Biofizyka II
advertisement
Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań Biofizyka II przedmiot obieralny Materiały pomocnicze do wykładów prof. dr hab. inż. Jan Mazerski 4. OPTYCZNE METODY BADANIA ODDZIAŁYWAŃ Efekt oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią zależy od energii kwantu tego promieniowania. Energia pojedynczego kwantu promieniowanie γ i X wynosi powyżej 10 eV, a tym samym przekracza energię jonizacji wiekszosci substancji organicznych. Dlatego promieniowanie takie wywołuje w układach biologicznych występowanie procesu jonizacji. Kwant światło z obszaru widzialnego i bliskiego nadfioletu ma za mało energii, ok. 1 ev, aby całkowicie oderwać elektron od cząsteczki. Ma go jednak dostatecznie dużo, aby przenieść elektron na wyższy poziom energetyczny. Energia niezbędna do wzbudzenia elektronowego zależy od budowy chemicznej cząsteczki. Z reguły wzbudzeniu ulegają tylko niektóre fragmenty cząsteczki zwane chromoforami. Typowe wzbudzenia elektronowe w związkach organicznych dotyczą przejść π→π* lub n→π. Promieniowanie podczerwone ma jeszcze niższą energię pojedynczego kwantu, ok. 0,1 eV. Energia ta wystarcza jedynie do przeniesienia cząsteczki na wyższy poziom oscylacyjny bez wywołania wzbudzenia elektronowego. Energia wzbudzenia oscylacyjnego zależy od rodzaju atomów tworzących wiązanie oraz od siły wiązania. Najłatwiej ulegają wzbudzeniu wiązania, w których jednym z partnerów jest atom wodoru. Ostatnim rodzajem promieniowania zdolnym do wzbudzenia cząsteczek jest promieniowanie mikrofalowe. Pojedynczy kwant tego promieniowania ma energię rzędu 0,01 eV i jest w stanie przenieść małe cząsteczki organiczne lub nieorganiczne na wyższy poziom rotacyjny. Warto przy tym pamiętać, że zmiana poziomu energetycznego cząsteczki związana jest z absorpcją lub emisją kwantu o energii dokładnie równej różnicy poziomów energetycznych całej cząsteczki. Energię cząsteczki można z rozsądnym przybliżeniem traktować jako sumę energii: stanów elektronowych, Eel, stanów oscylacyjnych, Eos, i stanów rotacyjnych, Erot. 1 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań W temperaturze pokojowej cząsteczki znajdują się w podstawowym stanie elektronowym i oscylacyjnym oraz na jednym ze wzbudzonych stanów rotacyjnych. Wzbudzenie elektronowe związane może być ze wzbudzeniem oscylacyjnym i rotacyjnym, a wzbudzenie oscylacyjne ze wzbudzeniem rotacyjnym. Dlatego nie można uzyskać czystego widma elektronowego lub oscylacyjnego. 4.1 Widma elektronowe Prawdopodobieństwo wystąpienia absorpcji lub emisji światła związanego ze zmianą stanu elektronowego cząsteczki zależne jest od wartości tak zwanego momentu przejścia, Mmn: M mn = ∫ ψ*m Mψ n dV gdzie: ψn – cząsteczkowa funkcja falowa stanu podstawowego, ψ*m – cząsteczkowa funkcja falowa stanu wzbudzonego, M – moment dipolowy cząsteczki. Przejście elektronowe jest tym bardziej prawdopodobne, im większy jest moment przejścia. Gdy Mmn = 0 mamy do czynienia z tzw. przejściami wzbronionymi. Wzbronione są np. przejścia związane ze zmianą multipletowości stanu (synglet → tryplet lub odwrotnie). Jednakże w skomplikowanych cząsteczkach organicznych przejścia wzbronione mają niezerowe prawdopodobieństwo wystąpienia. Wynikać to może z powodu występowania: sprzężenia spinu elektronów z ich orbitalnym momentem pędu (tzw. sprzężeń spin – orbita), kwadrupolowego momentu dipolowego, lub magnetycznego momentu dipolowego. Zawsze jednak prawdopodobieństwo przejść wzbronionych jest mniejsze niż przejść dozwolonych, czasami nawet o rzędy wielkości. 4.1.1 Diagram Francka-Condona Wygodnym narzędziem pozwalającym na analizę widm elektronowych jest tak zwany diagram Francka-Condona. Pozwala on zrozumieć położenie pasm zarówno w widmach absorpcyjnych jak i emisyjnych (fluorescencja). Oś pionowa diagramu repreze ntuje energię, a oś pozioma odległość atomów tworzących chromofor. Linie krzywe na diagramie przedstawiają przebieg zmian całkowitej energii cząsteczki w funkcji odległości odpowiednio dla podstawowego stanu elektronowego(niebieska linia na rysunku poniżej) oraz najbliższego elektronowego stanu wzbudzonego (linia czerwona). Dla każdego ze stanów elektronowych zaznacza się ponadto jego poziomy oscylacyjne (cienkie linie poziome w obrębie studni energii). Wzbudzenie elektronowe zachodzi tak szybko, że pozycja jąder nie zdąży ulec zmianie. Na diagramie odpowiada to tzw. przejściu pionowemu. Przejście elektronowe 2 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań zachodzi najczęściej ze stanu najbardziej prawdopodobnego, czyli środka najniższego poziomu oscylacyjnego. Istnieje jednak niezerowe prawdopodobieństwo przejścia również z któregoś ze wzbudzonych stanów oscylacyjnych. Dla stanów takich najbardziej prawdopodobne jest występowanie układu w tzw. punktach zwrotnych, czyli z krańców poziomów oscylacyjnych. Rozważmy np. absorpcję kwantu z podstawowego stanu oscylacyjnego (szara strzałka pionowa na wykresie powyżej). Ponieważ krzywe energii są przesunięte względem siebie, więc przejście pionowe z najbardziej prawdopodobnego stanu podstawowego kończy się zarówno na stanie wzbudzonym elektronowo jak i oscylacyjnie. Analogicznie, emisja światła z najbardziej prawdopodobnego elektronowego stanu podstawowego (zielona strzałka) kończy się na podstawowym stanie elektronowym, ale wzbudzonym stanie oscylacyjnym. Z powyższych rozważań wynika, że: struktura oscylacyjna widma absorpcyjnego dostarcza informacji o poziomach oscylacyjnych stanu wzbudzonego, a struktura oscylacyjna widma emisyjnego o poziomach oscylacyjnych stanu podstawowego. 