Temat 57 Pomiar widma absorpcji i oznaczania stężenia ryboflawiny

Temat 57 Pomiar widma absorpcji i oznaczania stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą
spektrofotometru.doc
(128 KB) Pobierz
WYDZIAŁ BIOINŻYNIERII ZWIERZĄT
ZOOTECHNIKA
Temat 57:
POMIAR WIDMA ABSORPCJI I OZNACZANIE STĘŻENIE RYBOFAWINY W
ROZTWORACH WODNYCH ZA POMOCĄ SPEKTROFOTOMETRU
Oddziaływanie światła z materią obejmuje szeroki wachlarz zjawisk zachodzących zarówno w
organizmach żywych, jak i w substancji nieożywionej. W organizmach żywych z oddziaływaniem tym jest
związane wiele istotnych dla organizmu procesów z zakresu fizjologii roślin, zwierząt i człowieka oraz
fotobiofizyki.
Procesy oddziaływania światła z substancją mają bardzo zróżnicowany charakter, zachodzą
według różnych mechanizmów i prowadzą do różnych efektów końcowych. Ta różnorodność pozwala
wykorzystać światło zarówno jako źródło energii i synsybilizator procesów biologicznych, jak i w celach
analitycznych do badania substancji na poziomie molekularnym. W pierwszym przypadku aktualnym
zagadnieniem o randze światowej jest na przykład wykorzystanie energii słonecznej do produkcji biomasy,
szeroko omawiane w monografiach z zakresu współczesnej biotechnologii. Nie można również pominąć
różnego rodzaju reakcji fotochemicznych i fotobio-chemicznych, które są istotne w hodowli roślin i zwierząt
oraz w przetwórstwie i przechowalnictwie.
Druga grupa zagadnień to penetracja substancji na poziomie molekularnym za pomocą światła, co
pozwala śledzić reakcje biochemiczne, łącznie z przebiegającymi bardzo szybko, w nano- i
femtosekundach, oraz badać strukturę i skład chemiczny tych substancji. Służą do tego różnorodne tzw.
optyczne metody badania substancji.
Rozpatrzmy od podstaw zjawiska towarzyszące oddziaływaniu światła z substancją, ze szczególnym
uwzględnieniem procesów i mechanizmów fotofizycznych. Światło, czyli promieniowanie optyczne, w
spektroskopii jest to przedział długości fal elektromagnetycznych widzialnych (Vis) oraz podczerwień (IR) i
ultrafiolet (UV). Przez światło często rozumie się tę część promieniowania elektromagnetycznego, którą
rejestruje nasze oko, czyli promieniowanie optyczne widzialne - Vis (patrz Optyka. Wstęp do ćwiczeń). W
niniejszym rozdziale pojęcie światło będzie używane zgodnie z pierwszym określeniem.
Oddziaływanie światła z substancją obserwuje się zazwyczaj jako zjawiska załamania, odbicia,
rozpraszania i pochłaniania. Informacji o przebiegu tych zjawisk dostarcza pomiar natężenia światła.
Światło ulega na ogół osłabieniu podczas przejścia przez substancję. Jeżeli wiązka światła o
natężeniu I0 pada na substancję, to część energii może ulec odbiciu (natężenie I1), rozproszeniu
(natężenie I2) i absorpcji (I3), pozostała zaś ilość energii przechodzi (natężenie I)
Zjawiska odbicia, rozpraszania i absorpcji występują zazwyczaj jednocześnie. Jeżeli jednak w
trakcie pomiarów używa się właściwy rozpuszczalnik i zastosuje odpowiednią technikę pomiarową, to (I1 +
I2) << I3 i możemy mówić, że zachodzi tylko zjawisko absorpcji światła.
Natężenie światła przechodzącego przez substancję absorbującą zależy od ilości
centrów absorbujących. Zmiana natężenia światła (-dl) podczas przejścia przez warstwę o dowolnie małej
grubości dl w roztworze, w którym stężenie molowe substancji pochłaniającej wynosi c (rys. 6.9), wyraża
się wzorem:
gdzie:
μ — współczynnik absorpcji.
Stąd względne osłabienie światła przechodzącego można zapisać wzorem:
Aby obliczyć natężenie / światła po przejściu przez kuwetę, należy dodać wszystkie przyczynki do
osłabienia wiązki wzdłuż drogi I, czyli scałkować powyższe równanie.
stąd:
Jest to prawo Lamberta-Beera, które mówi, że natężenie światła przechodzącego przez roztwór substancji
absorbującej zależy od natężenia światła padającego (I0), stężenia roztworu (c) i grubości warstwy (l) oraz
od współczynnika absorpcji substancji rozpuszczonej (μ). Współczynnik sorpcji jest wielkością
charakteryzującą właściwości absorpcyjne sorpcji. Współczynnik absorpcji jest funkcją długości fali (a więc
również funkcją częstotliwości) światła pochłanianego.
