SEMINARIUM 1 Sylabus Budowa i właściwości makrocząsteczek

advertisement
SEMINARIUM 1
SYLABUS
Budowa i właściwości makrocząsteczek życia
Skład chemiczny oraz budowa kwasów nukleinowych:
definicje pojęć: kwas deoksyrybonukleinowy, kwas rybonukleinowy, ryboza, deoksyryboza, zasady azotowe;
właściwości zasad azotowych:- pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina; - purynowe: adenina i guanina;
wiązanie fosfodiestrowe, wiązanie β-N-glikozydowe, wiązania wodorowe, koniec 3’, koniec 5’ nici kwasu
nukleinowego, nukleozyd, nukleotyd, budowa helisy DNA, komplementarność zasad; rodzaje struktur DNA: BDNA, A-DNA, Z-DNA, struktura RNA, struktura szpilki do włosów.
Skład chemiczny oraz budowa białek:
wzór ogólny aminokwasu, wiązanie peptydowe, aminokwasy egzogenne, aminokwasy endogenne, hydrofobowe
aminokwasy alifatyczne, hydrofobowe aminokwasy aromatyczne, polarne aminokwasy obdarzone ładunkiem,
polarne aminokwasy pozbawione ładunku, struktura białka: I-rzędowa, II-rzędowa, III-rzędowa, IV-rzędowa,
funkcje białek.
Skład chemiczny oraz budowa cukrów:
Cukry: cukry proste - aldozy, ketozy, cukry złożone - dwucukry, oligosacharydy, polisacharydy,
izomery, aldehyd-3-glicerynowy, ryboza, glukoza, galaktoza, piranozowe formy pierścieniowe, furanozowe
formy pierścieniowe, disacharydy, laktoza, maltoza, sacharoza, celobioza, polisacharydy glikogen, celuloza,
funkcje cukrów.
Skład chemiczny oraz budowa kwasów tłuszczowych i tłuszczy: nasycone kwasy tłuszczowe, nienasycone
kwasy tłuszczowe, niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe, kwasy -3, kwasy -6, tłuszcze właściwe
(triacyloglicerole, triglicerydy) funkcje lipidów, podział lipidów, tłuszcze właściwe, woski, fosfolipidy,
glikolipidy.
Spektrofotometryczne metody oznaczania kwasów nukleinowych i białek: spektrofotometria absorpcyjna,
spektrofotometria w świetle widzialnym (VIS), kolorymetria, spektrofotometria w świetle nadfioletowym (UV),
absorbancja, prawo Lamberta-Beera, spektrofotometryczne oznaczanie kwasów nukleinowych i białek, widmo
absorpcyjne, długość fali, oznaczanie czystości próbek kwasów nukleinowych, krzywa wzorcowa.
ĆWICZENIE 1
KARTA PRACY
1. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek.
2. Jakościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek.
SEMINARIUM 2
SYLABUS
Oczyszczanie i metody badań makrocząsteczek życia
Homogenizacja materiału biologicznego (homogenat, lizat, ekstrakt, sonikacja, permeabilizacja).
Metody oczyszczania białek (chromatografia powinowactwa, żelowa, kolumnowa, jonowymienna,
hydrofobowa; wirowanie różnicowe, wirowanie w gradiencie gęstości; sedymentacja szybkościowa,
równowagowa; frakcjonowanie; dializa; supernatant).
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych (ekstrakcja fenol/chloroform; odsalanie białek, metody
kolumienkowe; elektroforeza w żelu agarozowym).
Metody analizy jakościowej i ilościowej białek (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, Western blotting;
elektroforeza dwukierunkowa; ogniskowanie izoelektryczne; sekwencjonowanie białek, spektroskopia mas,
krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR, spektroskopia dichroizmu kołowego, termostabilność białek).
Metody analizy jakościowej i ilościowej RNA (Technika northern-blot; RT-PCR; RT-qPCR; SAGE (serial
analysis of gene expression); Mikromacierze; Hybrydyzacja in situ (tech. mikroskopowa); RNAseq:
Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie transkryptomów).
Metody analizy jakościowej i ilościowej DNA (Enzymy restrykcyjne; Hybrydyzacja (renaturacja): Southern
Blotting, DNA fingerprinting, Northern blotting, In situ hybridization (FISH); Amplifikacja DNA metodą PCR
(łańcuchowej reakcji polimerazy); Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny:
PCR-Multiplex; PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych); Sekwencjonowanie
enzymatyczne metodą Sangera; Sekwencjonowanie równoległe, Next Generation Sequencing).
ĆWICZENIE 2
KARTA PRACY
1. Oznaczanie stabilności kwasów nukleinowych i białek.
SEMINARIUM 3
SYLABUS
Struktura molekularna organelli komórkowych
cytoszkielet, mikrotubule, mikrofilamenty, aktyna, białka wiążące aktynę (ABPs = actin-binding proteins),
tubulina, białka towarzyszące mikrotubulom (nietubularne – tektyny i MAPs = microtubule-binding proteins),
białka motoryczne mikrotubul (dyneiny, kinezyny), centrosom, centriole, mitochondrium, siateczka
śródplazmatyczna, rybosomy, peroksysom, lizosom pierwotny, lizosom wtórny, błona komórkowa, budowa,
aparat Golgiego, jądro komórkowe, macierz jądrowa, otoczka jądrowa, wymiana jądrowo-plazmatyczna,
jąderko, budowa i zasada działania mikroskopu świetlnego,
ĆWICZENIE 3
KARTA PRACY
Zdjęcia do wydrukowania przez KAŻDEGO studenta danej grupy seminaryjnej: gr.1; gr.2; gr.3; gr.4; gr.5;
gr.6; gr.7; gr.8; gr.9; gr.10; gr.11; gr.12; gr.13; gr.14; gr.15; gr.16; gr.17; gr.18; gr.19; gr.20
1.
Obrazy komórki w mikroskopie świetlnym.
2.
Obrazy struktur komórkowych w mikroskopie fluorescencyjnym.
3.
Obrazy struktur komórkowych otrzymanych metodą mikroskopii elektronowej.
SEMINARIUM 4
SYLABUS
Molekularne mechanizmy replikacji, transkrypcji i translacji
Genom, genotyp, fenotyp, gen, allel
Replikacja DNA: Helisa DNA, model semikonserwatywny replikacji, zasada komplementacji zasad, widełki
replikacyjne, bąbel replikacyjny, fragmenty Okazaki, nić wiodąca, nić opóźniona, kierunek replikacji, enzymy
biorące udział w replikacji DNA; ori; telomery, naprawa błędów replikacyjnych
Transkrypcja: kod genetyczny, rodzaje RNA, etapy transkrypcji, kierunek transkrypcji, enzymy biorące udział
