkrypty RNA mogą hybrydyzować
ze sobą, tworząc dupleks RNA.
[0092] Zatem, niniejszy wynalazek przedstawia konstrukt, który nie ma
terminatora lub nie ma terminatora, który jest poprzedzony przez
samowycinany region DNA kodujący rybozym, lecz który obejmuje pierwszy
promotor, który jest funkcjonalnie połączony z pożądanymi polinukleotydami.
[0093] Tkanka: dowolna część rośliny, która jest stosowana do wytwarzania
żywności. Tkanką może być bulwa ziemniaka, korzeń słodkich ziemniaków
lub nasiona rośliny kukurydzy.
[0094] Terminatory transkrypcji: Konstrukty DNA ekspresyjnego według
niniejszego wynalazku typowo mają region terminacji transkrypcji na
przeciwległym końcu do regulacyjnego regionu inicjacji transkrypcji. Region
terminacji transkrypcji może być wybrany z uwagi na stabilność mRNA, dla
wzmocnienia ekspresji i/lub w celu dodania ogonów poliadenylacji,
dodawanych do produktu transkrypcji genu. Translacja powstającego
polipeptydu ulega terminacji, gdy dowolny z trzech kodonów terminacji
łańcucha wchodzi na stronę A na rybosomu. Kodony terminacji translacji to
UAA, UAG i UGA.
[0095] Terminatory transkrypcji pochodzą albo z genu lub, korzystniej, z
sekwencji, które nie stanowią genu lecz międzygenowy DNA. Można na
24
przykład stosować sekwencję terminatora z genu ubikwityny ziemniaka,
jprzedstawioną w SEQ ID NR: 5
[0096] Transferowe DNA (T-DNA): transferowe DNA oznacza segment
DNA wyznaczony przez granice T-DNA lub granice P-DNA w celu utworzenia
T-DNA lub P-DNA, odpowiednio. T-DNA jest elementem genetycznym
dobrze znanym jako element zdolny do integracji sekwencji nukleotydowej
zawartej w jego granicach do innego genomu. W tym względzie, T-DNA jest
otoczone zwykle przez dwie sekwencje "graniczne". Pożądany polinukleotyd
według niniejszego wynalazku i marker selekcyjny mogą być usytuowane
pomiędzy lewą sekwencję typu granicznej i prawą sekwencją typu granicznej
T-DNA. Pożądany polinukleotyd i marker selekcyjny zawarte w T-DNA mogą
być funkcjonalnie połączone z wieloma różnymi, specyficznymi dla rośliny (tj.
natywnymi) lub obcymi kwasami nukleinowymi, jak elementy promotora i
terminatora, które ułatwiają ich ekspresję, tzn., transkrypcję i/lub translację
sekwencji DNA kodowanej przez pożądany polinukleotyd lub marker
selekcyjny.
[0097] Transformacja komórek roślinnych: Proces za pomocą którego
kwas nukleinowy jest stabilnie wprowadzony do genomu komórki roślinnej.
Transformacja może wystąpić w warunkach naturalnych lub sztucznych, przy
zastosowaniu różnych metod znanych w tej dziedzinie. Transformacja może
opierać się na dowolnych znanych metodach wprowadzania sekwencji
kwasów nukleinowych do komórki prokariotycznego lub eukariotycznego
gospodarza, w tym protokołach Agrobacterium do transformacji, takich jak
"transformacja
udoskonalona"
lub
"precyzyjna
hodowla"',
zakażenia
wirusowe, wiskery elektroporacja, mikrowstrzyknięcia, traktowanie glikolem
polietylenowym, szok cieplny, lipofekcja i bombardowaniea cząstkami.
[0098] Roślina transgeniczna: rośliną transgeniczną jest ta, która która
zawiera co najmniej jeden genom komórki, w który jest stabilnie
wintegrowany
egzogenny
transgeniczna
jest
rośliną,
kwas
która
nukleinowy.
zawiera
Odpowiednio
tylko
jedną
roślina
genetycznie
zmodyfikowaną komórkę i genom komórki, lub jest rośliną, która zawiera
niektóre genetycznie zmodyfikowane komórki lub jest rośliną, w której
25
wszystkie komórki są zmodyfikowane genetycznie. Transgeniczną rośliną
może być ta, która obejmuje ekspresję pożądanego polinukleotydu, tzn.
egzogennego kwasu nukleinowego, tylko w pewnych częściach rośliny.
Zatem, roślina transgeniczna może zawierać genetycznie zmodyfikowane
komórki tylko w pewnych częściach jej struktury.
[0099] Wariant: przez "wariant", jak stosowany niniejszym dokumencie,
rozumie się sekwencję nukleotydową lub aminokwas odbiegający od
standardowej, albo danej sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej
konkretnego genu lub białka. Terminy "izoforma", "izotyp" i "analog" także
odnoszą
się
do
"wariantowych"
postaci
nukleotydu
lub
sekwencji
aminokwasowej. Sekwencja aminokwasowa, która jest zmieniona przez
dodanie,
usunięcie
albo
zastąpienie
jednej
albo
większej
liczby
aminokwasów lub zmianę sekwencji nukleotydowej może być uważana za
sekwencję "wariantową". Wariant może mieć zmiany "konserwatywne", gdzie
podstawiony aminokwas ma podobne własności strukturalne i chemiczne,
np.
zamiana
leucyny
w
izoleucynę.
Wariant
może
mieć
zmiany
"niekonserwatywne", np. zamiana glicyny w tryptofan. Analogiczne mniejsze
różnice mogą obejmować delecje lub insercje aminokwasowe, lub obie.
Wytyczne
dla
określenia,
które
reszty
aminokwasowe
mogą
być
podstawione, wstawione lub usunięte można znaleźć przy zastosowaniu
programów komputerowych dobrze znanych w tej dziedzinie, takich jak
Vector NTI (InforMax, MD). "Wariant" może także odnosić się do "genu
tasowanego" takiego jak opisane w patentach Maxygen.
Sekwencje polinukleotydowe
[0100] SEQ ID NR.: 2-35 nie stanowią części wynalazku i są przeznaczone
wyłącznie do celów poglądowych.
[0101] Niniejszy wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki nukleinowej
zawierającego polinukleotyd mający sekwencję wybraną z grupy składającej
się z dowolnej z sekwencji polinukleotydowych o SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4, 9,
10, 14, 15, 23, 24 lub 25. Ujawnienie przedstawia także funkcjonalnych
fragmentów sekwencji polinukleotydowych o SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4, 9, 10,
14, 15, 23, 24 lub 25. Ujawnienie przedstawia ponadto kwasy nukleinowe lub
26
ich fragmenty, komplementarne do dowolnej z sekwencji polinukleotydowych
o SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 lub 25, a także kwas
nukleinowy, zawierający co najmniej 15 sąsiadujących zasad, które
hybrydyzują z dowolną z sekwencji polinukleotydowych o SEKW ID NR: 1, 2,
3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 lub 25.
[0102] Przez "wyizolowane" cząsteczki kwasu nukleinowego rozumie się
cząsteczki kwasu nukleinowego, DNA lub RNA, które zostały usunięte ze
swojego natywnego środowiska. Na przykład, cząsteczki rekombinowanego
DNA zawarte w konstrukcie DNA uważane są za wyizolowane do celów
niniejszego wynalazku. Dalsze przykłady cząsteczek wyizolowanego DNA
obejmują
cząsteczki
rekombinowanego
DNA
utrzymywane
w
heterologicznych komórkach gospodarza lub oczyszczone (częściowo lub
całkowicie) cząsteczki DNA, w roztworze, wyizolowane cząsteczki DNA
obejmują transkrypty in vitro RNA cząsteczek DNA według wynalazku.
Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku,
obejmują ponadto takie cząsteczki wytworzone syntetycznie.
[0103] Cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku mogą
być w postaci RNA, takie jak RNA lub w postaci DNA, obejmujące na
przykład DNA i genomowy DNA uzyskany przez klonowanie lub wytworzony
syntetycznie. DNA lub RNA może być dwuniciowy lub jednoniciowy.
Jednoniciowy DNA może być nicią kodującą, znaną także jako nić sensowna
lub może być nicią niekodującą, określaną także jako nić antysensowna.
[0104] O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie sekwencje nukleotydowe
ustalone przez sekwencjonowanie cząsteczki DNA zostały ustalane przy
użyciu zautomatyzowanego sekwencjonowania DNA (np Model 373 z
Applied Biosystems, Inc.). Dlatego, jak wiadomo w tej dziedzinie, dla
dowolnej sekwencji DNA określonej w tym zautomatyzowanego podejściu,
dowolna sekwencja nukleotydowa określona w niniejszym dokumencie,
może zawierać pewne błędy. Sekwencje nukleotydowe określone przez
automatyzację są zazwyczaj w co najmniej około 95% identyczne, bardziej
zazwyczaj w co najmniej około 96% do co najmniej około 99,9% identyczne z
rzeczywistą sekwencją nukleotydową cząsteczki sekwencjonowanego DNA.
27
Rzeczywistą sekwencję można dokładniej określić innymi metodami, w tym
sposobami ręcznego sekwencjonowania DNA, dobrze znanymi w technice.
Jak wiadomo również w tej dziedzinie, pojedyncze wstawienie lub delecja w
określonej sekwencji nukleotydowej w porównaniu z rzeczywistą sekwencją
będą powodować przesunięcie ramki w translacji sekwencji nukleotydowej
tak, że przewidywana sekwencja aminokwasowa kodowana przez określoną
sekwencję
nukleotydowa
może
być
zupełnie
inna
od
sekwencji
aminokwasowej, kodowanej przez cząsteczki sekwencjonowanego DNA,
poczynając od miejsca takiej insercji lub delecji.
[0105] Każda "sekwencja nukleotydów" określona w niniejszym dokumencie
jest przedstawiona jako sekwencja deoksyrybonukleotydów (skrótowo, A, G,
C i T). Jednakże, przez "sekwencję nukleotydową" cząsteczki kwasu
nukleinowego lub polinukleotyd, należy rozumieć dla cząsteczki lub
polinukleotydu DNA, sekwencję dezoksyrybonukleotydów, a dla cząsteczki
lub polinukleotydu RNA odpowiednią sekwencję rybonukleotydów (A, G, C i
U), w której każdy deoksynukleotyd tymidyny (T) w określonej sekwencji
deoksynukleotydów, zastąpiono rybonukleotydem urydyny (U).
[0106] Niniejszy wynalazek odnosi się również do fragmentów izolowanych
cząsteczek kwasu nukleinowego opisanych w niniejszym dokumencie.
Korzystnie, fragmenty DNA obejmuje co najmniej 15 nukleotydów, korzystniej
co najmniej 20 nukleotydów, jeszcze bardziej korzystnie co najmniej 30
nukleotydów, są użyteczne jako sondy diagnostyczne i startery. Oczywiście
większe fragmenty kwasu nukleinowego, aż do pełnej długości cząsteczki
kwasu nukleinowego są również użyteczne w diagnostyce jako sondy,
zgodnie z konwencjonalnymi technikami hybrydyzacji, lub jako startery do
amplifikacji sekwencji docelowej w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak
opisano na przykład, w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 wydanie,
wydane przez Sambrook & Russel., (2001), Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Przez fragment co najmniej 20 nukleotydów długości, na przykład,
należy rozumieć fragmenty, które zawierają 20 lub więcej sąsiadujących
zasad z sekwencji nukleotydowej SEQ ID NR: 1, 2, 17, 20, 21. Kwasy
nukleinowe zawierające sekwencje nukleotydowe, które są wymienione w
28
SEQ ID NR: 1, 2, 17, 20, 21 mogą być wytwarzane z zastosowaniem
konwencjonalnych metod syntezy DNA, które są rutynowe dla specjalistów w
tej dziedzinie. Do wytworzenia fragmentów o różnych rozmiarach można na
przykład łatwo wykorzystać trawienie restrykcyjne endonukleazami lub
ścinanie
ultradźwiękami
Alternatywnie,
fragmenty
DNA
mogą
być
wytwarzane syntetycznie zgodnie ze znanymi metodami.
