Tkanka limfoidalna i układ limfatyczny

Mechanizmy obronne organizmu:
Odporność wrodzona:
Tkanka limfoidalna
i układ limfatyczny
• bariery nabłonkowe
• komórki fagocytujące
• ostre stany zapalne
(neutrofile, makrofagi, inne granulocyty,
mastocyty)
• limfocyty NK
• układ dopełniacza
Odporność adaptatywna (nabyta)
• reakcje immunologiczne
(limfocyty B, T, komórki prezentujące antygen,
makrofagi)
Antygen: substancja (zazwyczaj białko) wywołująca
reakcję immunologiczną
Epitop: fragment antygenu rozpoznawany przez
receptory limfocytów i/lub wiążący się
z przeciwciałem
Przeciwciało (immunoglobulina): białko
(produkowane głównie przez komórki
plazmatyczne) swoiście wiążące epitop
klasy: IgG, IgM, IgD, IgE,
IgA - zmodyfikowane przez
komórki wydzielnicze
Antygeny:
• własne (tolerowane przez układ immunologiczny;
ważne: antygeny zgodności tkankowej MHC I i II)
• obce (atakowane przez układ immunologiczny,
np. bakteryjne, wirusowe, pasożytnicze, przeszczepu)
Subpopulacje limfocytów:
Limfocyty B - odpowiedzialne za humoralną
reakcję immunologiczną,
BCR
receptor BCR (immunoglobulina
powierzchniowa)
Limfocyty T - odpowiedzialne za komórkową
reakcję immunologiczną,
receptor TCR
TCR
• limfocyty T pomocnicze (T H)
• limfocyty T cytotoksyczne (T C)
• limfocyty T regulatorowe (T reg) = supresyjne (T S)
Limfocyty NK (natural killers)
Specyficzne białka (antygeny) powierzchniowe limfocytów:
• CD20, CD40 – limfocyty B
• CD4 – limfocyty T H
• CD8 – limfocyty T C
• CD4, CD25 – limfocyty T reg
• CD16, CD56 – limfocyty NK
Komórki prezentujące antygen (APC):
1. „Profesjonalne” (działają spontanicznie)
• makrofagi
• komórki dendrytyczne
- kom. dendrytyczne w tkance limfoidalnej
- kom. splatające się w tkance limfoidalnej
- kom. Langerhansa w naskórku i innych
nabłonkach (jama ustna, drogi oddechowe)
• limfocyty B
2. „Nieprofesjonalne” (wymagają stymulacji
cytokinami)
• komórki nabłonkowe zrębu grasicy
• komórki śródbłonka naczyń
• fibroblasty
• komórki mikrogleju
Komórki APC pochłaniają antygen, nadtrawiają go (w lizosomach,
niekiedy w proteasomach) i wystawiają jego fragmenty (epitopy)
na swoją błonę komórkową razem z antygenem MHC II - prezentując
w ten sposób antygen limfocytom T.
1
Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź humoralna
1. Przyłączenie obcego antygenu do receptora limfocytu B
2. Pobranie i prezentacja antygenu przez limfocyt B (pełni rolę APC)
limfocytowi TH2 – aktywacja limfocytu TH2 (wydziela cytokiny)
3. Aktywacja limfocytu B przez cytokiny limfocytu TH2
4. Proliferacja limfocytu B (powstaje klon identycznych limfocytów B)
5. Transformacja limfocytów B w plazmocyty
6. Plazmocyty produkują przeciwciała (immunoglobuliny) skierowane
przeciw antygenowi, który wywołał reakcję
Typy reakcji immunologicznych: odpowiedź komórkowa
1. Rozpoznanie obcego antygenu (związanego z komórką)
przez komórkę APC i aktywacja limfocytu TH1
2. Limfocyt TH1 aktywuje limfocyty TC
3. Proliferacja limfocytów TC
4. Kontakt limfocytów TC z komórkami obcymi antygenowo
5. Limfocyty TC zabijają obce antygenowo komórki, wydzielając
specjalne białka: perforyny i granzymy
! Niektóre limfocyty TC pozostają jako limfocyty T pamięci
! Niektóre limfocyty B nie przekształcają się w komórki plazmatyczne,
pozostając jako limfocyty B pamięci
Perforyny wbudowują się w błonę
komórkową atakowanej komórki
i tworzą w niej stale otwarte kanały
Granzymy wnikają do wnętrza
atakowanej komórki i indukują
proces apoptozy
Limfocyty NK (natural killers):
• nie mają cech limfocytów B ani T
• duże (12 µm)
• zawierają dość liczne, duże
pęcherzyki hydrolazowe
• stała „gotowość” cytotoksyczna
• zabijają:
- komórki obce antygenowo, zwłaszcza pokryte przeciwciałami
(ADCC)
- komórki bez „własnych” antygenów MHC lub z ich obniżoną
ekspresją (np. komórki zainfekowane wirusami, komórki
nowotworowe)
• mechanizm zabijania
taki jak limfocytów Tc
atak...