4.1.2 Elektronowe widmo absorpcyjne Absorpcję promieniowania elektromagnetycznego w zakresie widzialnym i bliskim nadfiolecie opisuje prawo Lamberta-Beera: I = I 0e −ε (λ )cd gdzie: I i I0 to odpowiednio natężenie po i przed próbką c – stężenie molowe substancji absorbującej d – grubość warstwy roztworu ε(λ) – molowy współczynnik ekstynkcji 3 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań W codziennym użyciu wygodniejsza jest logarytmiczna postać tego prawa: A = ln I0 = ε(λ )cd I będąca jednocześnie definicja wielkości zwanej absorbancją. Molowy współczynnik ekstynkcji Molowy współczynnik ekstynkcji jest funkcją długości fali, a jego wielkość zależy od: rodzaju przejścia elektronowego budowy chemicznej związku lokalnego otoczenia chromoforu Pojedyncze pasmo absorpcyjne opisujemy zgrubnie podając ekstynkcje molową w maksimum pasma, ε(λmax). Jej wartość zależy przede wszystkim od rodzaju przejścia elektronowego: silne pasma dozwolone (duża zmiana momentu dipolowego) ε(λmax) > 104 słabe pasmo dozwolone ε(λmax) ≈ 103 pasmo zabronione ε(λmax) < 100 Lokalne otoczenie chromoforu W badaniach biofizycznych nie interesuje nas zwykle szczegółowe poznanie struktury poziomów energetycznych substancji, a raczej wpływ otoczenia chromoforu na jego widmo. Położenie, natężenie, a przede wszystkim kształt pasma absorpcyjnego zależy w znacznym stopniu od lokalnego otoczenia chromoforu. Lokalnym otoczeniem chromoforów w układach biologicznych mogą być cząsteczki rozpuszczalnika lub fragmenty biopolimeru. Tym samym chromofor może pełnić rolę sondy pozwalającej na określenie właściwości jego najbliższego otoczenia. Pomiędzy chromoforem a jego otoczeniem występują oddziaływania, które prowadzą do powstania lokalnego uporządkowania cząsteczek rozpuszczalnika lub fragmentów biopolimeru. Charakter, zasięg i stopień tego uporządkowania zmienia się po przejściu ze stanu podstawowego w stan wzbudzony. Uporządkowanie jak i jego zmiany w wyniku wzbudzenia zależą przy tym bardzo silnie od właściwości środowiska lokalnego. Np. położenie i kształt długofalowego pasma absorpcyjnego chromoforu indolowego w łańcuchu bocznym tryptofanu silnie zależy od tego, czy znajduje się on w otoczeniu hydrofilowym (na powierzchni białka w kontakcie z wodą) czy hydrofobowym (wewnątrz cząsteczki białka).Ponadto z wielkości i kierunku zmian położenia pasma absorpcyjnego przy zmianie polarności środowiska wyciągnąć można wnioski na temat rodzaju przejścia odpowiedzialnego za powstanie pasma. W przypadku przejścia π→π* wzrost polarności środowiska powoduje przesunięcie pasma w kierunku fal dłuższych. Odwrotnie zachowuje się pasmo związane z przejściem n→π*. Wykazano, że położenie maksimum pojedynczego pasma absorpcji zależy od: położenia maksimum absorpcji w próżni, λmax0 4 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań momentu dipolowego chromoforu, M względnej stałej dielektrycznej lokalnego otoczenia chromoforu, ε lokalnej wartości współczynnika załamania światła. Aktualne położenie pasma można wyznaczyć, że wzoru: λ max = λ max 0 − 2M 2 hc ⎡ ε −1 n 2 −1 ⎤ − ⎢ ⎥. ⎢⎣ 2ε + 1 2(2n + 1) ⎥⎦ W biofizyce zależność powyższa bywa raczej wykorzystywana do wyznaczania parametrów lokalnego otoczenia chromoforu, np. współczynnika załamania światła. 4.1.3 Elektronowe widmo emisyjne (fluorescencja) W wyniku absorpcji kwantu promieniowania o odpowiedniej energii cząsteczka znajdująca się na podstawowym poziomie elektronowym i podstawowym poziomie oscylacyjnym przechodzi do wzbudzonego stanu elektronowego. Jak już mówiliśmy przejście to ma charakter przejścia pionowego na diagramie Francka-Condona, a więc odbywa się bez zmiany geometrii cząsteczki. Oznacza to, że chromofor „trafia” na jeden ze wzbudzonych stanów oscylacyjnych wzbudzonego stanu elektronowego (linia żółta na wykresie obok). W tym stanie zderza się z cząsteczkami ze swego otoczenia oraz uczestniczy w drganiach całej cząsteczki. Na skutek tych oddziaływań może oddać energię wzbudzenia oscylacyjnego na drodze przejść bezpromienistych. Najczęściej odbywa się to w kilku etapach. W ten sposób chromofor „schodzi” po drabinie poziomów oscylacyjnych (czerwone strzałki) aż do podstawowego stanu oscylacyjnego wzbudzonego stanu elektronowego (zielona linia). Bezpromieniste przejście pomiedzy stanami elektronowymi jest bardzo mało prawdopodobne ze względu na dużą różnice poziomów energetycznych. W efekcie chromofor pozostaje przez czas rzędu milisekund we wzbudzonym stanie elektronowym. Zwykle opuszcza ten stan na drodze emisji kwantu promieniowania (zielone strzałki na rysunku obok). Zjawisko to nazywamy fluorescencją. Fluorescencja, podobnie jak absorpcja, jest przejściem pionowym i układ po emisji zatrzymać się może na jednym z kilku stanów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego. Dlatego też widmo fluorescencyjne posiada również strukturę oscylacyjną. 5 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań Kształt widm emisyjnych i absorpcyjnych Na widmo absorpcyjne składają się kolejno przejścia: 0→0*, 0→1*, 0→2* itd. Przejściom tym odpowiada coraz większa energia, więc występują one przy coraz krótszych długościach fali (lewy panel na rysunku poniżej). Widmo fluorescencyjne powstaje w wyniku przejść 0*→0, 0*→1, 0*→2 itd. Ponieważ przejścia kończą się na coraz wyższych poziomach oscylacyjnych, więc na widmie występują przy coraz większych długościach fali (panel prawy). widmo absorpcji widmo emisji Można oczekiwać, że przejście 0→0* w widmie absorpcyjnym i przejście 0*→0 w widmie emisyjnym powinny się pokrywać. Zwykle jednak występuje pomiędzy nimi niewielka różnica (rysunek poniżej). Związane jest to z różnym otoczeniem chromoforu w stanie podstawowym i wzbudzonym. widmo absorpcji widmo emisji Absorpcja (szybko) Emisja (szybko) W stanie podstawowym chromofor (szary prostokąt) znajduje się w otoczeniu dopasowanym do geometrii i rozkładu elektronowego tego stanu (szara elipsa). Absorpcja kwantu zachodzi tak szybko, że wzbudzony stan elektronowy (zielony równoległobok) początkowo znajduje się w niedopasowanym do niego otoczeniu. Po pewnym czasie otoczenie dopasowuje się do wzbudzonego stanu elektronowego (zielona elipsa). Emisja kwantu jest również bardzo szybka, więc powstający elektronowy stan podstawowy znajduje się początkowo w otoczeniu dopasowanym do stanu wzbudzonego. Tak więc przejścia 0→0* i 0*→0 nie są sobie równoważne. Przesuniecie stokesowskie 6 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań Ponieważ emisja kwantu zachodzi z niższego poziomu en ergetycznego (część energii została rozproszona na drzodze przejść bezpromienistych), więc (λ max)abs (λmax)em widmo fluorescencji jest przesunięte w stosunku do widma absorpcji w kierunku większych długości fali: (λmax)em > (λmax)abs. Przesuniecie to nosi nazwę przesunięcia stokesowskiego. Jego wielkość zależna jest przy tym bardzo silnie od właściwości lokalnego otoczenia chromoforu. Wzbudzenie