Prostszy zapis matematyczny prawa absorpcji otrzymuje się po rytmowaniu wzoru
czyli:
Wprowadzając oznaczenia:
(absorbancja)
oraz
(molowy współczynnik absorpcji)
należy zapisać:
W spektroskopii wielkość fizyczna zdefiniowana wzorem nazwę absorbancji (A), ekstynkcji (E) lub
gęstości optycznej (D). W dostępnych podręcznikach i monografiach używa się zarówno symbolu A jak i
E. Stosunek natężeń wiązek świetlnych można łatwo zmierzyć, dlatego absorbancja jest podstawową
wielkością optyczną, którą wyznacza się doświadczalnie. Molowy współczynnik absorpcji (ε) ma taki sam
sens fizyczny współczynnik absorpcji (μ). Współczynnik absorpcji ε liczbowo jest równy absorbancji
warstwy roztworu o jednostkowej grubości i jednostkowym stężeniu.
Inną wielkością używaną w spektroskopii jest transmitancja T, wyrażona w %.
Związek między transmitancja a absorbancja jest następujący:
Substancje w różny sposób absorbują światło o różnej częstotliwość dlatego współczynnik
ekstynkcji ε jest funkcją częstotliwości v lub, długości fali λ:
gdzie:
c - prędkość światła.
Zależność współczynnika absorpcji (ε) od długości fali lub częstotliwości nazywa się
widmem absorpcji. Widmo absorpcji jest charakterystyczne dla danej substancji w danych warunkach
fizykochemicznych.
Podany uprzednio związek między absorbancją (A) i molowym współczynnikiem absorpcji (e):
jest znany jako prawa Bouguera-Lamberta-Beera.
Widmo absorpcji substancji zależy od struktury cząsteczek tej substancji. Za pochłanianie fal
optycznych w zakresie widzialnym i ultrafiolecie są odpowiedzialne głównie elektrony walencyjne, czyli tzw.
elektrony n i a. Widma te w spektroskopii nazywa się widmami elektronowymi.
Aby zrozumieć mechanizm pochłaniania światła przez substancję należy prześledzić zjawisko na
poziomie molekularnym z punktu widzenia teorii kwantowej. W spektroskopii molekularnej, oprócz czterech
liczb kwantowych (n, l, m, s), wprowadza się nową liczbę kwantową λ — opisującą elektron w cząsteczce.
Weźmy pod uwagę cząsteczkę dwuatomową. W takiej cząsteczce wektor całkowitego momentu pędu
elektronu walencyjnego może ustawić się pod różnymi kątami do prostej łączącej jądra atomów. Rzut
momentu pędu na tę prostą jest skwantowany zgodnie z zasadami i mechaniki kwantowej. Wynikająca z
tego kwantowania liczba kwantowa λ może przybierać wartości 0, 1, 2... Jeżeli stan elektronu jest opisany
liczbą kwantową λ = 0, nazywa się go elektronem σ, dla λ = 1 mamy elektron π.
Aby wyjaśnić charakter absorpcyjnych widm elektronowych i ich związek ze strukturą cząsteczki
należy wziąć pod uwagę dozwolone stany energetyczne cząsteczki i rozpatrzyć zmiany energii cząsteczki,
jakie mogą zachodzić pod wpływem energii dostarczonej z zewnątrz. Pod wpływem kwantów świetlnych
ulega zmianie energia elektronów π i σ (Ee) cząstki, energia oscylacji (E ) atomów w cząsteczce i energia
rotacji cząsteczki bądź grup atomów w cząsteczce (E ). Energie te są skwantowane, czyli mogą
przyjmować tylko ściśle określone wartości. Zbiór tych wartości można przedstawić na schemacie w postaci
poziomów energetycznych cząsteczki.
osc
rot
Przedstawiony na rysunku schemat dozwolonych stanów energetycznych dotyczy hipotetycznej
cząsteczki, jednak dla cząsteczek wielotomowych licznych substancji charakter schematu pozostaje
podobny.
Na rysunku poniżej wprowadzono następujące oznaczenia:
0, 1', 2', 3'... dozwolone wartości energii rotacyjnej - poziomy rotacyjne,
0, 1, 2, 3 ...
dozwolone wartości energii oscylacyjnej - poziomy oscylacyjne,
A - podstawowy poziom elektronowy, który odpowiada stanowi stacjonarnemu elektronów w cząsteczce,
B - pierwszy wzbudzony stan elektronowy,
C - drugi wzbudzony stan elektronowy.
Dalsze dozwolone stany elektronowe, o wyższej energii można zaznaczyć na schemacie jako
wyższe poziomy energetyczne D, E i itd. Podobnie liczba poziomów oscylacyjnych i rotacyjnych jest na
schemacie ograniczona do kilku ze względów graficznych.