w transkrypcji, czynniki transkrypcyjne, aktywator, represor, elementy cis- i trans-; obróbka posttranskrypcyjna
Translacja: etapy translacji, enzymy biorące udział w translacji, obróbka posttranslacyjna
Reakcja PCR: etapy reakcji PCR, warunki reakcji, modyfikacje reakcji PCR, zasady projektowania starterów
reakcji PCR,
ĆWICZENIE 4
KARTA PRACY
1. Bazy danych internetowe.
2. Projektowanie starterów reakcji PCR.
3. Projektowanie warunków reakcji PCR ilościowego.
SEMINARIUM 5
SYLABUS
Struktura czynnościowa komórki eukariotycznej
czynność błony komórkowej, transport przez błonę komórkową, dyfuzja prosta, dyfuzja ułatwiona, transport
aktywny, symporter sodowo glukozowy, adenozynotrójfosfataza sodowo potasowa, transportery ABC,
przedziały komórkowe, transport białek w komórce, transport do jądra komórkowego, bałka Ran, receptory
transportu jądrowego, transport do mitochondrium, kompleks TOM, transport do peroksysomów, białka PEX,
transport do siateczki wewnątrzplazmatycznej, białko translokacyjne, transport pęcherzykowy, kompleks COPI,
kompleks COPII, klatryna, białka SNARE, czynność aparatu Golgiego, receptor M6P, wymiana białek przez
aparat Golgiego, peptyd sygnałowy, peptydaza sygnałowa, sortowanie białek, endocytoza, egzocytoza, czynność
lizosomów, czynność mitochondrium, łańcuch oddechowy, synteza adenozynotrójfosforanu, fosforylacja
oksydacyjna, łańcuch transportu elektronów w trakcie łańcucha oddechowego, gradient protonowy błony
wewnętrznej mitochondrium i jego źródło.
ĆWICZENIE 5
1.
2.
3.
4.
Analiza struktur przestrzennych kwasów nukleinowych jednoniciowych.
Analiza struktur przestrzennych kwasów nukleinowych dwuniciowych.
Analiza wyników wykrywania kwasów rybonukleinowych.
Analiza wyników wykrywania kwasów deoksyrybonukleinowych.
SEMINARIUM 6
SYLABUS
Molekularna regulacja cyklu komórkowego
kolchicyna, mitoza – profaza, prometafaza, metafaza, anafaza, telofaza, cytokineza, wrzeciono podziałowe,
mikrotubule aparatu mitotycznego, włókna mikrotubularne – ciągłe, kinetochorowe, międzychromosomowe,
astralne, centrosfera (astrosfera), pierścień komórkowy (dot. cytokinezy), polimeryzacja/depolimeryzacja
mikrotubul kinetochorowych, dynamiczna niestabilność mikrotubul,
cykliny (cykliny mitotyczne = A, B, cykliny G1 = C, D, E), cyklinozależne kinazy (Cdks 2-9), fosforylacja,
defosforylacja, punkty kontrolne cyklu komórkowego, inhibitory Cdks, rodzina białek p16 i p21, p27, pRb, p53,
APC (kompleks promujący anafazę, anaphase promoting complex), czynnik promujący mitozę = mitosispromoting factor (MPF), fosfataza Cdc25 (cdc = cell division cycle), CDK1 = kinaza p34, kinaza aktywująca
cyklinę = cyclin activating kinase, CAK, kinaza Wee1, , gen supresorowy, onkogen, interfaza, faza G1, faza S,
faza G2, faza G0, faza M, ubikwitynozależna proteoliza białek regulatorowych cyklu komórkowego,
ĆWICZENIE 6
Podziały mitotyczne komórek
1.
Wykrywanie komórek w różnych fazach cyklu komórkowego na przykładzie preparatu stożka cebuli.
preparat mikroskopowy przekroju przez stożek wzrostu Allium cepa
2.
Wykrywanie mitozy w hodowli ludzkich fibroblastów skóry. Preparat mikroskopowy z dzielących się
hepatocytów (hodowla in vitro)
SEMINARIUM 7
SYLABUS
Molekularne aspekty śmierci komórki
Autofagia, śmierć martwicza (nekrotyczna) komórek, katastrofa mitotyczna, programowana śmierć komórki
(apoptoza), kaspazy – rodzaje, budowa – struktura domenowa, homoaktywacja i heteroaktywacja, kaskada
aktywacji kaspaz, szlaki indukowania programowanej śmierci komórki: 1) receptorowy (w tym promowanie
przeżycia komórki skutkiem fosforylacji NFkB i pozytywnej ekspresji regulowanej przez ten czynnik
transkrypcyjny genów, aktywacja kaspazy 2 poprzez RIP i RAIDD/CRADD), 2) pseudoreceptorowy (udział
granzymu B w a) aktywacji kaspazy 3, b) aktywacji Bid, c) inaktywacji DFF45/ICAD/aktywacji endonukleazy
DFF40/CAD), 3) mitochondrialny (w tym – łączenie ze ścieżką receptorową na poziomie kaspazy inicjującej,
megakanały – ANT, VDAC, BPR, enzymy (heksokinaza, kinaza kreatynowa), białka macierzy - cyklofilina D,
apoptosom – udział kofaktorów (cytochromu c, dATP/ATP) w stymulacji autooligomeryzacji Apaf1 i
katalitycznej aktywacji kaspazy 9), 4) sfingomielinowo-ceramidowy (sfingomielinaza – obojętna lub kwaśna,
sfingomielina, ceramid, fosfolipaza A2, kinazy MAPKs, kinazy stresu SAPK/JNK, CAPK = ceramide activated
protein kinase, CAPP = ceramede-activated protein phosphatase), 5) indukowany stresem (sygnał wywołujący,
aktywacja kaspazy 12), 6) bez udziału kaspaz (AIF, granzym A, granzym B – aktywacja DFF), p53, (w tym jego
fosforylacja, tetrameryzacja, degradacja ubikwitynozależna, struktura domen – 1) domena aktywująca
transkrypcję = TAD, 2) domena aktywacyjna 2 = AD2, 3) domena bogata w reszty proliny, ważna dla
aktywności apoptotycznej, 4) centralna domena wiązania z DNA = BDB, 5) domena sygnalna, warunkująca
jądrową lokalizację p53, 6) domena warunkująca oligomeryzację, 7) domena zaangażowana w regulację
wiązania DNA poprzez domenę centralną; mutacje w genie p53 – zespół Li-Fraumeni), Mdm2, ASPP =
apoptotic specific regulator of p53, ARF = alternative reading frame (dotyczy alternatywnej ekspresji genu p16
= INK4a), JMY = junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor, pRb, Bad, Bax, Bid, tBid, E2F,
DISC, FADD, Fas-L, TRADD, TRAIL, Bak (ang. Bcl2 homologous antagonist/killer), Noxa, Apaf(s), DED
(domena), i inne hasła zestawione poniżej (dot. apoptozy);
Rozwinięcie akronimów opisujących nazwy wskazanych w sylabusie genów/białek uczestniczących w
regulacji apoptozy