elektronowe związane jest zwykle ze wzrostem momentu dipolowego chromoforu, więc towarzyszy mu: polaryzacja chmur elektronowych cząsteczek otaczających chromofor przesunięcie indukcyjne atomów polaryzacja orientacyjna Tak więc przesunięcie stokesowskie będzie tym większe im: dłuższy będzie czas życia stanu wzbudzonego, większa będzie przenikalność dielektryczna środowiska, oraz mniejsza jego lepkość (mikrolepkość). Intensywność fluorescencji Na intensywność fluorescencji mają wpływ dwa podstawowe czynniki: liczba cząsteczek w stanie wzbudzonym zależna od długości fali światła wzbudzającego wydajność kwantowa fluorescencji związana ze względnym prawdopodobieństwem przejść promienistych i bezpromienistych Dużą liczbę cząsteczek w stanie wzbudzonym można uzyskać stosując światło wzbudzające odpowiadające maksimum absorpcji. Wydajność kwantowa zależy przede wszystkim od prawdopodobieństwa przejść bezpromienistych. Można ją w pewnym stopniu regulować dobierając odpowiednie warunki pomiaru.Przejścia energetyczne związane z fluorescencją szczególnie wygodnie jest śledzić na tzw. diagramie Jabłońskiego (rysunek poniżej). Występują na nim trzy stany elektronowe: singletowy stan podstawowy, S0, singletowy stan wzbudzony, S1, oraz wzbudzony stan tripletowy, T1. Strzałki ciągłe pokazują przejścia promieniste, a strzałki przerywane przejścia bezpromieniste. 7 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań S1 Absorpcja Fluorescencja T1 Fosforescencja S0 Jedną z przyczyn obniżenia intensywności fluorescencji jest bezpromieniste wewnątrzcząsteczkowe przejście pomiędzy singletowym stanem wzbudzonym S1 i singletowym stanem podstawowym S0. W procesie tym energia stanu wzbudzonego jest rozpraszana na skutek zderzeń z cząsteczkami rozpuszczalnika i/lub na skutek wewnątrzcząsteczkowego wzbudzania oscylacyjnego innych fragmentów cząsteczki. Prawdopodobieństwo występowania tego przejścia silnie zależy od temperatury układu. Zależność ta komplikuje zastosowanie pomiarów fluorescencyjnych do obserwacji zmian konformacyjnych biopolimerów wywołanych zmianami temperatury. Wygaszanie fluorescencji Zanik stanu wzbudzonego może również zachodzić na skutek zderzeń lub tworzenia kompleksów z obecnymi w roztworze cząsteczkami zdolnymi do wygaszania fluorescencji. Zjawisko to można wykryć wykonując pomiary wydajności kwantowej przy różnych stężeniach wygaszacza. Bardzo wydajnymi wygaszaczami są: gazowy tlen O2 lub jony jodkowe J-. Wygaszacze te są w stanie zneutralizować stan wzbudzony przy pojedynczym zderzeniu. Szybkość ich działania ograniczona jest jedynie szybkością dyfuzji. Fosforescencja Kolejną przyczyną spadku intensywności fluorescencji jest przejście z singletowego stanu wzbudzonego S1 do trypletowego stanu wzbudzonego T1 (patrz diagram Jabłońskiego). Jest to przejście formalnie wzbronione. Występuje jednak z niezerowym prawdopodobieństwem w niektórych układach molekularnych. Stan trypletowy T1 jest względnie trwały, gdyż przejście promieniste do stanu podstawowego S0 jest wzbronione. Zachodzi jednak z niezerowym prawdopodobieństwem dając zjawisko fosforescencji. Cząsteczki mogą pozostawać w stanie trypletowym przez godziny a nawet dni, wiec fosforescencję można obserwować długo po ustaniu naświetlania wzbudzającego. 8 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań 4.2 Aktywność optyczna W fali elektromagnetycznej wzajemnie prostopadłe wektory pola elektrycznego, E (niebieski na rysunku poniżej), i indukcji magnetycznej, B (czerwony), zmieniają sinusoidalnie swoją długość. Faza zmian pola magnetycznego przesunięta jest o 90° względem zmian pola elektrycznego. E B Za oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z materią odpowiada oscylacja pole elektrycznego. Wektor tego pola jest zawsze prostopadły do kierunku rozchodzenia się fali. Źródła światła generują fale o przypadkowych kierunkach drgań wektora pola elektrycznego. Światło takie nazywamy światłem niespolaryzowanym (niezorientowanym). 4.2.1 Światło spolaryzowane W specjalnych warunkach można uzyskać światło w którym wszystkie fale posiadają jednakową płaszczyznę drgań pola elektrycznego. Światło takie nazywamy światłem spolaryzowanym liniowo, a wspólną płaszczyznę drgań pola elektrycznego płaszczyzną polaryzacji. Światło spolaryzowane uzyskać można np. w efekcie odbicia niskokątowego: Układ optyczny zdolny do przepuszczania jedynie światła spolaryzowanego liniowo w pewnej wyróżnionej płaszczyźnie nazywamy polaryzatorem. Układ dwóch skrzyżowanych polaryzatorów nie przepuszcza światła: 9 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań Roztwory niektórych substancji posiadają zdolność do skręcania płaszczyzny polaryzacji. Umieszczenie takiego roztworu pomiędzy skrzyżowanymi polaryzatorami powoduje, że za drugim polaryzatorem pojawia się promień o niezerowym natężeniu: Miarą aktywności optycznej próbki jest kąt φ o jaki zmienia się położenie płaszczyzny polaryzacji. Zjawisko to nosi nazwę skręcalności optycznej. φ Polaryzacja eliptyczna Wektor pola elektrycznego fali po przejściu przez aktywną optycznie próbkę nie oscyluje w płaszczyźnie. Przemieszcza się po elipsie, której oś długa skręcona jest o kąt φ względem płaszczyzny polaryzacji światła padającego. Światło takie nazywamy spolaryzowanym eliptycznie: y y φ 1 1 2 2 3 3 x x 4 4 5 5 Światło padające Światło przechodzące (polaryzacja liniowa) (polaryzacja eliptyczna) Miarą eliptyczności, θ, jest arkus tangens stosunku osi krótkiej i długiej elipsy zakreślanej przez wektor pola elektrycznego. Np. gdy stosunek osi krótkiej do długiej wynosi 1/100 eliptyczność, θ, równa jest 0,57 stopnia. Dichroizm kołowy Przy opisie polaryzacji eliptycznej wygodnie jest posłużyć się pojęciem światła spolaryzowanego kołowo. W fali spolaryzowanej kołowo koniec wektora pola elektrycznego porusza 10 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań się po linii śrubowej. Mogą istnieć dwa rodzaje światła spolaryzowanego kołowo: prawoskretne i lewoskretne. Światło spolaryzowane liniowo można traktować jako superpozycję dwóch fal: jednej spolaryzowanej kołowo w lewo, EL, i drugiej spolaryzowanej kołowo w prawo, ER. y y y 1 1 1 3 x 2 2 2 + 3 4 x = 3 4 4 5 5 EL ER x 5 W środowisku aktywnym optycznie absorbancja