i zwycięstwo
Umiejscowienie tkanki limfoidalnej:
Tkanka limfoidalna =
• tkanka łączna siateczkowa +
• bardzo liczne limfocyty
• narządy limfatyczne:
węzły chłonne
Tkanka łączna siateczkowa:
• sieć włókien siateczkowych
tworzących rusztowanie dla
• komórek z wypustkami
(fibroblasty, makrofagi,
komórki dendrytyczne)
śledziona
grasica*
• tkanka limfoidalna błon śluzowych:
- migdałki
- przewód pokarmowy wraz z wyrostkiem
robaczkowym
- drogi oddechowe
2
Formy tkanki limfoidalnej:
Węzeł chłonny
• zrąb łącznotkankowy:
• grudkowa
- torebka
- beleczki/przegrody
(głównie limfocyty B)
• rozproszona
(limfocyty T i B)
Grudki chłonne:
• pierwotne
• wtórne (po kontakcie z obcym antygenem)
- mankiet
- ośrodek odczynowy (namnażanie
limfocytów B, przekształcanie w komórki
plazmatyczne)
B
T
• obszary:
- kora (grudki chłonne,
głównie limfocyty B)
- pas przykorowy (tkanka
limfoidalna rozproszona,
głównie limfocyty T)
- rdzeń (sznury rdzenne,
limfocyty B, T, komórki
plazmatyczne)
Węzły chłonne są „filtrami” na przebiegu naczyń limfatycznych,
monitorują antygeny obecne w chłonce i w razie potrzeby inicjują
reakcje immunologiczne
Drogi
przepływu chłonki
przez węzeł chłonny
1. Naczynia chłonne
doprowadzające
2. Zatoki brzeżne
3. Zatoki przybeleczkowe
(promieniste)
4. Zatoki rdzenne
5. Naczynie chłonne
wyprowadzające
kora i
pas przykorowy
Zatoki: przestrzenie wyścielone
nieciągłą warstwą komórek
śródbłonkowych
rdzeń
zatoki brzeżne i przybeleczkowe
Recyrkulacja
limfocytów
zatoki rdzenne
Naczynia chłonne
• tkanka limfoidalna węzła
• zatoki przykorowe
i rdzenne węzła
• wyprowadzające naczynie
chłonne
• krew
• żyłki o wysokim
śródbłonku
• tkanka limfoidalna węzła
Żyłki o wysokim śródbłonku (HEV) –
postkapilary wyścielone sześciennymi
lub walcowatymi komórkami
śródbłonkowymi – miejsce migracji
limfocytów z krwi do tkanki
limfatycznej
Kapilary:
• kom. śródbłonkowe (ściana ciągła,
ale o znacznej przepuszczalności)
• blaszka podstawna
Większe naczynia chłonne:
• budowa ściany jak w cienkościennych żyłach
• obecne zastawki
3
Miazga biała: tkanka limfoidalna jest rozmieszczona na przebiegu
Śledziona
małych tętnic (tętniczek centralnych) i tworzy:
• pochewki okołotętnicze (głównie limfocyty T)
• lokalne zgrubienia pochewek - grudki chłonne śledzionowe
(głównie limfocyty B)
Zrąb
łącznotkankowy:
• torebka
• beleczki
TC
Obszary:
• miazga biała (tkanka limfoidalna)
• miazga czerwona (tkanka łączna siateczkowa z licznymi
cienkościennymi naczyniami krwionośnymi)