Acinus – ang. apoptosis chromatin condensation inducer in the nucleus, białko jądrowe
indukujące apoptotyczną kondensację chromatyny;

AIF – ang. apoptosis inducing factor, czynnik indukujący apoptozę, białko uczestniczące w
szlaku indukcji apoptozy bez udziału kaspaz, po proteolitycznym uwolnieniu z wewnętrznej błony
mitochondrialnej osiąga cytoplazmę, skąd, dzięki domenie NLS (nuclear localization sequence, sekwencja
lokalizacji jądra) może być translokowane do jądra komórkowego;

Apaf-1/APAF-1 – ang. apoptosis protease activating factor -1, 1 czynnik aktywujący proteazy
w apoptozie; cytoplazmatyczne białko wiążące uwolniony z mitochondrium cytochrom c i ATP w
oligomerycznym kompleksie apoptosomu, koniecznym dla aktywacji kaspazy 9;

ANT – ang. adenine nucleotide translocator, translokaza nukleotydów adeninowych, element
megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie wewnętrznej mitochondrium;

Bad – ang. Bcl-2 antagonist of cell death, jedno z białek proapoptotycznych;

Bax – ang. the Bcl-2-associated protein, cytoplazmatyczne białko o aktywności
proapoptotycznej, po zmianie konformacji przestrzennej włączane jest w zewnętrzną błonę mitochondrialną,
gdzie, wchodząc w kontakt z poryną VDAC, pozytywnie reguluje otwieranie megakanałów w miejscu styku obu
błon mitochondrialnych (PTPs – ang. permeability transition pores); otwieranie megakanałów w szlaku
mitochondrialnym indukowania apoptozy prowadzi do obniżenia potencjału transbłonowego, ograniczenia
produkcji ATP, spadku zawartości wewnatrzmitochondrialnej puli związków tiolowych, wzrostu stężenia Ca 2+ w
macierzy mitochondrialnej, czemu towarzyszy wypływ z przestrzeni międzybłonowej do cytozolu białek
promujących apoptozę (cytochrom c, prokaspazy-2, -3, -9, białka Smac/DIABLO, AIF);

Bcl-2 – ang. B-cell leukemia/lymphoma 2, produkt protoonkogenu Bcl-2 o aktywności
antyapoptotycznej, w szerszym rozumieniu białka rodziny Bcl-2, zarówno o aktywności pro-, jak i
antyapoptotycznej;