fali spolaryzowanej kołowo w lewo, AL, i absorbancja fali spolaryzowanej kołowo w prawo, AR, jest różna.Zjawisko to nosi nazwę dichroizmu kołowego (CD, ang. Circular Dichroism). Po opuszczeniu próbki obydwie fale są dalej spolaryzowane kołowo różnią się jednak intensywnością (promieniem linii śrubowej). Superpozycja tych fal daje w efekcie światło spolaryzowane eliptycznie: y y φ y 1 1 1 2 3 4 5 x + 2 2 3 x 3 = 4 4 5 x 5 Miarą dichroizmu kołowego jest eliptyczność θ. Różnica w absorpcji fali spolaryzowanej kołowo w lewo i w prawo oznacza, że aktywna optycznie próbka posiada różne współczynniki załamania światła dla fali spolaryzowanej kołowo w lewo, nL, i w prawo, nR. Jedna z nich porusza się w próbce szybciej niż druga i po opuszczeniu próbki różnią się one fazą oscylacji. Przejawia się to występowaniem skręcalności optycznej, φ. Podstawowe zależności Można wykazać, że pomiędzy opisanymi wielkościami zachodzą relacje: φ = 180L(n L − n R ) / λ θ = 2,303(A L − A R )180 / 4π Różnice we współczynnikach załamania są zwykle bardzo małe, dlatego korzystniej jest mierzyć skręcalność optyczną bezpośrednio jako kąt φ. Dla typowych roztworów biopolimerów o stężeniu 11 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań -4 chromoforu ok. 10 M i drodze optycznej L = 1 cm kąt skręcenia φ wynosi od 0,01 do 0,001 stopnia. Współczesne sterowane komputerem przyrządy są w stanie zmierzyć skręcalność na poziomie -5 10 stopnia. Eliptyczność, θ, światła opuszczającego próbkę jest zwykle bardzo mała i trudna do precyzyjnego pomiaru. Dlatego dichroizm kołowy najłatwiej jest zmierzyć przepuszczając naprzemiennie przez próbkę wiązki spolaryzowane kołowo w lewo i w prawo i mierząc różnicę w natężeniu obu wiązek. Różnica ta, ΔA, wynosi zwykle od 0,03% do 0,3% ogólnej absorbancji. Jest to wielkość łatwo mierzalna przez współczesne aparaty. 4.2.2 Widma aktywności optycznej Skręcalność optyczna próbki, φ, i jej zdolność do indukowania eliptyczności, θ, silnie zależą od długości fali i mają największe natężenie w obszarze pasma absorpcji. Zależność φ(λ) nazywamy dyspersją skręcalności optycznej lub widmem ORD (ang. Optical Rotatory Dispersion), a zależność θ(λ) widmem dichroizmu kołowego lub widmem CD. Widmo absorpcyjne 200 220 240 260 280 300 Widmo ORD Widmo CD 200 200 220 240 260 280 220 240 260 280 300 300 Widmo CD Dla przejście dozwolonego (np. π→π*) kształt widma Widmo absorpcyjne CD jest bardzo zbliżony do kształtu widma absorpcji (tzw. efekt Cottona). Dzieje się tak dlatego, że w zakresie pasma absorpcji ΔA jest zwykle proporcjonalne do A. Poza pasmem 200 220 240 260 280 300 absorpcyjnym AL ≈ 0 i AR ≈ 0, więc ich różnica proporcjonalna do eliptyczność θ też jest bliska 0. Efekt Cottona może mieć znak dodatni lub ujemny w zależności Widmo CD od asymetrii występującej w otoczeniu chromoforu. Natężenie + 200 220 240 260 280 300 12 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań efektu Cottona silnie zależy nawet od niewielkich zmian w strukturze i otoczeniu chromoforu. Widmo ORD Widmo ORD Kształt widm ORD przypomina przebieg pierwszej pochodnej widma absorpcyjnego. Podstawowa + różnica występuje poza pasmem absorpcji: skręcalność optyczna, φ, ma 200 220 240 260 280 300 niezerową wartość nawet daleko poza pasmem absorpcji. Na krzywych ORD znak efektu Cottona przejawia się kolejnością skręcalności dodatniej i ujemnej. Widma ORD stosuje się w zasadzie jedynie do cząsteczek o pojedynczym chromoforze. Przy większej Widmo ORD - dwa izolowane chromofory liczbie chromoforów, nawet o oddzielnych pasmach absorpcji, krzywe ORD poszczególnych chromoforów nakładają się 200 220 240 260 280 300 320 praktycznie uniemożliwiając analizę widma. Pasma efektu Cottona w widmach CD są węższe a same widma łatwiejsze do analizy. 4.3 Polaryzacja fluorescencji Procesom absorpcji i emisji promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki towarzyszy zmiana momentu dipolowego. Momenty dipolowe stanu podstawowego i wzbudzonego leżą zwykle w tej samej płaszczyźnie, lecz mają różne kierunki: M* M Stan podstawowy Stan wzbudzony Jeżeli oświetlimy próbkę światłem spolaryzowanym liniowo, to pochłaniać światło będą przede wszystkim te cząsteczki, których momenty dipolowe są równoległe do kierunku drgań wektora pola elektrycznego. Gdy absorbujące cząsteczki są unieruchomione, to fluorescencja jest również spolaryzowana i to w kierunku równoległym do kierunku polaryzacji światła wzbudzającego. Mierząc natężenie fluorescencji po przejściu przez polaryzator zorientowany: I|| równolegle I⊥ i prostopadle 13 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań do płaszczyzny polaryzacji światła wzbudzającego otrzymujemy dwie wartości natężenia fluorescencji: I|| oraz I⊥. Miarą polaryzacji fluorescencji może być: stopień polaryzacji, P, definiowany wzorem: P= anizotropia fluorescencji, r, obliczana jako: r= I || − I ⊥ I || + I ⊥ lub I || − I ⊥ I || + 2 I ⊥ 4.4 Dichroizm liniowy (LD) Dichroizm liniowy, LD (ang. Linear Dichroism) jest techniką spektroskopową używaną przede wszystkim do badania struktury i orientacji chromoforów w cząsteczkach. Zjawisko dichroizmu liniowego związane jest z różną absorpcją światła spolaryzowanego równolegle i prostopadle w stosunku do wybranej osi cząsteczki. Wyniki pomiarów rejestrowane są w formie widma LD, czyli zależności natężenia zjawiska od długości fali. Obecnie największe zastosowanie znajduje technika LD przy badaniu biopolimerów (DNA, białka) oraz polimerów syntetycznych. Niektóre wersje tej techniki pozwalają również na badanie małocząsteczkowych związków organicznych oraz kryształów. 4.4.1 Podstawy teoretyczne Gdy wiązka światła pada na cząsteczkę część z niej ulega absorpcji. Ilość zaabsorbowanego światła zależy przede wszystkim od długości fali, λ. Na przykład chlorofil absorbuje światło głównie przy długości fali ok. 430 nm (niebieskie) i 670 nm (czerwone). Ponadto w widmie absorpcyjnym chlorofilu występuje jeszcze kilka dużo słabszych pasm absorpcji. Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego z zakresu widzialnego i bliskiego nadfioletu związana jest ze wzbudzeniem elektronowym, czyli przejściem elektronu na wyższy poziom energetyczny. Wielkością która determinuje prawdopodobieństwo wzbudzenia r elektronu jest dipolowy moment przejścia μ if . Jest to wektor, którego r E θ r μ if przestrzenna orientacja jest dla danego rodzaju chromoforu i typu wzbudzenia (σ→σ*, n→π*, π→π*) jednoznacznie zdefiniowana. Wzbudzenie elektronowe zmienia przestrzenny rozkład gęstości elektronowej w cząsteczce i wywoływane jest przez składową elektryczną fali elektromagnetycznej. Zależność pomiędzy r wydajnością wzbudzenia a wektorem pola elektrycznego fali elektromagnetycznej, E , i wektorem r momentu przejścia, μ if , dana jest zależnością: ( r r dN i ∝ μ if ⋅ E dt )2 = μif2 E 2 cos 2 (θ)f (λ ) 14 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań gdzie: f(λ) definiuje kształt pasma absorpcji. Z zależności tej wynika jednoznacznie, że wydajność wzbudzenia, a więc i absorbancja próbki zależy nie tylko od wielkości dipolowego momentu przejścia, ale również od jego orientacji względem wektora pola elektrycznego: kąta θ. Dlatego w pomiarach dichroizmu liniowego stosuje się światło spolaryzowane liniowo, czyli promieniowanie elektromagnetyczne, którego wektor pola elektrycznego drga tylko w jednej płaszczyźnie. Dipolowy moment przejścia posiada jednoznacznie zdefiniowaną orientację względem chromoforu. Orientację tę można wyznaczyć dwoma sposobami: - obliczeniowym: orientację momentu przejścia można obliczyć jeżeli znana jest funkcja falowa cząsteczki w stanie podstawowym i wzbudzonym - doświadczalnie z pomiarów absorpcji światła spolaryzowanego przez monokryształ badanej substancji Na przykład dwa główne momenty przejścia w cząsteczce chlorofilu a związane są ze wzbudzeniem układu porfirynowego. Oba wektory momentów przejścia leżą w 670 nm płaszczyźnie układu porfirynowego, lecz są do siebie prostopadłe (rysunek na poprzedniej stronie). Można więc korzystając ze światła spolaryzowanego liniowo określić jak cząsteczka chlorofilu związana z określonym białkiem lub kompleksem 430nm białek ustawiona jest w przestrzeni. Należy w tym celu dokonać pomiaru absorpcji światła spolaryzowanego liniowo w dwóch wzajemnie prostopadłych kierunkach. Technika spektroskopowa oparta na takich pomiarach nosi nazwę dichroizmu liniowego, LD. Podstawowym ograniczeniem techniki LD jest konieczność zapewnienia jednakowej orientacji cząsteczek w skali makroskopowej całej próbki. Cząsteczki w roztworach oraz w większości ciał stałych mają w skali makroskopowej przypadkową orientację i dlatego w takich środowiskach dichroizm liniowy jest niemierzalny. Wyjątkiem od tej zasady są monokryształy oraz zorientowane struktury supramolekularne. Zwłaszcza te ostatnie wykorzystywane są powszechnie w badaniach biofizycznych. Wyobraźmy sobie, że udało nam się uzyskać E|| makroskopową próbkę liniowego dwuniciowego DNA w której osie wszystkich heliks ustawione są w pewnym wyróżnionym kierunku. Wektory momentów przejścia E0|| E⊥ 15 E0⊥ Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań zasad występujących w DNA leżą w płaszczyźnie tych zasad, a więc w przypadku helisy B prostopadle do osi tej helisy. Dokonujemy teraz pomiaru absorpcji światła spolaryzowanego liniowo równolegle do osi helisy i prostopadle do niej. Wiązka światła spolaryzowana równolegle do osi helisy (prostopadle do płaszczyzny zasad i wektorów momentów przejścia) powinna przejść przez próbkę praktycznie niezmieniona podczas gdy wiązka o polaryzacji prostopadłej do osi helisy (równoległej do wektorów przejścia) powinna zostać w znacznym stopniu zaabsorbowana. Miernik dichroizmu Absorbancja wiązki światła poruszającej się wzdłuż osi Oy i spolaryzowanej zgodnie z osią Ox dana jest wzorem: A x = kμ 2 cos 2 θ x gdzie: cos 2 θ x oznacza wartość uśrednioną po wszystkich cząsteczkach znajdujących się w wiązce światła Jeżeli w badanej próbce nie występuje żaden rodzaj uporządkowania chromoforów (próbka jest izotropowa) to: cos 2 θ x = cos 2 θ y = cos 2 θz = 1 3 Tym samym: 1 A x = A y = A z = kμ 2 = A izo 3 gdzie: Aizo – absorbancja niespolaryzowanego światła przez izotropową próbkę Dla wiązki poruszającej się wzdłuż osi Oy najprostszym miernikiem dichroizmu liniowego jest wielkość: ΔA = A z − A x Wadą tego miernika jest jego zależność od stężenia próbki. Dlatego wprowadzono bezwymiarowy miernik zwany zredukowanym dichroizmem liniowym, LDr: LDr = Az − Ax = cos 2 θz − cos 2 θ x 3A izo Dla próbki izotropowej wartość tego miernika wynosi: LDr = 1 1 − = 0, 3 3 a dla próbki w której wektory momentów przejścia są idealnie zorientowane wzdłuż osi Oz wynosi: LDr = 1 − 0 = 1 . Istnieją dwie przyczyny dla których zmierzona wartość zredukowanego dichroizmu liniowego może być mniejsza od 1: 16 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań częściowa a nie idealna orientacja cząsteczek w próbce, wektor momentu przejścia nie pokrywa się z kierunkiem orientacji cząsteczek. W badanej próbce przyczyny te mogą występować oddzielnie lub łącznie. Zwykle orientację wektora momentu przejścia w stosunku do kierunku orientacji cząsteczki można oszacować z innych pomiarów. Niewiadomą pozostaje jednak stopień uporządkowania cząsteczek w próbce. θ μ12 Wektor momentu przejścia nie pokrywa się z kierunkiem orientacji cząsteczki Rozważmy sytuację, gdy cząsteczki o kształcie pręta są idealnie μ12 θ zorientowane zgodnie z osią Oz (rysunek obok) i zawierają tylko jeden chromofor zdolny do absorpcji światła w badanym zakresie długości fali. Załóżmy ponadto, że pomiędzy kierunkiem wektora momentu przejścia, μ12, a kierunkiem orientacji występuje niezerowy kąt θ. Spróbujmy przewidzieć jaka będzie w tym przypadku wartość LDr. Przede wszystkim musimy zwrócić uwagę, że orientacja cząsteczek zgodnie z osią Oz definiuje jednoznacznie wartość kąta θ, ale nie określa wartości kąta ϕ. Absorbancję światła spolaryzowanego zgodnie z kierunkiem osi Oz, Az, można więc łatwo zdefiniować wzorem: 2 A z = kμ12 cos 2 θ . Wyznaczenie absorbancji światła spolaryzowanego zgodnie z kierunkiem z Ox wymaga jednak bardziej skomplikowanych obliczeń: 2 A x = kμ12 θ 2π 1 2 2 2 2 ∫ sin θ cos ϕdϕ = 2 kμ12 sin θ . 0 ϕ Teraz możemy wyznaczyć wartość zredukowanego dichroizmu liniowego: 1 cos θ − sin 2 θ A − Ax 1 2 = LDr = z = 3 cos 2 θ − 1 2 2 3A izo 2 cos θ + sin θ 2 ( μ12 x y ) Z uzyskanej zależności wynika, że istnieje taki kąt θM przy którym wartość zredukowanego dichroizmu równa jest zero pomimo idealnej orientacji wszystkich cząsteczek. Ten tzw. kąt magiczny występuje, gdy cos2θ = 1/3 i wynosi θM = 54,7°. 