WYBRANE TECHNIKI CYTOGENETYKI MOLEKULARNEJ OPARTE

WYBRANE TECHNIKI CYTOGENETYKI MOLEKULARNEJ OPARTE O FISH
(konspekt)
M-FISH (wielokolorowa FISH)
Zasada: Technika polega na jednoczesnym wybarwieniu wszystkich chromosomów na różne
kolory (każda sonda specyficzna dla danego chromosomu znakowana kombinacją jednego
lub kilku barwników fluorescencyjnych). Sondy malujące tak przygotowane, aby nie wiązały
się z sekwencjami powtarzalnymi i chromosomowo niespecyficznymi (zablokowane
sekwencje centromerowe i regiony heterochromatyny).
Zastosowanie:
- diagnostyka aberracji strukturalnych chromosomów – zwłaszcza złożonych translokacji
(z udziałem kilku chromosomów lub niewidocznych w analizie prążkowej tzw. Ukrytych
translokacji – obejmujących fragmenty o identycznym wzorze prążkowym)
- identyfikacja chromosomów markerowych, neocentrycznych chromosomów markerowych
(NMC) lub dodatkowego materiału nieznanego pochodzenia znajdującego się w
którymkolwiek z chromosomów
- diagnostyka cytogenetyczna komórek nowotworowych (identyfikacja licznych i złożonych
aberracji liczbowych i strukturalnych chromosomów – często analiza na podstawie barwień
klasycznych niemożliwa ze względu na niską rozdzielczość prążków i małą liczbę metafaz)
M-FISH a chromosomy markerowe:
→ zastosowanie przy nietypowym wyglądzie chromosomu markerowego (aby ustalić jego
pochodzenie)
uwaga!
małe odcinki euchromatyny mogą zostać niewykryte; również chromosom markerowy
zawierający jedynie sekwencje centromerowe (zablokowane sekwencje powtarzalne) może
zostać niezdiagnozowa – rozwiązanie cenM-FISH (Centromere-specific multi-color FISH)
- pozwala na identyfikację centromerów z wykorzystaniem znakowanego centromerowego
DNA jako sondy; technika użyteczna w charakterystyce małych nadliczbowych
chromosomów markerowych pozbawionych lub z niewielką ilością euchromatyny
M-FISH a SKY-FISH
W technice SKY-FISH subiektywna ocena barwy światła przez oko ludzkie zastąpiona
spektrofotometryczną analizą widma światła emitowanego przez poszczególne chromosomy.
Sonda komplementarna do określonego chromosomu jest unikatową kombinacją od jednego
do kilku barwników fluorescencyjnych różniących się widmem emitowanego światła. Po
przetworzeniu w odpowiednim programie komputerowym uzyskujemy różnokolorowy obraz
kariotypu, w którym każda para chromosomów wybarwiona jest innym kolorem
W technice SKY stosuje się jednocześnie 24 sondy molekularne (dla każdej pary
chromosomów autosomalnych oraz dla X i Y inna) wyznakowane różnymi kombinacjami 5
różnych fluorochromów. Komputerowa analiza widmowa obrazu po hybrydyzacji – ocena
całego kariotypu w jednym badaniu. Komputer nadaje poszczególnym chromosomom
pseudokolory– analiza w programie do kariotypowania z modułem M-FISH lub SKY
Co możemy wykryć dzięki SKY
→ określić punkty pęknięć chromosomów
→ wykryć niewielkie translokacje
→ określić skład chromosomów markerowych i jednolicie barwiących regionów HSR
→ scharakteryzować złożone rearanżacje
Czego nie możemy wykryć dzięki SKY
→ inwersji
→ duplikacji
→ delecji
Multicolor banding FISH (mBAND-FISH)
Metoda FISH pozwalająca wizualizować jedną parę chromosomów z prążkami różnego
pseudo koloru; pozostałe chromosomy wybarwione DAPI. Uwaga: mBAND nie
odpowiadają prążkom G w systemie ISCN.
Porównawcza hybrydyzacja genomów (CGH)
Technika umożliwia mapowanie zmian liczby kopii określonych sekwencji DNA w
chromosomach bez uprzedniej wiedzy o ich istnieniu, czy też znajomości ich umiejscowienia
w genomie.
Główne założenie:
jednoczesna i kompetytywna hybrydyzacja dwu znakowanych różnymi fluorochromami
izolatów DNA uzyskanych z komórek pacjenta oraz komórek prawidłowych (sondy) do
normalnej płytki metafazowej (DNA znakowany jest przede wszystkim w reakcji nicktranslacji)
Co jest potrzebne: preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie),
DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona), DNA
kontrolny – prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja
czerwona), Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko
powtarzające się.
Przebieg analizy: Po przeprowadzeniu hybrydyzacji do płytek metafazowych mieszaniny
DNA znakowanego odpowiednio na zielono (DNA pacjenta) i na czerwono (DNA
referencyjny otrzymany z prawidłowych komórek dawcy) [sondy konkurują o DNA
chromosomu] podlegają dalszej analizie z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego i
kamery CCD podłączonej do komputera.