BH 1-4 – ang, Bcl-2 homology 1-4, domeny homologii w rodzinie białek Bcl-2, decydują o
zdolności do dimeryzacji tych białek, ułatwiając tworzenie homo- i heterodimerów, jak również oddziaływanie z
innymi białkami regulującymi apoptozę. W oparciu o występowanie domen homologii i właściwości wynikające
z ich budowy, białka rodziny Bcl-2 dzieli się na 3 klasy (podrodziny): I (podrodzina Bcl-2) – białka
antyapoptotyczne (w tym białko Bcl-2), w większości zawierające domeny BH 1-4; II (podrodzina Bax) – białka
proapoptotyczne pozbawione domeny BH4, bądź zawierające pewne jej motywy (w tym białka Bax, Bak); III
(podrodzina BH3) – białka proapoptotyczne zawierajace jedyną domenę homologii BH3 (w tym białka Bad,
Bid);

Bid – ang. the BH3 interacting-domain death agonist, białko rodziny Bcl-2 o aktywności
proapoptotycznej, zawierające w strukturze wyłącznie domenę homologii BH3, współdziałające z białkiem Bax,
ułatwia jego wbudowanie w zewnętrzną błonę mitochobdrialną;

BPR – ang. benzodiazepine peripheral receptor, obwodowy receptor benzodiazepiny, element
megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie zewnętrznej mitochondrium, buduje kompleks z udziałem
białka VDAC, białek enzymatycznych (kinaza kreatynowa, syntaza kardiolipiny, heksokinaza, kinaza
glicerolowa, peroksydaza glutationowa 4, dehydrogeneza/izomeraza 3-beta hydroksy steroidów) i niektórych
białek macierzy (cyklofilina D);

CAD – ang. caspase –activated Dbase, deoksyrybonukleaza zależna od Mg2+, homolog DFF
opisany w komórkach limfoidalnych myszy;

CANP – ang. Ca2+-activated neutral proteinase, zależna od Ca2+ obojętna endopeptydaza,
kalpaza, enzym proteolityczny uczestniczący, obok kaspaz, w apoptozie; bierze udział w degradacji białek
cytoszkieletu, cytokin, enzymów szlaków sygnalizacji komórkowej, ale także w proteolitycznej aktywacji
kaspaz (3, 7, 9);

CPAN – ang. caspase-activated nuclease, nukleaza aktywowana przez kaspazę, endonukleaza
zależna od Mg2+ aktywowana przez kaspazę 3 (patrz też CAD, DFF);

DD – ang. death domain, domena śmierci;

DED – ang. death effector domain, efektorowa domena śmierci;

DFF – ang. defragmentation factor, czynnik defragmentacji DNA, deoksyrybonukleaza,
zależna od Mg2+, odpowiedzialna za efektywną fragmentację chromatynowego DNA w komórkach
apoptotycznych, dokonuje cięć DNA między nukleosomami; enzym opisany w komórkach HeLa, składa się z
dwóch podjednostek – katalitycznej (DFF40/CAD = defragmentation factor 40 kDa/caspase activated DNase) i
regulatorowej DFF45/ICAD = defragmentation factor 45 kDa/inhibitor of caspase activated DNase),
podjednostka regulatorowa wobec podjednostki katalitycznej pełni funkcję białka opiekuńczego,
zapewniającego właściwe fałdowanie, oraz jej inhibitora; prawidłowa czynność podjednostki katalitycznej
DFF/CAD możliwa jest w następstwie proteolitycznej inaktywacji podjednostki regulatorowej tego enzymu, z
udziałem kaspaz (lub GrB);

DISC – ang. death inducing signalling complex, kompleks inicjujący apoptozę,
odpowiednikiem heterokompleksu DISC w szlaku mitochondrialnym jest apoptosom;

FADD – ang. Fas-associated death domain, białko adaptorowe z domeną smierci wiążące się
z receptorem Fas;

Fas-L – ang. Fas-ligand, ligand receptora Fas;

GrB – ang. granzyme B, granzym B, proteaza serynowa uczestnicząca w pseudoreceptorowym
szlaku indukcji apoptozy, kierowana do uśmiercanej komórki przez limfocyty T i komórki NK, uwalniana
jednocześnie z poryną, która umożliwia wnikanie enzymu; w komórce docelowej granzym B, podobnie do
kaspaz, dokonuje cięć substratów między resztą kwasu asparaginianowego i resztą kolejnego aminokwasu, przez
co może uruchamiać kaskadę kaspaz, inaktywować podjednostkę regulatorową (inhibitorową) jądrowej
endonukleazy DFF (DFF45/ICAD), czy dokonywać proteolitycznego cięcia białka Bid, z utworzeniem jego
aktywnej pochodnej tBid;

Kaspazy – ang. caspases = cysteine-dependent aspartate-directed proteases, rodzina proteaz
cysteinowych odgrywających kluczową rolę w szlakach indukowania programowanej śmierci komórki (ale także
w regulacji dojrzewania wielu komórek, w tym erytrocytów i mioblastów, czy rozwoju stanu zapalnego);
numeracja kaspaz nawiązuje do kolejności w jakiej były one opisywane, kaspazy dzieli się na 3 grupy
czynnościowe: 1) aktywatory cytokin związane ze stanami zapalnymi (kaspazy-1, -4, -5, -11, -12, -13, -14), 2)
inicjatory (kaspazy-2, -8, -9, -10, [-12]), 3) efektory fazy wykonawczej apoptozy (kaspazy-3, -6, -7);

NS – ang. nuclear scaffold, zależna od Ca2+ peptydaza, odpowiedzialna w apoptozie za
degradację lamin (białek karioszkieletu, będących głównymi składowymi blaszki jądrowej);