Tkanka limfoidalna miazgi białej monitoruje skład antygenowy
przepływającej krwi
Miazga czerwona:
• sznury śledzionowe: tkanka łączna
siateczkowa z licznymi makrofagami,
obecna krew (otwarte krążenie)
• zatoki śledzionowe (kapilary
o nieciągłej ścianie)
• żyły miazgowe
Zatoka śledzionowa:
• wrzecionowate komórki śródbłonkowe
(komórki pręcikowe) z szerokimi
szczelinami międzykomórkowymi
• okrężne włókna srebrochłonne
• nieciągła blaszka podstawna
Strefa brzeżna
Makrofagi miazgi czerwonej fagocytują
i trawią „stare” erytrocyty
Strefa brzeżna (pogranicze miazgi białej i czerwonej) jest miejscem
pierwszego kontaktu antygenów z tkanką limfoidalną śledziony
• liczne niewielkie naczynia zatokowe
• liczne komórki prezentujące antygeny
miazga biała
Otwarte krążenie krwi w śledzionie
Miazga czerwona:
tętnice beleczkowe (1)
tętniczki centralne (2)
tętniczki pędzelkowe (3)
OTWARTE kapilary osłonkowe* (4)
przestrzenie międzykomórkowe
sznurów śledzionowych (5)
OTWARTE zatoki śledzionowe (6)
żyły miazgowe (7)
żyły beleczkowe (8)
6
miazga czerwona
4
3
5
9
7
Miazga biała:
tętnice beleczkowe (1)
tętniczki centralne (2)
OTWARTE gałązki tętniczek centralnych (9)
przestrzenie międzykomórkowe strefy brzeżnej
OTWARTE zatoki strefy brzeżnej (10)
2
10
8
strefa
brzeżna
1
beleczka
Beleczki:
- tętnice i żyły
beleczkowe
Grasica różni się od innych
narządów limfatycznych:
• pochodzenie nabłonkowe
• brak tkanki łącznej siateczkowej
• brak grudek chłonnych
• wyłącznie limfocyty T (tymocyty)
• nie zachodzą reakcje immunologiczne
skierowane przeciw obcym antygenom
• funkcja: „szkoła” dla niedojrzałych
limfocytów T
Budowa pseudozrazikowa:
• torebka łącznotkankowa
• niekompletne przegrody
łącznotkankowe dzielące miąższ na
obszary (zraziki) o podobnej budowie
Strefy zrazika grasiczego:
• kora (bardzo liczne limfocyty)
• rdzeń (mniej liczne limfocyty)
*kapilary osłonkowe – otoczone warstwą
fibroblastycznych komórek siateczkowych i makrofagów
4
1. Komórki gwiaździste
prezentują własne antygeny MHC
dojrzewającym limfocytom T
Wewnętrzne rusztowanie zrazików grasicy budują komórki nabłonkowe
(nabłonkowo-siateczkowe) różnych typów:
komórka
gwiaździsta
• gwiaździste
• barierowe
• ciałek Hassalla
2. Komórki barierowe
Są połączone strefami zamykającymi,
tworząc bariery oddzielające korę
zrazika od tkanki łącznej, naczyń
krwionośnych (bariera krew-grasica)
i od rdzenia. Bariera uniemożliwia
dostęp obcych antygenów na teren
kory (przedwczesna aktywacja limfocytów
prowadziłaby do ich apoptozy).
