AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR)

AmpliTest Panel odkleszczowy
(Real Time PCR)
Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych
dla bakterii Borrelia burgdorferi, Anaplasma, Ehrlichia
oraz pierwotniaków rodzaju Babesia (B. canis , B. gibsoni,
B. divergens) techniką Real Time PCR
Nr kat.: BAC13-50
Wielkość zestawu: 50 oznaczeń
Objętość pojedynczej reakcji: 20 µL
Limit detekcji: 6 kopii DNA
Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją.
Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830
www.amplicon.pl email: [email protected], tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE
Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) jest przeznaczony do
wykrywania sekwencji specyficznych dla bakterii z grupy Borrelia burgdorferi,
bakterii z rodzaju Anaplasma oraz Ehrlichia, a także wybranych gatunków
pierwotniaków rodzaju Babesia (B. canis , B. gibsoni, B. divergens) w preparatach
DNA uzyskanych z tkanek zwierzęcia (kleszcza, ssaka). W celu uniknięcia
problemów z wydajnością reakcji Real Time PCR preparaty DNA powinny być
przygotowane przy użyciu metod pozwalających otrzymać wysokiej jakości DNA
pozbawiony inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji DNA oparte
o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe).
ZAKRES STOSOWANIA
 Diagnostyka weterynaryjna in vitro
 Badania i rozwój (B+R)
SKŁADNIKI ZESTAWU
Nazwa
Opis
Ilość
Kolor wieczka
RM
Mieszanina reakcyjna 2 × 300 µL Zielony
PC
Kontrola pozytywna
2 × 50 µL
Czerwony
NC
Kontrola negatywna
2 × 50 µL
Niebieski
Woda
Woda
2 × 300 µL Biały
TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE
 Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją
natychmiast rozpakować.
 Składniki testu przechowywać -20°C.
 UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO;
 Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu w
szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia składnika
RM nie wpływają znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na etykietach
probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w których można
zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji.
 Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia.
2
ZASADA DZIAŁANIA
Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) zawiera startery
namnażające fragmenty genomów badanych patogenów. Detekcja obecności
DNA charakterystycznego dla wykrywanych patogenów następuje dzięki
specyficznym sondom typu TaqMan®, które przyłączając się do powstających
amplikonów (powielanych fragmentów DNA) ulegają hydrolizie. Podczas
hydrolizy z sond uwalniane są barwniki fluorescencyjne FAM, Cy5 oraz Texas
Red, który są następnie wykrywane przez układ optyczny aparatu do Real Time
PCR. Odpowiednio dobrane sekwencje starterów i sond zapewniają wysoką
specyficzność reakcji.
W
celu
zwiększenia
wiarygodności
wyników
Zestaw
AmpliTest
Panel
odkleszczowy (Real Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny
fragment DNA) oraz układ starterów i sondy do jej namnożenia i detekcji.
Detekcja kontroli wewnętrznej odbywa się dzięki uwalnianiu przez sondę
barwnika fluorescencyjnego HEX. Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na
monitorowanie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time PCR. Amplifikacja
kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania
specyficznej
dla
oznaczanych
patogenów.
Pozytywny
wynik
sekwencji
kontroli
wewnętrznej stanowi potwierdzenie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time
PCR.
POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY
 Aparat do Real Time PCR:
LightCycler 480 (Roche)
LightCycler 96 (Roche)
RotorGene 3000/6000 (Qiagen)
Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych
FAM, HEX, Cy5 oraz Texas Red.
Zestaw AmpliTest Panel odkleszczowy (Real Time PCR) nie zawiera
barwnika normalizacyjnego ROX. Dodanie barwnika ROX do mieszaniny
reakcyjnej nie jest możliwe, gdyż odpowiadający mu kanał detekcji jest
3
zarezerwowany dla barwnika Texas Red® uwalnianego przez sondę
wykrywającą sekwencję specyficzną dla bakterii Anaplasma/Ehrlichia.
 Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od
posiadanego urządzenia do Real Time PCR)
 Wirówka do probówek reakcyjnych
 Wirówka stołowa
 Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µL
 Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych
 Zestaw do izolacji DNA
W zależności od użytego zestawu do izolacji DNA może być potrzeby
dodatkowy sprzęt i materiały.
IZOLACJA DNA
Z poszczególnych osobników pobrać fragmenty tkanek, a następnie wyizolować
DNA. Ilość potrzebnego materiału zależy od użytej metody izolacji DNA. Do
izolacji DNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe
(tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek DNA o
odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku
innych metod izolacji preparat DNA może zawierać związki, które istotnie
zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w
skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki DNA należy
przechowywać w +4°C (krótki okres przechowywania) lub w -20°C (długi okres
przechowywania).
REAKCJA REAL TIME PCR
1. Określić liczbę próbek DNA poddawanych analizie (n).
2. Rozmrozić składniki testu. Po rozmrożeniu składników dokładnie wymieszać
zawartość probówek i krótko je zwirować. Składniki po rozmrożeniu
przechowywać w +4°C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI składnika RM NA
ŚWIATŁO.
3. Określić ilość DNA dodawanego do reakcji (x µL).
Optymalna ilość DNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość DNA dodawanego do
reakcji nie powinna przekroczyć 400 ng. Duże ilości DNA dodanego do reakcji PCR
4
hamują aktywność polimerazy DNA i obniżają czułość testu. Typowo 100-200 ng
DNA jest zawarte w 1-5 µL próbki DNA uzyskanej przy użyciu zestawu
kolumienkowego.
