PRACA POGL¥DOWA 2003, VOL 33, NO 2, 97-104 POSZUKIWANIE GENÓW DLA NEFROPATII CUKRZYCOWEJ: NOWE KIERUNKI SEARCH FOR DIABETIC NEPHROPATHY GENES: NEW DIRECTIONS Wojciech M³ynarski, Pawe³ P. Wo³kow, Andrzej S. Krolewski Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA Streszczenie: Istnieje wiele dowodów dostarczonych przez badania epidemiologiczne, ¿e nefropatia u pacjentów z cukrzyc¹ typu 1 wystêpuje rodzinnie. Dane te sk³aniaj¹ do poszukiwania genów predysponuj¹cych do rozwoju nefropatii, co przyczyni³oby siê do zdefiniowania grupy wysokiego ryzyka wyst¹pienia tego powik³ania oraz pozwoli³oby na znalezienie nowych mechanizmów prowadz¹cych do niewydolnoci nerek w cukrzycy. Symulacje matematyczne w oparciu o istniej¹ce dane genetyczne sugeruj¹ zarówno istnienie jednego genu o silnym wp³ywie na rozwój nefropatii, jak i interakcji kilku genów o porednim wp³ywie. Wyniki obecnie prowadzonych badañ opartych na analizie sprzê¿eñ s¹ jednak wci¹¿ niejednoznaczne. Byæ mo¿e jest to spowodowane tym, ¿e badaniami objêto zbyt ma³¹ liczbê rodzin, stosowano ró¿norodne kryteria rozpoznawania nefropatii, jak równie¿ nieodpowiednie modele przy analizie danych genetycznych. Wyniki badania genów kandydatów s¹ równie¿ niejednoznaczne. Nie uda³o siê dotychczas potwierdziæ roli w predyspozycji do rozwoju nefropatii najbardziej obiecuj¹cych genów kandydatów, takich jak TGFβ czy AGTR1. W celu przyspieszenia badañ nad identyfikacj¹ genów odpowiedzialnych za predyspozycjê do nefropatii cukrzycowej pomocne bêdzie: ujednolicenie fenotypu nefropatii oraz modeli badawczych uwzglêdniaj¹cych miêdzy innymi czas trwania cukrzycy, jak równie¿ zastosowanie analiz warunkowych oraz profili ekspresji genów. S³owa kluczowe: genetyka, nefropatia, cukrzyca typu 1 Abstract: Multiple epidemiological investigations showed that diabetic nephropathy in type 1 diabetes clusters in families. Mathematical simulations based on existing family data suggest that such clustering could be accounted for by existence of a single gene with major effect or several genes with moderate effects. The results of recent genome scan studies have not confirmed this model, however. This may result from too small family collections used in these studies or heterogeneous definition of the affected patients. The results of studies on the role of specific candidate genes in the development of diabetic nephropathy are also inconclusive. The role of the most promising candidate genes such as TGFβ or AGTR1 could not be confirmed so far. In order to accelerate the search for susceptibility genes for diabetic nephropathy, following improvements should be made in the future studies: patients with diabetic nephropathy should be better defined with regards to proteinuria and renal function loss, as well as duration of diabetes, genetic analysis should include conditional analysis, and candidate genes and pathways should be searched for and examined by microarray studies. Key words: genetics, nephropathy, type 1 diabetes 1. Historia naturalna nefropatii Nefropatia cukrzycowa jest najpowa¿niejszym powik³aniem cukrzycy typu 1. Wynika to zarówno z jej wp³ywu na skrócenie czasu prze¿ycia pacjentów, jak i na jakoæ ich ¿ycia w okresie stopniowo rozwijaj¹cej siê niewydolnoci nerek (1). Niebagatelne jest te¿ obci¹¿enie spo³eczne zwi¹zane z koniecznoci¹ dializoterapii lub transplantacji nerki w schy³kowej fazie choroby. Utrata funkcji nerek mierzona jako spadek przes¹czania k³êbuszkowego wystêpuje niemal wy³¹cznie u pacjentów, u których uprzednio stwierdzono mikroalbuminuriê. Ta ostatPRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 97 M³ynarski W., Wo³kow P. P., Krolewski A. S. nia jest raczej wczesnym objawem choroby. Obecnoæ mikroalbuminurii stwierdza siê u kilku procent pacjentów z cukrzyc¹ typu 1 ju¿ w rok do 3 lat od rozpoznania, odsetek ten ronie do 50-60% pacjentów po 20 do 30 lat trwania choroby po okresie dojrzewania (uwa¿a siê, ¿e w okresie przedpokwitaniowym cukrzyca nie ma znacz¹cego ujemnego wp³ywu na funkcjê nerek) (2). Gdy dobowa utrata bia³ka z moczem przekracza 0,5 grama, mówimy o proteinurii, któr¹ stwierdza siê najwczeniej w 5 lat od momentu rozpoznania, a po 20-30 latach jest obecna u oko³o 30% pacjentów. Oznacza to, ¿e mniej wiêcej po³owa pacjentów, u których stwierdzono uprzednio mikroalbuminuriê przechodzi do stadium proteinurii. U czêci osób postêpuj¹cy równolegle spadek filtracji k³êbuszkowej doprowadza stopniowo do schy³kowej niewydolnoci nerek, obserwowanej najwczeniej po 13 latach cukrzycy typu 1 po okresie dojrzewania. W 35 lat po postawieniu diagnozy schy³kowa niewydolnoæ nerek stwierdzana jest u oko³o 25% pacjentów (3). Do stopniowego upoledzenia funkcji nerek u pacjentów z cukrzyc¹ typu 1 przyczyniaj¹ siê z pewnoci¹ czynniki rodowiskowe takie, jak dieta czy palenie tytoniu. Nie s¹ one jednak w stanie wyjaniæ w pe³ni wyst¹pienia i progresji nefropatii. Analiza powik³añ nerkowych u pacjentów z cukrzyc¹ typu 1 wykaza³a, ¿e ryzyko wyst¹pienia proteinurii jest najwy¿sze w 5 do 15 lat po rozpoznaniu cukrzycy, a nastêpnie maleje (4). Dane te sugerowa³y, ¿e podatnoæ na wyst¹pienie nefropatii cukrzycowej dotyczy jedynie czêci pacjentów. St¹d zmniejszenie liczby nowych przypadków proteinurii po 15 latach, gdy u wiêkszoci podatnych osób proces chorobowy ju¿ wyst¹pi³. 