Najniższej wartości energii elektronów odpowiada poziom Eo, czyli elektronowy poziom
podstawowy. Charakteryzuje on energię elektronów cząsteczki w stanie stacjonarnym. Poziomy Bv E2 i
dalsze charakteryzują energię, jaką ma cząsteczka po pochłonięciu kwantu energii, czyli cząsteczka w tzw.
stanie wzbudzonym. Zmiany energii cząsteczki przedstawia się na schemacie jako przejścia między
dozwolonymi stanami energetycznymi. Jeżeli np. cząsteczka pochłonęła kwant hv, tzn. jej energia E = E
+hv, to przechodzi ona z poziomu podstawowego £ 0 do poziomu wzbudzonego E , co na schemacie
zaznaczono strzałką a.
1
1
0
Doświadczalnie stwierdzono, że podczas pochłaniania światła przez cząsteczki zachodzą zmiany
energii elektronów, energii oscylacji i rotacji. Zmiany energii rotacji są mniejsze od zmian energii oscylacji,
a te ostatnie mniejsze od zmian energii elektronów.
Na schemacie dozwolonych stanów energetycznych cząsteczki zaznaczono to w ten sposób, że
każdemu poziomowi elektronowemu towarzyszy układ poziomów oscylacyjnych, między którymi znajdują
się poziomy rotacyjne. Cząsteczki w stanie stacjonarnym znajdują się na najniższym poziomie
elektronowym i oscylacyjnym. Podczas absorpcji światła cząsteczki mogą przejść do wyższych stanów
oscylacyjnych i rotacyjnych elektronowego stanu wzbudzonego (na schemacie - strzałki 6, c, d), dlatego
podczas przejścia cząsteczek ze stanu elektronowego podstawowego do stanu wzbudzonego ulega
absorpcji nie jeden rodzaj kwantów (Unia absorpcji), lecz zbiór różnych kwantów pochłanianych w różnej
ilości przez substancję, czyli pasmo absorpcji.
Kwanty o różnej częstotliwości są pochłanianie z różnym prawdopodobieństwem, czyli w różnej ilości.
Prawdopodobieństwo pochłaniania światła o określonej długości fali, czyli kwantów o określonej
częstotliwości jest charakterystyczne dla cząsteczek danej substancji w danych warunkach
fizykochemicznych.
Przedstawiony na rysunku schemat informuje o wielkości pochłanianych kwantów, czyli długości fal
pochłanianych przez cząsteczki, a więc określa położenie pasm absorpcji w skali długości fal. Schemat ten
nie podaje informacji dotyczących liczby pochłanianych kwantów, a tym samym wartości absorbancji
światła pochłanianego o danej długości fali. Te wartości są bowiem określone przez podanie
prawdopodobieństwa przejścia między dozwolonymi stanami cząsteczki, co można policzyć odpowiednimi
metodami.
Widmo absorpcji związków organicznych w roztworach składa się zazwyczaj z kilku pasm w zakresie
fal widzialnych (Vis) i ultrafioletowych (UV). Każde pasmo odpowiada przejściu między elektronowym
poziomem podstawowym a jednym z poziomów elektronowych wzbudzonych. Na przykład, najbardziej
długofalowe pasmo absorpcji danej substancji (pasmo I) odpowiada przejściu cząsteczek z elektronowego
stanu podstawowego E do pierwszego stanu wzbudzonego E . Następne pasma, bardziej krótkofalowe, to
przejścia do stanów E , E itd.
0
2
1
3
E →E
1
I pasmo absorpcji
E →E
2
II pasmo absorpcji
E →E
3
III pasmo absorpcji
0
0
0
Na wykresie
lub
każde pasmo jest przedstawione za pomocą krzywej o kształcie
zbliżonym do krzywej Gaussa. Wielkością charakteryzującą pasmo absorpcji jest długość fali A
max
odpowiadająca maksymalnej wartości współczynnika absorpcji danego pasma. Wartość
określa
położenie pasm absorpcji w skali długości fal, charakterystyczne dla danej substancji. Na rysunku 1
przykładowo przedstawiono widmo absorpcji witaminy B , a na rysunku 2 widmo absorpcji chlorofilu.
max
2
Rys. 1
...
Plik z chomika:
lejdii
Inne pliki z tego folderu:

Temat 57 Pomiar widma absorpcji i oznaczania stężenia ryboflawiny w roztworach
wodnych za pomocą spektrofotometru.doc (128 KB)
 Pomiar widma absorpcji stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą
spektrofotometru.doc (64 KB)
Inne foldery tego chomika:


 Anatomia
Genetyka zwierząt
 Hodowla koni
 Pszczelarstwo
Zioła i rośliny lecznicze
Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl