Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności
advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 • Volume 47 • Number 2 • 205-209 Praca poglądowa • Review Article Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności związanej z transporterami nadrodziny ABC Molecular techniques used in diagnostics of drug resistance associated with ABC transporters superfamily Marta Żebrowska, Aleksandra Sałagacka, Marek Mirowski, Ewa Balcerczak Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Lekooporność wpływa na skuteczność farmakoterapii. Istnieje kilka mechanizmów, które wywołują to zjawisko. Jednym z nich jest nadmierna aktywność białek nadrodziny ABC, które wykorzystują energię uzyskaną w procesie hydrolizy ATP do transportowania substratów przez błonę komórkową. Ze względu na bardzo szerokie spektrum substratowe za najważniejsze z nich uważa się glikoproteinę P (P-gp) kodowaną przez gen ABCB1, białko związane z opornością wielolekową 1 (MRP) kodowane przez gen ABCC1, białko oporności raka sutka (BCRP) kodowane przez gen ABCG2. Zmodyfikowana funkcja tych transporterów może wynikać ze zmian dokonujących się na poziomie DNA (mutacji punktowych), mRNA (poziom ekspresji) oraz samego białka. Techniki molekularne pozwalają na wykrywanie i ocenę zmian jakie zachodzą na wszystkich trzech wspomnianych etapach przepływu informacji w komórce. Pośród stosowanych technik można wyróżnić reakcje PCR (ang. polymerase chain reaction) wraz z jej modyfikacjami: PCR-SSCP (ang. single strand conformational polymorphism), PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism), RT (ang. reverse transcriptase PCR), Real–time PCR, Real-time HRM (ang. high resolution melting), a także sekwencjonowanie, mikromacierze, cytometrie przepływową oraz Northern blot i Western blot. Analiza na poziomie DNA, RNA i białka pozwala na zindywidualizowanie terapii. Summary Drug resistance affects the efficacy of pharmacotherapy. There are several mechanisms, which are responsible for that phenomenon. One of them is excessive activity of ABC superfamily proteins. They function as ATP-dependent membrane pumps, which eliminate xenobiotics from cells to extracellular environment. Due to the very broad substrate spectrum the most important is considered P-glycoprotein (P-gp), multidrug resistance associated protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein1 (BCRP). Encoded by ABCB1 gene, ABCC1 gene, ABCG2 gene respectively. Molecular techniques allow for detection and score changes occurring in all three stages of information flow in the cell. Among the techniques used can distinguish PCR (polymerase chain reaction) and its modifications: PCR-SSCP (single strand conformational polymorphism), PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism), RT (reverse transcriptase PCR), Real-time PCR, Real-time HRM (high resolution melting), as well as sequencing, microarrays, flow cytometry and Northern blot and Western blot. Analysis at the level of DNA, RNA and protein allows for individualized therapy. Słowa kluczowe:lekooporność, nadrodzina ABC, ABCB1, ABCC1, ABCG2, P-gp, MRP1, BCRP, mutacja punktowa, ekspresja, PCR, RT, HRM, PCR-RFLP, PCR-SSCP, mikromacierze, cytometria przepływowa Key words:drug resistance, ABC superfamily, ABCB1, ABCC1, ABCG2, P-gp, MRP1, BCRP, point mutation, expression, PCR, RT, HRM, PCR-RFLP, PCR-SSCP, microarrays, flow cytometry Wprowadzenie Lekooporność wielolekowa (ang. Multidrug Resistance MDR) jest jedną z przyczyn niepowodzeń leczenia farmakologicznego. Na jej rozwój wpływa szereg czynników takich jak: przyspieszenie metabolizmu leku, zwiększony wyrzut leku poza komórkę, zmniejszony jego wychwyt, blokowanie apoptozy czy też aktywacja systemu detoksykacji. Można wyróżnić pierwotną oporność wielolekową rozwijającą się przed zastosowaniem terapii oraz wtórną oporność