[0107]
Ujawnienie
przedstawia
wyizolowaną
cząsteczkę
kwasu
nukleinowego zawierającą polinukleotyd, który hybrydyzuje w ścisłych
warunkach hybrydyzacji z częścią polinukleotydu w cząsteczce kwasu
nukleinowego według wynalazku, opisaną powyżej. Przez polinukleotyd,
który hybrydyzuje z "częścią" polinukleotydu należy rozumieć polinukleotyd
(DNA albo RNA) hybrydyzujący do przynajmniej około 15 nukleotydów,
bardziej korzystnie co najmniej około 20 nukleotydów, jeszcze bardziej
korzystnie co najmniej około 30 nukleotydów a jeszcze bardziej korzystnie
więcej niż 30 nukleotydów polinukleotydu odniesienia. Fragmenty te, które
hybrydyzują
z
fragmentami
odniesienia
są
użyteczne
jako
sondy
diagnostyczne i startery. Sondę, stosowaną w niniejszym opisie, definiuje się
jako co najmniej około 100 sąsiadujących ze sobą zasad z sekwencji kwasu
nukleinowego przedstawionej w SEQ ID NR: 1-230. Dla celów niniejszego
wynalazku, dwie sekwencje, mogą hybrydyzować gdy tworzą dwuniciowy
kompleks w roztworze hybrydyzacyjnym złożonym z 6X SSC, 0,5% SDS, 5X
roztwór Denhardta i 100 µg niespecyficznego DNA nośnikowego. Patrz
Ausubel et al.,section 2.9, supplement 27 (1994). Taka sekwencja może
hybrydyzować w warunkach o "umiarkowanej ostrości", zdefiniowanych jako
temperatura 60 °C w roztworze hybrydyzacyjnym złożonym z 6X SSC, 0,5%
SDS, 5X roztwór Denhardta i 100µg nieswoistego DNA nośnikowego. W
przypadku hybrydyzacji "wysokiej ostrości" temperatura wzrasta do 68 °C. Po
reakcji hybrydyzacji umiarkowanej ostrości, nukleotydy przemywa się
roztworem 2x SSC plus 0,05% SDS pięć razy w temperaturze pokojowej, po
czym następują kolejne przemywania 0,1X SSC plus 0,1% SDS w
temperaturze 60 °C przez 1 godzinę. W warunkach wysokiej ostrości,
temperatura
przemywania
wzrasta
do
temperatury
około
68
°C,
29
hybrydyzowanymi nukleotydami są te, które są wykrywane przy użyciu 1 ng
wyznakowanej
radioaktywnie
sondy,
posiadającej
specyficzną
radioaktywność 10000 cpm/ng, gdzie zhybrydyzowane nukleotydy są
wyraźnie
widoczne
po
ekspozycji
na
promienie
rentgenowskie
w
temperaturze 70 °C przez okres nie dłuższy niż 72 godziny,
[0108] Niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na takie cząsteczki kwasów
nukleinowych, które są w co najmniej 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub 100% identyczne z sekwencją kwasu
nukleinowego opisaną w SEQ ID NR: 1, 2, 17, 20, 21. Jednakże korzystne są
cząsteczki kwasu nukleinowego, które są w co najmniej 95%, 96%, 97%,
98%, 99% lub 100% identyczne z sekwencją kwasu nukleinowego
przedstawioną w którejkolwiek z SEQ ID NR: 1, 2,17, 20,21. Różnice między
dwiema sekwencjami kwasu nukleinowego mogą wystąpić na końcu 5' lub 3'
sekwencji nukleotydowej odniesienia lub gdziekolwiek pomiędzy tymi
pozycjami końcowymi, rozrzucone pojedynczo wśród nukleotydów w
sekwencji referencyjnej lub w jednej lub większej liczbie ciągłych grup w
sekwencji referencyjnej.
[0109] W praktyce to, czy jakaś konkretna cząsteczka kwasu nukleinowego
jest w co najmniej 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% identyczna z nukleotydową
sekwencją odniesienia odnosi się do porównania dwóch cząsteczek przy
użyciu standardowych algorytmów dobrze znanych w tej dziedzinie i może
być określone klasycznie przy użyciu publicznie dostępnych programów
komputerowych takich jak algorytm BLastN. Patrz Altschul et al., Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402 (1997).
Analiza sekwencji
[0110] Sposoby dopasowania sekwencji celem ich porównania są dobrze
znane w tej dziedzinie. Optymalne dopasowanie sekwencji do porównania
można prowadzić za pomocą algorytmu homologii Smith i Waterman, Adv.
Appl. Math. 2: 482 (1981); przez algorytm dopasowania homologii
Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); przez poszukiwanie
podobieństwa metodą Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444
(1988); przez komputerowe wdrożenie tych algorytmów, w tym, ale nie
30
ograniczając się do: programu CLUSTAL PC/Gene Intelligenetics, Mountain
View, California; GAP, BESTFIT, BLast, FastA, i TFastA w oprogramowaniu
Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG),
575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; program CLUSTAL opisali
dokładnie Higgins i Sharp, Gene 73:237 244 (1988); Higgins i Sharp,
CABIOS 5: 151 153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:
10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences
8:155-65 (1992), i Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331
(1994).
[0111] Rodzina programów BLast, które można stosować do przeszukiwań
bazy danych pod kątem podobieństwa, obejmuje: BLastN do badania
sekwencji
nukleotydowych
nukleotydowych;
BLastX
na
do
podstawie
badania
bazy
sekwencji
danych
sekwencji
nukleotydowych
na
podstawie bazy danych sekwencji białek; BLastP do badania sekwencji
białka na podstawie bazy danych sekwencji białek; TBLastN do badania
sekwencji białka na podstawie bazy danych sekwencji nukleotydowych; oraz
TBLastX do badania sekwencji nukleotydowych na podstawie bazy danych
sekwencji nukleotydowych. Zobacz, Current Protocols in Molecular Biology,
Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience,
New York (1995); Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); i Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).
[0112] Program do wykonywania analiz BLast jest publicznie dostępny, na
przykład,
przez
National
Center
for
Biotechnology
Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ten algorytm wykonuje najpierw identyfikację
par sekwencji o wysokiej punktacji (HSP) przez identyfikację krótkich słów o
długości W, w sekwencji stanowiącej zapytanie, które bądź pasują, pewne
spełniają uznany za pozytywny wynik progowy o wartości T, kiedy są
przyrównane ze słowem o tej samej długości w sekwencji z bazy danych. T
określa się jako wynik progowy dla sąsiedniego słowa. Te pierwsze trafione
sąsiedzkie
słowa działają jak nasiona zapoczątkowania
poszukiwań
dłuższych HSP, zawierających je Trafione słowa następnie rozciąga się w
obydwu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji, dopóki kumulatywny wynik
31
dopasowania może zostać zwiększony. Skumulowane wyniki są obliczane
przy użyciu, dla sekwencji nukleotydowych, parametrów M (nagroda za parę
pasujących reszt; zawsze> O) i N (kara za reszty niedopasowane; zawsze
<o). Dla sekwencji aminokwasowych, w celu obliczenia łącznego wyniku,
stosuje się macierz punktacji. Rozszerzenie trafień słów w każdym kierunku
jest zatrzymywane, kiedy: kumulatywny wynik dopasowania spada o wartość
X od maksymalnej osiągniętej wartości; kumulatywny wynik dopasowania
dąży do zera albo poniżej na skutek akumulacji jednego albo więcej
negatywnych dopasowań reszt lub po osiągnięciu końca którejś z sekwencji.
Parametry W, T i X algorytmu BLast określają czułość i szybkość
dopasowania. Program BLastN (dla sekwencji nukleotydowych) stosuje jako
parametry domyślne: długość słowa (W) wynoszącą 11, wartość oczekiwaną
(E) wynoszącą 10, punkt odcięcia 100, M = 5, N = -4 i porównanie obu nici.
Dla sekwencji aminokwasowych, program BLastP stosuje jako parametry
domyślne: długość słowa (W) równą 3, wartość oczekiwaną (E) wynoszącą
10 i matryce punktacji BLOSUM62 (patrz Henikoff & Henikoff (1989) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
[0113] Oprócz obliczania procentu identyczności sekwencji, algorytm BLast
przeprowadza także analizę statystyczną podobieństwa między dwiema
sekwencjami (patrz, na przykład, Karlin i Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
90:5873-5877 (1993)). Jedną z miar podobieństwa przedstawianą przez
algorytm BLast jest prawdopodobieństwo najmniejszej sumy (P (N)), które
wskazuje na prawdopodobieństwo, że dopasowanie dwóch sekwencji
nukleotydowych lub aminokwasowych mogłoby nastąpić losowo.
[0114] Przyrównanie wielu sekwencji można przeprowadzić za pomocą
metody dopasowania CLUSTAL (Higgins Sharp (1989) CABIOS. 5: 151 153)
z parametrami domyślnymi (Kara za przerwę = 10, Kara za długość przerwy
= 10). Domyślne parametry dopasowania parami za pomocą metody
CLUSTAL są następujące KTUPLE 1, Kara za przerwę = 3, OKNO = 5 i
przekątne zapisane = 5.
[0115] Następujące parametry przebiegu, które wpływają na wartości E i
procent identyczności sekwencji polinukleotydowych, są korzystne dla
32
określenia dopasowania i podobieństw przy użyciu BLastN: Komenda
przebiegu Unix: blastall -p blastn -d embldb -e 10 -G0 -E0 -r 1 -v 30 -b 30 -i
queryseq -o results; parametry są następujące: -p Nazwa progarmu [String]; d Baza danych [String]; -e Wartość oczekiwana (E) [Rzeczywista]; -G Koszt
otwarcia przerwy (zero wywołuje domyślne zachowanie) [Liczba całkowita]; E Koszt rozszerzenia przerwy (zero wywołuje domyślne zachowanie) [Liczba
całkowita]; -r Nagroda za zgodność nukleotydów (tylko BLastN) [Liczba
całkowita]; -v Liczba opisów jednoliniowych (V) [Liczba całkowita]; -b Liczba
dopasowań do pokazania (B) [Liczba całkowita]; -I Plik stanowiacy zapytanie
[Plik Wej.]; i ewentualnie -o BLast plik raportu wyjściowego [Plik wyj.].
[0116] "Trafienia" do jednej lub więcej sekwencji w bazie danych przez
badaną sekwencję uzyskane przez BLastN, FastA, BLastP lub podobny
algorytm, dopasowują i identyfikują podobne części sekwencji. Trafienia są
ustawione w porządku stopnia podobieństwa i długości pokrywania się
sekwencji. Trafienia sekwencji z bazy danych zwykle przedstawiają
pokrywanie się tylko części długości badanej sekwencji.
[0117] Algorytmy BLastN, BLastP i FastA dają również wartość "oczekiwaną"
dopasowania. Wartość oczekiwana (E) wskazuje na liczbę trafień, jakiej
można "oczekiwać" przypadkowo dla pewnej liczby ciągłych sekwencji
podczas przeszukiwania bazy danych o pewnej wielkości. Wartość
oczekiwana jest stosowana jako próg istotności dla określenia czy trafienie w
bazę danych, taka jak korzystna baza danych EMBL, wskazuje na prawdziwe
podobieństwo. Na przykład, wartość E równa 0,1 przypisana do trafienia
polinukleotydowego jest interpretowana w taki sposób, że w bazie danych o
wielkości bazy danych EMBL, można spodziewać się 0,1 zgodności
wyrównanej części sekwencji, po prostu przez przypadek , Przy takim
kryterium, wyrównane i dopasowane części sekwencji polinukleotydowej są
takie same z prawdopodobieństwem 90%. Dla sekwencji posiadających
wartość E równą 0,01 lub mniejszą, dla wyrównanych i dopasowanych
części, prawdopodobieństwo znalezienia dopasowania przez przypadek w
bazie danych EMBL wynosi 1% lub mniej przy użyciu algorytmu BLastN lub
FastA.