2. Rodzinne uwarunkowania nefropatii Klasycznym dowodem na dziedziczenie ryzyka nefropatii cukrzycowej mog³yby teoretycznie byæ badania z udzia³em blini¹t mono- i dizygotycznych. Znalezienie wystarczaj¹cej liczby par blini¹t, które zapewni³yby takiemu badaniu odpowiedni¹ si³ê statystyczn¹ jest jednak zadaniem niezwykle trudnym. Mo¿liwym natomiast okaza³o siê sprawdzenie czy ryzyko wyst¹pienia niewydolnoci nerek w przebiegu cukrzycy typu 1 wystêpuje rodzinnie. W badaniu Seaquista i wsp. z 1989 roku wykorzystano dane dotycz¹ce rodzin, w których przynajmniej dwoje sporód rodzeñstwa chorowa³o na cukrzycê typu 1 (5). Probandem by³a pierwsza osoba, u której wyst¹pi³a cukrzyca. Analizowano dwie grupy rodzin, w jednej proband by³ po transplantacji nerki z powodu nefropatii cukrzycowej, w drugiej grupie u probanda nie stwierdzano nefropatii. Okaza³o siê, ¿e cechy nefropatii wystêpowa³y u 83% sporód chorego na cukrzycê rodzeñstwa probandów po przebytej transplantacji i tylko u 17% chorego rodzeñstwa probandów wolnych od komplikacji nerkowych. W badaniu Borch-Johnsen i wsp. wykazano, ¿e choruj¹ce na cukrzycê rodzeñstwo probandów, u których stwierdzono proteinuriê ma trzykrotnie wy¿sze ry- zyko nefropatii ni¿ rodzeñstwo probandów, u których nie stwierdza siê proteinurii (6). W du¿ym badaniu przeprowadzonym w naszym zak³adzie Quinn i wsp. wykazali, ¿e rodzeñstwo z cukrzyc¹ typu 1 probandów z utrwalon¹ proteinuri¹ ma 2,5-krotnie wiêksz¹ szansê rozwiniêcia proteinurii ni¿ rodzeñstwo probandów z normo- lub mikroalbuminuri¹ (7). W tym badaniu oprócz du¿ej liczby rodzin pos³u¿ono siê parametrem kumulatywnego ryzyka wyst¹pienia proteinurii. Takie przedstawienie wyników pozwoli³o na ocenê modeli genetycznych i zaplanowanie przysz³ych badañ nad poszukiwaniem genów odpawiedzialnych za nefropatiê cukrzycow¹ (8). W wieloorodkowym badaniu DCCT (ang. Diabetes Control and Complication Trial), którego g³ównym celem by³a ocena skutecznoci intensywnej insulinoterapii, potwierdzono wyniki poprzednich trzech badañ (9). 3. Model genetycznej predyspozycji do nefropatii Mimo licznych dowodów na rodzinne wystêpowanie nefropatii, badania te nie mog¹ wykluczyæ wp³ywu czynników rodowiskowych takich, jak dieta lub styl ¿ycia, chocia¿ co istotne, stopieñ kontroli glikemii w badanych grupach by³ podobny i nie mo¿e wyjaniaæ zaobserwowanych ró¿nic. W celu odró¿nienia genetycznych i rodowiskowych przyczyn rodzinnego wystêpowania nefropatii z pomoc¹ przychodz¹ symulacje przeprowadzone przez Khoury i wsp. oraz Hoppera i Carlina (10, 11). Wykaza³y one, ¿e zak³adaj¹c brak komponenty genetycznej, czynniki rodowiskowe zwiêkszaj¹ce 2-10 razy ryzyko wyst¹pienia choroby, spowoduj¹ tak nieznaczn¹ agregacjê przypadków wród rodzeñstwa, ¿e mo¿na by to wykryæ jedynie na bardzo liczebnych próbach. W pierwszym z tych badañ, ryzyko ze strony czynników rodowiskowych modelowano jako funkcjê dychotomiczn¹ (brak efektu rodowiskowego lub jego obecnoæ), a w drugim by³a to funkcja ci¹g³a. W po³¹czeniu z wczeniej cytowanymi danymi epidemiologicznymi stanowi to silny argument na rzecz istnienia czynników genetycznych przyczyniaj¹cych siê do rozwoju nefropatii cukrzycowej. Aby odpowiednio zaprojektowaæ badania poszukuj¹ce gen lub geny przyczyniaj¹ce siê do rozwoju nefropatii cukrzycowej istotne znaczenie ma wybór odpowiedniego modelu dziedziczenia tego powik³ania. Mo¿na wyró¿niæ trzy podstawowe modele podatnoci genetycznej (tab. 1). W pierwszym, wystêpuje jeden najwa¿niejszy gen, w którym zmiana/zmiany sekwencji nukleotydowej (polimorfizm/ polimorfizmy) przyczyniaj¹ siê do rozwoju nefropatii. Drugi model zak³ada interakcjê kilku genów, które na drodze addycji warunkuj¹ predyspozycjê do uszkodzenia nerek. Wp³yw poszczególnych genów mo¿e byæ wówczas nierównomierny, od znacznego po niewielki. Wreszcie w trzecim modelu wiele genów wspó³uczestniczy w procesie chorobowym, z których ka¿dy ma jedynie niewielki wp³yw na rozwój powik³ania. Ka¿dy z tych modeli musi zak³adaæ jako Tabela 1. Prawdopodobne modele dziedziczenia nefropatii w cukrzycy typu 1. Model Model 1 Definicja Przewlek³a hiperglikemia + jeden gen Metoda poszukiwania genów w modelu Analiza sprzê¿eñ Badanie genów kandydatów (typu case-control lub TDT) Model 2 Model 3 98 Przewlek³a hiperglikemia + kilka genów o podobnym addytywnym oddzia³ywaniu lub jeden gen g³ówny i wiele genów o s³abszym wp³ywie Przewlek³a hiperglikemia + wiele genów o s³abym addytywnym oddzia³ywaniu PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 Analiza sprzê¿eñ Badanie genów kandydatów (typu case-control lub TDT) Badanie genów kandydatów (typu case-control lub TDT) M³ynarski W., Wo³kow P. P., Krolewski A. S. Rycina 1. Mo¿liwe szlaki metabloliczne zaanga¿owane w rozwój nefropatii cukrzycowej. Przewlek³a hiperglikemia Szlak poliolowy Nieenzymatyczna glikacja bia³ek Diacyloglicerol Stres oksydacyjny Odczyn zapalny Metabolizm lipidowy Aktywacja PKCβ Efekt hemodynamiczny Nefropatia cukrzycowa warunek konieczny wystêpowanie przewlek³ej hiperglikemii jako czynnika sprzyjaj¹cego nefropatii (ryc. 1). Nie wiadomo jednak czy wiêksze znaczenie ma intensywnoæ hiperglikemii czy kumulatywny czas jej trwania. Zarysowane modele mo¿na dalej rozbudowywaæ zak³adaj¹c dominuj¹cy b¹d recesywny efekt ka¿dego z implikowanych genów. Ocena, który z powy¿szych modeli jest najbli¿szy patogenezie nefropatii jest utrudniona ze wzglêdu na brak odpowiedniej liczby rodzin z mnogimi przypadkami cukrzycy typu 1 i nefropatii. W naszym orodku Rogus i wsp. przeprowadzili symulacje trzech opisanych powy¿ej modeli u¿ywaj¹c danych z publikacji Quinn i wsp. (8, 7). Rezultaty potwierdzaj¹, i¿ mo¿liwy jest pierwszy model, z obecnoci¹ genu o du¿ym efekcie, dziedziczonego w sposób autosomalnie dominuj¹cy, jak i recesywny. W tym drugim przypadku allel zwiêkszaj¹cy podatnoæ na nefropatiê musia³by byæ stwierdzany w ok. 60% populacji. Mo¿liwy jest tak¿e drugi model, zarówno w sytuacji, gdy obecne s¹ dwa geny o umiarkowanych, niezale¿nych efektach addycyjnych, jak i sytuacja, w której jeden z genów wywiera efekt znacz¹cy a drugi niewielki. Natomiast model trzeci, zak³adaj¹cy obecnoæ wielu genów o niewielkim jednostkowym wp³ywie na nefropatiê zosta³ wykluczony. Obecnie nie jest te¿ mo¿liwe sprawdzenie a priori bardziej skomplikowanych modeli, testuj¹cych czy podatnoæ genetyczna w wiêkszym stopniu wp³ywa na wyst¹pienie nefropatii czy te¿ na jej progresjê do proteinurii i niewydolnoci nerek. Aby odró¿niæ te efekty konieczne s¹ badania poszczególnych genów a nie ogólnego modelu. 4. Metody poszukiwania genetycznego uwarunkowania chorób W badaniach poszukuj¹cych nowych loci w genomie, zaanga¿owanych w predyspozycjê do rozwoju choroby, wykorzystuje siê dwie metody: przeszukiwanie ca³ego genomu z wykorzystaniem markerów mikrosatelitarnych w analizie sprzê¿eñ (ang. linkage analysis) oraz badanie genów kandydatów poprzez analizê zwi¹zku (ang. association studies). Sprzê¿enie genetyczne jest zjawiskiem, w którym allele z loci zlokalizowanych na tym samym chromosomie znajduj¹ siê wystarczaj¹co blisko, aby mog³y dziedziczyæ siê wspólnie, poniewa¿ wyst¹pienie zjawiska crossing-over, i w rezultacie rekombinacji genetycznej pomiêdzy tymi loci, jest w takim przypadku ma³o prawdopodobne. Im bli¿ej znajduj¹ siê loci, tym prawdopodobieñstwo rekombinacji jest mniejsze. Miar¹ sprzê¿enia danego locus z chorob¹ jest 100 PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 wartoæ parametru lod (ang. logarithm of odds). Jest to logarytm dziesiêtny ze stosunku prawdopodobieñstwa, ¿e wród obserwowanych genotypów frakcja rekombinacji jest mniejsza ni¿ 1/2 do prawdopodobieñstwa braku sprzê¿enia. Zjawisko sprzê¿enia wykorzystuje siê przy przeszukiwaniu ca³ego genomu cz³owieka, porównuj¹c dziedziczenie wieloallelicznych markerów mikrosatelitarnych na przyk³ad wród rodzeñstwa chorego na cukrzycê typu 1, z których oboje maj¹ nefropatiê (ang. concordant sib-pair lub affected sib-pair analysis) lub z których jedno ma objawy nefropatii a drugie nie (ang. discordant sib-pair analysis). To drugie postêpowanie, jak wykaza³ Rogus i wsp. wydaje siê bardziej pomocne w poszukiwaniu genów nefropatii (8). Wynikiem badañ opartych na analizie sprzê¿eñ jest pewien ograniczony region chromosomowy, w którym w nastêpnym etapie, poszukuje siê znanego genu i/lub nowego transkryptu potencjalnie zwi¹zanego z nefropati¹. Kolejnym etapem jest poszukiwanie ró¿nicy lub ró¿nic w sekwencji nukleotydowej, która funcjonalnie wi¹¿e sie z rozwojem nefropatii w cukrzycy. W przypadku, gdy gen zaanga¿owany w predyspozycjê do nefropatii jest silnie sprzê¿ony z markerem genomowym/ polimorfizmem mo¿na wykazaæ zwi¹zek pomiêdzy allelami danego markera a chorob¹. Zjawisko zwi¹zku genetycznego mo¿e byæ wynikiem bardzo silnego sprzê¿enia pomiêdzy locus choroby a markerem, gdy czêstoæ rekombinacji w poprzednich pokoleniach by³a niska i w rezultacie pozwoli³o to na osi¹gniêcie równowagi sprzê¿eñ. Z drugiej strony zwi¹zek mo¿e ujawniæ siê, gdy dany marker/ polimorfizm wywiera bezporedni etiologiczny wp³yw na rozwój choroby. Analiza zwi¹zku jest przydatna, gdy obszar badany ogranicza siê do regionu kilku genów kandydatów w celu wytypowania genu o charakterze etiologicznym lub gdy badamy konkretny gen, którego produkt funkcjonalnie wi¹¿e siê z patogenez¹ nefropatii. Tak¹ analizê poszukiwania mutacji etiologicznej przeprowadza siê metod¹ porównania grupy badanej z grup¹ kontroln¹ (ang. case-control study). W celu unikniêcia b³êdu wynikaj¹cego z genetycznej niejednorodnoci badanych populacji analizê zwi¹zku mo¿na równie¿ przeprowadziæ w rodzinach, np. wykorzystuj¹c jako grupê kontroln¹ czêstoæ teoretyczn¹, jak w przypadku testu TDT (ang. transmissiondisequilibrium test) (12). W tecie tym bada siê czêstoæ dziedziczenia alleli danego markera przez osoby chore od rodziców bêd¹cych heterozygotami. Ka¿da istotna ró¿nica w obserwowanej czêstoci dziedziczenia allela u chorych w porównaniu z teoretyczn¹ (50%) wiadczy o zwi¹zku danego allela z chorob¹. Poszukiwanie genów ... 5. Loci sprzê¿one z nefropati¹ w cukrzycy typu 1 6.1. Geny uk³adu renina-angiotensyna-aldosteron Przeszukiwanie ca³ego genomu w przypadku nefropatii cukrzycowej pozwala z odpowiedni¹ si³¹ statystyczn¹ znaleæ jedynie geny zwi¹zane z pierwszym lub drugim modelem dziedziczenia predyspozycji do rozwoju cukrzycowej choroby nerek (tab. 1). Pozwala jednak tak¿e na wskazanie zupe³nie nowych loci i/lub wskazanie nowych genów kandydatów, które nie by³y dotychczas badane. Przeprowadzone badania genomowe wykaza³y istnienie co najmniej kilku loci sprzê¿onych z nefropati¹ zarówno towarzysz¹c¹ cukrzycy typu 1 (T1D), jak i cukrzycy typu 2 (T2D). Ciekawy wydaje siê fakt, ¿e w obu przypadkach loci te tylko czêciowo pokrywaj¹ siê ze sob¹, co sugeruje inne pod³o¿e genetyczne nefropatii w cukrzycy typu 1 i 2. Badania rodzin Indian Pima wykaza³y obecnoæ czterech loci sprzê¿onych z nefropati¹ w cukrzycy typu 2 na chromosomie 3q, 7q, 9q i 20p (13). Badania chorych na cukrzycê typu 1 prowadzone w naszym zak³adzie przez Moczulskiego i wsp. potwierdzi³y obecnoæ istotnego zwi¹zku z regionem 3q21-q23, jednak¿e region ten jest oddalony o oko³o 20 cM od locus sugerowanego w badaniach Indian Pima (14). Interesuj¹ce wydawa³o siê, ¿e maksymaln¹ wartoæ lod otrzymano w locus obejmuj¹cym gen receptora typu 1 dla angiotensyny II (AGTR1). Jednak¿e analiza polimorfizmów jednonukleotydowych (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) nie potwierdzi³a, ¿e genem odpowiedzialnym za nefropatiê jest ATR1 (14, 15). Obecnoæ locus predyspozycji do nefropatii w T1D w regionie 3q zosta³a równie¿ potwierdzona przez badaczy skandynawskich (16). Ponadto, nasze najnowsze wyniki przeszukiwania genomu wskazuj¹ równie¿ na istnienie innych loci sprzê¿onych z nefropati¹ w cukrzycy typu 1. Sugestywne dane uzyskano dla loci na chromosomie 2p, 19q i 20p (Krolewski, dane niepublikowane). Grupa skandynawska sugeruje natomiast istnienie potencjalnych loci w regionach 4q, 16q i 22p (16). Uk³ad Renina-Angiotensyna-Aldosteron (RAA) z aktywnym bia³kiem angiotensyn¹ II odgrywa znacz¹c¹ rolê w regulacji równowagi p³ynowej organizmu przez udzia³ w fizjologicznych mechanizmach, takich jak: bezporednie dzia³anie wazopresyjne, stymulacja produkcji katecholamin i aldosteronu, regulacja wymiany sodowo-wodorowej w nerkach itd. (20, 21). Rozszczepienie dekapeptydu angiotensyny I do aktywnego oktapeptydu angiotensyny II zachodzi w p³ucach pod wp³ywem enzymu konwertuj¹cego. Ponadto, enzym konwertuj¹cy inaktywuje równie¿ bradykininê poprzez odciêcie dwóch reszt aminokwasowych z C-koñca tego peptydu. Doniesienia ostatnich lat wskazuj¹ równie¿ na wa¿n¹ rolê jak¹ uk³ad RAA odgrywa w rozwoju zmian fibrotycznych, przede wszystkim w uk³adzie sercowo-naczyniowym oraz nerkach (20-22). In vitro angiotensyna II mo¿e bezporednio zwiêkszaæ proliferacjê komórkow¹ oraz pobudzaæ czynniki wzrostu np. TGFβ (21, 23); zablokowanie nerkowych receptorów angiotensyny II os³abia proliferacjê i ró¿nicowanie fibroblastów w miofibroblasty (17, 18). In vivo wzrost aktywnoci angiotensyny II stymuluje w nerkach syntezê prawid³owej macierzy zewn¹trzkomórkowej oraz kolagenu typu I i III (18, 20, 23). Dane te wskazuj¹ na udzia³ elementów uk³adu RAA w procesach rozwoju tkanki ³¹cznej. Zmiennoæ genów koduj¹cych sk³adowe uk³adu RAA wydaje siê wiêc potencjalnym elementem predyspozycji do nefropatii cukrzycowej. W zwi¹zku z tym przeprowadzono wiele badañ genów kandydatów uk³adów RAA, w tym genu konwertazy angiotensyny II (ang. angiotensin-coverting enzyme; ACE), reniny (REN), angiotensynogenu (AGT), receptora typu 1 dla angiotensyny II (ang. angiotensin II type 1 receptor; AGTR1), syntazy aldosteronu (CYP11B2) czy receptorów dla bradykininy (ang. bradykinin B1 and B2 receptor; B1R i B2R) (24-29). Najbardziej intensywnie badany jest obecnie polimorfizm delecja/insercja (D/I) 287 par zasad w intronie 16 genu ACE, który mo¿e modulowaæ aktywnoæ kr¹¿¹cej i tkankowej konwertazy angiotensyny - u osób z genotypem DD obserwuje siê wy¿sz¹ aktywnoæ enzymatyczn¹ ACE ni¿ u osób z genotypem II (24). Jednak¿e, wyniki badañ zwi¹zku tego polimorfizmu z rozwojem nefropatii cukrzycowej nie s¹ wci¹¿ jednoznaczne. W niektórych populacjach obserwuje siê zwi¹zek innego polimorfizmu genu ACE (A/G w intronie 7) z nefropati¹ w cukrzycy typu 1 (np. w populacji ¯ydów Ashkenazi) (25). Na d³ugim ramieniu chromosomu 3 znajduje siê locus genu AGTR1. Kilka zespo³ów potwierdzi³o obecnoæ na chromosomie 3q locus dla nefropatii cukrzycowej w badaniach opartych na analizie sprzê¿eñ (14, 16). Dane te sugerowa³y, ¿e AGTR1 jest wymienitym genem kandydatem. Przeprowadzona wnikliwa analiza dystrybucji alleli polimorfizmów znalezionych w regionie obejmuj¹cych gen AGTR1 (oko³o 60,5 kpz) nie wykaza³a istotnych ró¿nic zarówno w badaniach typu case-control, jak i w TDT, co praktycznie wyklucza zwi¹zek tego genu z nefropati¹ cukrzycow¹ (14, 15). Obecnie kontynuowane s¹ badania regionu maj¹ce na celu poszukiwanie nowych polimorfizmów oraz badanie innych genów kandydatów w tym locus. Kolejnym rozpatrywanym genem kandydatem predyspozycji do rozwoju nefropatii w uk³adzie RAA by³ AGT, zlokalizowany na ramieniu d³ugim chromosomu 1. W genie tym najczêciej badanym polimorfizmem, o udowodnionych implikacjach funkcjonalnych, jest tranzycja T/C, która powoduje zmianê 235 aminokwasu w ³añcuchu peptydowym z reszty metioninowej na treoninow¹ (M235T). Badania dotycz¹ce zwi¹zku tego polimorfizmu, jak i polimorfizmów mikrosatelitarnych w regionie genu AGT nie w pe³ni dokumentuj¹ udzia³ zmiennoci genetycznej angiotensyny w patoge- 6. Badanie genów kandydatów W badaniach zmiennoci sekwencji DNA genów kandydatów wykorzystuje siê analizê zwi¹zku. Wyboru genu kandydata dokonuje siê, gdy istniej¹ dowody, ¿e produkt ekspresji takiego genu jest bezporednio zaanga¿owany w patogenezê nefropatii lub/i istniej¹ sugestywne dane z badañ opartych na analizie sprzê¿eñ. Intensywne badania nad patogenez¹ nefropatii cukrzycowej sugeruj¹, ¿e w proces destrukcyjny zaanga¿owanych jest wiele szlaków metabolicznych indukowanych przewlek³¹ hiperglikemi¹, takich jak: aktywacja reduktazy aldozowej na szlaku poliolowym, aktywacja kinazy bia³kowej Cβ poprzez syntezê de novo diacyloglicerolu, indukcja i uwalnianie mediatorów odczynu zapalnego przez produkty nieenzymatycznej glikacji oraz stres oksydacyjny i nadekspresja transformuj¹cego czynnika wzrostu β (TGFβ). Ponadto, wiele innych czynników mo¿e równie¿ sprzyjaæ rozwojowi nefropatii, na przyk³ad takie jak zaburzenie regulacji cinienia têtniczego czy zaburzenie metabolizmu lipidowego (ryc. 1) (17, 18). W badaniach epidemiologicznych wykazano, ¿e nadcinienie têtnicze mo¿e dziedziczyæ siê w tych samych rodzinach i w podobny sposób jak nefropatia (19). Zaburzenie ka¿dego ze szlaków mo¿e byæ uwarunkowane genetycznie, tak wiêc istnieje wiele potencjalnych genów kandydatów. Wprowadzaj¹c has³o nephropathy diabetes gene do literaturowej bazy danych Medline (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) mo¿na znaleæ blisko 800 doniesieñ na temat wiêcej ni¿ 30 genów sugerowanych jako zwi¹zane z rozwojem nefropatii cukrzycowej. Poni¿ej opisano dwa szlaki, w których udzia³ genów kandydatów jest stosunkowo dobrze udokumentowany. PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 101 M³ynarski W., Wo³kow P. P., Krolewski A. S. nezie nefropatii cukrzycowej (14, 26, 27). Dane te wymagaj¹ wci¹¿ dalszych badañ. 7.1. Ucilenie fenotypu choroby i odpowiednie populacje badane 6.2. Geny cytokin, chemokin i czynników wzrostu Wa¿nym zagadnieniem wydaje siê dobór odpowiednich rodzin/pacjentów do badañ w oparciu o dane kliniczne. Liczne dane funkcjonalne sugeruj¹, ¿e w patogenezie nefropatii cukrzycowej zaanga¿owane s¹ co najmniej dwa procesy, z jednej strony uszkodzenie k³êbuszka nerkowego, z drugiej uszkodzenie nab³onka cewek bli¿szych oraz w³óknienie podcieliska (17, 18, 23). Byæ mo¿e w obu procesach zaanga¿owane s¹ ró¿ne geny. Wiêkszoæ danych literaturowych dokumentuj¹ca zwi¹zek genetyczny traktuje jako grupê badan¹ pacjentów ze schy³kow¹ niewydolnoci¹ nerek. W tej grupie istotny wydaje siê fakt wysokiego wskanika miertelnoci z powodu niewydolnoci nerek lub powik³añ sercowo-naczyniowych, co mo¿e wp³yn¹æ na dystrybucjê alleli i generowaæ zarówno fa³szywie dodatnie, jak i fa³szywie ujemne wyniki badañ genetycznych. W innych pracach podkrela siê, ¿e miar¹ cukrzycowej choroby nerek jest proteinuria lub mikroalbuminuri¹. Ponadto, miar¹ zakwalifikowania pacjenta do grupy badanej mo¿e byæ obni¿enie wskanika filtracji k³êbuszkowej (ang. glomerular filtration rate, GFR). Analizy matematyczne wykazuj¹, ¿e wiêkszoæ dotychczas prowadzonych badañ mia³a stosunkowo ma³¹ si³ê statystyczn¹ ze wzglêdu na niewystarczaj¹c¹ liczebnoæ badanych populacji. Zwiêkszenie grup badanych z pewnoci¹ pozwoli na potwierdzenie potencjalnych loci w badaniach sprzê¿enia genetycznego oraz wykazanie zwi¹zku polimorfizmów genów kandydatów z rozwojem nefropatii. Poza tym, istotnym problemem przy projektowaniu badañ genetycznych w nefropatii jest czas trwania cukrzycy. Badania symulacyjne w naszym zak³adzie wykaza³y, ¿e czas trwania cukrzycy ma istotne znaczenie w doborze grupy kontrolnej (pacjentów z cukrzyc¹ typu 1 bez cech nefropatii) zarówno w badaniach typu case-control, jak i w TDT (36). Optymalnie zaprojektowane grupy badane pozwol¹ w przysz³oci z wystarczaj¹c¹ si³¹ statystyczn¹ potwierdziæ zwi¹zek potencjalnego genu kandydata z predyspozycj¹ do rozwoju nefropatii cukrzycowej. Istnieje coraz wiêcej dowodów na zaanga¿owanie procesów zapalnych w stopniowe upoledzenie funkcji nerek. Sugeruje siê równie¿, ¿e chemokiny i inne mediatory zapalenia mog¹ byæ zwi¹zane z rozwojem i progresj¹ nefropatii cukrzycowej. Uwa¿a siê, ¿e przewlek³a hiperglikemia, produkty nieenzymatycznej glikacji oraz stres oksydacyjny (ryc. 1) mog¹ indukowaæ ekspresjê chemokin (np. MCP-1, RANTES) przez komórki nab³onka cewek bli¿szych oraz podcieliska, które w rezultacie doprowadzaj¹ do przybycia do potencjalnego ogniska zapalnego komórek immunokompetentnych, przede wszystkim makrofagów i limfocytów (30, 31). Trwaj¹cy latami przewlek³y odczyn zapalny doprowadza do transformacji komórek cewkowych w miofibroblasty lub/i ich apoptozy, stymulowania fibroblastów do produkcji macierzy zewn¹trzkomórkowej (np. fibronektyny, kolagenu typu I i III itp.), co w konsekwencji wiedzie do klinicznych objawów postêpuj¹cej niewydolnoci nerek (17, 20, 22). Zmiennoæ genów koduj¹cych liczne bia³ka potencjalnie wspó³uczestnicz¹ce w ka¿dym z wymienionych procesów równie¿ mo¿e modulowaæ indukowanie i przebieg kliniczny nefropatii w cukrzycy typu 1. Wiele