wielolekową pojawiającą się po leczeniu. Jednym z najważniejszych mechanizmów prowadzących do rozwoju oporności wielolekowej jest aktywne usuwanie leku z komórek przez 205 Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności związanej z transporterami nadrodziny ABC błonowe białka transportowe, w tym białka należące do nadrodziny ABC [7,22,25]. Ze względu na dużą liczbę białek zaangażowanych w zjawisko lekooporności wielolekowej w artykule tym skoncentrowano się na technikach biologii molekularnej wykorzystywanych w diagnostyce tego procesu głównie w odniesieniu do: glikoprteiny P (P-gp), białka związanego z opornością wielolekową 1 (MRP1) oraz białka oporności raka sutka (BCRP). Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności. Badania molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności pozwalają na ocenę zmian zachodzących na poziomie DNA (mutacje), RNA (ekspresja genu i jej poziom), a także produktu białkowego. Większość technik molekularnych stosowanych w diagnostyce lekooporności związanej ze zmianami w genach kodujących białka nadrodziny ABC opiera się o technikę PCR. Diagnostyka lekooporności na poziomie DNA. Poszukiwanie mutacji. Reakcja PCR stanowi pierwszy etap badań, których celem jest poszukiwanie mutacji punktowych oraz ustalenie rodzaju genotypu. PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) jest odzwierciedleniem in vitro procesu replikacji, pozwala na namnożenie i zwielokrotnienie ilości wybranego fragmentu genu. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą: termostabilna polimeraza DNA prowadzącą syntezę nowej nici, odpowiedni bufor zawierający jony Mg2+ stanowiące kofaktor polimerazy DNA, matrycowe dwuniciowe DNA, trifosforany wszystkich deoksyrybonukleotydów, które są substratami niezbędnymi do syntezy nowych nici DNA, a także odpowiednie startery jednoniciowe oligonukleotydy o długości 1530 pz (par zasad), komplementarne do sekwencji otaczających powielany fragment DNA. Reakcja PCR przebiega w 3 powtarzających się cyklicznie etapach, które wyznacza zmiana temperatury: • W I etapie zachodzi denaturacja dwuniciowego DNA, która przebiega w temp. 93-96°C. • W II etapie w temp. 40-68°C, komplementarne startery hybrydyzują do jednoniciowych łańcuchów DNA. • W III etapie w temp. ok. 72°C termostabilna polimeraza od miejsc wyznaczonych przez startery wydłuża nowe nici DNA. Elongacja rozpoczyna się od końca 3` startera i przebiega równocześnie na obu przeciwstawnych niciach DNA. Po zakończeniu III etapu reakcji PCR ponownie następuje wzrost temperatury i rozpoczyna się kolejna denaturacja. Cały proces powtarza się ok. 25-40 razy. Zwielokrotniony w reakcji PCR wybrany fragment DNA poddaje się dalszej analizie mającej na celu ustalenie genotypu w przypadku mutacji już zdefiniowanych lub analizie przesiewowej wykrywającej nowe mutacje w badanym genie. Mutacja zdefiniowana to taka zmiana w sekwencji nukleotydów, której lokalizacja w obrębie genu oraz wpływ na białko 206 został poznany. W genach kodujących białka z rodziny ABC opisano i scharakteryzowano dotychczas wiele mutacji, do ich oceny wykorzystuje się najczęściej opisane poniżej metody [13]. Polimorfizm Długości Fragmentów Restrykcyjnych PCR–RFLP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) Wybrany fragment DNA namnożony w reakcji PCR poddaje się trawieniu określonym enzymem restrykcyjnym. Istnienie mutacji punktowej może być przyczyną powstania lub zaniku miejsca restrykcyjnego rozpoznawanego przez specyficzny enzym restrykcyjny. Skutkiem tego jest uzyskanie charakterystycznego obrazu elektroforetycznego dla poszczególnych genotypów [13]. Sekwencjonowanie (ang. sequencing) Pozwala na ustalenie rodzajów oraz kolejności nukleotydów w badanym fragmencie DNA. Można wyróżnić dwie główne metody sekwencjonowania: metodę Maxama–Gilberta oraz częściej stosowana metodę