33
[0118] Zgodnie z tym, "wariant" polinukleotydu zawiera korzystnie sekwencje
posiadające tę samą liczbę lub mniej kwasów nukleinowych niż każdy z
polinukleotydów według niniejszego wynalazku, i wytwarza wartość E równą
0,01 lub mniej w stosunku do polinukleotydu według niniejszego ujawnienia.
Oznacza to, że wariant polinukleotydu jest dowolną sekwencją, która ma co
najmniej 99% prawdopodobieństwa, że jest taka sama jak polinukleotydu
według niniejszego wynalazku, zmierzonego jako wartość E równa 0,01 lub
mniejsza, za pomocą algorytmu BLastN, FastA lub BLastP z parametrami
ustawionymi jak opisano powyżej.
[0119] Alternatywnie, warianty polinukleotydy według niniejszego wynalazku
hybrydyzują do sekwencji polinukleotydowych wyliczonych w SEKW ID NR:
1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 lub 25 lub dopełnień, odwrotnych sekwencji
lub odwrotnych dopełnień tych sekwencji w ostrych warunkach.
[0120] Niniejszy wynalazek dotyczy także polinukleotydów, które różnią się
od
ujawnionych
sekwencji,
lecz
w
konsekwencji
degeneracji
kodu
genetycznego, kodują polipeptyd, który jest taki sam jak ten kodowany przez
polinukleotyd według niniejszego ujawnienia. Tak więc, polinukleotydy
obejmujące sekwencje, które różnią się od sekwencji polinukleotydowych
wyliczonych w SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 lub 25; lub ich
dopełnienia,
odwrotne sekwencje lub
odwrotne dopełnienia, będące
wynikiem konserwatywnych podstawień są rozważane i objęte niniejszym
ujawnieniem. Dodatkowo, polinukleotydy obejmujące sekwencje, które różnią
się od sekwencji polinukleotydowych wyliczonych w SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4,
9, 10, 14, 15, 23, 24, lub 25, lub ich dopełnienia odwrotne sekwencje lub
odwrotne dopełnienia, będące wynikiem delecji i/lub insercji w łącznej licznie
mniej niż 10% całkowitej długości sekwencji są także rozważane i objęte
niniejszym ujawnieniem.
[0121] Oprócz posiadania konkretnego procentu identyczności, warianty
polinukleotydów korzystnie posiadają dodatkowe cechy strukturalne i/lub
funkcjonalne wspólne z polinukleotydem według wynalazku. Oprócz
wysokiego stopnia podobieństwa w ich pierwotnej strukturze, polinukleotydy
posiadające określony stopień identyczności lub zdolne do hybrydyzacji z
34
polinukleotydem według wynalazku, korzystnie posiadają co najmniej jedną z
następujących cech: (i) zawierają otwartą ramkę odczytu lub część otwartej
ramki odczytu kodującą polipeptyd posiadający zasadniczo te same
własności funkcjonalne co polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według
wynalazku; lub (ii) mają wspólne domeny.
Źródło elementów i sekwencji DNA
[0122] Dowolne lub wszystkie elementy i sekwencje DNA, które zostały
opisane w niniejszym dokumencie mogą być natywne dla jednego lub
większej liczby genomów roślinnych. Odpowiednio, wszystkie elementy i
sekwencje DNA, które są wybrane do ostatecznej kasety do transferu są
endogenne lub rodzime wobec genomu rośliny do transformacji. Na przykład,
wszystkie sekwencje mogą pochodzić z genomu ziemniaka. Alternatywnie,
jeden lub większa liczba elementów lub sekwencji DNA może być nienatywna wobec genomu roślinnego, który nie jest tego samego gatunku co
roślina do transformacji, lecz który funkcjonuje w dowolnym wydarzeniu w
komórce
roślinnego
gospodarza.
Rośliny
takie
obejmują
ziemniaka,
pomidora i lucernę. Ujawniono także zastosowanie jednego lub większej
liczby elementów genetycznych z rośliny, która jest płciowo zgodna z
gatunkiem rośliny do transformacji.
[0123] W tym kontekście, "roślina" obejmuje, ale nie ogranicza się do nich,
ziemniaka, pomidora, awokado, lucernę, buraka cukrowego, maniok, batat,
soję, groch, fasolę, kukurydzę, pszenicę, ryż, jęczmień i sorgo. Tak więc,
roślina może być rośliną jednoliścienną lub dwuliścienną. "Roślina" i "materiał
roślinny" obejmuje także komórki roślinne, nasiono, potomstwo rośliny,
propagulę wytworzoną drogą płciową lub bezpłciową i potomków dowolnego
z nich, takich jak części cięte lub nasiono. "Materiał roślinny" obejmują
hodowle zawiesinowe komórek, kalusa, zarodki, regiony merystematyczne,
tkanki kalusa, liście, korzenie, pędy, gametofity, sporofity, pyłki roślin,
kiełkujące sadzonki, nasiona i mikrospory. Rośliny mogą znajdować się w
różnych stadiach dojrzałości i mogą rosnąć w hodowli płynnej lub stałej, lub
w glebie, lub odpowiednich pożywkach w doniczkach, szklarniach lub na
35
polach. Ekspresja wprowadzonych liderów, "trailerów" lub sekwencji genów
w roślinach może być przejściowa lub trwała.
[0124] W związku z tym sekwencja graniczna transferowego DNA
pochodzenia roślinnego ("P-DNA") według niniejszego wynalazku nie jest
identyczna w sekwencji nukleotydowej z dowolną znaną sekwencją
graniczną T-DNA pochodzącą z bakterii, lecz działa zasadniczo w tym
samym celu. To znaczy, P-DNA można stosować do transferu i integracji
jednego polinukleotydu do innego. P-DNA można wstawić do plazmidu
indukującego guza, takiego jak plazmid Ti z Agrobacterum w miejsce
tradycyjnego
T-DNA
i
utrzymywać
w
szczepie
bakterii,
tak
jak
konwencjonalne plazmidy do transformacji. P-DNA można poddawać
manipulacjom
tak,
aby
zawierał
pożądany polinukleotyd,
który jest
przeznaczony do integracji do genomu roślinnego przez transformację roślin
za pośrednictwem bakterii. Patrz Rommens i in. w WO2003/069980,US2003-0221213, US-2004-0107455, and WO2055/004585.
[0125] Zatem, sekwencja graniczna P-DNA różni się o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 lub większą liczbę nukleotydów od
znanej sekwencji granicznej T-DNA z gatunków Agrobacterium, takich jak
Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes.
[0126] Sekwencja graniczna P-DNA jest więcej niż w 99%, 98%, 97%, 96%,
95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87 %, 86%, 85%, 84%, 83%,
82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%,
69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%,
56%, 55%, 54% 53%, 52%, 51% lub 50% podobna do sekwencji
nukleotydowej sekwencji granicznej T-DNA z Agrobacterium.
[0127] Opracowano sposoby identyfikacji i izolacji DNA transferowego z
roślin, zwłaszcza ziemniaków i pszenicy, które wykorzystują graniczną
sekwencję konsensus opisaną w US-2004-0107455.
[0128] DNA pochodzenia roślinnego według niniejszego wynalazku, takie jak
opisane w niniejszym wynalazku dowolne sekwencje, miejsca cięcia, regiony
lub
elementy, są
polinukleotydu,
z
funkcjonalne,
którym
są
jeśli
ułatwiają transfer
związane
do
innej
i
integrację
cząsteczki
kwasu
36
nukleinowego, na przykład chromosomu roślinnego, przy częstotliwości
transformacji około 99%, około 98%, około 97%, około 96%, około 95%,
około 94%, około 93%, około 92%, około 91%, około 90%, około 89%, około
88%, około 87%, około 86%, około 85%, około 84%, około 83%, około 82%,
około 81%, około 80%, około 79 %, około 78%, około 77%, około 76%, około
75%, około 74%, około 73%, około 72%, około 71 %, około 70%, około 69%,
około 68%, około 67%, około 66%, około 65%, około 64%, około 63%, około
62%, około 61%, około 60%, około 59%, około 58%, około 57%, około 56%,
około 55%, około 54 %, około 53%, około 52%, około 51 %, około 50%,
około 49%, około 48%, około 47%, około 46%, około 45%, około 44%, około
43%, około 42%, około 41%, około 40%, około 39%, około 38%, około 37%,
około 36%, około 35%, około 34%, około 33%, około 32%, około 31%, około
30%, około 29 %, około 28%, około 27%, około 26%, około 25%, około 24%,
około 23%, około 22%, około 21%, około 20%, około 15% lub około 5% lub
co najmniej około 1%.
[0129] Każda z tych sekwencji i elementów związanych z transformacją,
mogą być zmodyfikowane lub zmutowane w celu zmiany wydajności
transformacji. Do sekwencji transformacyjnej według niniejszego wynalazku
mogą być dodane inne sekwencje polinukleotydowe. Na przykład, można ją
zmodyfikować tak, aby posiadała wiele 5' i 3' miejsc klonowania lub
dodatkowe miejsca restrykcyjne. Sekwencja miejsca cięcia, jak ujawniona w
niniejszym opisie, na przykład, może być modyfikowana w celu zwiększenia
prawdopodobieństwa, że szkielet DNA wektora towarzyszącego nie zostanie
zintegrowany z genomem roślinnym.
[0130] Między dowolnymi sekwencjami cięcia lub granicznymi, opisanymi w
niniejszym dokumencie, można umieścić dowolny pożądany polinukleotyd.
Na przykład, pożądany polinukleotyd może być genem typu dzikiego lub
modyfikowanym, który pochodzi z roślin lub może być genem z genomu
innego niż roślinny. Na przykład, do przekształcenia rośliny ziemniaka,
kaseta ekspresyjna może być wykonana tak, że obejmuje promotor
specyficzny dla ziemniaka, który jest funkcjonalnie połączony z pożądanym
genem ziemniaka lub jego fragmentem i terminatorem specyficzny dla
37
ziemniaka. Kaseta ekspresyjna może zawierać dodatkowe elementy
genetyczne ziemniaka, takie jak sekwencja peptydu sygnałowego sprzężona
w ramce z końcem 5' genu oraz wzmacniacz transkrypcji ziemniaka.
Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do takiego układu, a kaseta
transformacji może być tak skonstruowana, że pożądany polinukleotyd,
funkcjonalnie połączony z promotorem, nie jest funkcjonalnie połączony z
sekwencją terminatora.
[0131] Jeśli sekwencja lub element związany z transformacja, taki jak
opisane powyżej, zostaną zidentyfikowane i izolowane z rośliny i jeśli ta
sekwencja lub element zostaną następnie zastosowane do transformacji
rośliny tego samego gatunku, to taką sekwencję lub element można opisać
jako "rodzimą" dla genomu roślinnego.
[0132] Zatem, "rodzimy" element genetyczny odnosi się do kwasu
nukleinowego, który występuje naturalnie w, pochodzi z lub należy do
genomu rośliny do transformacji. Podobnie, termin "endogenny" można także
stosować do określenia konkretnego kwasu nukleinowego, na przykład DNA
lub RNA lub białka jako "rodzimego" dla rośliny. Endogenny oznacza
element, który pochodzi z organizmu. Zatem dowolny kwas nukleinowy, gen,
polinukleotyd, DNA, RNA, mRNA lub cDNA, wyizolowany z genomu rośliny
lub gatunku rośliny, który ma zostać poddany transformacji lub wyizolowany
z rośliny lub gatunku, który jest płciowo zgodny lub zdolny do rozmnażania z
gatunkiem rośliny który ma zostać poddany transformacji, jest "rodzimy dla
gatunku roślin. Innymi słowy, natywny (rodzimy) element genetyczny
reprezentuje cały materiał genetyczny, który jest dostępny dla hodowców
roślin dla udoskonalania roślin za pomocą klasycznej hodowli roślin.
