SEMINARIUM 1 Sylabus Budowa i właściwości makrocząsteczek
advertisement
SEMINARIUM 1 SYLABUS Budowa i właściwości makrocząsteczek życia Skład chemiczny oraz budowa kwasów nukleinowych: definicje pojęć: kwas deoksyrybonukleinowy, kwas rybonukleinowy, ryboza, deoksyryboza, zasady azotowe; właściwości zasad azotowych:- pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina; - purynowe: adenina i guanina; wiązanie fosfodiestrowe, wiązanie β-N-glikozydowe, wiązania wodorowe, koniec 3’, koniec 5’ nici kwasu nukleinowego, nukleozyd, nukleotyd, budowa helisy DNA, komplementarność zasad; rodzaje struktur DNA: BDNA, A-DNA, Z-DNA, struktura RNA, struktura szpilki do włosów. Skład chemiczny oraz budowa białek: wzór ogólny aminokwasu, wiązanie peptydowe, aminokwasy egzogenne, aminokwasy endogenne, hydrofobowe aminokwasy alifatyczne, hydrofobowe aminokwasy aromatyczne, polarne aminokwasy obdarzone ładunkiem, polarne aminokwasy pozbawione ładunku, struktura białka: I-rzędowa, II-rzędowa, III-rzędowa, IV-rzędowa, funkcje białek. Skład chemiczny oraz budowa cukrów: Cukry: cukry proste - aldozy, ketozy, cukry złożone - dwucukry, oligosacharydy, polisacharydy, izomery, aldehyd-3-glicerynowy, ryboza, glukoza, galaktoza, piranozowe formy pierścieniowe, furanozowe formy pierścieniowe, disacharydy, laktoza, maltoza, sacharoza, celobioza, polisacharydy glikogen, celuloza, funkcje cukrów. Skład chemiczny oraz budowa kwasów tłuszczowych i tłuszczy: nasycone kwasy tłuszczowe, nienasycone kwasy tłuszczowe, niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe, kwasy -3, kwasy -6, tłuszcze właściwe (triacyloglicerole, triglicerydy) funkcje lipidów, podział lipidów, tłuszcze właściwe, woski, fosfolipidy, glikolipidy. Spektrofotometryczne metody oznaczania kwasów nukleinowych i białek: spektrofotometria absorpcyjna, spektrofotometria w świetle widzialnym (VIS), kolorymetria, spektrofotometria w świetle nadfioletowym (UV), absorbancja, prawo Lamberta-Beera, spektrofotometryczne oznaczanie kwasów nukleinowych i białek, widmo absorpcyjne, długość fali, oznaczanie czystości próbek kwasów nukleinowych, krzywa wzorcowa. ĆWICZENIE 1 KARTA PRACY 1. Ilościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek. 2. Jakościowe oznaczanie kwasów nukleinowych i białek. SEMINARIUM 2 SYLABUS Oczyszczanie i metody badań makrocząsteczek życia Homogenizacja materiału biologicznego (homogenat, lizat, ekstrakt, sonikacja, permeabilizacja). Metody oczyszczania białek (chromatografia powinowactwa, żelowa, kolumnowa, jonowymienna, hydrofobowa; wirowanie różnicowe, wirowanie w gradiencie gęstości; sedymentacja szybkościowa, równowagowa; frakcjonowanie; dializa; supernatant). Metody oczyszczania kwasów nukleinowych (ekstrakcja fenol/chloroform; odsalanie białek, metody kolumienkowe; elektroforeza w żelu agarozowym). Metody analizy jakościowej i ilościowej białek (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, Western blotting; elektroforeza dwukierunkowa; ogniskowanie izoelektryczne; sekwencjonowanie białek, spektroskopia mas, krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR, spektroskopia dichroizmu kołowego, termostabilność białek). Metody analizy jakościowej i ilościowej RNA (Technika northern-blot; RT-PCR; RT-qPCR; SAGE (serial analysis of gene expression); Mikromacierze; Hybrydyzacja in situ (tech. mikroskopowa); RNAseq: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie transkryptomów). Metody analizy jakościowej i ilościowej DNA (Enzymy restrykcyjne; Hybrydyzacja (renaturacja): Southern Blotting, DNA fingerprinting, Northern blotting, In situ hybridization (FISH); Amplifikacja DNA metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy); Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny: PCR-Multiplex; PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych); Sekwencjonowanie enzymatyczne metodą Sangera; Sekwencjonowanie równoległe, Next Generation Sequencing). ĆWICZENIE 2 KARTA PRACY 1. Oznaczanie stabilności kwasów nukleinowych i białek. SEMINARIUM 3 SYLABUS Struktura molekularna organelli komórkowych cytoszkielet, mikrotubule, mikrofilamenty, aktyna, białka wiążące aktynę (ABPs = actin-binding proteins), tubulina, białka towarzyszące mikrotubulom (nietubularne – tektyny i MAPs = microtubule-binding