Sangera, inaczej nazywaną metodą „dideoksy”. Metoda enzymatycznej syntezy Sangera Opiera się o reakcje PCR (seqPCR), w której oprócz deoksynukleotydów wykorzystuje się dideoksynukleotydy (nukleotydy terminujące-ddNTP). Nukleotydy terminujące nie posiadają grupy hydroksylowej w pozycji 3` deoksyrybozy, co wyklucza możliwość przyłączenia kolejnego nukleotydu do nowo syntetyzowanego łańcucha DNA w trakcie reakcji seqPCR. W efekcie otrzymujemy fragmenty DNA, które różnią się o 1 nukleotyd. Produkty reakcji ocenia się w żelach poliakrylamidowych przy użyciu automatycznych sekwenatorów. Te urządzenia do detekcji wykorzystują fluorescencję emitowaną przez wyznakowany fluorochromem starter [5]. Real-time HRM czyli wysoko rozdzielcze topnienie matrycy (ang. High Resolution Melting) Nowoczesna metoda diagnostyczna, która pozwala na wykrywanie mutacji oraz mutacji punktowych typu SNP. Reakcja przebiega w dwóch etapach. W pierwszym z nich badaną próbę poddaje się amplifikacji w reakcji PCR w obecności fluorescencyjnego barwnika interkalującego, który wbudowuje się w dwuniciową cząsteczkę DNA i powoduje jej świecenie. W drugim etapie produkt reakcji PCR, cząsteczki DNA ulegają topnieniu w procesie denaturacji termicznej. W jego przebiegu temperatura wzrasta w określonym czasie, w sposób precyzyjny. Mierzony jest poziom fluorescencji badanych próbek, który w miarę postępu procesu denaturacji spada co wiąże się z rozplataniem dwuniciowej cząsteczki DNA pod wpływem temperatury oraz uwalnianiem do roztworu barwnika fluorescencyjnego. Szybkość denaturacji DNA zależy od składu nukleotydowego, głównie zawartości par GC, komplementarności oraz długość ich cząsteczek. W trakcie HRM wyznaczanym parametrem jest temperatura M. Żebrowska i inni topnienia Tm, czyli taka temperatura, przy której denaturacji ulega połowa obecnych w próbie dwuniciowych cząsteczek DNA. Porównanie temperatur topnienia dla produktów reakcji PCR umożliwia ocenę SNP [4]. Ze względu na dużą polimorficzność omawianych genów warto nie tylko badać już znane mutacje, ale także poszukiwać nowych. W tym celu można wykorzystać metody przesiewowe, jak na przykład PCR-SSCP. progową wchodząc w fazę wzrostu wykładniczego. Reakcji real-time PCR z barwnikiem niespecyficznym SYBR Green była wykorzystywana przez Szakacs i wsp. [27]. Longman i wsp. opracowali również macierz o niskiej gęstości “Human ATP-Binding Cassette Transporter TaqMan® Low-Density Array” wykorzystującą reakcję real-time z sondami typu TaqMan do ilościowej oceny ekspresji 47 genów z nadrodziny ABC [19]. Polimorfizm konformacyjny pojedynczych nici PCR-SSCP (ang. Single Strand Coformational Polymorphism) PCR-SSCP należy do przesiewowych metod wykrywania mutacji, w której produkty reakcji PCR poddaje się denaturacji, a potem szybko przenosi do środowiska niedenaturującego. Pojedyncze nici DNA przyjmują wtedy najkorzystniejszą strukturę drugo- i trzeciorzędową zależną od składu oraz sekwencji nuklotydowej konformerów. Nici o sekwencji zmutowanej przyjmują odmienną konformacje niż nici prawidłowe, różnią się także szybkością migracji produktów PCR-SSCP w żelu poliakrylamidowym [13]. Tą technikę wykorzystał Kobayashi i wsp. np.: do badania wariantów genu ABCG2 (BCRP) [14]. Zmiany mutacyjne w DNA mogą prowadzić do zmiany w ekspresji kodowanego genu. W celu oceny ekspresji należy poprzedzić reakcje PCR przepisaniem informacji z mRNA na komplementarny cDNA z udziałem odwrotnej transkryptazy. Hybrydyzacja typu Northern Technika Northern blot przebiega w kilku etapach. W pierwszym z nich mieszanina transkryptów wszystkich aktywnych w komórce genów ulega rozdzieleniu w warunkach denaturujących w żelu agarozowym. Potem mieszanina zostaje przeniesiona na nylonowy filtr, gdzie hybrydyzuje ze znakowaną sondą molekularną. Kilka serii płukań filtru daje możliwość usunięcia sondy związanej niespecyficznie [21]. Technika ta została wykorzystana między innymi do analizy transkryptu genu ABCC1 przez Guo i wsp.