Wszelkie odmiany natywnego kwasu nukleinowego są również uważane za
"natywne" według niniejszego wynalazku. W związku z tym, "rodzimy" kwas
nukleinowy może także być wyizolowany z rośliny lub jej płciowo zgodnego
gatunku i zmodyfikowany lub zmutowany, tak że wariant otrzymany ma w co
najmniej 99%, 98%, 97%, 96%, 95 %, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%,
88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%,
75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%,
38
62%, 61% lub 60% podobną sekwencję nukleotydową, jak niezmodyfikowany
natywny kwas nukleinowy wyizolowany z rośliny. Rodzimy wariant kwasu
nukleinowego może mieć również mniej niż około 60%, mniej niż około 55%,
albo mniej niż około 50% podobieństwa sekwencji nukleotydowej.
[0133] "Rodzimy" kwas nukleinowy wyizolowany z rośliny może także
kodować
odmianę
naturalnie
występującego
produktu
białkowego
ulegającego transkrypcji i translacji z tego kwasu nukleinowego. Zatem,
rodzimy kwas nukleinowy może kodować białko, które ma większe niż lub
równe 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%,
87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%,
74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%,
61%, 60% podobieństwo sekwencji aminokwasowej do niezmodyfikowanego,
rodzimego białka wyrażanego w roślinie, z której wyizolowano kwas
nukleinowy.
Promotory
[0134] Polinukleotyd ujawniony w niniejszym dokumencie można stosować
do specyficznego kierowania ekspresją polipeptydów lub białek w tkankach
roślin. Kwas nukleinowy ujawnione w niniejszym dokumencie można także
stosować do specyficznego kierowania ekspresją antysensownego RNA lub
RNA biorącego udział interferencji RNA (RNAi), takiego jak mały interferujący
RNA (siRNA), w tkankach roślin, które może być przydatne w hamowaniu lub
całkowitym
blokowaniu
ekspresji
docelowych
genów.
Stosowane
tu
określenie "produkt kodujący" ma oznaczać, ostateczny produkt kwasu
nukleinowego, który jest funkcjonalnie połączony z promotorami. Na
przykład, białko lub polipeptyd jest produktem kodującym, jak antysensowny
RNA lub siRNA, który jest ostatecznym produktem kwasu nukleinowego
kodującego antysensowny RNA. Produkt kodujący może również oznaczać
nie ulegające translacji mRNA. Terminy polipeptyd i białko są tu stosowane
zamiennie. Przez promotor należy rozumieć kwas nukleinowy, korzystnie
DNA, który wiąże polimerazę RNA i/lub inne elementy regulacji transkrypcji.
Tak jak dowolny promotor, promotory według niniejszego wynalazku będą
ułatwiać lub kontrolować transkrypcję DNA lub RNA w celu wytworzenia
39
cząsteczki mRNA z cząsteczki kwasu nukleinowego, który jest funkcjonalnie
połączony z promotorem. RNA może kodować białko lub polipeptyd lub może
kodować interferujący RNA lub cząsteczkę antysensowną. Stosowane tu
określenie
"funkcjonalnie
połączony"
oznacza
odniesienie
do
fuzji
chemicznej, ligacji lub syntezy DNA, takiej, że tworzy się połączenie
promotor-sekwencja kwasu nukleinowego, w prawidłowej orientacji do
sekwencji kwasu nukleinowego, który ma podlegać transkrypcji w segment
RNA , Promotory mogą także zawierać niektóre lub wszystkie nie
podlegające translacji regiony 5' (5'-UTR) otrzymanego transkryptu mRNA. Z
drugiej strony, promotory niekoniecznie muszą posiadać jakikolwiek 5'UTR.
[0135] Promotor, w użytym tu znaczeniu, może także zawierać elementy
regulatorowe. I odwrotnie, element regulatorowy może być także oddzielony
od promotora. Elementy regulatorowe nadają szereg ważnych cech w
regionie promotorowym. Niektóre elementy wiążą czynniki transkrypcyjne,
które zwiększają szybkość transkrypcji funkcjonalnie połączonego kwasu
nukleinowego. Inne elementy wiążą represory, które hamują aktywność
transkrypcyjną. Wpływ tych czynników transkrypcyjnych na aktywność
promotora może pozwolić ustalić, czy aktywność promotora jest wysoka czy
niska, tzn. czy promotor jest "silny" lub "słaby".
[0136] Alternatywnie konstytutywny lub prawie konstytutywny promotor może
być
stosowany
do
ekspresji
sekwencji
polinukleotydowych
według
wynalazku.
[0137] Do ekspresji sekwencji polinukleotydowych według wynalazku można
użyć różnorodne indukowalne promotory genów roślinnych. Promotory
indukowalne
środowiskowe,
indukowanych
regulują
ekspresję
hormonalne
hormonami
lub
genu
w
odpowiedzi
chemiczne.
obejmują
promotory
Przykłady
na
sygnały
promotorów
indukowane
auksyny
Baumann i in. Plant Cell 11:323-334 (1999)); promotor indukowany przez
cytokininę (Guevara-Garcia Plant Mol. Biol. 38:743-753 (1998)) i promotor
reagujący na gibereliny (Shi i in. Plant Mol. Biol. 38:1053-1060(1998)).
Dodatkowo, do ekspresji sekwencji polinukleotydowych według wynalazku
mogą być stosowane promotory reagujące na działanie ciepła, światła,
40
zranienie, odporność na patogen oraz chemikalia takie jak jasmonian
metylowy lub kwas salicylowy.
[0138] Promotor może oznaczać promotor syntazy skrobi związanej z
granulkami, promotor genu pirofosforylazy ADP-glukozy ziemniaka lub
promotor genu 3'-monooksygenazy flawonoidów. Promotor może być
promotorem specyficznym dla nasion.
[0139] Niniejszy wynalazek dotyczy także polinukleotydów, które różnią się
od
ujawnionych
sekwencji,
lecz
w
konsekwencji
degeneracji
kodu
genetycznego, kodują polipeptyd, który jest taki sam jak ten kodowany przez
polinukleotyd według niniejszego ujawnienia. Tak więc, polinukleotydy
obejmujące sekwencje, które różnią się od sekwencji polinukleotydowych
wyliczonych w SEKW ID NR: 1,2,3,4,9,10,14,15,23, 24 lub 25; lub ich
dopełnienia,
odwrotne sekwencje lub
odwrotne dopełnienia, będące
wynikiem konserwatywnych podstawień są rozważane i objęte niniejszym
ujawnieniem. Dodatkowo, polinukleotydy obejmujące sekwencje, które różnią
się od sekwencji polinukleotydowych wyliczonych w SEKW ID NR: 1, 2, 3, 4,
9, 10, 14, 15, 23, 24, lub 25, lub ich dopełnienia odwrotne sekwencje lub
odwrotne dopełnienia, będące wynikiem delecji i/lub insercji w łącznej licznie
mniej niż 10% całkowitej długości sekwencji są także rozważane i objęte
niniejszym ujawnieniem.
[0140] Oprócz posiadanej określonej procentowej identyczności z ujawnioną
sekwencją polinukleotydową, warianty polinukleotydów korzystnie posiadają
dodatkowe wspólne cechy strukturalne i/lub funkcjonalne. Oprócz wysokiego
stopnia podobieństwa w ich pierwotnej strukturze, do polinukleotydów według
wynalazku, polinukleotydy posiadające określony stopień identyczności lub
zdolne do hybrydyzacji z polinukleotydem według wynalazku, korzystnie
posiadają co najmniej jedną z następujących cech: (i) zawierają otwartą
ramkę odczytu lub część otwartej ramki odczytu kodującą polipeptyd
posiadający zasadniczo te same własności funkcjonalne co polipeptyd
kodowany przez polinukleotyd według wynalazku; lub (ii) mają wspólne
domeny.
Źródło elementów i sekwencji DNA
41
[0141] Dowolne lub wszystkie elementy i sekwencje DNA, które zostały
opisane w niniejszym dokumencie mogą być natywne dla jednego lub
większej liczby genomów roślinnych. Odpowiednio, wszystkie elementy i
sekwencje DNA, które są wybrane do ostatecznej kasety do transferu mogą
być endogenne lub rodzime wobec genomu rośliny do transformacji. Na
przykład, wszystkie sekwencje mogą pochodzić z genomu ziemniaka.
Alternatywnie, jeden lub większa liczba elementów lub sekwencji DNA może
być nie-natywna wobec genomu roślinnego, który nie jest tego samego
gatunku co roślina do transformacji, lecz który funkcjonuje w dowolnym
wydarzeniu w komórce roślinnego gospodarza.
[0142] Rośliny takie obejmują ziemniaka, pomidora i lucernę. Można
wykorzystać jeden lub więcej elementów genetycznych z rośliny, która jest
płciowo zgodna z rośliną, która ma być transformowana.
[0143] W tym kontekście, "roślina" obejmuje, ale nie ogranicza się do nich,
ziemniaka, pomidora, lucernę, buraka cukrowego, maniok, batat, soję, groch,
fasolę, kukurydzę, pszenicę, ryż, jęczmień i sorgo. "Roślina" i "materiał
roślinny" obejmuje także komórki roślinne, nasiono, potomstwo rośliny,
propagulę wytworzoną drogą płciową lub bezpłciową i potomków dowolnego
z nich, takich jak części cięte lub nasiono. "Materiał roślinny" obejmują
hodowle zawiesinowe komórek, kalusa, zarodki, regiony merystematyczne,
tkanki kalusa, liście, korzenie, pędy, gametofity, sporofity, pyłki roślin,
kiełkujące sadzonki, nasiona i mikrospory. Rośliny mogą znajdować się w
różnych stadiach dojrzałości i mogą rosnąć w hodowli płynnej lub stałej, lub
w glebie, lub odpowiednich pożywkach w doniczkach, szklarniach lub na
polach. Ekspresja wprowadzonych liderów, "trailerów" lub sekwencji genów
w roślinach może być przejściowa lub trwała.
Konstrukty kwasu nukleinowego
[0144] Niniejszy wynalazek dotyczy konstruktów, zawierających wyizolowane
cząsteczki kwasu nukleinowego i sekwencje polipeptydowe tu opisane.
Konstrukty DNA mogą być plazmidami Ti pochodzącymi z A.tumefaciens.
[0145] Przy tworzeniu konstruktów kwasów nukleinowych, te różne składniki
konstruktu lub jego fragmenty będą zwykle wstawione do odpowiedniego
42
wektora do klonowania, na przykład, plazmidu, który jest zdolny do replikacji
w organizmie gospodarza bakteryjnego, na przykład, E. coli. Istnieją liczne
wektory, opisane w literaturze, wiele z nich jest dostępnych w handlu. Po
każdym klonowaniu, wektor do klonowania z pożądaną wkładką może być
izolowany i poddany dalszej manipulacji, takiej jak trawienie restrykcyjne,
dodanie nowych fragmentów lub nukleotydów, ligacja, delecja lub mutacja,
resekcja, itp., w celu dostosowania składników w żądanej kolejności . Po tym
gdy konstrukt zostanie zakończony, może następnie zostać przeniesiony do
odpowiedniego wektora do dalszej manipulacji, zgodnie ze sposobem
transformacji komórki gospodarza.
[0146] Cząsteczka rekombinowanego DNA zazwyczaj zawiera marker
selekcyjny, tak że transformowane komórki mogą być łatwo zidentyfikowane i
wybrane z nietransformowanych komórek. Przykłady takich markerów
obejmują, ale nie są ograniczone do nich, gen fosfotransferazy neomycyny
(nptll),(Potrykus i in. Mol. Gen. Genet. 199:183-188 (1985)), nadający
oporność na kanamycynę. Komórki wyrażające gen nptll można wybrać przy
użyciu odpowiedniego antybiotyku, takiego jak kanamycyna lub G418. Inne
powszechnie stosowane markery selekcyjne obejmują gen bar, nadający
oporność na bialafos; zmutowany gen syntazy EPSP (Hinchee i in.