4.4.2 Orientacja cząsteczek w próbce Zjawisko dichroizmu liniowego zostało początkowo stwierdzone w przypadku niektórych kryształów. Po wyjaśnieniu jego podłoża fizycznego stało się jasne, że technika ta może być wykorzystana również do badania biopolimerów. Zjawisko dichroizmu liniowego zaobserwowano początkowo tylko w układach biologicznych o uporządkowaniu dalekozasięgowym. Uporządkowanie takie występuje np. we włóknach mięśniowych. 17 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań W latach ’60 XX w. opracowano metody wymuszonej orientacji cząsteczek organicznych. Mogą być one stosowana w przypadku cząsteczek o wydłużonym kształcie. Ich efektywność wzrasta jeżeli wektor momentu przejścia rozpatrywanego chromoforu pokrywa się z osią długą cząsteczki lub jest do niej prostopadły. Zaproponowano szereg metod orientacji cząsteczek w próbce. W chwili obecnej najczęściej stosowane są: rozciąganie folii polimerowych orientacja hydrodynamiczna równoległe biwarstwy lipidowe Rozciągane folie polimerowe W tej technice dla uzyskania orientacji wymuszonej wykorzystuje się efekt orientujący rozciąganych łańcuchów polimerowych. Badaną substancję rozpuszcza się w roztworze polarnego polimeru np. alkoholu poliwinylowego i wylewa do płytkiej wydłużonej rynienki.. Po odparowaniu rozpuszczalnika ( w badaniach biofizycznych wody) pozostaje prostokątna kształtka polimeru z równomiernie lecz chaotycznie rozmieszczonymi cząsteczkami badanej substancji (lewy panel na rysunku poniżej). Przed rozciągnięciem Po rozciągnięciem Poddając kształtkę naprężeniu rozciągającemu doprowadzamy do plastycznego (trwałego) jej odkształcenia. Kształtki z alkoholu poliwinylowego można rozciągnąć zwiększając ich wymiar nawet o 50%. Podczas takiego rozciągania łańcuchy polimeru prostują się, układają równolegle i przemieszczają się względem siebie ruchem ślizgowym. W tak silnie zorientowanym środowisku cząsteczki badanej substancji również ulegają orientacji równolegle do kierunku działania sił rozciągających (prawy panel). Uporządkowanie jest tym silniejsze im bardziej wydłużony kształt posiada cząsteczka. Rozciągniętą folię umieszcza się następnie prostopadle do kierunku wiązki światła spolaryzowanego i wykonuje dwa pomiary lub widma. Podczas pierwszego pomiaru płaszczyzna polaryzacji światła jest równoległa do kierunku orientacji wymuszonej, a podczas drugiego prostopadła do tego kierunku. Orientacja hydrodynamiczna Obecnie najpowszechniej stosowaną techniką orientacji próbek ciekłych jest technika hydrodynamiczna wykorzystująca tzw. przepływ Couette’a. Badaną próbkę umieszcza się w wąskiej 18 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań przestrzeni pomiędzy obracającym się cylindrycznym naczyniem a nieruchomym, osiowo ustawionym prętem (lewy panel rysunku poniżej). Przy odpowiednio dobranej prędkości kątowej warstewka cieczy zaczyna się poruszać ruchem laminarnym (efekt Couette’a). Ten laminarny przepływ cieczy wywołuje silny efekt orientujący na cząsteczki obecne w roztworze (panel prawy). Efekt ten można dodatkowo zwiększyć używając roztworów o dużej lepkości. Równoległe biwarstwy lipidowe Do ustalenia orientacji badanych cząsteczek w próbce można również wykorzystać płaskie biwarstwy lipidowe. Na płytce kwarcowej Z wytwarza się układ kilkudziesięciu lub nawet więcej biwarstw lipidowych ω rozdzielonych warstewkami roztworu wodnego (rysunek obok). Układ taki uzyskać można przez łagodne odwodnienie zawiesiny pęcherzyków lipidowych, np. w strumieniu azotu. B ω A Płytkę kwarcową umieszcza się w przyrządzie pomiarowym w taki sposób, aby możliwy był obrót płytki. Płytkę oświetla się od dołu wiązką światła (A) spolaryzowanego poziomo (kierunek polaryzacji pokazuje strzałka B). Kąt ω definiuje położenie normalnej do powierzchni biwarstwy (Z) względem kierunku płaszczyzny polaryzacji światła (B). Wykonując pomiary przy różnych wartościach kąta ω określić można kąt φ pomiędzy normalną Z i wektorem momentu przejścia μ12. 4.5 Metody optyczne w badaniu oddziaływań W wyniku powstawania kompleksów ligand-biopolimer zmianie ulega charakterystyka spektralna chromoforu. Zmiana ta może być wynikiem:zmiany lokalnego otoczenia chromoforu wystąpienia lub zaniku oddziaływań chromofor – chromofor zmiany orientacji momentu dipolowego lub momentu przejścia indukowanej asymetrii chromoforu Tym samym chromofor można traktować jaku czułą sondę wrażliwą na zmiany wywołane wystąpieniem oddziaływania. Jest to powodem szerokiego wykorzystania metod optycznych do badania oddziaływania ligand-biopolimer. 19 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań 4.5.1 Zmiany lokalnego otoczenia chromoforu W białkach i kwasach nukleinowych występują ugrupowania chemiczne mogące pełnić rolę wewnątrzcząsteczkowych chromoforów. Są nimi np. układy aromatyczne takich aminokwasów jak fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan. Można je wykorzystać do śledzenia lokalnych lub globalnych zmian konformacyjnych. Podejście to bywa wykorzystywane do: badania wpływu środowiska (temperatura, siła jonowa itp.) wykrywania powstawania IV-rzędowej struktury białek określania zmian konformacyjnych indukowanych małocząsteczkowym ligandem (substratem, modulatorem) badania zmian konformacyjnych wywołanych modyfikacjami chemicznymi białek, np. fosforylacją ustalenia lokalizacji domen białkowych w środowiskach o różnej polarności, np. w błonach biologicznych. Podstawową wadą tego podejścia jest jego niska czułość. Naturalne chromofory maja zwykle niskie ekstynkcje molowe i ich zawartość w biopolimerze też jest zwykle niewielka. Dużo lepsze wyniki uzyskuje się, gdy chromofor jest ulokowany w ligandzie oddziałującym z biopolimerem. Można wtedy tak dobrać chromofor, aby uzyskać dużą czułość pomiaru. W wyniku oddziaływania z biopolimerem zmienia się lokalne otoczenie chromoforu, a tym samym również jego widmo absorpcyjne i fluorescencyjne. W przypadku widm absorpcyjnych zmiana lokalnego otoczenia wpływa na: przesuniecie maksimum absorpcji zmianę ekstynkcji molowej zmianę kształtu widma (zmiana względnej intensywności pasm oscylacyjnych) W przypadku widm fluorescencyjnych zmiany dotyczą: zmian intensywności fluorescencji (nawet o kilka rzędów wielkości) zmiany położenia pasma – zmiany barwy emitowanego światła. Właściwie dobrany chromofor lub fluorochrom pozwala uzyskać bardzo dużą czułość i selektywność pomiarów. Dotyczy to w szczególności ligandów fluorescencyjnych. 