[10]. Mutacje punktowe omawianych genów mogą wpływać nie Ocena ekspresji genu na poziomie mRNA. Reakcja odwrotnej transkrypcji RT (ang. Reverse Transcriptase PCR) Jest to synteza komplementarnego DNA (cDNA) na matrycy mRNA przy udziale enzymu odwrotnej transkryptazy. Przeprowadzenie tej reakcji wymaga użycia odpowiedniego startera, którym może być uniwersalny starter oligo dT lub specyficzny starter dla badanego mRNA. Starter oligo dT jest komplementarny do ogona poliA, znajdującego się w każdej cząsteczce mRNA. Uzyskane cDNA poddaje się amplifikacji w zwykłej reakcji PCR. Jeżeli w obrazie elektroforetycznym produktu reakcji PCR można zaobserwować obecność prążka o odpowiedniej wielkości oznacza to, że gen ulega ekspresji [15]. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym (ang. Quantitative real-time PCR, qRT-PCR) Reakcja PCR w czasie rzeczywistym służy do ilościowej oceny ekspresji. Reakcja Real-time może przebiegać z wykorzystaniem barwnika niespecyficznego jakim jest np. SYBR Green interkalujący z DNA, bądź z wykorzystaniem specyficznych dla danego genu sond wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Najczęściej wykorzystywanymi sondami są sondy typu TaqMan, latarnie molekularne, skorpiony molekularne (molecular beacons, molecular scorpions). Do wyliczeń wykorzystywany jest parametr Ct czyli numer cyklu przy którym krzywa amplifikacji przecina linię tylko na ekspresję genów, ale także na funkcje i ilość kodowanych przez nie białek. Dlatego z punktu widzenia pełnej oceny mechanizmów lekooporności związanych z transporterami ABC istotna jest również ocena funkcji oraz ilości białek należących do tej nadrodziny. Metody oceny na poziomie białka Technika Western blot Jest wieloetapową oraz pracochłonną metodą pozwalającą na wykrywanie białek. Znajdujące się w materiale badanym białka rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem siarczanu dodecylu sodu (metoda SDS-PAGE), który nadaje białkom ujemny ładunek. Dzięki temu podczas elektroforezy wędrują do dodatnio naładowanej elektrody, a szybkość ich migracji zależy od ich wielkości. Masę cząsteczkową protein wyznacza się porównując tempo przemieszczania się białek badanych z wzorcowymi. Rozdzielone białka po przeniesieniu na nitrocelulozową membranę są inkubowane z wyznakowanymi przeciwciałami. Jest to technika bezpośrednia. W metodzie pośredniej wykorzystuje się dwa przeciwciała: swoiste przeciwciało pierwszego rzędu oraz wyznakowane przeciwciało drugorzędowe. Obecność oraz ilości białek ocenia się różnymi metodami w zależności od typu znakowania przeciwciał [13]. Technika Western blot jest wykorzystywana do analizy zarówno białek CRP, glikoproteiny P [26,28] jak i MRP. Do diagnostyki BCRP można wykorzystać monoklonalne przeciwciało BXP-21 [3,14]. Natomiast do analizy ABCC1 (MRP1) można wykorzystać monoklonalne przeciwciała anty-ABCC1 [6] lub monoklonalne przeciwciało MRPr1 [11]. Cytometria przepływowa (ang. Flow Cytometry) Nowoczesna metoda diagnostyki oparta o pomiar cech fizycznych oraz chemicznych takich jak: ugięcie i rozproszenie światła oraz fluorescencja. Jej ogólną zasadą jest detekcja 207 Techniki molekularne wykorzystywane w diagnostyce lekooporności związanej z transporterami nadrodziny ABC antygenów powierzchniowych oraz wewnątrzkomórkowych za pomocą specyficznych przeciwciał wyznakowanych fluorochromami. Dzięki cytometrii przepływowej można ocenić takie cechy komórek jak: • Wielkość • Ziarnistość • Poziom określonych białek położonych zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz komórek. • Zawartość DNA oraz RNA [17,23] Rozproszenie wiązki światła mierzone przez przedni detektor światła rozproszonego FSC (ang. Forward Scatter Channel), leżący równolegle do osi