Komórki nabłonkowo-siateczkowe
tworzą sieć, w jej przestrzeniach
leżą:
• limfocyty T
• makrofagi
• komórki dendrytyczne
Dojrzewanie limfocytów w grasicy
3. Ciałka Hassalla
• tylko w rdzeniu zrazików
• koncentryczny układ komórek nabłonkowych,
często degenerujacych (szkliwienie, rogowacenie)
• wydzielają cytokiny kontrolujące dojrzewanie limfocytów Treg
komórka gwiaździsta
prezentująca MHC
• ekspresja receptorów TCR
receptory
• ekspresja antygenów CD
(różnicowanie w komórki
TH, TC lubTreg)
• selekcja: komórki gwiaździste
i komórki dendrytyczne
prezentują limfocytom własne
niedojrzałe limfocyty T
antygeny – limfocyty, które ich
nie rozpoznają albo rozpoznają,
ale atakują – giną na drodze apoptozy
- przeżywa zaledwie ok. 2 %!
selekcja
słabe
wiązanie
przechodzą
do krwi
mocne
wiązanie
(atak)
brak
wiązania
apoptoza i
eliminacja przez
makrofagi
Przeżywają zatem te, które rozpoznają
i tolerują własne antygeny organizmu.
Grasica zanika po okresie pokwitania – zostaje zastąpiona przez tkankę
tłuszczową.
Limfocyty B dojrzewają w szpiku krwiotwórczym, gdzie ulegają
podobnej selekcji – własne antygeny są im prezentowane przez
komórki zrębowe
Migdałki
krypty
• są wbudowane w błonę śluzową
(należą do tzw. tkanki limfoidalnej
błon śluzowych)
• ich powierzchnię pokrywa
nabłonek, który tworzy
wpuklenia – krypty)
• krypta otoczona tkanką
limfoidalną = mieszek
• obecne grudki chłonne
i rozproszona tkanka limfoidalna
• przeważają limfocyty B
• brak doprowadzających naczyń
chłonnych, obecne naczynia
wyprowadzające
Tkanka limfoidalna migdałków reaguje
na antygeny obecne w jamie gardłowej
(powietrze, pokarm), jeżeli przejdą one
przez barierę nabłonkową
5
Migdałki podniebienne
Migdałek gardłowy
• największe
• otoczone łącznotkankową torebką
• liczne (ok. 20) głębokie krypty
• nabłonek wielowarstwowy płaski
• wpuklenia nabłonka (rowki
oddzielające fałdy błony
śluzowej)
• nabłonek dróg oddechowych
(wieloszeregowy z migawkami
i komórkami kubkowymi)
krypta
Migdałki trąbkowe
Migdałek językowy
• zlokalizowane u ujścia
trąbek słuchowych
• brak wpukleń nabłonka
• nabłonek dróg oddechowych
• pojedyncza,
rozgałęziona krypta
• nabłonek
wielowarstwowy płaski
PODSTAWY
IMMUNOHISTOCHEMII
Determinanty antygenowe (epitopy)
- fragmenty cząsteczki antygenu, z którymi
reagują przeciwciała
Metody immunohistochemiczne wykorzystują swoiste
wiązanie antygenu przez przeciwciało
Struktura cząsteczki immunonoglobuliny
domeny
Miejsce wiązania
antygenu (Fab)
Miejsce wiązania
antygenu (Fab)
Jednak potocznie mówi się o reakcji antygenu
z przeciwciałem
Przeciwciała
poliklonalne
monoklonalne
Fab – 2x
Wiążą różne epitopy antygenu
Wiążą tylko jeden rodzaj epitopu
6
Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych
Otrzymywanie
przeciwciał
monoklonalnych
immunizacja zwierząt –
kilkukrotne podanie
parenteralne antygenu
z adjuwantem
pobranie krwi i
uzyskanie oczyszczonej
surowicy
Reakcja antygen-przeciwciało
stereospecyficzne łączenie przeciwciała i
determinanty antygenowej - odległość
pomiędzy cząsteczkami 0.2-0.3 nm sprzyja
powstawaniu bardzo licznych wiązań van Der