Bio/Technology 6:915-922 (1988)), nadający oporność na glifosat oraz
zmutowany gen syntazy acetylomleczanowej (ALS), nadający oporność na
imidazolinon lub sulfonylomocznik (zgłoszenie patentu europejskiego nr
154204, 1985).
[0147] Dodatkowo, wektory mogą obejmować miejsce startu replikacji
(replikony) w konkretnej komórce gospodarza. Specjalistom w tej dziedzinie
znane są różne replikony prokariotyczne, działające w celu bezpośredniej
autonomicznej replikacji i utrzymania zrekombinowanej cząsteczki w
komórce prokariotycznego gospodarza.
[0148] Dostarcza się także komórki gospodarza zawierające konstrukty DNA.
Jak stosuje się w niniejszym opisie, komórka gospodarza odnosi się do
komórki, w której kodowany produkt jest ostatecznie wyrażony. Odpowiednio,
komórka gospodarza może być pojedynczą komórką, hodowlą komórkową
43
lub komórkami stanowiącymi część organizmu. Komórka gospodarza może
być także częścią zarodka, bielma, spermy lub komórki jajowej, albo
zapłodnionego jaja.
[0149] Przedmiotem wynalazku są także rośliny lub komórki roślinne,
zawierające konstrukty DNA. Korzystnie rośliny są okrytonasienne lub
nagonasienne. Konstrukt ekspresyjny może być stosowany do transformacji
różnych roślin, zarówno jednoliściennych (np pszenicy, trawy darniowej,
kukurydzy, ryżu, owsa, pszenicy, jęczmienia, sorgo, orchidei, irysa, lilii,
cebuli,
banana,
trzciny
cukrowej
oraz
palmy),
dwuliściennych
(np
Arabidopsis, ziemniaka, tytoniu, pomidora, awokado, pieprzu, buraka
cukrowego, brokuła, manioku, słodkiego ziemniaka, bawełny, poinsecji,
warzyw, lucerny, soja, grochu, fasoli, ogórka, winogrona, kapustnych,
marchwi, truskawki, sałaty , dębu, klonu, orzecha róży, mięty, kabaczka,
stokrotki, kaktusa, dębu, eukaliptusa, kloun) oraz nagonasiennych (np, sosna
zwyczajna, patrz Aronen, innish Forest Res. Papers, Viol. 595, 1996), biały
świerk (Ellis et al, Biotechnology. 11: 84-89, 1993) i modrzew (Huang et al, In
Vitro Celi. 27: 201-207, 1991).
Transformacja roślin i regeneracja
[0150] Polinukleotydy i polipeptydy według wynalazku można wprowadzać
do komórki roślinnego gospodarza za pomocą standardowych procedur
znanych w stanie techniki, służących do wprowadzania zrekombinowanych
sekwencji do docelowej komórki gospodarza. Procedury takie obejmują, ale
nie
ograniczają
przyswajanie,
się
do
nich,
elektroporację,
transfekcję,
biolistykę
i
infekcję,
transformację,
Agrobacterium.
Metody
wprowadzania obcych genów do roślin, w tym protokoły biologicznej i
fizycznej transformacji roślin, są znane w tej dziedzinie i mogą być
wykorzystane do wstawienia konstruktu według wynalazku do rośliny
gospodarza. Patrz, na przykład, . Miki i in., 1993, "Procedure for Introducing
Foreign DNA into Plants", w: Methods in Plant Molecular Biology and
Biotechnology, Glick and Thompson, wyd., CRC Press, Inc., Boca Raton, str.
67-88. Wybrane metody różnią się gospodarzem roślinnym i obejmują
metody transfekcji chemicznej, takie jak fosforan wapnia, transfer genów w
44
którym pośredniczy mikroorganizm, takic jak Agrobacterium (Horsch i in.
Science 227:12291, 1985), elektroporacja, mikro-wtrysk i biolistyczne
bombardowanie. Korzystne sposoby transformacji obejmują precyzyjną
hodowlę (patrz: zgłoszenia patentowe US 2003/0221213 A1 , 2004/0107455
A1 oraz 2005/0229267 A1) i udoskonalonej transformacji (patrz zgłoszenie
patentowe US 2005/0034188 A1).
[0151] Przedmiotem wynalazku są także rośliny lub komórki roślinne,
obejmujące polinukleotydy lub polipeptydy. Rośliny mogą być okrytonasienne
lub nagonasienne. Poza zwykłym znaczeniem rośliny, termin "rośliny" ma
także oznaczać owoce, nasiona, kwiaty, strobile, itd. Roślina może być
bezpośrednim transfektantem, co oznacza, że wektor był wprowadzony
bezpośrednio do rośliny, np. za pomocą Agrobacterium lub roślina może być
potomstwem stransfekowanej rośliny. Potomstwo można również otrzymać
przez bezpłciową reprodukcję stransfekowanej rośliny. Drugie lub kolejne
pokolenia rośliny pokolenia mogą być lub mogą nie być wytwarzane przez
reprodukcję
płciową,
tzn. zapłodnienia. Ponadto, roślina
może być
gametofitem (stadium haploidalne) lub sporofitem (stadium diploidalne).
[0152] W związku z tym, niniejszy wynalazek opisuje transformowanie rośliny
jednym lub większą liczbą elementów, które genetycznie pochodzą z rośliny.
[0153] Wynalazek obejmuje podejście "całkowicie natywne" do transformacji,
przy czym tylko elementy transformacji, które są natywne dla roślin są
ostatecznie włączane do pożądanej rośliny poprzez transformację. W
związku z tym, niniejszy wynalazek obejmuje transformację danego gatunku
roślin tylko takimi elementami transformacji genetycznej, które są natywne
dla tego gatunku rośliny. Podejście natywne może także oznaczać, że
konkretny element transformacji jest wyizolowany z tej samej rośliny, która
ma być transformowana, tego samego gatunku rośliny lub z rośliny, która jest
płciowo zgodna z rośliną do transformacji.
[0154] Z drugiej strony, roślina, która ma być transformowana, może być
transformowana kasetą do transformacji, która zawiera jeden lub większą
liczbę elementów genetycznych i sekwencje, które pochodzą z rośliny innego
gatunku. Pożądane może być zastosowanie, na przykład, miejsca cięcia,
45
które jest natywne wobec genomu ziemniaka w kasecie do transformacji lub
plazmidzie do transformacji rośliny pomidora lub pieprzu.
[0155] Niniejszy wynalazek nie ogranicza się jednak do natywnego lub
całkowicie natywnego podejścia. Kaseta transformacji lub plazmid według
niniejszego wynalazku mogą także obejmować sekwencje i elementy z
innych organizmów, np. z gatunków bakterii.
PRZYKŁADY
Przykład 1
Regulowana w dół ekspresja genu syntetazy asparaginowej
[0156] Przykład ten pokazuje, że regulacja w dół ekspresji genu
zaangażowanego w biosyntezę asparaginy w zawierających skrobię
tkankach rośliny zmniejsza ilość asparaginy w tych tkankach zawierających
skrobię i w konsekwencji zmniejsza ilość akrylamidu w żywności uzyskanej
zprzez ogrzewanie tych tkanek zawierających skrobię.
[0157] Sekwencja genu syntetazy 1 asparaginowej ziemniaka (Ast1) jest
przedstawiona w SEQ ID NR .: 1 Częściowa sekwencja genu syntetazy 2
asparaginowej ziemniaka (Ast2) jest przedstawiona w SEQ ID NR .: 2
[0158] Fragmenty tych genów, przedstawione w SEQ ID NR: 3 i 4 zostały
połączone, aby utworzyć SEQ ID NR .: 5 Dwie kopie otrzymanego segmentu
DNA
wprowadzono,
jako odwrócone
powtórzenie,
oddzielone
przez
przekładkę przedstawioną w SEQ ID NR .: 6, pomiędzy zbieżnie
zorientowane promotory genów pirofosforylazy ADP-glukozy (Agp) i syntazy
skrobi związanej z granulkami (Gbss), (SEQ ID NR .: 7 i 8, odpowiednio).
[0159] Uzyskany konstrukt wyciszający wprowadzono pomiędzy granice TDNA, który zawierał już kasetę ekspresyjną fosfotransferazy neomycyny
(nptll), genu będącego markerem selekcji.
[0160] Binarny wektor niosący ten T-DNA, oznaczony pSIM1148 (Fig 1A),
wprowadzono
do
Agrobacterium
LBA4404
w
następujący
sposób.
Kompetentne komórki LB4404 (50 µl) inkubuje się przez 5 minut na lodzie w
obecności 1 µg wektora DN, zamrożonego na około 15 sekund w ciekłym
azocie i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po dodaniu 1 ml
płynnego bulionu, traktowane komórki są hodowane przez 3 godziny w
46
temperaturze 28 °C i umieszczane na agarze/ciekłym bulionie, zawierającym
streptomycynę (100 mg/l) i kanamycynę (100 mg/l). Następnie DNA wektora
wydzielono z nocnych hodowli pojedynczych kolonii LBA4404 i badano za
pomocą
analizy
restrykcyjnej
w
celu
potwierdzenia
obecności
nieuszkodzonego DNA plazmidowego.
[0161] Dziesięciokrotne rozcieńczenia hodowanych przez noc kultur
Agrobacterium hodowano przez 5-6 godzin, wytrącano przez 15 minut przy
2800 obrotów na minutę, przemyto pożywką płynną MS (Phytotechnology)
uzupełnioną sacharozą (3%, pH 5,7) i ponownie zawieszano w tej samej
pożywce do 0,2 OD/600nm. Zawieszone komórki mieszano i stosowano do
infekcji 0,4-0,6 mm segmentów międzywęźla ziemniaka odmiany "Ranger
Russet".
[0162] Zainfekowane łodygi inkubowano dwa dni w pożywce współhodowli
(1/10 soli MS, 3% sacharoza, pH 5,7) zawierającej agar 6 g/l w temperaturze
22 °C w inkubatorze Percival (16 godzin światło), a następnie przenoszono
do pożywki indukcji kalusa (CIM, pożywka MS uzupełniona 3% sacharozą,
2,5 mg/l rybozydu zeatyny, 0,1 mg/l kwasu naftylooctowego i 6g/l agaru)
zawierającej timentin (150 mg/l) i kanamycynę (100 mg/l). Po miesiącu
hodowli w CIM, eksplantaty przenoszono do pożywki indukującej pędy (SIM,
pożywka MS uzupełniona 3% sacharozą, 2.5 mg/l rybozydu zeatyny, 0,3
mg/litr kwasu giberelinowego GA3 i 6g/l agaru) zawierającej timentin i
kanamycynę (150 i 100 mg/L, odpowiednio) do momentu powstania pędów.
Pędy powstające pod koniec okresu regeneracji przeniesiono do pożywki MS
z 3% sacharozą, 6 g/l agaru i timentinem (150mg/l). Rośliny transgeniczne
przenoszono do ziemi i umieszczano w szklarni.