wiązki, informuje o wielkości komórki. Natomiast rozproszenie mierzone przez boczny detektor światła rozproszonego SSC (ang. Side Scatter Cannel), położony prostopadle do osi wiązki, informuje o ziarnistościach wewnątrzkomórkowych [17]. Do oceny poziomu białek: P-gp, MRP1, BCRP można wykorzystać przeciwciała: anty–MDR1, anty–MRP1, anty-BCRP [23]. Za pomocą cytometru przepływowego można również zbadać funkcję białek MDR1 oraz MRP1 poprzez pomiaru wyrzutu barwnika fluorescencyjnego – rodaminy 123 z komórki do środowiska pozakomórkowego [24]. Oprócz rodaminy można wykorzystać także barwnik Hoechst lub antracykliny [8]. Do oceny funkcji białek można także wykorzystać pozytronową tomografie komputerową (PET) lub emisyjną tomografie komputerową pojedynczego fotonu (SPECT) stosując różne substancje znaczone radionuklidem. Na przykład substrat transportera ABCB1 99Tc-sestamibi (99Tc-MIBI) jest użyteczny do obrazowania aktywności ABCB1 [8;20]. Nowoczesnym oraz bardzo użytecznym narzędziem biologii molekularnej są mikromacierze, które pozwalają na diagnostykę wszystkich etapów przepływu informacji w komórce: ocena wielu mutacji punktowych, porównawcza analiza ekspresji genów, białek oraz ich różnorodnych interakcji. Mikromacierze (ang. Microarrays) Mikromacierze to najczęściej szklane płytki, nylonowe membrany lub szkiełka mikroskopowe, na które naniesiono setki, a nawet tysiące molekularnych sond w postaci oligonukleotydów (25–60 nukleotydów) lub jednoniciowych cDNA (0,5–2,0 kpz). Zasadą tej metody jest hybrydyzacja na zasadzie komplementarności pomiędzy wyznakowanym fluorochromem materiałem badanym, a odpowiednią sondą molekularną umieszczoną na mikropłytce. Istnieje kilka typów mikromacierzy, które pozwalają na badanie mutacji punktowych SNP, a także na ocenę ekspresji genów na poziomie transkrypcji. W przypadku analizy ekspresji genów wykorzystuje się produkt reakcji RT (reakcji odwrotnej transkrypcji), czyli komplementarne cDNA, który po znakowaniu poddaje się hybrydyzacji z wcześniej przygotowaną mikromacierzą zawierającą specyficzne sondy. Zaletą mikromacierzy jest możliwość oceny ekspresji kilku tysięcy genów jednocześnie oraz po208 równawczej analizy ekspresji genów. W tym wypadku wykorzystuje się referencyjne cDNA oraz badane cDNA, każde znakowane innym fluorochromem. Analiza ekspresji genów techniką mikromacierzy może polegać na ocenie jakościowej, półilościowej bądź też ilościowej opartej o reakcje real-time PCR. Annereau i wsp. stworzyli mikromacierz o wysokiej gęstości zwaną ABC-ToxChip, która zawiera sondy specyficzne dla 36 transporterów ABC [1]. Wysokiej gęstości mikromacierze są użyteczne do przesiewowych badań nad nowymi markerami, ale nie pozwalają na precyzyjną ilościową analizę poziomu ekspresji genów, oprócz tego analiza uzyskanych wyników jest dość skomplikowana [8]. Huang i wsp. opracowali mikromacierz zawierająca sondy dla 40 z 49 transporterów tej nadrodziny [12]. Natomiast Gillet i wsp. opracowali mikromacierz DNA niskiej gęstości (DualChip human ABC) do analizy 38 genów transporterów ABC, które wykorzystali do oceny nadekspresji genów ABCB1, ABCC1 oraz ABCG2 w lekoopornych liniach komórkowych w porównaniu do linii lekowrażliwych [9]. Mikromacierze o niskiej gęstości lepiej nadają się do rutynowej analizy ze względu na dobrą powtarzalności oraz czułość i swoistość ich sond [8]. Z kolei Liu i wsp. zaprojektowali półilościową metodę AmpArray opartą o analizę porównawczą genów badanych do genu referencyjnego jakim jest GAPDH (housekeeping gene) i określeniu czy mamy tzw. regulację w górę lub w dół genu badanego w odniesieniu do genu referencyjnego. AmpArray pozwala na ocenę 47 genów z rodziny ABC, niestety jako metoda półilościowa nie pozwala na wykrywanie niewielkich zmian w ekspresji genów [18]. Aye i wsp. wykorzystali mikromacierze do analizy ekspresji genów należących