4.5.2 Oddziaływania chromofor-chromofor Przy bliskim kontakcie 2 chromoforów powstaje nowa funkcja falowa i nowe poziomy energetyczne. Zmianie ulega położenie i intensywność pasm absorpcyjnych. Wielkość tych zmian zależy od:odległości chromoforów kąta pomiędzy momentami przejścia poziomów energetycznych niezaburzonych chromoforów 20 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań Znając momenty przejścia niezaburzonych chromoforów można ustalić relacje geometryczne pomiędzy badanymi chromoforami. Efekty te są najsilniejsza gdy chromofory absorbują w podobnym zakresie długości fali. Szczególnie silne są wtedy, gdy oddziałują ze sobą takie same chromofory, np. podczas tworzenia dimerów. W przypadku gdy jeden z chromoforów jest jednocześnie fluorochromem pojawiają się dodatkowe efekty: tłumienie fluorescencji (ang. quenching) oraz transfer energii. Tłumienie fluorescencji Podstawą zjawiska tłumienia fluorescencji jest oddziaływanie wzbudzonego fluorochromu ze znajdującym się w jego bezpośredniej bliskości chromoforem. Oddziaływanie to ułatwia bezpromieniste przejście fluorochromu do podstawowego stanu elektronowego, a tym samym obniżenie intensywności fluorescencji. Należy z całą mocą podkreślić, że zjawisko to nie polega na następującej po sobie emisji i absorpcji kwantu światła, lecz ma naturę kwantowo-chemiczną. Zachodzi wtedy, gdy funkcje falowe obu układów zachodzą na siebie w przestrzeni. Tłumienie fluorescencji występuje również pomiędzy dwoma fluorochromami – takimi samymi lub różnymi. Jeden z nich pełni wtedy rolę chromoforu. Tłumienie fluorescencji wyjaśnia znany od wielu lat fakt, że dimery znaczników fluorescencyjnych wykazują fluorescencję o kilka rzędów wielkości słabszą niż znaczniki w rozproszeniu monomerycznym. Metoda wypierania znacznika Na opisanym powyżej zjawisku opiera się jedna z metod wyznaczania stałej wiązania ligandów przez biopolimer. Wykorzystuje się w niej znacznik fluorescencyjny wiążący się z biopolimerem jako monomer i wykazujący w tym stanie bardzo silną fluorescencję. Znacznik musi jednocześnie ulegać silnej agregacji w roztworze wodnym, a jego agregaty muszą wykazywać, w efekcie tłumienia, bardzo słabą fluorescencję. Jeżeli do roztworu dodamy teraz lidand wiążący się kompetytywnie do tego samego miejsca wiązania, to będzie on wypierał znacznik do roztworu, a w efekcie wystąpi spadek fluorescencji. Miareczkując kompleks biopolimer-znacznik ligandem możemy wyznaczyć takie stężenie liganda, c50, przy którym intensywność fluorescencji zmniejsza się do połowy wartości początkowej. Znając stałą wiązania znacznika oraz jego stężenie oraz wartość c50 możemy łatwo wyznaczyć stałą wiązania liganda. Technika ta jest np. powszechnie stosowana do wyznaczania stałych interkalacji różnych związków do dwuniciowego DNA. Jako znacznika fluorescencyjnego używa się zwykle bromku etydyny. Transfer energii Bliskie sąsiedztwo przestrzenne 2 różnych fluorochromów może prowadzić do przeniesienia wzbudzenia z jednego z nich na drugi. Zjawisko to nosi nazwę transferu energii i można je przedstawić jako wypadkową trzech kolejno następujących po sobie procesów: 21 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań D + hν1 = D* wzbudzenie donora D* + A = D + A* transfer energii – przeniesienie wzbudzenia na akceptor A* = A + hν2 fluorescencja akceptora Warunkiem wystąpienia transferu energii jest zachodzenie na siebie widma emisyjnego donora i widma absorpcyjnego akceptora oraz bliskość przestrzenna i odpowiednia orientacja obu fluorochromów. Analogicznie jak w przypadku tłumienia fluorescencji zjawisko to ma naturę kwantowo-chemiczną. Ponieważ podczas transferu energii część energii stanu wzbudzonego donora ulega rozproszeniu, więc jako akceptor należy wybierać związek fluoryzujący przy większej długości fali niż donor. Dla jednoznacznej interpretacji uzyskiwanych wyników długość fali światła wzbudzającego, ν1, musi być tak dobrana, aby nie wywoływała wzbudzenia akceptora. Przy stosowaniu partnerów spełniających powyższe reguły transfer energii przejawi się jako fluorescencja pochodząca od znacznika który nie mógł być wzbudzony wiązką oświetlajacą. Zjawisko transferu energii wykorzystuje się w pomiarach biofizycznych chcąc wykazać możliwość występowania bliskich kontaktów pomiędzy donorem i akceptorem. Jeden z partnerów może być np. kowalencyjnie związany z biopolimerem. Wystąpienie transferu energii świadczy wtedy, że drugi partner ma powinowactwo do tego samego centrum aktywnego. Innym zastosowaniem transferu energii może być badanie wnikania do błony lipidowej lub penetracji przez nią. Przy badaniu wnikania jeden z partnerów znajduje się w biwarstwie lipidowej, a drugi w roztworze wodnym. Wystąpienie transferu energii oznacza, że obaj partnerzy spotkali się wewnątrz błony lipidowej. Jeden z partnerów może być zamknięty wewnątrz pęcherzyków lipidowych (liposomów), a drugi znajdować się w roztworze wodnym na zewnątrz pęcherzyków. Penetracja jednego lub obu partnerów przez błonę pęcherzyka przejawi się wystąpieniem transferu energii. 4.5.3 Anizotropia fluorescencji Światło spolaryzowane liniowo preferencyjnie wzbudza cząsteczki, których moment przejścia jest zorientowany równolegle do płaszczyzny polaryzacji. Jeżeli pomiędzy absorpcją i emisją nie nastąpi rotacja cząsteczki, to I|| > I⊥, a anizotropia fluorescencji będzie miała wartość maksymalną: r = 0,4. Jeżeli fluorochrom ma dużą swobodę rotacyjną, to pomiędzy absorpcją i emisją dojdzie do przypadkowego ustawienia wektora momentu przejścia i anizotropia fluorescencji zaniknie: r ≈ 0.Kinetyka rotacji fluorochromu zależy od mikrolepkości środowiska lub stopnia usztywnienia struktury, do której przyłączona jest sonda fluorescencyjna. Znając czas życia stanu wzbudzonego (z innych pomiarów) i anizotropię fluorescencji możemy oszacować względną sztywność różnych części układu, np. błony lipidowej. 22 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań 4.5.4 Widma CD Efekt Cottona występuje w obszarze pasma absorpcyjnego asymetrycznie zaburzonego chromoforu. Zaburzenie symetrii chromoforu może wynikać z: obecności centrum chiralnego w sąsiedztwie chromoforu elementów asymetrii w strukturze biopolimeru, np. α-helisa w białku elementów asymetrii w strukturze kompleksu, np. śrubowego ułożenia cząsteczek w agregacie zmiany konformacji liganda pod wpływem oddziaływania asymetrycznych fragmentów biopolimeru (asymetria indukowana). Natężenie efektu Cottona jest tym większe im silniejsze jest zaburzenie. Dublet ekscytoniczny Bliskie sąsiedztwo przestrzenne asymetrycznych chromoforów prowadzi do wystąpienia w widmie CD tzw. dubletu ekscytonicznego. Widm o CD Widm o CD 200 200 220 240 260 280 220 240 260 280 300 300 Izolowany chromofor Chromofor zagregowany Dublet ekscytoniczny powstaje na skutek: rozszczepienia pasma absorpcyjnego, oraz przeciwnego znaku efektu Cottona dla każdego z nich. Znając moment przejścia izolowanego asymetrycznego chromoforu oraz kształt i intensywność dubletu ekscytonicznego można odtworzyć geometrię układu chromoforów. Asymetria indukowana Achiralny ligand oddziałujący z silnie asymetrycznym biopolimerem może ulec asymetrycznemu zaburzeniu. Zjawisko to nazywamy asymetrią indukowaną. Typowym przykładem asymetrii indukowanej jest występowanie efektu Cottona w widmach polimetylenopiroli (wzór poniżej) oddziałujących z małym rowkiem podwójnej helisy B DNA. Długa cząsteczka liganda wpasowuje się w mały rowek przyjmując kształt linii śrubowej. Wywołuje to silne asymetryczne zaburzenie chromoforów pirolowych tworzących szkielet cząsteczki. 4.5.5 Dichroizm liniowy Gdy chromofory w próbce są zorientowane wzdłuż wybranego kierunku widmo absorpcyjne mierzone zgodnie z kierunkiem orientacji jest różne od widma mierzonego prostopadle do tego kierunku. Efekt ten nazywamy dichroizmem liniowym (LD, ang. linear dichroism), a różnicę tych 23 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań widm widmem LD. Dichroizm liniowy występuje tylko w zakresie pasma absorpcji zorientowanego chromoforu. Warto zapamiętać, że dla wystąpienia dichroizmu liniowego (w odróżnieniu od dichroizmu kołowego) nie jest niezbędne chiralne zaburzenie chromoforu. Potrzebna jest jedynie makroskopowa orientacja momentów przejścia.Zjawisko dichroizmu liniowego zaobserwowano początkowo tylko w układach (biologicznych lub krystalicznych) o samoistnym uporządkowaniu dalekozasięgowym. W układach ożywionych uporządkowanie takie stwierdzamy np. we włóknach mięśniowych. Obecnie znamy szereg metod wymuszania orientacji cząsteczek w próbkach. Stosuje się je przede wszystkim do cząsteczek o wydłużonym kształcie. Efektywność tych metod wzrasta dodatkowo, jeżeli wektor momentu przejścia rozpatrywanego chromoforu pokrywa się z osią długą cząsteczki lub jest do niej prostopadły. DNA Podwójna helisa DNA jest ze względu na swój kształt i względnie dużą sztywność niemal idealnym obiektem badań z wykorzystaniem techniki LD. Dichroizm liniowy wykorzystany być może do uzyskania informacji o: 1. lokalnych zmianach orientacji zasad w stosunku do osi długiej helisy 2. orientacji ligandu oddziałującego z DNA W pierwszym przypadku korzysta się z pasm absorpcji zasad wchodzących w skład DNA, a w drugim przypadku z możliwie długofalowych pasm absorpcyjnych liganda. Białka włókniste Większość białek strukturalnych ma jeden z wymiarów dużo większy niż pozostałe dwa. Można je więc badać techniką LD po zorientowaniu jedną z opisanych wcześniej metod. Dla takich biopolimerów szczególnie przydatna jest metoda hydrodynamiczna. Pewnym utrudnieniem przy badaniu białek techniką LD jest brak w czasteczce białka chromoforu posiadającego pasma absorpcji w obszarze widzialnym lub bliskiego ultrafioletu. Najbardziej długofalowe pasmo absorpcji pochodzi od wiązania peptydowego i występuje przy ok. 210 nm, czyli na granicy tzw. próżniowego UV. W paśmie tym nakładają się na siebie 3 przejścia: dwa wzajemnie ortogonalne przejścia π→π* oraz jedno przejście n→π*. 24 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań π // π⊥ π⊥ Orientacje odpowiadających im momentów przejścia zależą od: i) rodzaju struktury II-rzędowej łańcucha peptydowego oraz ii) orientacji tej struktury względem osi długiej cząsteczki. Elementem struktury II-rzędowej białek, szczególnie łatwym do wykrycia w widmie LD jest helisa alfa. W widmie tej struktury (rysunek obok) jedno z przejść π→π* jest prawie prostopadłe, a drugie prawie równoległe do osi helisy. Przejściu n→π* odpowiada zwykle bardzo słaby sygnał LD. W innych strukturach II-rzędowych wzajemne proporcje sygnałów pochodzących od poszczególnych przejść nie są tak charakterystyczne. Na rysunku obok pokazano również widmo absorpcyjne próbki w świetle niespolaryzowanym: szara linia i prawa skala. Na uwagę zasługuje fakt, że dichroizm liniowy pochodzi od przejść, które na widmie absorpcyjnym są trudne do wychwycenia. Białka błonowe W komórce bardzo wiele białek związanych jest z błona komórkową. Mogą to być białka powierzchniowe (ułożone równolegle do powierzchni błony) lub białka transbłonowe (przebijające błonę w przybliżeniu prostopadle do jej powierzchni). Do badania białek tego typu techniką LD szczególnie przydatne okazały się równoległe biwarstwy lipidowe. Do badania oddziaływania biopolimerów a nawet małocząsteczkowych związków organicznych z błona lipidową wykorzystać można również inny układ modelowy: duże jednopowlokowe pęcherzyki lipidowe (LUV, ang. Large Unilamellar Vesicles). Efekt orientujący uzyskuje się pośrednio dzięki zastosowaniu metody hydrodynamicznej. LUV są na tyle elastyczne, że 25 Część IV: Optyczne metody badania oddziaływań przepływu cieczy wywołuje ich deformację: izotropowa forma sferyczna zmienia się w anizotropową formę elipsoidalną (rys. A poniżej). Tak zdeformowane pęcherzyki układają się ponadto swymi osiami długimi zgodnie z kierunkiem przepływu cieczy. Związki (biopolimery lub małocząsteczkowe ligandy) mogą oddziaływać z błoną na kilka różnych sposobów (rys. B – E). Jeżeli oddziaływanie to prowadzi do orientacji cząsteczek w stosunku do powierzchni błony (np. D – równolegle, E – prostopadle) to uzyskamy wyraźne i łatwe do interpretacji widma LD. 26