danych literaturowych sugeruje, ¿e odpowied komórek immunokompetentnych na chemokiny oraz cytokiny mo¿e byæ uwarunkowana genetycznie. Ostatnio prowadzone przez nas badania zwi¹zku zmiennoci genów chemokin (MCP-1 i RANTES) oraz ich receptorów (CCR2 i CCR5) z progresj¹ nefropatii w cukrzycy typu 1 sugeruj¹, ¿e delecja 32 par zasad w genie CCR5 jest zwi¹zana z rozwojem schy³kowej niewydolnoci nerek. Delecja ta powoduje brak funkcjonalnego receptora dla RANTES, a nosiciele tej delecji maj¹ podwy¿szone ryzyko wyst¹pienia zaawansowanej nefropatii, OR=1,9. Równie¿ nosiciele allela G w proksymalnym elemencie regulatorowym genu MCP-1 (pozycja -2518 A/G) maj¹ nieznacznie wy¿sze ryzyko rozwoju niewydolnoci nerek, OR=1,4 (M³ynarski, dane niepublikowane). Zwi¹zek polimorfizmu w regionie promotorowym genu CCR5 (G59029A) z postêpem choroby nerek w cukrzycy typu 2 zaobserwowano w populacji japoñskiej (32). Wród potencjalnych genów kandydatów nale¿y wymieniæ geny koduj¹ce interleukinê-1b (IL-1B) oraz antagonistê interleukiny-1 (IL-1RN). Oba geny zlokalizowane s¹ na d³ugim ramieniu chromosomu 2, w tak zwanym klasterze genów interleukiny-1. Wykazano, ¿e tranzycja T/C w eksonie 1 genu IL-1B, jak i polimorfizm powtórzeniowy 86 par zasad (ang. variable number of tandem repeats, VNTR) w intronie 2 genu IL-1RN s¹ zwi¹zane z predyspozycj¹ do rozwoju nefropatii cukrzycowej, zarówno w cukrzycy typu 1 i 2 (33, 34). Dane te jednak wymagaj¹ potwierdzenia w badaniach o wiêkszej sile statystycznej. Kolejnym istotnym elementem przewlek³ego odczynu zapalnego jest ekspresja czynników wzrostu np. TGFβ, jednak¿e intensywne badania genu koduj¹cego ten czynnik nie wykaza³y zwi¹zku znanych polimorfizmów z rozwojem i progresj¹ nefropatii cukrzycowej (35). 7. Nowe kierunki poszukiwania genów odpowiedzialnych za nefropatiê cukrzycow¹ Prowadzone badania nie wskazuj¹ jednoznacznie, ¿e pewne konkretne geny s¹ zwi¹zane z rozwojem nefropatii mimo epidemiologicznych dowodów na istnienie genetycznej predyspozycji. Byæ mo¿e nale¿y skupiæ siê w przysz³oci na s³abych punktach dotychczasowo projektowanych badañ. 102 PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 7.2. Interakcje miêdzy genami i przynale¿noæ do szlaków sygnalizacyjnych Poprzednie przyk³ady pokazuj¹, ¿e zmiennoæ w genach takich, jak receptor dla angiotensyny II czy transformuj¹cy czynnik wzrostu typu β nie zwiêksza ryzyka rozwoju nefropatii cukrzycowej mimo, i¿ patofizjologiczne znaczenie produktów oraz lokalizacja genomowa stawia³o je w rzêdzie pierwszoplanowych genów kandydatów. Dotychczas w badaniach opartych na analizie sprzê¿eñ, jak i badaniach typu case-control oraz TDT w modelu uwzglêdnia³o siê istnienie jednego niezale¿nego locus. W ostatnich latach rozwinê³y siê metody matematycznej analizy kilku loci oceniaj¹ce interakcje pomiêdzy genami (ang. conditional linkage and association analysis) (37-39). Metody analizy warunkowej pozwalaj¹ na poszukiwanie zale¿noci pomiêdzy loci. Przyk³adowo, mo¿na wykazaæ w ten sposób efekt addytywny kilku niezale¿nych genów, jak i efekt epistatyczny, gdy dwa lub wiêcej loci wspó³dzia³aj¹ w rozwoju nefropatii (40, 41). Drugim podejciem badawczym jest badanie genów nale¿¹cych do tego samego szlaku metabolicznego. W tym przypadku kilka nieznacznych zmian w sekwencji genów tego samego szlaku mo¿e w sposób synergistyczny warunkowaæ predyspozycjê genetyczn¹ do nefropatii. 7.3. Profilowanie ekspresji genów celem wykrycia nowych kandydatów do badañ genetycznych W badaniach genetycznych coraz czêciej zaczyna siê korzystaæ z danych generowanych przez równoczesne ozna- Poszukiwanie genów ... czanie profilu ekspresji tysiêcy genów obecnych w ludzkim genomie (42). Technika hybrydyzacji zmodyfikowanego transkryptu do ciasno upakowanych sond na p³ytce szklanej, plastikowej lub nylonowej (ang. microarray) pozwala na ca³ociowe spojrzenie na poziom ekspresji genów nale¿¹cych do jakiego interesuj¹cego ze wzglêdu na swoj¹ funkcjê biologiczn¹ szlaku metabolicznego lub sygnalizacyjnego. Przyk³adowo, zmiennoæ we wspomnianym ju¿ genie kandydacie TGF-β nie wp³ywa na rozwój nefropatii cukrzycowej. Uszkodzenie nerek mo¿e jednak zale¿eæ od wielu bia³ek uczestnicz¹cych w procesach indukowanych przez TGF-β, na przyk³ad we w³óknieniu oraz w apoptozie. Dostêpne narzêdzia analizy komputerowej pozwalaj¹ skorelowaæ ze sob¹ dane dotycz¹ce ekspresji genów, bêd¹ce wynikiem eksperymentu z u¿yciem microarray, z dostêpnymi w literaturze danymi o szlakach metabolicznych i sygnalizacyjnych. Przyk³adowym oprogramowaniem jest GenMAPP (ang. gene microarray pathway profiler) (http:// www.genmapp.org). Si³a takiej analizy polega na fakcie, ¿e chocia¿ zmiany w poziomie ekspresji jednego wybranego genu mog¹ byæ niewielkie to suma zmian ekspresji wielu genów nale¿¹cych do wspólnego szlaku mo¿e dawaæ znacz¹cy efekt. Powy¿sze podejcie badawcze mo¿na wykorzystaæ w poszukiwaniu genów dla cukrzycowej choroby nerek. W tym przypadku nale¿y porównaæ profil ekspresji genów w tkankach pochodz¹cych od osób podatnych oraz opornych na rozwój nefropatii w cukrzycy. Obiecuj¹cym materia³em do badañ wydaj¹ siê byæ zarówno podocyty, jak i komórki nab³onka cewek uzyskane z bioptatów lub