Analiza wyników: Po ułożeniu kariotypu - analiza stosunku fluorescencji na całej długości
chromosomów dzięki zastosowaniu specjalistycznego programu komputerowego; najczęściej
analizuje się 10 – 16 chromosomów dla każdego przypadku; wyniki analizy w postaci profili
intensywności fluorescencji w obu kolorach oraz wartości stosunku „zieleń : czerwień”
wzdłuż każdego chromosomu. Wartość >1 lub <1 w określonym regionie danego
chromosomu oznacza odpowiednio zwiększenie lub zmniejszenie w DNA nowotworowym
liczby kopii sekwencji DNA specyficznej dla tego regionu ; nieprawidłowe regiony
chromosomów (wykazujące delecje, duplikacje) można charakteryzować wykorzystując
specyficzne sondy i klasyczną technikę FISH. Odchylenia od osi pionowej (stosunek równy
1) w kierunku czerwieni świadczą o delecji materiału genetycznego w danym regionie
chromosomu u pacjenta, w kierunku zieleni o amplifikacji lub duplikacji tego regionu.
ZALETY:
o możliwość analizy aberracji w obrębie wszystkich chromosomów przy wykorzystaniu
pojedynczej hybrydyzacji oraz uniknięcie często niemożliwych do wykonania badań
opartych na cytogenetyce klasycznej
o możliwość zastosowania na tkankach, z których nie uzyskano dzielących się komórek
o możliwe badanie komórek nowotworowych
WADY:
o nie jest wiarygodne rozpatrywanie delecji czy addycji chromosomowych w obszarach
centromeru i telomerów
o utrudniona diagnostyka mozaikowości
o brak możliwości wykrywania aberracji zrównoważonych (translokacja, inwersja)
Co możemy wykryć dzięki CGH
o pojawienie się dodatkowych chromosomów lub utratę całych chromosomów
o duplikacje i delecje fragmentów chromosomów
o translokacje niezrównoważone
Czego nie możemy wykryć dzięki CGH
o inwersji
o translokacji zrównoważonych
CESH (Comparative Expressed Sequence Hybridization)
Pierwsza technika pokazująca pełen profil ekspresji genów bezpośrednio w chromosomach
(Lu et al., 2001). Zasad taka sama jak w przypadku CGH.
FIBER-FISH
-
Hybrydyzacja do włókien chromatynowych - wykorzystuje chemiczne i fizyczne
działania na chromosomach interfazowych rozluźniające i prostujące włókna
chromatyny tak, że obrazowane mogą być pojedyncze pętle DNA
-
Możliwe odróżnienie sond leżących w odległości kilku kpz od siebie
Analizując wynik hybrydyzacji zwracamy uwagę na:
1) liczbę sygnałów na danym włóknie, które obejmuje zazwyczaj loci o znanej
lokalizacji
2) wzajemne położenie tych loci
Uwaga: kiedy kolejność testowanych loci na włóknie znana - przedstawiamy je w
porządku pter do qter
MICRO-FISH
Etapy analizy
1) Pobranie chromosomu obarczonego aberracją lub chromosomu markerowego przy
użyciu odpowiedniej aparatury – mikrodysekcja (chromosomy uprzednio barwione
(GTG).
2) Pobrany materiał namnażamy techniką DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed
polimerase chain reaction)
3) Namnożony produkt wykorzystujemy następnie w charakterze sondy do FISH
- znakujemy sondę stosując jedną z technik znakowania
- wyznakowaną sondę dodajemy do mieszaniny hybrydyzacyjnej
4) FISH wykonujemy u badanego pacjenta ze zmienionym kariotypem oraz dla
porównania na prawidłowych płytkach metafazowych, aby określić pochodzenie aberracji
MICROARRAY CGH
Zasada metody: Taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany
wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA
umieszczone na mikromacierzy; mikromacierz może zawierać klony DNA pokrywające
tylko jeden chromosom, wybrane regiony odpowiedzialne za zespoły genetyczne lub cały
genom. Umożliwia analizę całego genomu, fragmentów chromosomów lub określonych
chromosomów z rozdzielczością zależną tylko od liczby zastosowanych klonów. Ocenę
niezrównoważenia kariotypu przeprowadza się przez określenie profilu fluorescencji –
zielony/czerwony uzyskanego w poszczególnych parach chromosomów homologicznych i
analizie ilościowej ich wzajemnego stosunku. Statystyczna analiza polega na uśrednieniu
wyników uzyskanych dla 10–20 płytek metafazowych; termin „częściowa aneuploidia”
używany do określenia aberracji wykrytej tą metodą – niemożliwe określenie, czy
nadwyżkowy materiał jest duplikacją, czy chromosomem markerowym, wiadomo jedynie,
że dany segment DNA występuje w nieprawidłowej ilości
ZALETY:
o
bardzo wysoka rozdzielczość badania
o
możliwość wykrywania bardzo małych delecji
WADY:
niemożliwe wykrywanie aberracji zrównoważonych
o
o
wysoki koszt badania
o
utrudniona diagnostyka mozaikowości