PIGs – ang. p53 induced genes, geny których ekspresja zależna jest od białka p53, kodujące
białka enzymatyczne (oksydoreduktazy), których produkty (reaktywne formy tlenu) należą do grupy czynników
uruchamiających mitochondrialny szlak programowanej śmierci komórki;

p53 – ang. protein 53, ale też tumor protein 53 = TP53 (u człowieka produkt genu TP53,
17p13.1), białko o masie cząsteczkowej 53 kDa szacowanej na podstawie jego izolacji w żelu
poliakrylamidowym, jego rzeczywista masa, określana na podstawie zawartości reszt aminokwasowych jest
nieco mniejsza (43,7 kDa); czynnik transkrypcyjny znany jako supresor nowotworowy, uczestniczący w
regulacji cyklu komórkowego (strażnik genomu), w odpowiedzi na uszkodzenie DNA aktywuje białka
uczestniczące w jego naprawie, jednocześnie hamując cykl komórkowy w punkcie G1/S, gdy uszkodzenie DNA
nie może być naprawione, inicjuje apoptozę, pozytywnie regulując ekspresję genów kodujących białka o
aktywności proapoptotycznej;

PUMA – ang. the p53 upregulated modulator of apoptosis, białko rodziny Bcl-2 o aktywności
proapoptotycznej, wiążąc białka tej rodziny o działaniu antyapoptotycznym (Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-w, A1),
przez co niezdolne są one hamować czynność białek Bax, czy Bak, uczestniczy w regulacji mitochondrialnej
ścieżki indukowania apoptozy;

Smac/DIABLO – ang. second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein
with low pI, wtórny mitochondrialny aktywator kaspazy/białko wiążące bezpośrednio IAP o niskim pI,
moitochondrialne białko proapoptotyczne uwalniane po otwarciu megakanałów do cytoplazy, gdzie wiąże i
inaktywuje białkowe inhibitory kaspaz (IAPs – ang. inhibitor of apoptosis proteins);

tBid – ang. truncated Bid, skrócona (aktywna) forma białka Bid;

TRADD – ang. TNF-R1 associated death domain, białko adaptorowe z domeną śmierci
wiążące się z receptorem TNF-R1;

TRAIL – ang. TNF-related apoptosis-indicing ligand, ligand z rodziny TNF indukujący
apoptozę;