[0163] Po trzech miesiącach, zbierano bulwy i analizowano poziomy
asparaginy zgodnie z Oficjalne sposoby analizy AOAC International (2002),
wydanie 17, AOAC International, Gaithersburg, MD, USA Official Method
982.30. Analiza ta wykazała, że 17 z 26 roślin pSIM1148 zawierało tylko
około 25% do 50% asparaginy, która była obecna w roślinach kontrolnych
(tabela 1) [0164] Bulwy z niektórych roślin o niskiej zawartości asparaginy
wycięto, blanszowano, smażono wstępnie i smażone końcowo w celu
47
produkcji frytek. Frytki zmielone na drobny proszek w ciekłym azocie, zostały
dostarczone na suchym lodzie do laboratoriów Covance. W Covance,
określano
poziomy
akrylamidu
wykonując
chromatografię
cieczowa
spektrometrię mas/ spektrometrię mas (LC/MS/MS) (United States Food and
Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition Office of
Plant & Dairy Foods and Beverages, "Detection and Quantitation of
Acrylamide in Foods", 2002). Tabela 2 pokazuje, że frytki z roślin pSIM48 o
niskiej zawartości asparaginy zgromadziły mniej niż jedną trzecią akrylamidu,
który występuje we frytkach kontrolnych.
[0165] Jako alternatywę do stosowania promotorów Agp i Gbss jako
elementów regulatorowych, możliwe jest również zastosowanie dwóch
promotorów Gbss. Konstrukt zawierający odwrócone powtórzenie, które
obejmuje fragmenty genów Ast1 i Ast2 wstawione pomiędzy dwoma
promotorami Gbss został wprowadzony pomiędzy granice T-DNA w celu
wytworzenia wektora binarnego pSM1151 (Figura 1B). Wektor ten
stosowano do wytworzenia linii transgenicznych ziemniaków w sposób
podobny jak opisano dla pSIM1148. Ponadto, sekwencje pochodzące z genu
Ast można włożyć pomiędzy promotor i terminator.
[0166] Dla dowolnego genu Ast, mogą istnieć inne sekwencje posiadające
wysoki stopień podobieństwa sekwencji. Możliwe jest stosowanie takich
sekwencji homologicznych do wytwarzania konstruktów wyciszających. Na
przykład, fragmenty genu Ast z pomidora mogą być stosowane do
wyciszania homologicznego genu Ast ziemniaka.
[0167] Po zidentyfikowaniu genu Ast pochodzącego z rośliny, konstruuje się
startery specyficzne dla genu, w celu amplifikacji genu techniką PCR.
Namnażanie PCR jest prowadzone zgodnie z metodami znanymi w
dziedzinie, a następnie gen asparaginazy, namnożony w PCR, jest
klonowany
w
wektorze
do
klonowania.
[0168]
Geny
Ast
można
zidentyfikować przez przeszukiwanie baz danych lub izolować z DNA rośliny.
Jednym przykładem genów Ast z warzyw innych niż ziemniak są geny Ast z
pszenicy przedstawione w SEQ ID NR .: 34 i 35. Równoczesne wyciszenie
tych genów w ziarnie pszenicy pozwoli na obniżenie poziomu asparaginy w
48
mące, a tym samym poziom akrylamidu w, na przykład, chlebie, ciastkac,
ciasteczkach lub krakersach.
[0169] Zamiast używania fragmentów genu Ast do wytwarzania konstruktów
tłumiącego, możliwe jest również użycie fragmentów uzyskanych z
promotorów genów Ast. Takie promotory można wydzielić przy użyciu metod
takich jak odwrotna PCR i dwie kopie poszczególnych fragmentów 150-600
par zasad promotora, mogą być wprowadzone jako odwrócone powtórzenie
pomiędzy promotora i terminatora lub dwa zbieżnie zorientowane promotory
(patrz: Rommens i in., Zgłoszenie międzynarodowe zgłoszenie patentowe
2006/036739 A2 , które jest włączone do niniejszego dokumentu poprzez
odniesienie).
Przykład 2
Nadekspresja genów asparaginazy
[0170] Przykład ten pokazuje, że nadekspresja genu zaangażowanego w
metabolizm asparaginy w zawierających skrobię tkankach rośliny zmniejsza
ilość asparaginy w tych tkankach zawierających skrobię i w konsekwencji
zmniejsza ilość akrylamidu w żywności uzyskanej zprzez ogrzewanie tych
tkanek zawierających skrobię.
[0171] Sekwencję genu asparaginazy ziemniaka (Asg1) z odmiany
ziemniaka Ranger Russet przedstawiono w SEQ ID NR .: 9 Odpowiednią
otwartą
ramkę
odczytu
i
przewidywaną
sekwencję
aminokwasową
przedstawiono w SEQ ID NR .: 10 i 11, odpowiednio. Binarny wektor
zawierający gen Asg1 wprowadzony pomiędzy promotor Agp i terminator
Ubi3 (SEQ ID NR .: 12) jest oznaczony jako pSIM658 (Figura 1C).
[0172] Poziomy ekspresji genu Asg1
zastosowanie
ilościowej
PCR
z
w bulwach określano przez
odwrotną
transkryptazą
w
czasie
rzeczywistym. Tabela 3 pokazuje, że bulwy 18 z 25 roślin pSIM658
wykazywały nadekspresję genu Arg1 od 2 do 20 razy. Bulwy te zostały użyte
do wytworzenia frytek. Analizy chemiczne wykazały, że frytki z dwóch linii
transgenicznych zawierały zredukowane poziomy akrylamidu (tabela 4).
[0173] Możliwe jest także wykorzystanie innych promotorów specyficznych
dla bulw do kierowania ekspresją genu Asg1. Plazmid pSIM757 zawiera
49
promotor Gbss funkcjonalnie połączony z genem Asg1. Transformacja
ziemniaka DNA transferowym tego plazmidu daje rośliny oporne na
kanamycynę, w których stwierdzono nadekspresję genu Asg1. Inne
promotory, które mogą być używane do kierowania ekspresją asparaginazy
w bulwach ziemniaka można wybrać z grupy składającej się z promotorów
patatyny, promotorów indukowanych zimnem i promotorów flawonoido-3'mono-oksygenazy (Fmo). Promotor Fmo jest przedstawiony przez SEQ ID
NR: 13 Promotor ten jest aktywny w na wpół dojrzałych i dojrzałych bulwach
lecz nie występuje w minibulwach.
[0174] Zamiast stosowania Asg1, możliwe jest także wykorzystanie innych
genów asparaginazy. SEQ ID NR: 14 przedstawia sekwencję cDNA
alternatywnego genu asparaginazy ziemniaka Asg2. Inne przykłady genów
asparaginazy obejmują gen asparaginazy z E. coli (numer dostępu Z1051m;
SEQ ID NR .: 31), Agrobacterium (nr dostępu Atu3044; SEQ ID NR .: 32),
jęczmienia (nr dostępu AF308474; SEQ ID NO .: 33) i dowolny gen kodujący
białko z motywem pfam01 112.12 (Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res
33, D192-6, 2005).
[0175] Sekwencję genu asparaginazy z pszenicy przedstawiono w SEQ ID
NR: 15 Przewidywana sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona jako
SEQ ID NR: 16
[0176] Dla dowolnego genu asparaginazy, mogą istnieć inne sekwencje
posiadające wysoki stopień podobieństwa sekwencji. Na przykład, gen
asparaginazy
pochodzący
z
rośliny
można
zidentyfikować
przez
przeszukiwanie baz danych takich jak te utrzymywane przez NCBI.
[0177] Po zidentyfikowaniu genu asparaginazy pochodzącego z rośliny,
konstruuje się startery specyficzne dla genu, w celu amplifikacji genu
techniką PCR. Namnażanie PCR jest prowadzone zgodnie z metodami
znanymi w dziedzinie, a następnie gen asparaginazy, namnożony w PCR,
jest klonowany w wektorze do klonowania.
[0178] Gen asparaginazy jest funkcjonalnie łączony z promotorem
specyficznym dla nasion, taki jak promotor genu puroindoliny pszenicy
przedstawiono w SEQ ID NR: 17 Transferowy NA obejmujący uzyskaną
50
kasetę ekspresyjną jest wprowadzany przy użyciu konwencjonalnych metod
transformacji, w celu wytwarzania pszenicy o niskiej zawartosci asparaginy.
W mące zyskanej z nasion takiej pszenicy będzie gromadzić się mniej
akrylamidu w czasie ogrzewania.
Przykład 3
Nadekspresja syntetazy glutaminowej
[0179] Nadekspresja genu syntetazy glutaminowej będzie powodować
zmniejszenie poziomów asparaginy. Dowolną sekwencję kodującą białko z
aktywnością syntetazy glutaminowej można funkcjonalnie połączyć z
promotorem, który jest wyrażany w pożądanym narządzie rośliny, takim jak
bulwa
ziemniaka. Ziemniak
zawiera
trzy pokrewne
geny
syntetazy
glutaminowej, przedstawione w SEQ ID NR .: 28-30. Segment DNA
obejmujący fragment każdego z tych genów można stosować do skutecznej
regulacji w dół aktywności syntetazy glutaminowej. W tym celu, co najmniej
jedną kopię segmentu można włożyć pomiędzy dwa zbieżne promotory lub
promotor i terminator. Uzyskaną kasetę ekspresyjną można wprowadzić do
rośliny
będącej
przedmiotem
zainteresowania
przez
zastosowanie
dowolnego sposobu transformacji. Można w ten sposób wybrać rośliny
transgeniczne
wytwarzające
narządy
roślinne
o
niskiej
zawartości
asparaginy. Obróbka cieplna tych organów roślinnych będzie dawać
produkty, które zawierają mniej akrylamidu niż produkty uzyskane z
odpowiednich, nie transformowanych roślin. Na przykład, przetworzona
bulwa transgeniczna powoli uzyskać frytki, które zawierają niższe poziomy
akrylamidu niż frytki uzyskane z bulw nietransformowanych. Wpływ
nadekspresji syntetazy glutaminowej na poziomy asparaginy opisali Harrison
i współpracownicy (Fizjologia roślin 133: 252-262, 2003). Jednakże, autorzy
ci nie mogli przewidzieć niespodziewanych konsekwencji zredukowanych
poziomów
asparaginy
na
silnie
zmniejszoną,
powodowaną
przez
ogrzewanie, akumulacją akrylamidu.
[0180] Podobnie, możliwe jest zmniejszenie ekspresji endogennego genu
przejawiającego aktywność reduktazy azotanowej. W tym celu, co najmniej
jedna kopia części genu lub promotora genu reduktazy azotanowej może
51
ulec ekspresji. Rośliny transgeniczne można przeszukiwać pod kątem
poziomów ekspresji
zredukowane
genu
poziomy
reduktazy azotanowej i
można
następnie
linie
przeszukiwać
wykazujące
pod
kątem
zredukowanych poziomów asparaginy. Możliwe jest również wyciszanie genu
kinazy
heksozowej
jednoczesnej
i
redukcji
wzrost
poziomu
poziomów
kwasu
asparaginy.
asparaginowego
Korelację
przy
pomiędzy
nadekspresją genów reduktazy azotanowej i heksokinazy a zwiększonymi
pozioma asparaginy opisano poprzednio (Roland i inni, Annu Rev Plant Biol.
57: 675-709, 2006; Szopa, Biochem Soc Trans 30: 405-410, 2002). Jednak
autorzy nie przewidzieli odwrotnego podejścia, aby obniżyć poziom
akrylamidu w żywności.
[0181]
Oczywiście,
istnieją
inne
strategie
modyfikowania
poziomów
asparaginy w roślinach przez zmianę ekspresji genów, które są bezpośrednio
lub pośrednio zaangażowane w syntezę lub metabolizm asparaginy. Nasze
wyniki sugerują, że do wytwarzania żywności o niskiej akrylamidu można
wykorzystać dowolną z tych metod.
Przykład 4
Równoczesna regulacja w dół ekspresji genów degradacji skrobi i
biosyntezy asparaginy
[0182] Przykład ten pokazuje, że równoczesna regulacja w dół ekspresji
genów zaangażowanych w rozkład skrobi i biosyntezę asparaginy,
odpowiednio, w zawierających skrobię tkankach rośliny może obniżyć
akumulację akrylamidu w żywności uzyskanej przez ogrzewanie tych tkanek
zawierających skrobię.