do nadrodziny ABC w owodni [2]. Mirkomacierze do analiz ilościowych oparte są o reakcje real-time PCR, przykładem są wykorzystywane do oceny omawianych w pracy genów z rodziny ABC TaqMan® Human ABC Transporter Array. Mutacje punktowe typu SNP wykrywa się natomiast wykorzystując sondy o sekwencji komplementarnej do badanych mutacji punktowych typu SNP. Mikromacierze SNP umożliwiają równoczesną analizę nawet wszystkich mutacji punktowych badanego genu [13,30]. Van Ness i wsp. zaprojektowali mikromacierz zawierająca 3404 SNPs wyselekcjonowane z 983 genów, w tym genów transportera ABCB1 oraz ABCC1, która pozwoliła na określenie zróżnicowania genetycznego u chorych na szpiczaka mnogiego [29]. Ważnym narzędziem diagnostycznym są także mikromacierze białkowe, które umożliwiają ocenę zarówno ilości, jak i funkcji białek. Oprócz tego pozwalają na ocenę interakcji białko-białko, enzym-substrat lub białko-ligand. W przypadku mikromacierzy białkowych na powierzchni płytek są nanoszone białka lub przeciwciała [16]. Podsumowanie Zjawisko lekooporności i związana z nim nieskuteczność leczenia stanowi duży problem. W rozwoju tego zjawiska istotną rolę odgrywają białka nadrodziny ABC (P-gp, MRP1, BCRP). Ich nadmierna bądź zmieniona aktywność prowadzi M. Żebrowska i inni do usuwania leku z komórki, przez co lek nie może osiągnąć stężenia terapeutycznego. W powyższej pracy przedstawiono najczęściej wykorzystywane w diagnostyce lekooporności związanej z białkami nadrodziny ABC techniki molekularne, które pozwalają na szybką, czułą i prostą diagnostykę ekspresji genów ich mutacji punktowych, a także poziomu i funkcji kodowanych przez te geny białek. Ocena tych białek i ich genów technikami molekularnymi jest niezwykle istotna pod kątem indywidualizacji terapii, a tym samym poprawy jej skuteczności, zwłaszcza w chorobach nowotworowych. Piśmiennictwo: 1. Annereau JP, Szakacs G, Tucker CJ i wsp. Analysis of ATPbinding cassette transporter expression in drug-selected cell lines by a microarray dedicated to multidrug resistance. Mol Pharmacol 2004; 66: 1397–1401. 2. Aye ILMH, Paxton JW, Evseenko DA i wsp. Expression, Localisation and Activity of ATP Binding Cassette (ABC) Family of Drug Transporters in Human Amnion Membranes. Placenta 2007; 28: 868-877. 3. Burger H, van Tol H, Boersma AWM i wsp. Imatinib mesylate (STI571) is a substrate for the breast cancer resistance protein (BCRP)/ABCG2 drug pump. Blood 2004; 104: 2940-2942. 4. Cieszczyk P, Maciejewska A, Sawczuk M Metodologia badań genetycznych w sporcie Badania genetyczne w sporcie. GnatLesińska A Wydawnictwo Otokinesiology, Szczecin 2008; 2035. 5. Drewa G, Olszewska-Słonina D, Bratkowska W i wsp. Inżynieria genetyczna, Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy. Drewa G, Ferenc T Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, Wrocław 2005; 401-425. 6. Echevarria-Lima J, Rumjanek VM, Kyle-Cezar F i wsp. HTLVI alters the multidrug resistance associated protein 1 (ABCC1/ MRP1) expression and activity in human T cells. J Neuroimmunol 2007; 185: 175–181. 7. Filipits M. Mechanisms of cancer: multidrug resistance. Drug Discov Today Dis Mech 2004; 1: 229-234. 8. Gillet JP, Efferth T, Remacle J Chemotherapy-induced resistance by ATP-binding cassette transporter genes. Biochim Biophys Acta 2007; 1775: 237–262. 9. Gillet JP, Efferth T, Steinbach D i wsp. Microarray-based Detection of Multidrug Resistance in Human Tumor Cells by Expression Profiling of ATP-binding Cassette Transporter Genes. Cancer Res 2004; 64: 8987–8993. 10. Guo L, Liu Y, Bai Y i wsp. Gene expression profiling of drug-resistant small cell lung cancer cells by combining microRNA and cDNA expression analysis. Eur J Cancer 2010; 46: 1692-1702. 11. Hooijberg JH, Jansen G, Assaraf YG I wsp. Folate concentration dependent transport activity of the Multidrug Resistance Protein 1 (ABCC1). Biochem Pharmacol 2004; 67: 1541–1548. 