VDAC – ang. voltage-dependent anion channel, poryna obecna w błonie zewnętrznej
mitochondrium, wchodząc w kompleksy z białkami rodziny Bcl-2 modyfikuje otwieranie megakanałów;
ĆWICZENIE 7
1. Wykrywanie apoptozy w preparacie z hodowli fibroblastów.
2. Ocena stopnia zaawansowania apoptozy na podstawie obrazu po elektroforezie DNA.
3. Różnicowanie apoptozy wywołanej na drodze receptorowej i mitochondrialnej.
TEST SPRAWDZAJĄCY 1 – W 8 TYGODNIU ćwiczeń i seminariów
SEMINARIUM 8
SYLABUS
MOLEKULARNE PODSTAWY REGULACJI PODZIAŁÓW KOMÓRKOWYCH
Mitoza, mejoza, porównanie podziałów komórkowych, I podział mejotyczny; profaza I
– leptoten, zygoten, pachyten, diploten, diakineza; metafaza I; anafaza I; telofazaI; II
podział mejotyczny; profaza II, metafaza II; anafaza II; telofaza II, nondysjunkcja
crossing – over; rekombinacja homologiczna, model Hollidaya, model MeselsonaRaddinga, model pęknięć dwuniciowych, rekombinacja umiejscowiona, transpozycja
replikatywna i konserwatywna; białka RecBCD; miejsce chi, białka Rad51, Dmc1,
miejsca att, integraza, ekscisionaza, rekombinaza Cre
Regulacja molekularna podziału komórki ze szczególnym uwzględnieniem białek
Rho, kinaz Aurora oraz Polo – like. Dojrzewanie oocytu ssaków. Spermatogeneza.
ĆWICZENIE 8
1.
2.
Mitoza w komórkach ludzkich.
Mejoza w komórkach ludzkich.
SEMINARIUM 9
SYLABUS
Molekularne podstawy różnicowania komórek
indukcja z udziałem genów aktywnych podczas rozwoju zarodkowego, rola centrum Niewkoopa i centrum
Spemanna w indukcji zarodkowej, morfogeneza, rola genów regulatorowych w rozwoju kręgowców: gen
Brachyury, Goosecoid, Wnt, Siamois, Shh, HOXs, PAXs, homeobox, kwas retinojowy,
czynniki indukcyjne w indukcji zarodkowej: FGF, TGFβ, Vg1, aktywiny, β-katenina, Noggin, BMPs, chordyna,
folistatyna,
morfogeneza, adhezja międzykomórkowa, kadheryny, rola cząsteczek adhezji w morfogenezie,
podział komórek macierzystych ze względu na zdolność do różnicowania i pochodzenie (zarodkowe, płodowe,
somatyczne),
markery powierzchniowe charakterystyczne dla macierzystych komórek zarodkowych: SSEA-1, SSEA-3,
SSEA-4, CD324 (E-kadheryna), CD90 (Thy-1), CD117 (c-kit), CD326, CD29 (beta1 integryna), CD24 (HASheat stable antygen), CD59, CD133, CD31, CD49f integryna alpha 6), TRA-1-60, TRA-1-81,
markery komórek mezenchymalnych macierzystych: CD73, CD105, CD90
markery komórek hematopoetycznych macierzystych: CD34, CD133, CXCR4, CD45
czynniki wpływające na różnicowanie komórek macierzystych: EGF (czynnik wzrostu naskórkowy), bFGF
(czynnik wzrostu fibroblastów), kwas retinowy, białka morfogenetyczne kości: BMP-2, BMP-4, BMP-6, NGF
(czynnik wzrostu nerwów), HGF (czynnik wzrostu hepatocytów), interleukiny 2, 5, 7, G-CSF (czynnik
pobudzający kolonie granulocytów), M-CSF (czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów), TPO
(Trombopoetyna), EPO (Erytropoetyna), SCF (czynnik wzrostu komórek macierzystych)
ĆWICZENIE 9
1.
Preparaty komórek macierzystych różnicowanych do osteoblastów i adipocytów.
SEMINARIUM 10
SYLABUS
Molekularne podstawy różnicowania tkanek
Molekularne podłoże determinacji płci – płeć genetyczna, płeć somatyczna, płeć heterogametyczna, płeć
homogenetyczna, mechanizmy sygnałów indukujących płeć, płeć nadrzędna, pleć podstawowa, mechanizm
kompensacyjny
Molekularne podłoże determinacji płci u D. melanogaster – sex-lethal (sxl), sis-a, sis-b, maleless, male
specific lethal (msl), double sex (dsx), tra, stosunek X:A, determinacja płci somatycznej, intersex,
gynandromorfy, kaskada sygnału wywołującego alternatywne składanie mRNA
Molekularne podłoże determinacji płci u ssaków – budowa chromosomu Y, region PAR, gen SRY, czynnik
TDF, przewody Mullera, przewody Wolffa, AMH (MIH), lyonizacja, ciałko Barra – czynnik Xist, Wt1, Sf1,
Sox9, Dax1, Wrx4, R-spondyna 1, Wnt4, beta katenina, BMP-2, FST (folistatyna)
Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu ruchu (szkieletowego i
mięśniowego) – somit, sklerotom (kadheryny N, Delta/Notch, neksus, SHH, PAX-3, PAX-1, PAX-9, tenascyna,
kolagen IV); wyrostek ościsty (SHH, BMP-4, msx-1, msx-2) molekularne podłoże chrzęstnienia (SHH, IHH,
PAX-1,GDF,Runx2, aktywina, Scleraxis, kolagen II) i kostnienia (Runx2, Osx, beta katenina), chondroblasty,
chondrocyty, osteoblasty, osteoklasty (Rank, Rankl , osteoprotegeryna), osteocyty;
Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu ruchu (szkieletowego i
mięśniowego) – dermatomiotom (BMP-4, BMP-7, Wnt-11), miotom, myoD, myf5, miogenina, mrf-4(myf-6);
mięśnie kończyn (PAX-3, PAX-7, lbx-1, msx-1, EphA-4, c-met),
Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu moczowo-płciowego –
grzebień moczo-płciowy, sznury nerko twórcze, sznury płciowe, WT1, GDNF, HGF, RET, MET, FGF2, BMP7,
WNT9B, EMX-2, PAX2, SIM-1, GATA4, LHX9, WNT4, SRY, SOX9, AMH, FGF9, SF1, DAX1, DHH, TDF
Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu nerwowego – płytka nerwowa
(BMP4, BMP7, folistatyna, noggin, chordyna, WNT1, SHH, PAX3,PAX7, OTX2, GBX2), różnicowanie
neuronów (nestyna, MASH-1, MAP-2, NKX2.2, NKX6.1, GLI2, dorsalina, GLI3), pęcherzyki mózgowe,
rombomery (HOX, kw. retinowy, WNT, KROX20, GBX2, KREISTLER, EPHRIN, LIM1, EMX1, EMX2,
FOXG1, EN1, EN2, WNT1)
Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania i tkanek układu sercowo-naczyniowego – wyspy
krwiotwórcze, waskulogeneza (notch, COUP-TFII, EGFL7), angiogeneza (VEGF, PFGF, angiopoetyna, TIE1,
TIE2, efryna), pole sercotwórcze (BMP2/4, FGF8, NKX2, GATA4, VMHC1, ANF, TLL1, TBX5, XIN, BMP5,
nodal, Lefty2, HAND1, HAND2) ĆWICZENIE 10
ĆWICZENIE 10
1.
Prezentacje tematów przez studentów.
SEMINARIUM 11
SYLABUS
Molekularna organizacja informacji genetycznej: Genom człowieka.
Genom, genom jądrowy, genom mitochondrialny, proteom, transkryptom. Sekwencje w genomie człowieka:
sekwencje kodujące, sekwencje niekodujące, sekwencje powtarzające się: tandemowe (satelitarne,
minisatelitarne, mikrosatelitarne) i rozproszone (SINE, LINE), VNTR. RNA komórki: hnRNArna, snoRNA,
miRNA, siRNA.
Poziomy organizacji chromatyny: nukleosom, solenoid (włókno 30nm), supersolenoid, zwinięta spirala,
chromatyda, chromosom metafazowy. Budowa chromosomu metafazowego, kinetochory, białka CENP-A.
Cytogenetyka. Cytogenetyka klasyczna – prążkowanie – prążki: G, HRT, R, Q, C, AgNOR). Cytogenetyka
molekularna - ISH, FISH, odmiany metody FISH: fiber FISH, SKY-FISH, M-FISH, porównawcza hybrydyzacja
genomowa (CGH), mikromacierze CGH), cytometria przepływowa. Przygotowanie kariogramu;
fitohemaglutynina, kolchicyna, transformacja blastyczna, kariotyp, kariogram, idiogram. Lyonizacja, ciałko
Barra, pałeczka Dobosza.
ĆWICZENIE 11
1.
2.
Wykrywanie typów chromatyny w komórkach interfazowych.
Wykrywanie płytek metafazowych w komórkach człowieka.
SEMINARIUM 12
SYLABUS
Wprowadzenie do wybranych zagadnień z biotechnologii.
1.
Rekombinowanie i klonowanie DNA, analiza i zastosowanie klonowanego DNA.

