Lab_2_Dezintegracja_mechaniczna - Instrukcje

Lab_2_Dezintegracja_mechaniczna.doc
(69 KB) Pobierz
Mikrobiologia przemysłowa
Ćwiczenie nr 2- Dezintegracja komórek mikroorganizmów- metody mechaniczne
Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach nadekspresji w komórkach
drobnoustrojów potrzebne są odpowiednie metody, które pozwalają na uwolnienie danego białka
z komórki z dużą wydajnością przy jednoczesnym zachowaniu jego własności np. aktywności
enzymatycznej, struktury itp. Szczególnie pleśnie i drożdże, ale również komórki roślinne
posiadają odporną na lizę ścianę komórkową, która utrudnia izolację białek i innych składników
komórkowych. Wyodrębnienie związków chemicznych zawartych we wnętrzu mikroorganizmów
wymaga
zniszczenia
ciągłości
ścian
komórkowych
i
błon
cytoplazmatycznych
w
stopniu umożliwiającym wypłynięcie chronionej przez nie zawartości. Do tego celu służą różne
metody dezintegracji komórek.
Kryteria i efektywność procesu dezintegracji
Dezintegracja
komórki
reprezentuje proces
nieodwracalnego
niszczenia
jej
anatomicznego bytu. Z doświadczalnego punktu widzenia uszkodzenie ściany komórkowej można
uzyskać korzystając z
różnych czynników : fizycznych, mechanicznych, chemicznych,
enzymatycznych i biologicznych. W większości przypadków, po procesie dezintegracji, jest
wymagane izolowanie morfologicznych i funkcjonalnie nietkniętych wewnątrzkomórkowych
struktur. Z tego powodu, proces dezintegracji powinien być nie tylko skuteczny, ale musi również
zapewnić brak funkcjonalnych i strukturalnych strat izolowanych białek czy innych
komponentów.
Wymagania danego procesu dezintegracji określają prowadzone badania. Wybór stopni
kontroli i kryteriów dla oszacowania konkretnych właściwości rozpadu docelowych składników
komórki, zależy od specyficzności jaką chcemy uzyskać w eksperymencie.
Podział metod dezintegracji
Metody używane do niszczenia komórek mikroorganizmów mogą być sklasyfikowane
jako mechaniczne (sonikacja, młyn perełkowy, homogenizacja) i niemechaniczne (traktowanie
kwasami, zasadami, detergentami takimi jak siarczan dodecylu albo Triton X-100,
rozpuszczalnikami organicznymi jak aceton, etanol czy toluen, szok osmotyczny, enzymatyczne
trawienie lizozymem, glukonazami lub protezami czy proces fizycznego zamrażania - odmrażania
).
Z szerokiego spektrum stosowanych technik, nie wszystkie są odpowiednie do
stosowania na dużą skalę. Przykładem jest użycie ultradźwięków (rodzaj mechanicznej
procedury). Zanurzona w roztworze końcówka aparatu wywołuje „fale ciśnienia” mechanicznie
niszczące cząsteczki zawiesiny. Jednakże zasadnicze znaczenie dla efektywności dezintegracji
ultradźwiękowej ma proces nazywany kawitacją, czyli formowania się i implozji mikroskopijnych
„baniek próżni”. Powstają one podczas „cofania” się końcówki i są następnie wypychane w głąb
roztworu kolejnym „uderzeniem” końcówki. Lokalne „fale ciśnienia” wywołane przez gwałtownie
implodujące „bańki próżni” potęgują proces dezintegracji i powodują, że odbywa się on nie tylko
przy samej końcówce, ale nawet w pewnej od niej odległości. Metoda ta jest często używana na
skalę laboratoryjną, ale duża ilość wymaganej energii i inne problemy np. cieplne, generalnie
uniemożliwiają wykorzystywanie tej metody na skalę przemysłową. Ponadto, kiedy wybieramy
metodę dezintegracji komórki, musimy brać pod uwagę potencjalny wpływ danej metody na
ogólny schemat oczyszczania w końcowym etapie, np. strącanie solami i hydrofobowa
chromatografia, nie mogą zostać wykonane w obecności detergentów. Czynniki takie jak typ
mikroorganizmu, wzrost i warunki przechowywania komórek także mają duże znaczenie w
wyborze metody dezintegracji. Jednakże, wybrana procedura musi pozwalać na połączenie
wysokiego poziomu wydajności, efektywności z krótkim czasem niszczenia osłon komórkowych.
Skuteczność poszczególnej metody jest zazwyczaj oszacowywana poprzez stopień uszkodzenia
komórki i poziom specyficznej aktywności enzymu w uzyskanej zawiesinie- ekstrakcie.