12. Huang Y, Anderle P, Bussey KJ i wsp. Membrane transporters and channels: role of the transportome in cancer chemosensitivity and chemoresistance. Cancer Res 2004; 64: 4294–4301. 13. Jamroziak K, Balcerczak E, Mirowski M. Diagnostyka molekularna w hematologii. Hematologia dla studentów i lekarzy. Robak T Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Łódź 2008; 22-35. 14. Kobayashi D, Ieiri I, Hirota T i wsp. Functional assessment of ABCG2 (BCRP) gene polymorphism to protein expression in human placenta. Drug Metab Dispos 2005; 33: 94-101. 15. Korcz A, Lipiński D, Mikołajczyk-Stecyna J i wsp. Synteza cDNA na matrycy całkowitego RNA. Analiza DNA teoria i praktyka. Słomski R Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, Poznań 2008; 176-182. 16. LaBaer J, Ramachandran N. Protein microarrays as tools for functional proteomics. Curr Opin Chem Biol 2005; 9: 14–19. 17. Lisiecka U, Kostro K, Jarosz Ł. Cytometria przepływowa jako nowoczesna metoda w diagnostyce i prognozowaniu chorób Med Weter 2006; 62: 998-1001. 18. Liu Y, Peng H, Zhang JT Expression profiling of ABC transporters in a drug-resistant breast cancer cell line using AmpArray. Mol Pharmacol 2005; 68: 430–438. 19. Langmann T, Mauerer R, Schmitz G, Human ATP-binding cassette transporter TaqMan low-density array: analysis of macrophage differentiation and foam cell formation. Clin Chem 2006; 52: 310–313. 20. Luker GD, Piwnica-Worms D. Beyond the Genome: Molecular Imaging in vivo with PET and SPECT. Acad Radiol 2001; 8: 4-14. 21. Nuc K, Słomski R. Hybrydyzacja typu Northern. Analiza DNA teoria i praktyka. Słomski R Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, Poznań 2008; 125-130. 22. Panczyk M, Sałagacka A, Mirowski M. Gen MDR1 (ABCB1) kodujący glikoproteinę P (P-gp) z rodziny transporterów błonowych ABC: znaczenie dla terapii i rozwoju nowotworów. Postępy Biochem 2007; 53: 361-373. 23. Podolak−Dawidziak M, Duś D, KiełbińskiI M i wsp. Clinical Relevance of Multidrug Resistance Proteins Expression in Patients with de novo Acute Myeloid Leukaemia. Adv Clin Exp Med 2005; 14: 6: 1151–1160. 24. Siegmund W, Ludwig K, Giessman T i wsp. The effects of the human MDR1 genotype on the expression of duodenal P-glycoprotein and disposition of the probe drug talinolol. Clin Pharmacol Ther 2002; 72: 572-583. 25. Sparreboom A, Romano D, Yuichi A i wsp. Pharmacogenomics of ABC transporters and its role in cancer chemotherapy. Drug Resist Updat 2003; 6: 71-84. 26. Suna M, Kingdomb J, Baczyk D i wsp. Expression of the Multidrug Resistance P-Glycoprotein, (ABCB1 glycoprotein) in the Human Placenta Decreases with Advancing Gestation. Plecanta 2006; 27: 602-609. 27. Szakacs G, Annereau JP, Lababidi S i wsp .Predicting drug sensitivity and resistance: profiling ABC transporter genes in cancer cells. Cancer Cell 2004; 6: 129–137. 28. Tiwari AK, Sodani K, Wang S i wsp. Nilotinib (AMN107, Tasigna1) reverses multidrug resistance by inhibiting the activity of the ABCB1/Pgp and ABCG2/BCRP/MXR transporters. Biochem Pharmacol 2009; 78: 153–161. 29. Van Ness B, Ramos C, Haznadar M i wsp. Genomic variation in myeloma: design, content, and initial application of the Bank On A Cure SNP Panel to detect associations with progression-free survival. BMC Med 2008; 6: 1-14. 30. Wybrańska I, Guevara I, Maziarz B i wsp. Metody biologii molekularnej w diagnostyce medycznej. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Wydawnictwo Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010; 142-172. Adres do korespondencji: Marta Żebrowska Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-151 Łódź, ul. Muszyńskiego 1 tel./fax: 42 677-91-30 e-mail: [email protected] Praca finansowana z grantu Ministerstwa Nauki I Szkolnictwa Wyższego nr 507-13-051 Zaakceptowano do publikacji: 08.04.2011 209
