Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA

WEKTORY WYSPECJALIZOWANE
Cechy budowy dobrych wektorów:
1) rodzaj replikonu umożliwiający dużą liczbę
kopii plazmidu, im więcej tym lepiej;
2) występowanie wielu unikalnych miejsc
restrykcyjnych zgrupowanych w określonym
obszarze plazmidu zwanym MCS lub
miejscem wielokrotnego klonowania, im
więcej tym lepiej;
3) obszar MCS powinien być ograniczony
specyficznymi promotorami dla wydajnych polimeraz
RNA takich jak: polimeraza RNA T7, SP6 lub T3.
Można to wykorzystać do otrzymania dużych ilości
specyficznego transkryptu klonowanego fragmentu
DNA w reakcji in vitro;
4) wektor może posiadać dodatkowe ori replikacji dla
jednego z fagów filamentarnych (M13, f1), w celu
potencjalnego wykorzystania plazmidu do
otrzymywania DNA w formie jednoniciowej, kolistej
matrycy, z przeznaczeniem do reakcji
sekwencjonowania czy miejscowo-specyficznej
mutagenezy;
5) wektor powinien posiadać elementy genetyczne
wykorzystywane do selekcji rekombinantów.
Wektory do ekspresji genów
(nadprodukcji białek)
Wektory te umożliwiają ogromną
nadprodukcję białek (stanowiącą od kilku
do kilkudziesięciu procent ogólnej masy
białek w komórce) wykorzystując
właściwości wyselekcjonowanych, dobrze
regulowanych i bardzo silnych
promotorów.
Wektory do ekspresji genów
(nadprodukcji białek)
Istnieją dwa możliwe podejścia regulacji ekspresji badanego
genu:
fuzje genowe transkrypcyjne - gen przeznaczony do
ekspresji posiada własny rejon RBS i sekwencję kodującą
(wektor dostarcza silnego promotora);
fuzje genowe translacyjne - gen przeznaczony do ekspresji
musi być najczęściej produktem amplifikacji PCR, z
przekształconym początkiem sekwencji kodującej, w taki
sposób aby po przecięciu enzymem NdeI (CATATG) lub NcoI
(CCATGG) pasował w istniejącą na plazmidzie ramkę odczytu.
Tak jest jeśli fuzja dotyczy pierwszego kodonu inicjatorowego
AUG. Powstaje wtedy białko niezmienione, dzikiego typu.
Wektor w tego typu fuzjach dostarcza zatem promotor i rejon
RBS, wraz z kodonem inicjatorowym ATG. Pozycje sekwencji
SD i ATG narzucają jedyną możliwą ramkę odczytu.
Inaczej jest jeśli do utworzenia fuzji genowej
wykorzystamy inne miejsce restrykcyjne,
położone w miejscu wielokrotnego
klonowania (MCS).
Miejsce to położone jest za kodonem
inicjatorowym, ale umożliwia klonowanie, w
którym sekwencja kodująca genu zachowa
właściwą sobie ramkę odczytu.
Powstaje wtedy białko fuzyjne, z
dodatkowymi aminokwasami na N- lub Ckońcu. Ma to miejsce zwłaszcza, kiedy
przeprowadzamy fuzje z różnego typu
ogonkami peptydowymi (ang. tag),
oferowanymi nam przez dany wektor.
Wykorzystanie tego typu możliwości znajduje
zastosowanie głównie w ułatwianiu
oczyszczania produktów białkowych (dotyczy
to m.in. peptydów fuzyjnych His-tag, S-tag) lub
ich identyfikacji przy pomocy specyficznych
przeciwciał (dotyczy to m.in. peptydów
fuzyjnych T7-tag, S-tag).
W wektorach ekspresyjnych powinno się
unikać sytuacji, kiedy gen oporności na
antybiotyk ma własny stosunkowo silny
promotor lub jest w tej samej orientacji co gen
główny.
Tworzy to sytuację współzawodnictwa między
dwoma promotorami, co w efekcie prowadzi
do ograniczenia produkcji białka
rekombinacyjnego (głównego) i dwukrotnego
spadku jej wydajności kosztem
niepotrzebnego zwiększenia poziomu białka
oporności na antybiotyk.
To że poziom białka dającego
antybiotykooporność zwykle jest i tak
nadmierny pokazuje przykład b-laktamazy.
Produkcja tego białka osiągana z plazmidu
pBR322 pozwala na wzrost bakterii w
obecności 5 mg Ap na ml pożywkj (!). W
przypadku plazmidu pUC wzrost bakterii jest
możliwy w obecności ponad 20 mg
antybiotyku na mililitr pożywki!