[0183] Rośliny transgeniczne wytwarzające bulwy o niskich poziomach
cukrów redukujących i asparaginy wytwarzano w dwóch etapach. Po
pierwsze, rośliny transformowano P-DNA z wektora binarnego pSIM371. Ten
P-DNA zawiera dwie kopie polinukleotydu obejmującego fragmenty genu
PPO (SEQ ID NR .: 18), R1' (SEQ ID NR. 19) i phL (SEQ ID NR: 20),
wprowadzone jako odwrócone powtórzenie pomiędzy promotora Gbss i
terminatora Ubi3.
52
[0184] Szczep Agrobacterium niosący zarówno wektor pSIM371, jak i
LifeSupport wektor pSIM368, który zawiera kasety ekspresyjne dla obu
genów nptll i codA, wstawione pomiędzy granicami T-DNA, stosowano do
infekowania 21900 eksplantatów z łodygi ziemniaka. Po dwudniowym okresie
wspólnej hodowli, zainfekowane eksplantaty poddawano przez pięć dni
ekspozycji na kanamycynę w celu wyselekcjonowania przejściowej ekspresji
genu nptII. Aby zapobiec proliferacji komórek zawierających stabilnie
zintegrowane T-DNA, eksplantaty zostały następnie przekazane do pożywki
zawierającej
5-fluorocytozynę
(5FC).
Ten
związek
chemiczny
jest
przekształcany w toksyczny 5-fluorouracyl (5FU) przez produkt genu codA
(Perera et al., 1993). 3822 pędów, które przeżyły podwójną selekcję
genotypowano na obecność P-DNA i brak jakiegokolwiek obcego DNA
zarówno z T-DNA jak i szkieletu plazmidu. Analiza ta zidentyfikowała 256
pędów zawierających wyłącznie rodzimy (wewnątrzgenowy) DNA , którym
pozwolono na ukorzenienie, posadzono w glebie i uprawiano przez sześć
tygodni w komorach wzrostu. W celu przeszukiwania pod kątem aktywności
PPO, roztwór katecholu odpipetowano na powierzchniach cięcia zebranych ~
2 cm minibulw. Czterdzieści osiem linii, które miały hamowane brązowienie
bulw indukowane katecholem hodowano w szklarni przez trzy miesiące w
celu wytworzenia częściowo dojrzałych bulw, które biochemicznie oceniano
pod kątem resztkowych poziomów aktywności PPO. Analiza ta wykazała, że
wykorzystanie konstruktu wyciszania genu PPO obniżyło aktywność PPO o
około 90%. 48 linii wewnątrzgenowych i nietransformowane rośliny kontroli
Ranger Russet i Russet Burbank były następnie rozmnażane i hodowane w
polu w Idaho, Aberdeen.
[0185] Dojrzałe bulwy wszystkich linii wewnątrzgenowych i kontroli
analizowano pod kątem stężenia glukozy po trzech i sześciu miesięcy
przechowywania w niskiej temperaturze.. Większość linii (43) wykazywała
większą redukcję słodkości indukowanej zimnem (~ 60%), niż uzyskane z
linii kontroli, w których został wyciszony tylko jeden z genów związanych ze
skrobią. Frytki uzyskane z bulw wyciszonych roślin 371-28 i 371-38 zawierały
mniej niż jedną trzecią neurotoksyny akrylamidowej zgromadzonego we
53
frytkach kontrolnych (tabela 4). Przewidywano takie zmniejszenie, ponieważ
akrylamid w większości pochodzi z indukowanych ogrzewaniem reakcji
pomiędzy grupą karbonylową cukrów redukujących i asparaginą (Mottram i
wsp, 2002;. Stadler et al., 2002).
[0186] Właściwości sensoryczne zmodyfikowanych frytek oceniane były
przez panel ośmiu profesjonalnie przeszkolonych osób. Frytki pochodzące z
bulw zmodyfikowanej odmiany Ranger Russet wykazały lepszy wygląd
wzrokowy niż frytki z Ranger Russet lub Russet Burbank. Ponadto, frytki
transgeniczne wykazywały znacząco lepszy ogólny zapach, wykrywany
przez nabłonek węchowy, który znajduje się w jamie nosowej. Dla bulw, które
były przechowywane przez dziesięć tygodni w 4 °C, obserwowano podobną
tendencję. W rzeczywistości, przechowywane na zimno transgeniczne linie
371-28, 30, 38 i 68 nadal osiągały lub przekraczały cechy sensoryczne
świeżych odmian niestransformowanych.
[0187] Jedna linię ziemniaka o niskiej zawartości cukru ponownie
transformowano pSIM1148. W porównaniu do frytek z oryginalnych roślin
pS1M1148, frytki z odpornego na kanamycynę podwójnego transformantu
generalnie wykazały dalszą redukcję poziomów akrylamidu. Zatem podwójne
transformanty wytwarzają bulwy, które można stosować w celu uzyskania
frytek, które (i) zawierają zredukowane poziomy akrylamidu i (ii) wykazują
ulepszone cechy sensoryczne.
Przykład 5
Sposoby transformacji całkowicie rodzimego DNA w celu redukcji
poziomów asparaginy i słodkości indukowanej zimnem w bulwach
ziemniaka
[0188] Ten przykład opisuje wykorzystanie metod transformacji całkowicie
rodzimego DNA do redukcji poziomów asparaginy i słodkości indukowanej
zimnem w bulwach ziemniaka. Przetwory spożywcze otrzymane z tych bulw
będą zawierały zredukowane poziomy akrylamidu.
[0189] DNA transferowe stosowane do transformacji zawiera dwie kasety
ekspresyjne wstawione pomiędzy pochodzące z ziemniaka regiony graniczne
przedstawiono w SEQ ID NR .; 2 3 (Figura 2). Pierwsza kaseta obejmuje
54
dwie kopie segmentu DNA obejmującego fragmenty genu promotora PPO
(SEQ ID NR .: 24), PhL (SEQ ID NR. 25) i R1. (SEQ ID NR: 26)
wprowadzone jako odwrócone powtórzenie pomiędzy funkcjonalnie aktywny
promotor genu Agp i terminator genu ubikwityny-3. Druga kaseta obejmuje
dwie kopie segmentu DNA obejmującego fragmenty genów Ast1, Ast2 i Ppo
(SEQ ID NR .: 27) wprowadzone jako odwrócone powtórzenie pomiędzy dwa
funkcjonalnie aktywne i zbieżnie zorientowane promotory genu Gbss.
[0190] Plazmid zawierający zarówno transferowe DNA i kasetę ekspresyjną
genu
transferazy izopentenylu
Agrobacterium (ipt)
wprowadzono do
Agrobacterium LBA4404 i uzyskany szczep stosowano do transformacji
odmian ziemniaka takich jak Ranger Russet i Atlantic stosując sposoby
transformacji bez markerów (patrz; Craig Richael, "Generation of marker-free
and backbone-free transgenic plants using a single binary approach",
tymczasowe zgłoszenie patentowe 60/765.177 , włączone do niniejszego
dokumentu poprzez odniesienie). Transformowanym roślinom, które nie
wykazują fenotypu cytokin, co określano przez zahamowania wzrostu i
niezdolność do tworzenia korzeni, pozwolono wytworzyć bulwy. Bulwy z
niektórych linii wykazują niskie poziomy aktywności enzymu Ppo, co można
zbadać przez odpipetowanie 0,5 ml 50 mM katecholu na powierzchnie
świeżo przeciętej bulwy. Poziomy aktywności enzymu Ppo można określić
dokładniej przez mieszanie sproszkowaneych bulw (1 gram) w ciągu 1
godziny w 50 mM buforu kwasu 3-(N-morfolino)propano-sulfonowego przy
pH 6,5 (5 ml). Po wytrąceniu frakcji stałej, można okreslić zmianę OD410 w
czasie. Linie bulw niż zawierające mniej niż 25% aktywności enzymu Ppo
będą dalej testowane przez inkubowanie bulw w temperaturze około 4 °C. Po
upływie co najmniej jednego miesiąca, poziomy glukozy można określić, na
przykład,
za
pomocą
odczynnika
oksydaza
glukozy/peroksydaza
(Megazyme, Treland). Linie bulw, które wykazują > 75% obniżenie poziomu
aktywności ppo i > 50% redukcji słodkości indukowanej zimnem można
analizować pod kątem stężenia wolnej asparaginy. Jeżeli wolne poziomy
asparaginy są zmniejszone o około> 50%, bulwy można przetwarzać i
analizować pod względem poziomów akrylamidu. Stransformowane linie,
55
które zawierają niskie poziomy asparaginy, oprócz niskiego poziomu Ppo i
niskiej słodkości indukowanej zimnem, można uznać za nadające sie do
produkcji handlowej. Frytki uzyskane z bulw korzystnych linii zawierają mniej
cukrów redukujących, co sprawia, że możliwe jest zmniejszenie czasu
blanszowania i zachowanie pierwotnego smaku ziemniaka. Co więcej, ich
atrakcyjność wizualna jest wzmocniona przez brak końców cukrowych i
czarnych zasinień. Frytki posiadają także lepszy zapach i akumulują
zredukowane poziomy akrylamidu, co można określić, w sensorycznym
panelu przez osoby przeszkolone do oceniania charakterystyki sensorycznej
frytek.
Przykład 6
TILLING
[0191] Geny zaangażowane w biosyntezę asparaginy, takie jak syntetaza
asparaginy mogą mieć również regulowaną w dół ekspresję przez ich
zmutowanie. Jeden ze sposobów osiągnięcia tego celu jest oznaczany jako
"Wywołane kierunkowo lokalne zmiany w genomach" (ang. Targeting
Induced Local Lesions IN Genomes - TILLING). Metoda ta łączy wydajność
mutagenezy wywołanej metanosulfonianem etylu (EMS) ze zdolnością
denaturacyjnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (DHPLC) do
wykrywania zmian par zasad za pomocą analizy heterodupleksu. Sposób
generuje szeroki zakres zmutowanych alleli, jest szybki i zautomatyzowany i
ma zastosowanie do dowolnego organizmu, który może być chemicznie
mutagenizowany..
W
podstawowej
metodzie
TILLING,
nasiona
są
mutagenizowane przez traktowanie EMS. Uzyskane rośliny M1 są samozapłodnione i osobników pokolenia M2 używa się do przygotowania próbek
DNA do badań przesiewowych mutacji, podczas gdy ich nasiona są poddane
inwentaryzacji. Próbki DNA są łączone i pule są rozmieszczane na płytkach
mikrotitracyjnych i poddawane reakcji PCR specyficznej dla genu (McCallum
et al, Nat Biotechnol. 18: 455-457).
[0192] Istnieje wiele alternatyw dla TILLING. Na przykład, możliwe jest
zastosowanie różnych typów substancji mutagennych, takich jak szybkie
neutrony lub diepoksybutan (DEB). Wszystkie te sposoby mogą być
56
połączone z platformą odwrotnej genetyki, która pozwala na przegląd i
izolację mutantów wstępnie wybranych genów. Takie metody zostały opisane
szczegółowo w, na przykład Wang et al., Floriculture, Ornamental and Plant
Biotechnology, Volume I, 2006, Global Science Brooks.
[0193] Ponadto, możliwe jest po prostu badanie przesiewowe plazmy
zarodkowej pod katem fenotypu o niskiej zawartości asparaginy. Tak więc
zarówno molekularna hodowla roślin, jak i hodowla z mutacjami, oraz
selekcja linii stanowią metody, które umożliwiają uzyskanie odmian o niskiej
zawartości asparaginy.
Przykład 7
Zmniejszenie poziomów asparaginy
[0194] Poziomy asparaginy można także zmniejszyć poprzez modyfikację
sposobu hodowli. Na przykład, gen syntetazy asparaginowej jest tłumione
przez węgiel (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene expression in plants.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:5 09-540, 1996). Możliwe jest
również zmniejszenie gromadzenia się asparaginy przez redukcję stosunku
azot/siarka w glebie. Stosunkowo niskie poziomy azotu będą powodować
zmniejszenie stężenia związków bogatych w azot i wzrost metabolitów
zawierających siarkę, takich jak cysteina, glutation i S-adenozylometionina.