Enzymy restrykcyjne

Typy wektorów: plazmidy, bakteriofagi, kosmidy, wektory stosowane w komórkach eukariotycznych

Ogólne zasady stosowania wektorów: przygotowanie wektora, wbudowanie wektora do komórek
gospodarza, dobór gospodarza, w którym zachodzi klonowanie genu

Zastosowanie klonowanego DNA w medycynie
2.
Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR).

Ogólna zasada metody, etapy, zastosowanie w medycynie

Rodzaje PCR: RT-PCR (reverse transcriptase PCR), PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR),
Multiplex PCR, RFLP PCR, Gniazdowy PCR, zagnieżdżony PCR (nested PCR)
3.



Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych.
Metoda Sangera
Metoda Maxama-Gilberta
Pirosekwencjonowanie
4.









Metody wykrywania mutacji.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
ASO (Allele Specific Oligonucleotide hybridization)
Heterodupleksy: HA (lub HET = Heteroduplex Analysis, CMC = Chemical Mismatch Cleavage)
DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Mikromacierze DNA ( oligonukleotydowe, cDNA)
Southern Blot (Southern Blotting)
Western Blot (Western Blotting)
Northern Blot (Northern Blotting)
5.


GMO – metody, wykorzystanie w medycynie, transgeniczne rośliny.
Metody uzyskiwania roślin transgenicznych
Przykłady wykorzystania roślin transgenicznych w medycynie
6.


GMO – metody, wykorzystanie w medycynie, transgeniczne zwierzęta.
Metody uzyskiwania zwierząt transgenicznych
Przykłady wykorzystania zwierząt transgenicznych w medycynie
7.


Cytometria przepływowa i jej zastosowanie w badaniach, medycynie i diagnostyce.
Budowa i zasada działania cytometru
Zastosowanie cytometru w badaniach, medycynie i diagnostyce
8.
Medycyna regeneracyjna.

Zastosowanie komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej

Zastosowanie materiałów polimerowych w medycynie regeneracyjnej
ĆWICZENIE 12
1.
Prezentacje tematów przez studentów.
SEMINARIUM 13
SYLABUS
MOLEKULARNE PODŁOŻE KOMUNIKACJI MIĘDZYKOMÓRKOWEJ
1.
Sposoby przekazywania sygnału między komórkami:

Poziomy sygnalizacji komórkowej (autokrynia, jukstakrynia, parakrynia, endokrynia), pojęcia: ligand,
receptor, szlak sygnalizacyjny, kaskady sygnalizacyjne, wtórne przekaźniki (ang. second messengers);

Sygnalizacja z udziałem jonów Ca2+;

Połączenia międzykomórkowe i ich rola w przekazywaniu informacji;

Międzykomórkowe połączenia komunikacyjne typu neksus (szczelinowe, ang. gap junctions). Rola
koneksonów.
2.



Transport substancji przez błony komórkowe
Ogólne zasady transportu błonowego, transport aktywny i bierny;
Nośniki, pompy – budowa, funkcje, przykłady;
Kanały jonowe – typy, budowa, funkcje, przykłady; potencjał błonowy.
3.
Receptory komórkowe

Główny podział receptorów: receptory cytoplazmatyczne, receptory błonowe;

Receptory błonowe (jonotropowe, metabotropowe – współpracujące z białkami G, receptory o
właściwościach enzymatycznych);

Receptory wewnątrzkomórkowe (InsP3R, pojęcie przekaźnika wtórnego);

Receptory jądrowe (członowy charakter budowy, znane ligandy, podstawowe klasy receptorów
jądrowych). Dla mocno zainteresowanych tematem poleca się odwiedzić stronę NucleaRDB
http://www.receptors.org/nucleardb/
4.
Adhezja komórek

Połączenia międzykomórkowe: zamykające (ścisłe), zwierające (przylegania), desmosomy,
hemidesmosomy, komunikacyjne typu neksus (szczelinowe);

Cząsteczki związane z adhezją: kadheryny, kateniny, desmoplakiny, integryny, CAM (np. N-CAM, ICAM), selektyny, klaudyny, koneksyny

Rola cytoszkieletu i jonów wapnia w adhezji komórek

Adhezja a nowotwory
5.
Oddziaływanie komórek z macierzą zewnątrzkomórkową

Struktura i funkcja składników macierzy zewnątrzkomórkowej (proteoglikany, laminina, fibronektyna,
kolageny. Enzymy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs, TIMPs)

Oddziaływanie komórek z macierzą zewnątrzkomórkową
ĆWICZENIE 13
1.
Prezentacje tematów przez studentów.
TEST SPRAWDZAJĄCY 2 – W 14 TYGODNIU ćwiczeń i seminariów
SEMINARIUM 14
SYLABUS
SYGNALIZACJA WEWNATRZKOMÓRKOWA, SZLAKI PRZEKAZYWANIA SYGNAŁÓW
1.
Kaskada sygnalizacyjna z udziałem receptora błonowego.