Wektory o szerokim zakresie gospodarzy
Szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych znalazły
plazmidy o specjalnych cechach replikonu, pozwalających na
propagację plazmidu w szerokim spektrum gospodarzy
bakteryjnych (ang. broad-host-range plasmids). Do tej grupy
należy np. replikon RK2 (z białkiem inicjatorowym TrfA
kodowanym na plazmidzie), który dzięki dużej tolerancji jeśli
chodzi o wymagania co do reszty białek replikacyjnych
dostarczanych przez gospodarza bakteryjnego, może się
replikować zarówno w E. coli jak i innych bakteriach Gramujemnych takich jak: Salmonella typhimurium, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas putida, Alcaligenes eurotropus,
Azotobacter vinelandii, Azotobacter xylinum, Agrobacterium
tumefaciens, Caulobacter crescentus, Acinetobacter
calcoaceticus, Rhodopseudomonas sphaeroides. Oczywiście
uzyskiwana liczba kopii plazmidu w poszczególnych gatunkach
bakterii jest różna.
Wektory wahadłowe
Inną ciekawą grupą są wektory wahadłowe (ang.
shuttle vectors). Są to plazmidy zawierające dwa
różne origin replikacji, specyficzne dla organizmów
niespokrewnionych, często dość odległych
ewolucyjnie (np. dla bakterii Gram-ujemnych i Gramdodatnich, oraz dla bakterii i drożdży, lub dla bakterii i
wirusa eukariotycznego). Umożliwia to prowadzenie
prac konstrukcyjnych nad pochodnymi plazmidu w
bakteriach E. coli, a następnie jego wykorzystanie
poprzez niezależną replikację (a także ekspresję
specyficznych białek) w organizmie docelowym.
Fagmidy (ang.phagemids)
Są to wektory plazmidowe E. coli, posiadające dwa
typy origin replikacji -wegetatywny, zwykle pochodna
pUC, i warunkowy - replikon faga filamentarnego (f1
lub MI3). Wektory te dają możliwość otrzymywania
jednoniciowego plazmidowego DNA, idealnego jako
matryca do reakcji polimeryzacji DNA. Jest to możliwe
po uaktywnieniu ori f1 lub M13, zakażając komórki
gospodarza odpowiednim fagiem pomocniczym
(helperowym). Fag taki dostarcza specyficznych białek
do zainicjowania replikacji DNA i zapakowania cząstek
potomnych we własną osłonkę białkową.
Wektory samobójcze (ang. suicide vectors)
Są to wektory nie mogące się replikować w komórce
gospodarza lub mogące to robić tylko warunkowo
(najczęściej posiadające temperaturo-wrażliwe
replikony). Używane są do kontrolowanego i
krótkotrwałego wprowadzania do komórek
specyficznych aktywności biologicznych. Jedną z
odmian tych wektorów są wektory integracyjne (ang.
integrating vectors), które są wprowadzane do
komórek z myślą ich samointegracji do określonego
regionu genomu (na drodze RecA- zależnej
rekombinacji homologicznej lub lnt-zależnej
miejscowo specyficznej rekombinacji) lub losowo na
drodze transpozycji.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Charakteryzują się one:
ogromnym potencjałem do stabilnego
utrzymywania dużych fragmentów DNA (501000 kpz), w kolejnych pokoleniach klonu
gospodarza (wysoka stabilność strukturalna i
segregacyjna wektora),
możliwością selekcji i identyfikacji
rekombinantów
względnie łatwą izolacją z organizmu
gospodarza.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Biblioteka genów w tych wektorach sporządzana jest
losowo a efektywność jej tworzenia zależy od
zoptymalizowania następujących procesów:
częściowego trawienia DNA genomu enzymem
restrykcyjnym,
frakcjonowania DNA, w celu wyodrębnienia
fragmentów w określonym zakresie wielkości,
wprowadzaniu zrekombinowanych wektorów do
określonych komórek gospodarza. Okazuje się, że ten
ostatni etap stanowi najistotniejszy problem.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Biblioteki fragmentów DNA genomów
poszczególnych organizmów konstruowane są
w oparciu o bardzo różne systemy do
klonowania.
Trudno jest wskazać jednoznacznie na jeden
najlepszy system. Jedne z nich
wykorzystywane są do wykonania wstępnej
mapy fizycznej (ang. low resolution physical
map) inne są konieczne do precyzyjnej analizy
ułatwiając wykonanie mapy genetycznej (ang.
high density physical map).