Zatem, gleby zawierające stosunkowo wysoki poziom C, wysoki poziom S i
niski poziom N mogą być stosowane do wytwarzania żywności ze
stosunkowo niską zawartością asparaginy.
57
TABELE
[0195]
Tabela 1. Poziomy asparaginy w bulwach z trzech linii ziemniaka
hodowanych trzy miesiące w szklarni.
Linia
Poziom
(mg/100 g)
Nietransformowane Ranger Russet - 1
150
Nietransformowane Ranger Russet - 2
130
Nietransformowane Ranger Russet - 3
100
Nietransformowane Russet Burbank - 1
230
Nietransformowane Russet Burbank - 2
210
Kontrola
transgenicznych
odpornych
na 200
odpornych
na 220
odpornych
na 110
odpornych
na 200
odpornych
na 130
kanamycynę -1
Kontrola
transgenicznych
kanamycynę -2
Kontrola
transgenicznych
kanamycynę -3
Kontrola
transgenicznych
kanamycynę -4
Kontrola
transgenicznych
kanamycynę -5
Transgeniczna linia 1148-1
160
Transgeniczna linia 1148-3
90
Transgeniczna linia 1148-4
70
Transgeniczna linia 1148-5
150
Transgeniczna linia 1148-6
80
Asparaginy
58
Linia
Poziom
(mg/100 g)
Transgeniczna linia 1148-7
70
Transgeniczna linia 1148-8
80
Transgeniczna linia 1148-10
110
Transgeniczna linia 1148-11
160
Transgeniczna linia 1148-13
80
Transgeniczna linia 1148-14
210
Transgeniczna linia 1148-15
110
Transgeniczna linia 1148-17
50
Transgeniczna linia 1148-18
90
Transgeniczna linia 1148-19
80
Transgeniczna linia 1148-21
60
Transgeniczna linia 1148-22
170
Transgeniczna linia 1148-23
80
Transgeniczna linia 1148-24
80
Transgeniczna linia 1148-25
90
Transgeniczna linia 1148-26
80
Transgeniczna linia 1148-28
310
Asparaginy
59
Tabela 2. Poziomy akrylamidu we frytkach uzyskanych z bulw z trzech linii
ziemniaka hodowanych trzy miesiące w szklarni. Poziomy określono zgodnie
z wymogami United States Food and Drug administration, Center for Food
Safety and Applied Nutrition Office of the Plant & Dairy Foods and
Beverages, "Detection and Quantitation of Acrylamide in Foods" (2002).
Linia
Poziom akrylamidu (części
na miliard)
Nietransformowane Ranger Russet - 2
126
Kontrola transgenicznych odpornych na 127
kanamycynę -1
Transgeniczna linia 1148-7
46,6
Transgeniczna linia 1148-17
<20,0
Transgeniczna linia 1148-19
<20,0
Transgeniczna linia 1148-21
38,6
Transgeniczna linia 1148-24
23,1
60
Tabela 3. Poziomy ekspresji genu asparaginazy-1 w bulwach ziemniaka z
linii ziemniaka hodowanych sześć tygodni w komorach wzrostu, określone
się ilościowo prze RT-PCR.
Linia
Kontrola-1
linii
Względna
=
ekspresja
standardowy.
transgenicznych 22,4
8,8
odpornych na kanamycynę
Kontrola-2
linii
transgenicznych 8,9
4,2
odpornych na kanamycynę
Kontrola-3
linii
transgenicznych 23,7
4,2
odpornych na kanamycynę
Kontrola-4
linii
transgenicznych 27,5
3,4
odpornych na kanamycynę
Nietransformowane Ranger Russet -1 22,4
8,8
Linia transgeniczna 658-1
101,6
13,4
Linia transgeniczna 658-2
58,8
8,1
Linia transgeniczna 658-3
912,9
57
Linia transgeniczna 658-4
165,9
52,1
Linia transgeniczna 658-5
75,8
6,3
Linia transgeniczna 658-7
101,2
10,7
Linia transgeniczna 658-8
289,3
59,6
Linia transgeniczna 658-9
99,0
9,8
Linia transgeniczna 658-11
92,1
8,2
Linia transgeniczna 658-12
85,9
29,2
Linia transgeniczna 658-14
390,2
5,0
Linia transgeniczna 658-15
57,9
8,0
błąd
61
Linia
Względna
=
błąd
ekspresja
standardowy.
Linia transgeniczna 658-16
8,4
1,7
Linia transgeniczna 658-17
64,7
4,2
Linia transgeniczna 658-18
112,1
21,8
Linia transgeniczna 658-19
196,7
46,6
Linia transgeniczna 658-20
101,9
31,2
Linia transgeniczna 658-21
58,3
3,7
Linia transgeniczna 658-22
81,4
20,5
Linia transgeniczna 658-23
85,7
17,8
Linia transgeniczna 658-24
281,0
63,7
Linia transgeniczna 658-25
229,0
67,1
Linia transgeniczna 658-26
110,7
16,2
Linia transgeniczna 658-27
220,3
66,9
Linia transgeniczna 658-28
151,1
17,5
62
Tabela 4. Poziomy akrylamidu we frytkach uzyskanych z bulw z trzech linii
ziemniaka hodowanych trzy miesiące w szklarni.
Linia
Poziom akrylamidu (części na
miliard)
Nietransformowane Ranger Russet - 1150
1
Nietransformowane Ranger Russet - 1200
2
Nietransformowane Russet Burbank 958
-1
Nietransformowane Russet Burbank 1230
-2
Linia transgeniczna 371-28-1
211
Linia transgeniczna 371-28-2
281
Linia transgeniczna 371-38-1
152
Linia transgeniczna 371-38-2
184
Inne przykłady wykonania wynalazku
[0196] Wynalazek przedstawia również :
1 Produkt poddany obróbce termicznej, który otrzymuje się z tkanek
transgenicznych roślin, które zawierają pierwszy polinukleotyd,
obejmujący całkowitą lub częściową sekwencję genu, który jest
zaangażowany w biosyntezę asparaginy lub metabolizm asparaginy,
przy czym produkt ma stężenie akrylamidu niższe niż produkt
poddany obróbce termicznej, otrzymany z odpowiednich tkanek
identycznej rośliny nietransgenicznej.
2 Produkt podany obróbce termicznej jak w punkcie 1, przy czym
komórki
z
roślin
transgenicznych
ponadto
zawierają
drugi
polinukleotyd obejmujący co najmniej jeden z (i) sensownej i/lub
63
antysensownej sekwencji odpowiadającej genowi lub fragmentowi
genu R1 i (ii) sensowne i/lub antysensowne sekwencje odpowiadające
genowi lub fragmentowi genu fosforylazy L.
Sekwencje
SEQ ID NR: 1 (syntetaza asparaginowa 1)
[0197]
SEQ ID NR: 2 (syntetaza asparaginowa 2)
[0198]
64
SEQ ID NR: 3 (fragment Ast1)
[0199]
SEQ ID NR: 4 (fragment Ast2)
[0200]
SEQ ID NR: 5
[0201]
SEQ ID NR: 6
[0202]
SEQ ID NR: 7 (P: AGP)
[0203]
65
SEQ ID NR: 8 (P: Gbss)
[0204]
SEQ ID NR: 9 (asparaginaza-1)
66
[0205]
SEQ ID NR: 10 (cDNA asparaginazy-1)
[0206]
67
SEQ ID NR: 11 (białko asparaginazy-1)
[0207]
SEQ ID NR: 12 (ubiT)
[0208]
SEQ ID NR: 13 (P: FMO)
[0209]
68
SEQ ID NR: 14 (asparaginaza-2 ziemniaka)
[0210]
SEQ ID NR: 15 (asparaginaza pszenicy)
[0211]
69
SEQ ID NR: 16 (asparaginaza pszenicy)
[0212]
SEQ ID NR: 17 (promotor puroindoliny pszenicy)
[0213]
SEQ ID NR: 18 (PPO)
70
[0214]
SEQ ID NR: 19 (R1)
[0215]
SEQ ID NR: 20 (PhL)
[0216]
SEQ ID NR: 21 (P:ubi7)
[0217]
71
SEQ ID NR: 22 (P:patatin)
[0218]
72
SEQ ID NR: 23
[0219]
73
74
75
SEQ ID NR: 24 (P:PPO)
[0220]
76
SEQ ID NR: : 25 (P:PHL)
[0221]
SEQ ID NR: 26 (P:R1)
[0222]
SEQ ID NR: 27 (G:PPO)
[0223]
SEQ ID NR: 28 (GS1)
[0224]
77
SEQ ID NR: 29 (GS2)
[0225]
78
SEQ ID NR: 30 (GS3)
[0226]
SEQ ID NR: 31 (gen asparaginazy z E. coli)
[0227]
79
SEQ ID NR: 32 (gen asparaginazy z bakterii Agrobacterium)
[0228]
80
SEQ ID NR: 33 (gen asparaginazy z jęczmienia)
[0229]
81
SEQ ID NR: 34 (gen Ast z pszenicy)
[0230]
82
SEQ ID NR: 35 (gen Ast z pszenicy)
[0231]
83
Zastrzeżenia patentowe
1 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, otrzymanych z rośliny
ziemniaka, w których poziom biosyntezy asparaginy jest obniżony przez
zmniejszenie ekspresji genu syntetazy asparaginowej I kodowanego przez
sekwencję SEQ ID NR: 1, znamienny tym, że wyrób z bulw poddanych
obróbce termicznej ma co najmniej 70% niższe stężenie akrylamidu niż
produkty z bulw poddanych obróbce termicznej, wykonane z odpowiedniej
tkanki identycznej rośliny nietransgenicznej.
2 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 1,
znamienny tym, że produktem z bulw rośliny bulwiastej jest frytka, chips,
chrupka, ziemniak ub pieczony ziemniak.
3 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 1,
znamienny tym, że produkt z bulw ma stężenie akrylamidu, które jest o co
najmniej 80%.mniejsze niż stężenie akrylamidu w produkcie z poddanych
obróbce termicznej bulw, wykonanym z odpowiedniej tkanki identycznej
rośliny nietransgenicznej.
4 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 1,
znamienny
tym,
że
roślina
ziemniaka
zawiera
kasetę
ekspresyjną
obejmującą pierwszy promotor specyficzny dla bulw i drugi promotor
specyficzny dla bulw lub terminator, oraz w której pierwszy i ewentualnie
drugi promotor są położone w zbieżnej orientacji, tak że jest zdolna do
redukcji poziomów genu syntetazy I asparaginy, kodowanego przez
sekwencję SEQ ID NR: 1
5 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 4,
znamienny tym, że promotor jest promotorem (i) genu syntazy skrobi
związanej z granulkami (ii) genu pirofosforylazy ADP-glukozy ziemniaka (iii)
genu patatyny ziemniaka, lub (iv) genu monooksygenazy flawonoidów
ziemniaka.
84
6 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 1,
znamienny tym, że roślina ponadto eksprymuje polinukleotyd zawierający
fragment genu R1 i fragment genu fosforylazy L w orientacji antysensownej.
7 Produkt z poddanych obróbce termicznej bulw, według zastrzeżenia 1,
znamienny tym, że, gdy produktem są wypiekane frytki, chipsy ziemniaczane
lub placki ziemniaczane, stężenie akrylamidu w produkcie z poddanych
obróbce termicznej bulw, otrzymanych z rośliny bulwiastej która wyraża w
bulwach polinukleotyd, jest wybrane z grupy obejmującej 1-20 cząsteczek na
miliard (ppb), 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60-80 ppb; 80-100 ppb, oraz 100-120
ppb akrylamidu.
1/1