Diagnostyka molekularna Dr n.biol. Anna Wawrocka Strategia diagnostyki genetycznej: Aberracje chromosomowe: Metody:Analiza kariotypu, FISH, aCGH, MLPA, QF-PCR Gen(y) znany Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO Gen(y) nieznany Metody: Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), Analiza sprzężeń, Klonowanie pozycyjne, Klonowanie funkcjonalne Źródła DNA/RNA: • Krew obwodowa • Fibroblasty • Płyn owodniowy • Kosmówka • Szpik kostny • Plemniki • Włosy • Fragmenty tkanek Metody izolacji RNA: • Izolacja specyficznego RNA poprzez frakcjonowanie całkowitego RNA komórki • Bezpośrednia izolacja specyficznego RNA, ograniczona do komórek syntetyzujących określony RNA w zwiększonej ilości • Izolacja poli(A)RNA • Izolacja RNA z polirybosomów • Izolacja całkowitego RNA komórki a następnie uzyskanie określonego RNA (cDNA) metodą PCR. PCR-Łańcuchowa reakcja polimerazy: 1. Matryca DNA 2. Primery (primer forward, primer revers) 3. Polimeraza DNA 4. dNTP’s 5. Buffor Real Time PCR-PCR w czasie rzeczywistym • • Jest to metoda ilościowego oznaczania DNA. Pozwala na monitorowanie zmian stężenia produktu PCR poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do jego ilości w czasie trwania reakcji Zastosowania aplikacji real-time PCR: • Ilościowe określanie ekspresji genów • Testowanie stabilności genetycznej • Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków • Ilościowe określanie DNA wirusowego • Detekcja patogenów • Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna) • Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie • Obrazowanie in vivo procesów komórkowych • Studia nad DNA mitochondrialnym • Detekcja metylacji • Detekcja inaktywacji chromosomu X • Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych • Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych • Wykrywanie mikrodelecji Droplet Digital PCR PCR w wodno-emulsyjnej kropli. Analiza 8 pacjentów jednocześnie, dla każdej rekcji 20.000 kropli o objętości 1 nanolitra. Zastosowanie: - Wykrywanie biomarkerów nowotworowych - Wykrywanie patogenów - Analiza CNV (copy numer variation) - Analiza ekspresji MLPA - Zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond • Detekcja zmian liczby kopii 45 genomowych sekwencji DNA w jednej, prostej do przeprowadzenia reakcji PCR. • Minimum 20 ng ludzkiego DNA lub 10-120 ng RNA • Analiza częściowo zdegradowanego DNA – DNA ze skrawków parafinowych – Tkanek w formalinie – Płodowy DNA uzyskany z plazmy krwi matczynej. • Rozróżnienie sekwencji które różnią się pojedynczym nukleotydem, detekcja znanych mutacji oraz SNP • 45 różnych mRNA • Identyfikacja statusu metylacji promotorów • wszystkie fragmenty są amplifikowane z wykorzystaniem pojedynczej pary starterów w reakcji PCR • Wyjątkowość tej techniki polega na tym, że w reakcji nie jest amplifikowany DNA badanej próby, ale sondy, które są dodawane do próbki Sondy SALSA MLPA Pojedyńcza sonda MLPA zawiera dwa różne oligonukleotydy, każdy z nich zawiera sekwencje startera oraz sekwencje komplementarną do sekwencji docelowej. 4 etapy MLPA: 1. Hybrydyzacja Mieszanina sond MLPA jest dodawana do zdenaturowanego genomowego DNA Dwie części każdej sondy hybrydyzują do sekwencji docelowych (komplementarnych) 2. Ligacja Połączone w ten sposób sondy ulegaja ligacji (sondy, które nie uległy ligacji nie musza byc usuwane), wykorzystując termostabilną ligazę, a nastepnie amplifikację PCR. Liczba otrzymanych w ten sposób produktów wydłużonych sond zależy od liczby odpowiadajacych sobie docelowych sekwencji w próbce 3. Amplifikacja Do amplifikacji wszystkich sond została użyta uniwersalna para starterów. Produkt amplifikacji każdej sondy posiada unikalną wielkość (130-480 pz). 4. Separacja i ocena ilościowa za pomocą elektroforezy kapilarnej Każdy pik jest produktem amplifikacji poszczególnych sond. Próby porównuje się do prób kontrolnych. Różnice w relatywnej wielkości piku (wysokość lub powierzchnia) wskazują zmianę liczby kopii badanej sekwencji. Sekwencjonowanie 1. Sekwencjonowanie metodą Sangera 2. Sekwencjonowanie nowej generacji: Next generation sequencing (NGS)/Whole exome sequencing (WES) - Zastosowanie NGS: Wykrywanie mutacji Analiza transkryptomu – RNA seq Badanie interakcji białko-DNA/RNA Sprawdzanie stopnia metylacji Sekwencjonowanie genomu • • • Zalety NGS: Masowe równoległe sekwencjonowanie wielu próbek jednocześnie Niższy koszt analizy w stosunku do sekwencjonowania metodą Sangera Krótki czas uzyskania wyników QF-PCR - Quantitative fluorescence polymerase chain reaction Amplifikacja specyficznych regionów mikrosatelitarnych (wysoce polimorficznych krótkich powtórzeń tandemowych typu STR) z zastosowaniem fluorescencyjnych starterów w reakcji PCR Ilościowa ocena produktów po amplifikacji Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13, 18, 21 aCGH - Technologia mikromacierzy arrayCGH Stanowi przełom w diagnostyce genetycznej Umożliwia w jednym badaniu wykrycie wszystkich niezrównoważonych aberracji chromosomowych oraz submikroskopowych mikrodelecji i mikroduplikacji Nie wymaga hodowli komórek Krótki czas oczekiwania na wynik Hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie DNA pacjenta do płytki mikromacierzy z naniesionymi sekwencjami DNA w postaci klonów BAC lub fragmentów oligonukleotydowych Rozdzielczość – od 1Mpz do <100 kpz (?) Nie identyfikuje zmian zrównoważonych oraz poliploidii Czasami trudna interpretacja uzyskanych wyników Przykazania dobrej diagnostyki w genetyce klinicznej 1. U kobiety >35 roku życia nie wykonujemy kariotypu z racji wieku 2. U mężczyzny z pary po poronieniach nie wykonujemy rutynowo analizy CFTR ani AZF, badania te wykonujemy tylko w przypadkach oligozoospermii/azoospermii 3. U pary spokrewnionej nie wykonujemy kariotypów z racji spokrewnienia 4. Jeśli chcemy wykonać diagnostykę prenatalną w kierunku choroby jednogenowej musimy znać chorobę, gen i konkretną mutację 5. W przypadku aberracji liczby chromosomów u dziecka nie wykonujemy badań kariotypów u rodziców 6. W przypadku aberracji struktury u dziecka zawsze wykonujemy badania u rodziców (kariotyp lub FISH do chromosomów metafazowych) 7. FISH nie wykrywa zmian w genach 8. Mikromacierze nie wykrywają translokacji zrównoważonych. Nie stosujemy ich u zdrowych osób z niepowodzeniami rozrodu 9. Z martwej tkanki (martwo urodzonego płodu, kosmówki poronionego zarodka) nie robimy kariotypu (tylko mikromacierze, QF-PCR, MLPA)