Spośród wektorów z pierwszej grupy zadań
czołową rolę odgrywają tzw. sztuczne
chromosomy.
Sztuczny chromosom bakteryjny - BAC
(bacterial artificial chromosome)
Sztuczny chromosom oparty na replikonie
bakteriofaga P1 - PAC (P1 derived
artificial chromosome),
Sztuczny chromosom drożdżowy - YAC
(yeast artificial chromosome).
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Wektory te zostały nazwane sztucznymi
chromosomami z racji:
porównywalnej z nimi liczbie kopii (1- 2)
oraz
stosunkowo dużej pojemności insercyjnej
dla długich fragmentów DNA,
maksymalnie 300 kpz dla BAC i PAC oraz
1400 kpz dla YAC.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Podobnie jak w przypadku naturalnych chromosomów
replikują się wiernie i są stabilnie przekazywane
komórkom potomnym.
Poszczególne rodzaje sztucznych chromosomów
różnią się stopniem złożoności, co pozostaje w
ścisłym związku z pochodzeniem elementów
genetycznych je tworzących oraz rodzajem
organizmu, w którym są utrzymywane.
Tylko YAC może być uznany za strukturalny
minichromosom. Jest liniową cząsteczką DNA,
posiada autonomiczne origin replikacji, centromer i
telomery.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Podstawowymi elementami funkcjonalnymi w
przypadku BAC są elementy kontroli oraz
regulacji replikacji i segregacji pochodzące z
episomu F E. coli.
Dla PAC będą to ori plazmidowy i lityczny
bakteriofaga P1 E. coli oraz system do
pozytywnej selekcji rekombinantów.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Niewątpliwą zaletą wektora YAC jest możliwość
wprowadzania nawet bardzo długich insertów DNA
(od 100 do 2000 kpz). Niestety często prowadzi to do
powstawania chimer, insertów powstałych z
połączenia z dwóch lub większej ilości fragmentów
DNA, nie sąsiadujących ze sobą na genomie. Stwarza
to poważne problemy interpretacyjne podczas analizy
struktury genomu.
Kolejną istotną słabością tego systemu jest trudność
izolacji YAC spośród innych chromosomów
drożdżowych oraz mało wydajna transformacja
komórek drożdżowych zrekombinowanym wektorem.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Drugą grupę wektorów stanowią systemy
klonowania heterologicznego DNA w
komórkach E. coli, łączące w sobie cechy
plazmidowego wektora i systemu do pakowania
w główki bakteriofagów (obecność elementów
cosN lub pac).
Wielkość klonowanego fragmentu DNA
ograniczana jest pojemnością główki faga.
Zrekombinowane DNA przenoszone jest do
komórek metodą transdukcji, której towarzyszy
recyrkularyzacja w komórce bakterii.
Wektory do przygotowywania
bibliotek genomowego DNA
Do wektorów tej grupy należą:
kosmidy, wysokokopijne plazmidy oparte na replikonie ColE1
lub pMB1, zawierające sekwencję cosN, rozpoznawaną w
procesie pakowania DNA in vitro w główki bakteriofaga l;
fosmidy, udoskonalone pochodne kosmidów, zachowujące ich
cechy z wyjątkiem rodzaju replikonu, który w tym przypadku
pochodzi z plazmidu F, co obniża ich liczbę kopii do 1-2,
pacmidy, zawierające sekwencję pac, istotną podczas
pakowania DNA w główki bakteriofaga P1, sekwencję loxP,
istotną do po-transdukcyjnej Cre-zależnej cyrkularyzacji
wektora, oraz dwa alternatywne replikony P1, plazmidowy
(niskokopijny, 1-2 kopie), do stabilnego utrzymywania wektora i
lityczny (wysokokopijny, 10-20 kopii), do amplifikacji wektora.
System zaopatrzono ponadto w element pozytywnej kontroli
rekombinantów, w postaci genu sacB. którego produkt
powoduje efekt letalny bakterii rosnących na podłożu z 5%
sacharozą.
Ogromną zaletą tych systemów jest bardzo
wydajny sposób wprowadzania DNA do
komórek bakteryjnych gospodarza, ale ich
ograniczeniem jest maksymalna wielkość
fragmentu DNA możliwa do upakowania w
główce: 45 kpz dla faga l i 100 kpz dla P1. Z
racji podwyższonej liczby kopii kosmidów,
wektory te uważa się za niestabilne
strukturalnie (35% rekombinacji), co zostało w
dużej mierze już wyeliminowane w fosmidach.