proteins), białka motoryczne mikrotubul (dyneiny, kinezyny), centrosom, centriole, mitochondrium, siateczka śródplazmatyczna, rybosomy, peroksysom, lizosom pierwotny, lizosom wtórny, błona komórkowa, budowa, aparat Golgiego, jądro komórkowe, macierz jądrowa, otoczka jądrowa, wymiana jądrowo-plazmatyczna, jąderko, budowa i zasada działania mikroskopu świetlnego, ĆWICZENIE 3 KARTA PRACY Zdjęcia do wydrukowania przez KAŻDEGO studenta danej grupy seminaryjnej: gr.1; gr.2; gr.3; gr.4; gr.5; gr.6; gr.7; gr.8; gr.9; gr.10; gr.11; gr.12; gr.13; gr.14; gr.15; gr.16; gr.17; gr.18; gr.19; gr.20 1. Obrazy komórki w mikroskopie świetlnym. 2. Obrazy struktur komórkowych w mikroskopie fluorescencyjnym. 3. Obrazy struktur komórkowych otrzymanych metodą mikroskopii elektronowej. SEMINARIUM 4 SYLABUS Molekularne mechanizmy replikacji, transkrypcji i translacji Genom, genotyp, fenotyp, gen, allel Replikacja DNA: Helisa DNA, model semikonserwatywny replikacji, zasada komplementacji zasad, widełki replikacyjne, bąbel replikacyjny, fragmenty Okazaki, nić wiodąca, nić opóźniona, kierunek replikacji, enzymy biorące udział w replikacji DNA; ori; telomery, naprawa błędów replikacyjnych Transkrypcja: kod genetyczny, rodzaje RNA, etapy transkrypcji, kierunek transkrypcji, enzymy biorące udział w transkrypcji, czynniki transkrypcyjne, aktywator, represor, elementy cis- i trans-; obróbka posttranskrypcyjna Translacja: etapy translacji, enzymy biorące udział w translacji, obróbka posttranslacyjna Reakcja PCR: etapy reakcji PCR, warunki reakcji, modyfikacje reakcji PCR, zasady projektowania starterów reakcji PCR, ĆWICZENIE 4 KARTA PRACY 1. Bazy danych internetowe. 2. Projektowanie starterów reakcji PCR. 3. Projektowanie warunków reakcji PCR ilościowego. SEMINARIUM 5 SYLABUS Struktura czynnościowa komórki eukariotycznej czynność błony komórkowej, transport przez błonę komórkową, dyfuzja prosta, dyfuzja ułatwiona, transport aktywny, symporter sodowo glukozowy, adenozynotrójfosfataza sodowo potasowa, transportery ABC, przedziały komórkowe, transport białek w komórce, transport do jądra komórkowego, bałka Ran, receptory transportu jądrowego, transport do mitochondrium, kompleks TOM, transport do peroksysomów, białka PEX, transport do siateczki wewnątrzplazmatycznej, białko translokacyjne, transport pęcherzykowy, kompleks COPI, kompleks COPII, klatryna, białka SNARE, czynność aparatu Golgiego, receptor M6P, wymiana białek przez aparat Golgiego, peptyd sygnałowy, peptydaza sygnałowa, sortowanie białek, endocytoza, egzocytoza, czynność lizosomów, czynność mitochondrium, łańcuch oddechowy, synteza adenozynotrójfosforanu, fosforylacja oksydacyjna, łańcuch transportu elektronów w trakcie łańcucha oddechowego, gradient protonowy błony wewnętrznej mitochondrium i jego źródło. ĆWICZENIE 5 1. 2. 3. 4. Analiza struktur przestrzennych kwasów nukleinowych jednoniciowych. Analiza struktur przestrzennych kwasów nukleinowych dwuniciowych. Analiza wyników wykrywania kwasów rybonukleinowych. Analiza wyników wykrywania kwasów deoksyrybonukleinowych. SEMINARIUM 6 SYLABUS Molekularna regulacja cyklu komórkowego kolchicyna, mitoza – profaza, prometafaza, metafaza, anafaza, telofaza, cytokineza, wrzeciono podziałowe, mikrotubule aparatu mitotycznego, włókna mikrotubularne – ciągłe, kinetochorowe, międzychromosomowe, astralne, centrosfera (astrosfera), pierścień komórkowy (dot. cytokinezy), polimeryzacja/depolimeryzacja mikrotubul kinetochorowych, dynamiczna niestabilność mikrotubul, cykliny (cykliny mitotyczne = A, B, cykliny G1 = C, D, E), cyklinozależne kinazy (Cdks 2-9), fosforylacja, defosforylacja, punkty kontrolne cyklu komórkowego, inhibitory Cdks, rodzina białek p16 i p21, p27, pRb, p53, APC (kompleks promujący anafazę, anaphase promoting complex), czynnik promujący mitozę = mitosispromoting factor (MPF), fosfataza Cdc25 (cdc = cell division cycle), CDK1 = kinaza p34, kinaza aktywująca cyklinę = cyclin activating kinase, CAK, kinaza Wee1, , gen supresorowy, onkogen, interfaza, faza G1, faza S, faza G2, faza G0, faza M, ubikwitynozależna proteoliza białek regulatorowych cyklu komórkowego, ĆWICZENIE 6 Podziały mitotyczne komórek 1. Wykrywanie komórek w różnych fazach cyklu komórkowego na przykładzie preparatu stożka cebuli. preparat mikroskopowy przekroju przez stożek wzrostu Allium cepa 2. Wykrywanie mitozy w hodowli ludzkich fibroblastów skóry. Preparat mikroskopowy z dzielących się hepatocytów (hodowla in vitro) SEMINARIUM 7 SYLABUS Molekularne aspekty śmierci komórki Autofagia, śmierć martwicza (nekrotyczna) komórek, katastrofa mitotyczna, programowana śmierć komórki (apoptoza), kaspazy – rodzaje, budowa – struktura domenowa, homoaktywacja i heteroaktywacja, kaskada aktywacji kaspaz, szlaki indukowania programowanej śmierci komórki: 1) receptorowy (w tym promowanie przeżycia komórki skutkiem fosforylacji NFkB i pozytywnej ekspresji regulowanej przez ten czynnik transkrypcyjny genów, aktywacja kaspazy 2 poprzez RIP i RAIDD/CRADD), 2) pseudoreceptorowy (udział granzymu B w a) aktywacji kaspazy 3, b) aktywacji Bid, c) inaktywacji DFF45/ICAD/aktywacji endonukleazy DFF40/CAD), 3) mitochondrialny (w tym – łączenie ze ścieżką receptorową na poziomie kaspazy inicjującej, megakanały – ANT, VDAC, BPR, enzymy (heksokinaza, kinaza kreatynowa), białka macierzy - cyklofilina D, apoptosom – udział kofaktorów (cytochromu c, dATP/ATP) w stymulacji autooligomeryzacji Apaf1 i katalitycznej aktywacji kaspazy 9), 4) sfingomielinowo-ceramidowy (sfingomielinaza – obojętna lub kwaśna, sfingomielina, ceramid, fosfolipaza A2, kinazy MAPKs, kinazy stresu SAPK/JNK, CAPK = ceramide activated protein kinase, CAPP = ceramede-activated protein phosphatase), 5) indukowany stresem (sygnał wywołujący, aktywacja kaspazy 12), 6) bez udziału kaspaz (AIF, granzym A, granzym B – aktywacja DFF), p53, (w tym jego fosforylacja, tetrameryzacja, degradacja ubikwitynozależna, struktura domen – 1) domena aktywująca transkrypcję = TAD, 2) domena aktywacyjna 2 = AD2, 3) domena bogata w reszty proliny, ważna dla aktywności apoptotycznej, 4) centralna domena wiązania z DNA = BDB, 5) domena sygnalna, warunkująca jądrową lokalizację p53, 6) domena warunkująca oligomeryzację, 7) domena zaangażowana w regulację wiązania DNA poprzez domenę centralną; mutacje w genie p53 – zespół Li-Fraumeni), Mdm2, ASPP = apoptotic specific regulator of p53, ARF = alternative reading frame (dotyczy alternatywnej ekspresji genu p16 = INK4a), JMY = junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor, pRb, Bad, Bax, Bid, tBid, E2F, DISC, FADD, Fas-L, TRADD, TRAIL, Bak (ang. Bcl2 homologous antagonist/killer), Noxa, Apaf(s), DED (domena), i inne hasła zestawione poniżej (dot. apoptozy); Rozwinięcie akronimów opisujących nazwy wskazanych w sylabusie genów/białek uczestniczących w regulacji apoptozy Acinus – ang. apoptosis chromatin condensation inducer in the nucleus, białko jądrowe indukujące apoptotyczną kondensację chromatyny; AIF – ang. apoptosis inducing factor, czynnik indukujący apoptozę, białko uczestniczące w szlaku indukcji apoptozy bez udziału kaspaz, po proteolitycznym uwolnieniu z wewnętrznej błony mitochondrialnej osiąga cytoplazmę, skąd, dzięki domenie NLS (nuclear localization sequence, sekwencja lokalizacji jądra) może być translokowane do jądra komórkowego; Apaf-1/APAF-1 – ang. apoptosis protease activating factor -1, 1 czynnik aktywujący proteazy w apoptozie; cytoplazmatyczne białko wiążące uwolniony z mitochondrium cytochrom c i ATP w oligomerycznym kompleksie apoptosomu, koniecznym dla aktywacji kaspazy 9; ANT – ang. adenine nucleotide translocator, translokaza nukleotydów adeninowych, element megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie wewnętrznej mitochondrium; Bad – ang. Bcl-2 antagonist of cell death, jedno z białek proapoptotycznych; Bax – ang. the Bcl-2-associated protein, cytoplazmatyczne białko o aktywności proapoptotycznej, po zmianie konformacji przestrzennej włączane jest w zewnętrzną błonę mitochondrialną, gdzie, wchodząc w kontakt z poryną VDAC, pozytywnie reguluje otwieranie megakanałów w miejscu styku obu błon mitochondrialnych (PTPs – ang. permeability transition pores); otwieranie megakanałów w szlaku mitochondrialnym indukowania apoptozy prowadzi do obniżenia potencjału transbłonowego, ograniczenia produkcji ATP, spadku zawartości wewnatrzmitochondrialnej puli związków tiolowych, wzrostu stężenia Ca 2+ w macierzy mitochondrialnej, czemu towarzyszy wypływ z przestrzeni międzybłonowej do cytozolu białek promujących apoptozę (cytochrom c, prokaspazy-2, -3, -9, białka Smac/DIABLO, AIF); Bcl-2 – ang. B-cell leukemia/lymphoma 2, produkt protoonkogenu Bcl-2 o aktywności antyapoptotycznej, w szerszym rozumieniu białka rodziny Bcl-2, zarówno o aktywności pro-, jak i antyapoptotycznej; BH 1-4 – ang, Bcl-2 homology 1-4, domeny homologii w rodzinie białek Bcl-2, decydują o zdolności do dimeryzacji tych białek, ułatwiając tworzenie homo- i heterodimerów, jak również oddziaływanie z innymi białkami regulującymi apoptozę. W oparciu o występowanie domen homologii i właściwości wynikające z ich budowy, białka rodziny Bcl-2 dzieli się na 3 klasy (podrodziny): I (podrodzina Bcl-2) – białka antyapoptotyczne (w tym białko Bcl-2), w większości zawierające domeny BH 1-4; II (podrodzina Bax) – białka proapoptotyczne pozbawione domeny BH4, bądź zawierające pewne jej motywy (w tym białka Bax, Bak); III (podrodzina BH3) – białka proapoptotyczne zawierajace jedyną domenę homologii BH3 (w tym białka Bad, Bid); Bid – ang. the BH3 interacting-domain death agonist, białko rodziny Bcl-2 o aktywności proapoptotycznej, zawierające w strukturze wyłącznie domenę homologii BH3, współdziałające z białkiem Bax, ułatwia jego wbudowanie w zewnętrzną błonę mitochobdrialną; BPR – ang. benzodiazepine peripheral receptor, obwodowy receptor benzodiazepiny, element megakanałów mitochondrialnych obecny w błonie zewnętrznej mitochondrium, buduje kompleks z udziałem białka VDAC, białek enzymatycznych (kinaza kreatynowa, syntaza kardiolipiny, heksokinaza, kinaza glicerolowa, peroksydaza glutationowa 4, dehydrogeneza/izomeraza 3-beta hydroksy steroidów) i niektórych białek macierzy (cyklofilina D); CAD – ang. caspase –activated Dbase, deoksyrybonukleaza zależna od Mg2+, homolog DFF opisany w komórkach limfoidalnych myszy; CANP – ang. Ca2+-activated neutral proteinase, zależna od Ca2+ obojętna endopeptydaza, kalpaza, enzym proteolityczny uczestniczący, obok kaspaz, w apoptozie; bierze udział w degradacji białek cytoszkieletu, cytokin, enzymów szlaków sygnalizacji komórkowej, ale także w proteolitycznej aktywacji kaspaz (3, 7, 9); CPAN – ang. caspase-activated nuclease, nukleaza aktywowana przez kaspazę, endonukleaza zależna od Mg2+ aktywowana przez kaspazę 3 (patrz też CAD, DFF); DD – ang. death domain, domena śmierci; DED – ang. death effector domain, efektorowa domena śmierci; DFF – ang. defragmentation factor, czynnik defragmentacji DNA, deoksyrybonukleaza, zależna od Mg2+, odpowiedzialna za efektywną fragmentację chromatynowego DNA w komórkach apoptotycznych, dokonuje cięć DNA między nukleosomami; enzym opisany w komórkach HeLa, składa się z dwóch podjednostek – katalitycznej (DFF40/CAD = defragmentation factor 40 kDa/caspase activated DNase) i regulatorowej DFF45/ICAD = defragmentation factor 45 kDa/inhibitor of caspase activated DNase), podjednostka regulatorowa wobec podjednostki katalitycznej pełni funkcję białka opiekuńczego, zapewniającego właściwe fałdowanie, oraz jej inhibitora; prawidłowa czynność podjednostki katalitycznej DFF/CAD możliwa jest w następstwie proteolitycznej inaktywacji podjednostki regulatorowej tego enzymu, z udziałem kaspaz (lub GrB); DISC – ang. death inducing signalling complex, kompleks inicjujący apoptozę, odpowiednikiem heterokompleksu DISC w szlaku mitochondrialnym jest apoptosom; FADD – ang. Fas-associated death domain, białko adaptorowe z domeną smierci wiążące się z receptorem Fas; Fas-L – ang. Fas-ligand, ligand receptora Fas; GrB – ang. granzyme B, granzym B, proteaza serynowa uczestnicząca w pseudoreceptorowym szlaku indukcji apoptozy, kierowana do uśmiercanej komórki przez limfocyty T i komórki NK, uwalniana jednocześnie z poryną, która umożliwia wnikanie enzymu; w komórce docelowej granzym B, podobnie do kaspaz, dokonuje cięć substratów między resztą kwasu asparaginianowego i resztą kolejnego aminokwasu, przez co może uruchamiać kaskadę kaspaz, inaktywować podjednostkę regulatorową (inhibitorową) jądrowej endonukleazy DFF (DFF45/ICAD), czy dokonywać proteolitycznego cięcia białka Bid, z utworzeniem jego aktywnej pochodnej tBid; Kaspazy – ang. caspases = cysteine-dependent aspartate-directed proteases, rodzina proteaz cysteinowych odgrywających kluczową rolę w szlakach indukowania programowanej śmierci komórki (ale także w regulacji dojrzewania wielu komórek, w tym erytrocytów i mioblastów, czy rozwoju stanu zapalnego); numeracja kaspaz nawiązuje do kolejności w jakiej były one opisywane, kaspazy dzieli się na 3 grupy czynnościowe: 1) aktywatory cytokin związane ze stanami zapalnymi (kaspazy-1, -4, -5, -11, -12, -13, -14), 2) inicjatory (kaspazy-2, -8, -9, -10, [-12]), 3) efektory fazy wykonawczej apoptozy (kaspazy-3, -6, -7); NS – ang. nuclear scaffold, zależna od Ca2+ peptydaza, odpowiedzialna w apoptozie za degradację lamin (białek karioszkieletu, będących głównymi składowymi blaszki jądrowej); PIGs – ang. p53 induced genes, geny których ekspresja zależna jest od białka p53, kodujące białka enzymatyczne (oksydoreduktazy), których produkty (reaktywne formy tlenu) należą do grupy czynników uruchamiających mitochondrialny szlak programowanej śmierci komórki; p53 – ang. protein 53, ale też tumor protein 53 = TP53 (u człowieka produkt genu TP53, 17p13.1), białko o masie cząsteczkowej 53 kDa szacowanej na podstawie jego izolacji w żelu poliakrylamidowym, jego rzeczywista masa, określana na podstawie zawartości reszt aminokwasowych jest nieco mniejsza (43,7 kDa); czynnik transkrypcyjny znany jako supresor nowotworowy, uczestniczący w regulacji cyklu komórkowego (strażnik genomu), w odpowiedzi na uszkodzenie DNA aktywuje białka uczestniczące w jego naprawie, jednocześnie hamując cykl komórkowy w punkcie G1/S, gdy uszkodzenie DNA nie może być naprawione, inicjuje apoptozę, pozytywnie regulując ekspresję genów kodujących białka o aktywności proapoptotycznej; PUMA – ang. the p53 upregulated modulator of apoptosis, białko rodziny Bcl-2 o aktywności proapoptotycznej, wiążąc białka tej rodziny o działaniu antyapoptotycznym (Bcl-xL, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-w, A1), przez co niezdolne są one hamować czynność białek Bax, czy Bak, uczestniczy w regulacji mitochondrialnej ścieżki indukowania apoptozy; Smac/DIABLO – ang. second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI, wtórny mitochondrialny aktywator kaspazy/białko wiążące bezpośrednio IAP o niskim pI, moitochondrialne białko proapoptotyczne uwalniane po otwarciu megakanałów do cytoplazy, gdzie wiąże i inaktywuje białkowe inhibitory kaspaz (IAPs – ang. inhibitor of apoptosis proteins); tBid – ang. truncated Bid, skrócona (aktywna) forma białka Bid; TRADD – ang. TNF-R1 associated death domain, białko adaptorowe z domeną śmierci wiążące się z receptorem TNF-R1; TRAIL – ang. TNF-related apoptosis-indicing ligand, ligand z rodziny TNF indukujący apoptozę; VDAC – ang. voltage-dependent anion channel, poryna obecna w błonie zewnętrznej mitochondrium, wchodząc w kompleksy z białkami rodziny Bcl-2 modyfikuje otwieranie megakanałów; ĆWICZENIE 7 1. Wykrywanie apoptozy w preparacie z hodowli fibroblastów. 2. Ocena stopnia zaawansowania apoptozy na podstawie obrazu po elektroforezie DNA. 3. Różnicowanie apoptozy wywołanej na drodze receptorowej i mitochondrialnej. TEST SPRAWDZAJĄCY 1 – W 8 TYGODNIU ćwiczeń i seminariów SEMINARIUM 8 SYLABUS MOLEKULARNE PODSTAWY REGULACJI PODZIAŁÓW KOMÓRKOWYCH ĆWICZENIE 8 1. 2. Mitoza w komórkach ludzkich. Mejoza w komórkach ludzkich. SEMINARIUM 9 SYLABUS Molekularne podstawy różnicowania komórek indukcja z udziałem genów aktywnych podczas rozwoju zarodkowego, rola centrum Niewkoopa i centrum Spemanna w indukcji zarodkowej, morfogeneza, rola genów regulatorowych w rozwoju kręgowców: gen Brachyury, Goosecoid, Wnt, Siamois, Shh, HOXs, PAXs, homeobox, kwas retinojowy, czynniki indukcyjne w indukcji zarodkowej: FGF, TGFβ, Vg1, aktywiny, β-katenina, Noggin, BMPs, chordyna, folistatyna, morfogeneza, adhezja międzykomórkowa, kadheryny, rola cząsteczek adhezji w morfogenezie, podział komórek macierzystych ze względu na zdolność do różnicowania i pochodzenie (zarodkowe, płodowe, somatyczne), markery powierzchniowe charakterystyczne dla macierzystych komórek zarodkowych: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, CD324 (E-kadheryna), CD90 (Thy-1), CD117 (c-kit), CD326, CD29 (beta1 integryna), CD24 (HASheat stable antygen), CD59, CD133, CD31, CD49f integryna alpha 6), TRA-1-60, TRA-1-81, markery komórek mezenchymalnych macierzystych: CD73, CD105, CD90 markery komórek hematopoetycznych macierzystych: CD34, CD133, CXCR4, CD45 czynniki wpływające na różnicowanie komórek macierzystych: EGF (czynnik wzrostu naskórkowy), bFGF (czynnik wzrostu fibroblastów), kwas retinowy, białka morfogenetyczne kości: BMP-2, BMP-4, BMP-6, NGF (czynnik wzrostu nerwów), HGF (czynnik wzrostu hepatocytów), interleukiny 2, 5, 7, G-CSF (czynnik pobudzający kolonie granulocytów), M-CSF (czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów), TPO (Trombopoetyna), EPO (Erytropoetyna), SCF (czynnik wzrostu komórek macierzystych) ĆWICZENIE 9 1. Preparaty komórek macierzystych różnicowanych do osteoblastów i adipocytów. SEMINARIUM 10 SYLABUS Molekularne podstawy różnicowania tkanek Molekularne podłoże determinacji płci – płeć genetyczna, płeć somatyczna, płeć heterogametyczna, płeć homogenetyczna, mechanizmy sygnałów indukujących płeć, płeć nadrzędna, pleć podstawowa, mechanizm kompensacyjny Molekularne podłoże determinacji płci u D. melanogaster – sex-lethal (sxl), sis-a, sis-b, maleless, male specific lethal (msl), double sex (dsx), tra, stosunek X:A, determinacja płci somatycznej, intersex, gynandromorfy, kaskada sygnału wywołującego alternatywne składanie mRNA Molekularne podłoże determinacji płci u ssaków – budowa chromosomu Y, region PAR, gen SRY, czynnik TDF, przewody Mullera, przewody Wolffa, AMH (MIH), lyonizacja, ciałko Barra – czynnik Xist, Wt1, Sf1, Sox9, Dax1, Wrx4, R-spondyna 1, Wnt4, beta katenina, BMP-2, FST (folistatyna) Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu ruchu (szkieletowego i mięśniowego) – somit, sklerotom (kadheryny N, Delta/Notch, neksus, SHH, PAX-3, PAX-1, PAX-9, tenascyna, kolagen IV); wyrostek ościsty (SHH, BMP-4, msx-1, msx-2) molekularne podłoże chrzęstnienia (SHH, IHH, PAX-1,GDF,Runx2, aktywina, Scleraxis, kolagen II) i kostnienia (Runx2, Osx, beta katenina), chondroblasty, chondrocyty, osteoblasty, osteoklasty (Rank, Rankl , osteoprotegeryna), osteocyty; Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu ruchu (szkieletowego i mięśniowego) – dermatomiotom (BMP-4, BMP-7, Wnt-11), miotom, myoD, myf5, miogenina, mrf-4(myf-6); mięśnie kończyn (PAX-3, PAX-7, lbx-1, msx-1, EphA-4, c-met), Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu moczowo-płciowego – grzebień moczo-płciowy, sznury nerko twórcze, sznury płciowe, WT1, GDNF, HGF, RET, MET, FGF2, BMP7, WNT9B, EMX-2, PAX2, SIM-1, GATA4, LHX9, WNT4, SRY, SOX9, AMH, FGF9, SF1, DAX1, DHH, TDF Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania komórek i tkanek układu nerwowego – płytka nerwowa (BMP4, BMP7, folistatyna, noggin, chordyna, WNT1, SHH, PAX3,PAX7, OTX2, GBX2), różnicowanie neuronów (nestyna, MASH-1, MAP-2, NKX2.2, NKX6.1, GLI2, dorsalina, GLI3), pęcherzyki mózgowe, rombomery (HOX, kw. retinowy, WNT, KROX20, GBX2, KREISTLER, EPHRIN, LIM1, EMX1, EMX2, FOXG1, EN1, EN2, WNT1) Molekularne mechanizmy regulacji różnicowania i tkanek układu sercowo-naczyniowego – wyspy krwiotwórcze, waskulogeneza (notch, COUP-TFII, EGFL7), angiogeneza (VEGF, PFGF, angiopoetyna, TIE1, TIE2, efryna), pole sercotwórcze (BMP2/4, FGF8, NKX2, GATA4, VMHC1, ANF, TLL1, TBX5, XIN, BMP5, nodal, Lefty2, HAND1, HAND2) ĆWICZENIE 10 ĆWICZENIE 10 1. Prezentacje tematów przez studentów. SEMINARIUM 11 SYLABUS Molekularna organizacja informacji genetycznej: Genom człowieka. Genom, genom jądrowy, genom mitochondrialny, proteom, transkryptom. Sekwencje w genomie człowieka: sekwencje kodujące, sekwencje niekodujące, sekwencje powtarzające się: tandemowe (satelitarne, minisatelitarne, mikrosatelitarne) i rozproszone (SINE, LINE), VNTR. RNA komórki: hnRNArna, snoRNA, miRNA, siRNA. Poziomy organizacji chromatyny: nukleosom, solenoid (włókno 30nm), supersolenoid, zwinięta spirala, chromatyda, chromosom metafazowy. Budowa chromosomu metafazowego, kinetochory, białka CENP-A. Cytogenetyka. Cytogenetyka klasyczna – prążkowanie – prążki: G, HRT, R, Q, C, AgNOR). Cytogenetyka molekularna - ISH, FISH, odmiany metody FISH: fiber FISH, SKY-FISH, M-FISH, porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH), mikromacierze CGH), cytometria przepływowa. Przygotowanie kariogramu; fitohemaglutynina, kolchicyna, transformacja blastyczna, kariotyp, kariogram, idiogram. Lyonizacja, ciałko Barra, pałeczka Dobosza. ĆWICZENIE 11 1. 2. Wykrywanie typów chromatyny w komórkach interfazowych. Wykrywanie płytek metafazowych w komórkach człowieka. SEMINARIUM 12 SYLABUS Wprowadzenie do wybranych zagadnień z biotechnologii. 1. Rekombinowanie i klonowanie DNA, analiza i zastosowanie klonowanego DNA. Enzymy restrykcyjne Typy wektorów: plazmidy, bakteriofagi, kosmidy, wektory stosowane w komórkach eukariotycznych Ogólne zasady stosowania wektorów: przygotowanie wektora, wbudowanie wektora do komórek gospodarza, dobór gospodarza, w którym zachodzi klonowanie genu Zastosowanie klonowanego DNA w medycynie 2. Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR). Ogólna zasada metody, etapy, zastosowanie w medycynie Rodzaje PCR: RT-PCR (reverse transcriptase PCR), PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR), Multiplex PCR, RFLP PCR, Gniazdowy PCR, zagnieżdżony PCR (nested PCR) 3. Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych. Metoda Sangera Metoda Maxama-Gilberta Pirosekwencjonowanie 4. Metody wykrywania mutacji. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) ASO (Allele Specific Oligonucleotide hybridization) Heterodupleksy: HA (lub HET = Heteroduplex Analysis, CMC = Chemical Mismatch Cleavage) DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Mikromacierze DNA ( oligonukleotydowe, cDNA) Southern Blot (Southern Blotting) Western Blot (Western Blotting) Northern Blot (Northern Blotting) 5. GMO – metody, wykorzystanie w medycynie, transgeniczne rośliny. Metody uzyskiwania roślin transgenicznych Przykłady wykorzystania roślin transgenicznych w medycynie 6. GMO – metody, wykorzystanie w medycynie, transgeniczne zwierzęta. Metody uzyskiwania zwierząt transgenicznych Przykłady wykorzystania zwierząt transgenicznych w medycynie 7. Cytometria przepływowa i jej zastosowanie w badaniach, medycynie i diagnostyce. Budowa i zasada działania cytometru Zastosowanie cytometru w badaniach, medycynie i diagnostyce 8. Medycyna regeneracyjna. Zastosowanie komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej Zastosowanie materiałów polimerowych w medycynie regeneracyjnej ĆWICZENIE 12 1. Prezentacje tematów przez studentów. SEMINARIUM 13 SYLABUS MOLEKULARNE PODŁOŻE KOMUNIKACJI MIĘDZYKOMÓRKOWEJ 1. Sposoby przekazywania sygnału między komórkami: Poziomy sygnalizacji komórkowej (autokrynia, jukstakrynia, parakrynia, endokrynia), pojęcia: ligand, receptor, szlak sygnalizacyjny, kaskady sygnalizacyjne, wtórne przekaźniki (ang. second messengers); Sygnalizacja z udziałem jonów Ca2+; Połączenia międzykomórkowe i ich rola w przekazywaniu informacji; Międzykomórkowe połączenia komunikacyjne typu neksus (szczelinowe, ang. gap junctions). Rola koneksonów. 2. Transport substancji przez błony komórkowe Ogólne zasady transportu błonowego, transport aktywny i bierny; Nośniki, pompy – budowa, funkcje, przykłady; Kanały jonowe – typy, budowa, funkcje, przykłady; potencjał błonowy. 3. Receptory komórkowe Główny podział receptorów: receptory cytoplazmatyczne, receptory błonowe; Receptory błonowe (jonotropowe, metabotropowe – współpracujące z białkami G, receptory o właściwościach enzymatycznych); Receptory wewnątrzkomórkowe (InsP3R, pojęcie przekaźnika wtórnego); Receptory jądrowe (członowy charakter budowy, znane ligandy, podstawowe klasy receptorów jądrowych). Dla mocno zainteresowanych tematem poleca się odwiedzić stronę NucleaRDB http://www.receptors.org/nucleardb/ 4. Adhezja komórek Połączenia międzykomórkowe: zamykające (ścisłe), zwierające (przylegania), desmosomy, hemidesmosomy, komunikacyjne typu neksus (szczelinowe); Cząsteczki związane z adhezją: kadheryny, kateniny, desmoplakiny, integryny, CAM (np. N-CAM, ICAM), selektyny, klaudyny, koneksyny Rola cytoszkieletu i jonów wapnia w adhezji komórek Adhezja a nowotwory 5. Oddziaływanie komórek z macierzą zewnątrzkomórkową Struktura i funkcja składników macierzy zewnątrzkomórkowej (proteoglikany, laminina, fibronektyna, kolageny. Enzymy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs, TIMPs) Oddziaływanie komórek z macierzą zewnątrzkomórkową ĆWICZENIE 13 1. Prezentacje tematów przez studentów. TEST SPRAWDZAJĄCY 2 – W 14 TYGODNIU ćwiczeń i seminariów SEMINARIUM 14 SYLABUS SYGNALIZACJA WEWNATRZKOMÓRKOWA, SZLAKI PRZEKAZYWANIA SYGNAŁÓW 1. Kaskada sygnalizacyjna z udziałem receptora błonowego. Zapoczątkowanie sygnału (ligandy receptorów błony komórkowej – hormony peptydowe, czynniki wzrostu, neurotransmitery, tlenek azotu; Receptory powierzchniowe komórki (receptory oddziałujące z białkami G – w tym molekularny mechanizm działania heterotrimerycznych białek G, receptory o aktywności kinazy fosforylującej białka na resztach tyrozynowych, receptory o aktywności fosfatazy białkowej); Sygnałowe enzymy efektorowe (kinazy i fosfatazy cytoplazmatyczne, cyklazy nukleotydowe, fosfodiesterazy, fosfolipazy); Nieenzymatyczne cytoplazmatyczne przekaźniki wtórne (produkty hydrolizy PIP2 [diacyloglicerol, który aktywuje PKC i IP3, który moblilizuje Ca2+], cykliczne nukleotydy [cAMP, cGMP], Ca2+ - jego udział w aktywacji białek enzymatycznych, w tym rola kalmoduliny); Jądrowe transaktywatory. 2. Przekazywanie sygnału przez receptor cytoplazmatyczny. Hormony steroidowe – wprowadzenie, budowa i znaczenie fizjologiczne; Receptory hormonów steroidowych – czynniki transkrypcji zależne od liganda, budowa domenowa (domena wiążąca hormon, w jej obrebie zwykle poddomeny odpowiadające za późniejsze zdarzenia metaboliczne – patrz niżej, domena wiążąca DNA – palc cynkowy, domena dominująca); Receptory nietransformowane w cytoplazmatycznym kompleksie z Hsp90; Zmiany strukturalne receptora indukowane ligandem (związaniem hormonu steroidowego) transformacja; Sekwencja zdarzeń molekularnych wyzwalana aktywacją receptora, przemieszczanie przekształconego receptora do jądra komórkowego (dysocjacja Hsp90, dimeryzacja, translokacja do jądra); Wiązanie receptora z DNA, transaktywacja ekspresji genu swoista dla hormonu. 3. Ścieżka sygnalizacyjna TGFβ. Ligandy nadrodziny TGF uczestniczące w uruchamianiu ścieżki sygnalizacyjnej TGFβ (BMPs, GDFs, AMH, aktywiny – aktywina A, aktywina B, aktywina AB, Nodal, TGFβ s,; BMPR I i II = TGFβ receptor I i II; Rekrutacja receptora i jego fosforylacja; Fosforylacja SMADs (SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD9=SMAD8), funkcjonalne znaczenie białek SARA i HGS; Wiązanie coSMAD (SMAD4); Udział fosforylowanego kompleksu RSMAD/coSMAD w regulacji transkrypcji genów; Mechanizmy regulacji ścieżki sygnalizacyjnej TGFβ. 4. Ścieżka sygnalizacyjna WNT. Białka sygnalizacyjne Wnt i ich funkcjonalne znaczenie; Kanoniczna ścieżka sygnalizacyjna Wnt, mechanizm (ligandy Wnt, receptory rodziny Frizzled, białka rodziny Dishevelled, Lrp, Aksyna, β-katenina, Apc, Gsk3, Ck1; Modyfikatory kanonicznej ścieżki sygnalizacyjnej Wnt (Cerberus); Niekanoniczne ścieżki sygnalizacyjne Wnt (ścieżki PCP i Wnt/Ca2+); Udział ścieżki sygnalizacyjnej Wnt w regulacji rozwoju zarodkowego i patogenezie wybranych schorzeń nowotworowych. 5. Ścieżka sygnalizacyjna HH (Hedgehog) Ścieżka sygnalizacyjna shh u Drosophila melanogaster, mechanizm i znaczenie; ścieżka sygnalizacyjna Shh u zwierząt kręgowych, mechanizm (homologi Shh/SHH, SHH-N, SHH-C, PTCH1, PTCH2, SMO, GLIs); Czynnościowe znaczenie ścieżek sygnalizacyjnych SHH; Zaburzenia ścieżki sygnalizacyjnej SHH w molekularnym mechanizmie patogenetycznym chorób człowieka. ĆWICZENIE 14 1. Prezentacje tematów przez studentów. WYKAZ ZALECANYCH PODRĘCZNIKÓW: 1. Podstawy biologii komórki. B. Alberts, Wyd. Naukowe PWN, 2005 i następne. 2. Cytobiochemia. Biochemia niektórych struktur komórkowych. Kłyszejko-Stefanowicz L., PWN, Warszawa, 2002. 3. Podstawy genetyki dla studentów i lekarzy (G. Drewa i T. Ferenc, red.) Elsevier Urban & Partner 2007 i następne. 4. Genetyka molekularna (P. Węgleński, red.). PWN, Warszawa 2006 lub nowsze. Piśmiennictwo uzupełniające będące podstawą przygotowania prezentacji przez studentów: 5. Epstein, R. J.: Biologia molekularna człowieka. Molekularne podłoże zjawisk w stanie zdrowia i w przebiegu chorób. Wydawnictwo Czelej, Lublin 2005 6. Genomy. Brown T.A. (P. Węgleński, red.) Wyd. Naukowe PWN, 2009 i następne. 7. Zarys organogenezy. Różnicowanie się komórek w narządach. Z. Bielańska-Osuchowska. 2004 PWN i następne. 8. Embriologia człowieka. Ostrowski K.: PZWL, Warszawa 1988 i następne. 9. Embriologia, podręcznik dla studentów; Hieronim Bartel; wyd.: Warszawa; PZWL; 2002 i następne. 10. Biologia rozwoju. Le Moigne A., PWN, Warszawa 1999 lub Twyman R.M: Biologia rozwoju, 2003 PWN i następne.