4. Dokładnie wymieszać ze sobą (n + 3) × 12 µL mieszaniny reakcyjnej RM oraz
(n + 3) × (8 - x) µL wody.
5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce)
nanieść po (20 – x) µL przygotowanej mieszaniny.
6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych preparatów DNA.
Do jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę
negatywną NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: kontrolę
pozytywną należy dodać jako ostatnią.
7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować.
8. Probówki reakcyjne umieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję
według następującego protokołu:
Denaturacja wstępna
Amplifikacja (45 cykli)
Schłodzenie aparatu
95°C 5 min
95°C 10 s
60°C 50 s*
30-40°C 30s (zależnie od typu aparatu)
*Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM, HEX,
Cy5 oraz Texas Red. Kanał dla FAM służy do wykrywania sekwencji specyficznej
dla bakterii z grupy Borrelia burgdorferi, kanał Cy5 do wykrywania sekwencji
specyficznej dla wybranych pierwotniaków rodzaju Babesia, na kanale Texas Red
wykrywa się sekwencje specyficzną dla bakterii z rodzaju Anaplasma i Ehrlichia.
Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej.
5
INTERPRETACJA WYNIKÓW
Cy5
HEX
Wynik
+
+
+
Prawidłowy
2
Kontrola negatywna
-
-
-
+
Prawidłowy
3
Oznaczenie 1
+
-
-
+
4
Oznaczenie 2
-
+
-
+
5
Oznaczenie 3
-
-
+
+
6
Oznaczenie 4
+
-
+
+
7
Oznaczenie 5
-
+
+
+
8
Oznaczenie 6
+
+
-
+
9
Oznaczenie 7
+
+
+
+
10
Oznaczenie 8
-
-
-
+
Wykrywane
sekwencje
poniżej
+
Opis wyników w tekście
Kontrola pozytywna
Borrelia burgdorferi
1
Kontrola wewnętrzna
Texas Red
Babesia
FAM
Anaplasma/Ehrlichia
L.p. Rodzaj próbki
Oznaczenia 1-3 – wyniki dodatnie wskazujące na obecność w preparacie DNA jednego oznaczanego patogenu;
Oznaczenia 4-6 – wyniki dodatnie wskazujące na obecność w preparacie DNA dwóch oznaczanych patogenów;
Oznaczenie 7 – wynik dodatni wskazujący na obecność w preparacie DNA wszystkich trzech oznaczanych
patogenów;
Oznaczenie 8 – wynik ujemny.
Brak odczytu w kanale dla HEX* oznacza, że reakcja Real Time PCR nie
przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu
fluorescencji w kanałach dla badanych próbek w przypadku kontroli pozytywnej i
negatywnej wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest Panel odkleszczowy
(Real Time PCR) (niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu
przydatności do użycia itp.). Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w
przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla
badanych próbek DNA oznacza złą jakość próbek DNA (obecność związków
hamujących reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość DNA użytego w reakcji. W tym
6
przypadku należy do reakcji dodać mniejszą objętość próbki DNA, jednocześnie
dodając taką objętość wody, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µL.
*Przy bardzo wysokim mianie bakterii/pierwotniaków może wystąpić brak odczytu w kanale
HEX przy jednoczesnym odczycie w kanale FAM/Cy5/Texas Red. Zaleca się wtedy
powtórzenie reakcji z zmniejszoną (10-100-krotnie) ilością DNA dodanego do reakcji.
UWAGI DODATKOWE
 Zastosowane sondy TaqMan® posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ
(Black
Hole
Quencher™),
które
nie
generują
dodatkowych
sygnałów
fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000),
jako typ wygaszacza należy wybrać opcję „none”.
 Przygotowany test wykrywa powyżej 6 kopii bakteryjnego DNA obecnych w
dodawanej próbce. Preparaty DNA uzyskane z pojedynczych osobników
można ze sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym
celu równe objętości preparatów DNA (np. 10 µL) przeznaczonych do
pulowania należy ze sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji
Real Time PCR. Pulowaniu można również poddawać kleszcze, tj. izolować
DNA z kilku osobników jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że pulowanie
preparatów DNA zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w
przypadku próbek zawierających niewielką ilość bakterii.
 Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µL. Zmniejszenie objętości
reakcji powoduje znaczące zmniejszenie czułości testu.
 Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji DNA, a materiał
biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie
zakażony.
 Izolację DNA oraz detekcję obecności patogenów powinien wykonać
odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie
wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym.
Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji DNA nie doszło do
krzyżowego zanieczyszczenia próbek DNA izolowanych równolegle.
 W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się
przestrzegać następujących zasad:
- w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji DNA,
przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy;
7
- pomiędzy etapami izolacji DNA, przygotowania reakcji Real Time PCR
należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany
rękawiczek jednorazowych;
- powierzchnię stanowisk do izolacji DNA i przygotowania reakcji Real Time
PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi DNA;
- do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z
filtrem;
- podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR kontrolę pozytywną PC
należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem, w miarę możliwości, należy
zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC.
TaqMan® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc.
LightCycler® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH.
Black Hole Quencher™ jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc.
Texas Red® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Molecular Probes, Inc.
Cy5® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Amersham Biosciences Corp.
8