Zapoczątkowanie sygnału (ligandy receptorów błony komórkowej – hormony peptydowe, czynniki
wzrostu, neurotransmitery, tlenek azotu;

Receptory powierzchniowe komórki (receptory oddziałujące z białkami G – w tym molekularny
mechanizm działania heterotrimerycznych białek G, receptory o aktywności kinazy fosforylującej białka na
resztach tyrozynowych, receptory o aktywności fosfatazy białkowej);

Sygnałowe enzymy efektorowe (kinazy i fosfatazy cytoplazmatyczne, cyklazy nukleotydowe,
fosfodiesterazy, fosfolipazy);

Nieenzymatyczne cytoplazmatyczne przekaźniki wtórne (produkty hydrolizy PIP2 [diacyloglicerol,
który aktywuje PKC i IP3, który moblilizuje Ca2+], cykliczne nukleotydy [cAMP, cGMP], Ca2+ - jego udział w
aktywacji białek enzymatycznych, w tym rola kalmoduliny);

Jądrowe transaktywatory.
2.
Przekazywanie sygnału przez receptor cytoplazmatyczny.

Hormony steroidowe – wprowadzenie, budowa i znaczenie fizjologiczne;

Receptory hormonów steroidowych – czynniki transkrypcji zależne od liganda, budowa domenowa
(domena wiążąca hormon, w jej obrebie zwykle poddomeny odpowiadające za późniejsze zdarzenia
metaboliczne – patrz niżej, domena wiążąca DNA – palc cynkowy, domena dominująca);

Receptory nietransformowane w cytoplazmatycznym kompleksie z Hsp90;

Zmiany strukturalne receptora indukowane ligandem (związaniem hormonu steroidowego) transformacja;

Sekwencja zdarzeń molekularnych wyzwalana aktywacją receptora, przemieszczanie przekształconego
receptora do jądra komórkowego (dysocjacja Hsp90, dimeryzacja, translokacja do jądra);

Wiązanie receptora z DNA, transaktywacja ekspresji genu swoista dla hormonu.
3.
Ścieżka sygnalizacyjna TGFβ.

Ligandy nadrodziny TGF uczestniczące w uruchamianiu ścieżki sygnalizacyjnej TGFβ (BMPs, GDFs,
AMH, aktywiny – aktywina A, aktywina B, aktywina AB, Nodal, TGFβ s,; BMPR I i II = TGFβ receptor I i II;

Rekrutacja receptora i jego fosforylacja;

Fosforylacja SMADs (SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD9=SMAD8), funkcjonalne
znaczenie białek SARA i HGS;

Wiązanie coSMAD (SMAD4);

Udział fosforylowanego kompleksu RSMAD/coSMAD w regulacji transkrypcji genów;

Mechanizmy regulacji ścieżki sygnalizacyjnej TGFβ.
4.
Ścieżka sygnalizacyjna WNT.

Białka sygnalizacyjne Wnt i ich funkcjonalne znaczenie;

Kanoniczna ścieżka sygnalizacyjna Wnt, mechanizm (ligandy Wnt, receptory rodziny Frizzled, białka
rodziny Dishevelled, Lrp, Aksyna, β-katenina, Apc, Gsk3, Ck1;

Modyfikatory kanonicznej ścieżki sygnalizacyjnej Wnt (Cerberus);

Niekanoniczne ścieżki sygnalizacyjne Wnt (ścieżki PCP i Wnt/Ca2+);

Udział ścieżki sygnalizacyjnej Wnt w regulacji rozwoju zarodkowego i patogenezie wybranych
schorzeń nowotworowych.
5.
Ścieżka sygnalizacyjna HH (Hedgehog)

Ścieżka sygnalizacyjna shh u Drosophila melanogaster, mechanizm i znaczenie;

ścieżka sygnalizacyjna Shh u zwierząt kręgowych, mechanizm (homologi Shh/SHH, SHH-N, SHH-C,
PTCH1, PTCH2, SMO, GLIs);

Czynnościowe znaczenie ścieżek sygnalizacyjnych SHH;

Zaburzenia ścieżki sygnalizacyjnej SHH w molekularnym mechanizmie patogenetycznym chorób
człowieka.
ĆWICZENIE 14
1.
Prezentacje tematów przez studentów.
WYKAZ ZALECANYCH PODRĘCZNIKÓW:
1.
Podstawy biologii komórki. B. Alberts, Wyd. Naukowe PWN, 2005 i następne.
2.
Cytobiochemia. Biochemia niektórych struktur komórkowych. Kłyszejko-Stefanowicz L., PWN,
Warszawa, 2002.
3.
Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy (G. Drewa i T. Ferenc, red.)
Elsevier Urban & Partner 2007 i następne.
4.
Genetyka molekularna (P. Węgleński, red.). PWN, Warszawa 2006 lub nowsze.
Piśmiennictwo uzupełniające będące podstawą przygotowania prezentacji przez studentów:
5.
Epstein, R. J.: Biologia molekularna człowieka. Molekularne podłoże zjawisk w stanie zdrowia i w
przebiegu chorób. Wydawnictwo Czelej, Lublin 2005
6.
Genomy. Brown T.A. (P. Węgleński, red.) Wyd. Naukowe PWN, 2009 i następne.
7.
Zarys organogenezy. Różnicowanie się komórek w narządach. Z. Bielańska-Osuchowska. 2004 PWN i
następne.
8.
Embriologia człowieka. Ostrowski K.: PZWL, Warszawa 1988 i następne.
9.
Embriologia, podręcznik dla studentów; Hieronim Bartel; wyd.: Warszawa; PZWL; 2002 i następne.
10.
Biologia rozwoju. Le Moigne A., PWN, Warszawa 1999 lub Twyman R.M: Biologia rozwoju, 2003
PWN i następne.
Download