Waalsa i innych słabych oddziaływań
nie powstają wiązania kowalencyjne
Reakcja antygen-przeciwciało,
a metoda IHC
- każda substancja (białko) pochodzące od
jednego gatunku jest antygenem dla
osobnika innego gatunku
- immunoglobuliny jednego gatunku
stanowią antygen dla osobników innego
gatunku
Metody immunohistochemiczne
• dzięki wykorzystaniu swoistych przeciwciał
pozwalają na identyfikację w materiale
histologicznym specyficznych białek
(antygeny)
• dzięki czułym metodom detekcji umożliwiają
rozpoznanie bardzo małych ilości antygenu
Znakowanie przeciwciał
MIKROSKOPIA ŚWIETLNA
enzymy
fluorochromy
MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA
ferrytyna
złoto koloidalne
7
Znakowanie
enzymami
Enzymy stosowane w IHC
SUBSTRAT
E
PRODUKT
peroksydaza chrzanowa (HRP)
alkaliczna fosfataza (AP)
oksydaza glukozowa (Aspergillus niger)
β-galaktozydaza (E. coli)
Przeciwciała znakowane enzymami wymagają
przeprowadzenia dodatkowej reakcji histochemicznej
wykrywającej aktywność enzymu. Stosowane do tego
celu odczynniki noszą nazwe chromogenów
Chromogeny
Znakowanie
fluorochromami
PEROKSYDAZA
3,3’diaminobenzydyna (DAB)
3amino-9etylokarbazol (AEC)
4chloro-1naftol (CN)
FOSFATAZA ALKALICZNA
new fuchsin
fast red
F
Fluorochromy
pochodne fluoresceiny (np. FITC),
Cy2, AlexaFluor 488
pochodne rodaminy (np. TRITC),
Cy3, Texas Red, AlexaFluor 555
pochodne kumaryny (np. AMCA),
AlexaFluor 405
światło emisji
ENERGIA
ENERGIA
światło wzbudzenia
Fluorochromy - przykłady
F
Cy5, AlexaFluor 647 – emisja w
widmie podczerwieni
FITC
wzbudzenie - max. 494 nm
emisja - max. 520 nm
Mikroskop
epifluorescencyjny
8
Typy reakcji immunohistochemicznych
Typy reakcji immunohistochemicznych
reakcja pośrednia
dwuetapowa
reakcja bezpośrednia
przeciwciało
pierwotne
przeciwciało wtórne przeciw immunoglobulinom
(antyglobulina) - znakowane
znacznik –
np. fluorochrom
Typy reakcji immunohistochemicznych
Typy reakcji immunohistochemicznych
reakcja pośrednia PAP
reakcja pośrednia ABC
(peroxidase anti-peroxidase)
(avidin-biotin complex)
SUBSTRAT
HRP
SUBSTRAT
HRP
PRODUKT
przeciwciało wtórne
- biotynylowane
PRODUKT
Reakcja z polimerami
Typy reakcji immunohistochemicznych
reakcja pośrednia LAB
(labeled avidin*-biotin)
reakcja dwuetapowa
SUBSTRAT
HRP
przeciwciało wtórne
- biotynylowane
PRODUKT
* ... lub streptavidin (LSAB)
9
Uwagi praktyczne
Zawiązek kończyny – wzrastające włókna nerwowe
GAP-43
HE
utrwalanie materiału i odtwarzanie miejsc wiązania
przeciwciał (metody przygotowania skrawków)
preinkubacja z normalną, nieimmunogenną surowicą
blokowanie endogennej aktywności enzymatycznej
inkubacje z przeciwciałami (rozcieńczenia, czas) oraz
płukanie w buforze pomiędzy etapami
(przyklejanie skrawków)
podwójne barwienia
reakcje kontrolne
tło i podbarwianie
problemy z fluorochromami
Mózg człowieka - astrocyty
Migdałek podniebienny
GFAP
CD20
Płuca – ciałka neuroepitelialne (NEBs)
w drogach oddechowych
Unerwienie tętnicy w
mięśniu szkieletowym
CD3
GAP-43
PGP 9.5
CGRP
PARV
10
Linia komórek HeLa
Zwój międzykręgowy
GAP-43
CGRP
α− tubulina
11