wyda- lone z moczem. Wielokrotne pasa¿owanie w hodowli pozwoli zminimalizowaæ efekt d³ugotrwa³ego przebywania tych komórek w chorobowo zmienionej nerce. Umo¿liwi to przeledzenie czy i jak ró¿ni siê podstawowa ekspresja genów w dwóch badanych grupach. Ponadto, mo¿liwe bêdzie porównanie zmian profilu ekspresji genów po zadzia³aniu np. hiperglikemii lub produktów zaawansowanej glikacji bia³ek. Mo¿e to wskazaæ nowe szlaki przekazywania sygna³u, których do tej pory nie podejrzewano o udzia³ w patomechanizmie nefropatii cukrzycowej. W konsekwencji polimorfizmy w genach maj¹cych bezporednie lub porednie, np. regulatorowe, znaczenie dla nowo poznanych szlaków mog¹ staæ sie kolejnym celem badañ predyspozycji do rozwoju nefropatii cukrzycowej. Podsumowanie Poszukiwanie genów dla nefropatii cukrzycowej ma olbrzymie znaczenie, gdy¿ mo¿e doprowadziæ do prze³omu w dwóch dziedzinach: diagnostyce oraz terapii tego powik³ania. Jeli w chwili rozpoznania cukrzycy typu 1 mo¿liwe bêdzie przeprowadzenie testu genetycznego oceniaj¹cego stopieñ ryzyka rozwoju nefropatii, to bêdziemy mogli bardzo wczenie wyodrêbniæ grupê osób, które wymagaæ bêd¹ szczególnie wnikliwej kontroli glikemii oraz odpowiednio intensywnej terapii. Ponadto, jeli oka¿e siê, i¿ podatnoæ genetyczna do rozwoju nefropatii zwi¹zana jest z polimorfizmem w genie, którego nie podejrzewano do tej pory o zwi¹zek z tym powik³aniem, to bêdziemy, byæ mo¿e, wiadkami narodzin nowej grupy leków pozwalaj¹cych odpowiednio zmodyfikowaæ dzia³anie tego genu lub jego produktu tak, aby zmniejszyæ ryzyko wyst¹pienia niewydolnoci nerek. PIMIENNICTWO: 1. Effect of intensive therapy on the microvascular complications of type 1 diabetes mellitus. JAMA 2002, 287, 2563-2569. 2. Dahlquist G., Rudberg S. The prevalence of microalbuminuria in diabetic children and adolescents and its relation to puberty. Acta Paediatr. Scand. 1987, 76, 795-800. 3. Andersen A. R., Christiansen J .S., Andersen J. K., Kreiner S., Deckert T. Diabetic nephropathy in Type 1 (insulin-dependent) diabetes: an epidemiological study. Diabetologia 1983, 25, 496-501. 4. Krolewski A. S., Warram J. H., Christlieb A. R., Busick E. J., Kahn C. R. The changing natural history of nephropathy in type I diabetes. Am. J. Med. 1985, 78, 785-794. 5. Seaquist E. R., Goetz F. C., Rich S., Barbosa J. Familial clustering of diabetic kidney disease. Evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy. N. Engl. J. Med. 1989, 320, 1161-1165. 6. Borch-Johnsen K., Norgaard K., Hommel E., Mathiesen E. R., Jensen J. S., Deckert T., Parving H. H. Is diabetic nephropathy an inherited complication? Kidney Int. 1992, 41, 719-722. 7. Quinn M., Angelico M. C., Warram J. H., Krolewski A. S. Familial factors determine the development of diabetic nephropathy in patients with IDDM. Diabetologia 1996, 39, 940-945. 8. Rogus J. J., Krolewski A. S. Using discordant sib pairs to map loci for qualitative traits with high sibling recurrence risk. Am. J. Hum.Genet. 1996, 59, 1376-1381. 9. Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. Diabetes 1997, 46, 1829-1839. 10. Khoury M. J., Flanders W. D., Greenland S., Adams M. J. On the measurement of susceptibility in epidemiologic studies. Am. J. Epidemiol. 1989, 129, 183-190. 11. Hopper J. L., Carlin J. B. Familial aggregation of a disease consequent upon correlation between relatives in a risk factor measured on a continuous scale. Am. J. Epidemiol. 1992, 136, 1138-1147. 12. Spielman R. S., McGinnis R. E., Ewens W. J. Transmission test for linkage disequilibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am. J. Hum.Genet. 1993, 52, 506-516. 13. Imperatore G., Hanson R. L., Pettitt D. J., Kobes S., Bennett P. H., Knowler W. C. Sib-pair linkage analysis for susceptibility genes for microvascular complications among Pima Indians with type 2 diabetes. Pima Diabetes Genes Group. Diabetes 1998, 47, 821-830. 14. Moczulski D. K., Rogus J. J., Antonellis A., Warram J. H., Krolewski A. S. Major susceptibility locus for nephropathy in type 1 diabetes on chromosome 3q: results of novel discordant sib-pair analysis. Diabetes 1998, 47, 1164-1169. 15. Antonellis A., Rogus J. J., Canani L. H., Makita Y., Pezzolesi M.G., Nam M., Ng D., Moczulski D., WarramJ. H., Krolewski A. S. A method for developing high-density SNP maps and its application at the type 1 angiotensin II receptor (AGTR1) locus. Genomics 2002, 79, 326-332. 16. Osterholm A. M., He B., Pitkaniemi J., Reynisdottir I., Berg T., Tuomilehto J., Tryggvason K. An initial genome scan for type 1 diabetec nephropathy susceptibility loci in the Finnish population. Am. J. Hum. Genet. 2002, 71, 453. 17. Cheng J., Grande J. P. Transforming growth factor-beta signal transduction and progressive renal disease. Exp. Biol. Med. (Maywood.)2002, 227, 943-956. 18. Ina K., Kitamura H., Tatsukawa S., Takayama T., Fujikura Y., Shimada T. Transformation of interstitial fibroblasts and tubulointerstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Med. Electron. Microsc. 2002, 35, 87-95. 19. Fogarty D. G., Krolewski A. S. Genetic susceptibility and the role of hypertension in diabetic nephropathy. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1997, 6, 184-191. PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2 103 M³ynarski W., Wo³kow P. P., Krolewski A. S. 20. Mezzano S. A., Ruiz-Ortega M., Egido J. Angiotensin II and renal fibrosis. Hypertension 2001, 38, 635-638. 21. Weigert C., Brodbeck K., Klopfer K., Haring H. U., Schleicher E. D. Angiotensin II induces human TGF-beta 1 promoter activation: similarity to hyperglycaemia. Diabetologia 2002, 45, 890-898. 22. Lane A., Johnson D. W., Pat B., Winterford C., Endre Z., Wei M., Gobe G. C. Interacting roles of myofibroblasts, apoptosis and fibrogenic growth factors in the pathogenesis of renal tubulo-interstitial fibrosis. Growth Factors 2002, 20, 109-119. 23. Huang C., Kim Y., Caramori M. L., Fish A. J., Rich S. S., Miller M. E., Russell G. B., Mauer M. Cellular basis of diabetic nephropathy: II. The transforming growth factor-beta system and diabetic nephropathy lesions in type 1 diabetes. Diabetes 2002, 51, 3577-3581. 24. Doria A., Onuma T., Warram J. H., Krolewski A. S. Synergistic effect of angiotensin II type 1 receptor genotype and poor glycaemic control on risk of nephropathy in IDDM. Diabetologia 1997, 40, 1293-1299. 25. Freire M. B., van Dijk D. J., Erman A., Boner G., Warram J. H., Krolewski A. S. DNA polymorphisms in the ACE gene, serum ACE activity and the risk of nephropathy in insulin-dependent diabetes mellitus. Nephrol. Dial.Transplant. 1998, 13, 2553-2558. 26. Rogus J. J., Moczulski D., Freire M. B., Yang Y., Warram J. H., Krolewski A. S. Diabetic nephropathy is associated with AGT polymorphism T235: results of a family-based study. Hypertension 1998, 31, 627-631. 27. Lovati E., Richard A., Frey B. M., Frey F. J., Ferrari P. Genetic polymorphisms of the renin-angiotensin-aldosterone system in end-stage renal disease. Kidney Int. 2001, 60, 46-54. 28. Bachvarov D. R., Landry M., Pelletier I., Chevrette M., Betard C., Houde I., Bergeron J., Lebel M., Marceau F. Characterization of two polymorphic sites in the human kinin B1 receptor gene: altered frequency of an allele in patients with a history of end-stage renal failure. J. Am. Soc. Nephrol. 1998, 9, 598-604. 29. Zychma M. J., Gumprecht J., Zukowska-Szczechowska E., Grzeszczak W. Polymorphisms in the genes encoding for human kinin receptors and the risk of end-stage renal failure: results of transmission/disequilibrium test. The End-Stage Renal Disease Study Group. J. Am. Soc. Nephrol. 1999, 10, 2120-2124. 30. Kato S., Luyckx V. A., Ots M., Lee K.W., Ziai F., Troy J. L., Brenner B. M., MacKenzie H. S. Renin-angiotensin blockade lowers MCP-1 expression in diabetic rats. Kidney Int. 1999, 56, 1037-1048. 31. Morii T., Fujita H., Narita T., Shimotomai T., Fujishima H., Yoshioka N., Imai H., Kakei M., Ito S. Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy. J. Diabetes Complications 2003, 17, 11-15. 32. Nakajima K., Tanaka Y., Nomiyama T., Ogihara T., Piao L., Sakai K., Onuma T., Kawamori R. Chemokine receptor genotype is associated with diabetic nephropathy in Japanese with type 2 diabetes. Diabetes 2002, 51, 238-242. 33. Blakemore A. I., Cox A., Gonzalez A. M., Maskil J. K., Hughes M. E., Wilson R. M., Ward J. D., Duff G. W. Interleukin-1 receptor antagonist allele (IL1RN*2) associated with nephropathy in diabetes mellitus. Hum.Genet. 1996, 97, 369-374. 34. Loughrey B. V., Maxwell A. P., Fogarty D. G., Middleton D., Harron J. C., Patterson C. C., Darke C., Savage D. A. An interluekin 1B allele, which correlates with a high secretor phenotype, is associated with diabetic nephropathy. Cytokine 1998, 10, 984-988. 35. Ng D. P., Warram J. H., Krolewski A. S. TGF-beta 1 as a genetic susceptibility locus for advanced diabetic nephropathy in type 1 diabetes mellitus: an investigation of multiple known DNA sequence variants. Am. J. Kidney Dis. 2003, 41, 22-28. 36. Rogus J. J., Warram J. H., Krolewski A. S. Genetic studies of late diabetic complications: the overlooked importance of diabetes duration before complication onset. Diabetes 2002, 51, 1655-1662. 37. Culverhouse R., Suarez B. K., Lin J., Reich T. A perspective on epistasis: limits of models displaying no main effect. Am. J. Hum.Genet. 2002, 70, 461-471. 38. Curtis D., North B. V., Sham P. C. A novel method of two-locus linkage analysis applied to a genome scan for late onset Alzheimers disease. Ann. Hum.Genet. 2001, 65, 473-481. 39. Wilson S. R. Epistasis and its possible effects on transmission disequilibrium tests. Ann. Hum.Genet. 2001, 65, 565-575. 40. Krolewski A. S. Genetics of diabetic nephropathy: evidence for major and minor gene effects. Kidney Int. 1999, 55, 1582-1596. 41. Krolewski A. S., Ng D. P., Canani L. H., Warram J. H. Genetics of diabetic nephropathy: how far are we from finding susceptibility genes? Adv. Nephrol. Necker. Hosp. 2001, 31, 295-315. 42. Eikmans M., Baelde H. J., de Heer E., Bruijn J. A. RNA expression profiling as prognostic tool in renal patients: toward nephrogenomics. Kidney Int. 2002, 62,1125-1135. Adres do korespondencji: Andrzej S. Krolewski, MD, PhD, Section on Genetics and Epidemiology Joslin Diabetes Center Harvard Medical School One Joslin Place 02-215 Boston, MA, USA 104 PRZEGL¥D PEDIATRYCZNY 2003, VOL 33, NO 2