a.) Metody mechaniczne
Mechaniczne rozrywanie ściany komórek przeprowadza się w urządzeniach, które
można podzielić na dwie grupy:
1) urządzenia bez elementów rozdrabniających:
- prasy (homogenizatory) wysokociśnieniowe,
- dezintegratory ultradźwiękowe,
2) urządzenia z elementami rozdrabniającymi ( kulkami):
- wibratory wstrząsowe,
- młyny perełkowe
Niewątpliwie mechaniczne metody są najskuteczniejsze w procesie dezintegracji
komórek na małą i dużą skalę. Są one zazwyczaj mniej specyficzne i działają mocniej od metod
niemechanicznych. Najczęściej używanymi urządzeniami wykorzystywanymi w tej metodzie są:
homogenizator (Manton Gaulin, French Press, Braun Homogenizer), młyny perełkowe (np. KLD
Dyno- Mill) oraz dezintegrator ultradźwiękowy. Homogenizator wyposażony w napędzaną
powietrzem lub silnikową pompę, pozwala na ekspozycję komórek na ciśnienie aż do 2000 atm.,
sprężając je wbrew ograniczającej kryzie. Za dezintegrację komórki, w tym przypadku, odpowiada
wygenerowana przy takim działaniu hydrodynamiczna deformacja. Niszczenie przy pomocy
szklanych kulek jest również dobrą techniką. Ta procedura jest szczególnie skuteczna w
dezintegracji komórek drożdży i grzybów, które mają sztywne ściany komórkowe, utworzone
głównie z polisacharydów ( 80- 90 %). Ponadto, proces ten może działać w trybie ciągłym [14].
Używając młyna perełkowego możemy operować takimi czynnikami jak: ilość i wielkość kulek,
rodzaj materiału, z jakiego są wykonane.
Dezintegracja ultradźwiękami
W dezintegratorach ultradźwiękowych proces rozdrabniania mikroorganizmów polega na
przejściu fali dźwiękowej przez zawiesinę komórek. Powoduje to lokalne zmiany ciśnienia, które
są przyczyną tworzenia się pęcherzyków. Pęcherzyki rosną do wielkości ok. 10 μm, zaczynają
drgać, a następnie implodują, tworząc falę uderzeniowa o ciśnieniu kilku tysięcy atmosfer i
wysokiej temperaturze lokalnej. Komórki poddane działaniu tych fal ulegają rozbiciu.
Dezintegracja w młynie perełkowym
Metoda ta polega na mokrym mieleniu w młynie perełkowym gdzie możemy
wykorzystywać perełki wykonane z różnych materiałów, zwykle szklane lub z tworzyw
sztucznych, o różnej średnicy (od 0,1 do 2,0 mm). Zbiornik takiego młyna jest wypełniony
kuleczkami, między którymi w czasie cyrkulacji wsadu wywołanego mieszadłem odbywa się
rozdrabnianie. Dezintegracja przebiega z udziałem kilku mechanizmów rozdrabniania: ścieranie,
ścinanie, zgniatanie, uderzanie. W trakcie procesu dezintegracji w młynie perełkowym następuje
rozrywanie
i
niszczenie
ścian
komórkowych
mikroorganizmów,
uwalnianie
struktur
wewnątrzkomórkowych, deformacja uwolnionych związków wielkocząsteczkowych oraz
oddziaływanie uwolnionych enzymów między sobą. Najistotniejszym czynnikiem wpływającym
na
efektywność
rozrywania
komórek
jest
stopień
wypełnienia
młyna
elementami
rozdrabniającymi, jak również rodzaj materiału, z którego są wykonane. Stopień rozdrobnienia
mikroorganizmów oraz temperaturę procesu można regulować przez zmianę:
- średnicy i typu kulek,
- prędkości obrotowej wału mieszadła,
- natężenia przepływu zawiesiny oraz natężenia przepływu cieczy chłodzącej komorę boczną.
Zadanie 1.1. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych z wykorzystaniem dezintegratora.
Materiały: drożdże piekarskie , bufor Tris 50mM pH 7.0.
1.
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i
odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
2.
Osad zawiesić w małej ilości schłodzonego buforu. Umieścić w lodzie.
3.
Naczynie dezintegratora wypełnić do około połowy szklanymi kulkami, uprzednio schłodzonymi.
Następnie przenieść do niego zawieszone w buforze komórki i dopełnić buforem prawie do pełna.
Naczynie ochronne wypełnić lodem. Aparat zabezpieczyć sprężynami.
4.
Cykl dezintegracji trwa 3 min.
5.
Po zakończeniu dezintegracji przenieść ekstrakt komórkowy do cylindra miarowego (zanotować
objętość uzyskanego ekstraktu).
6.
Do dwóch probówek wirówkowych przenieść po 5 ml ekstraktu i odwirować fragmenty komórek
przez 5 min w 6000 rpm. W powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.
Zadanie 1.2. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych poprzez rozcieranie materiału biologicznego w
moździerzu.
Materiały: drożdże piekarskie , bufor Tris 50mM pH 7.0.
1.
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i
odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
2.
Osad zawiesić w 3 ml schłodzonego buforu, przenieść do porcelanowego moździerza
umieszczonego w lodzie.
3. Dodać oczyszczony piasek morski i energicznie ucierać przez 15 minut.
4. Po zakończonym procesie dezintegracji do uzyskanej mieszaniny dodać kolejne 7 ml
buforu (objętość całkowita 10 ml).
5.
Do dwóch probówek wirówkowych przenieść po 5 ml ekstraktu i odwirować fragmenty komórek
przez 5 min w 5000 rpm. W powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.
Ocena skuteczności procesu dezintegracji- pomiar ilości białka uwolnionego z komórek
drożdży- Metoda Bradforda
Odczynnik Bradforda:
100mg błękitu Coomasie Blue G rozpuszczono w 50ml 95% etanolu, następnie dodano
100ml 85% kwasu fosforowego i uzupełniono do objętości 1litra wodą destylowaną.
1.
a.
Sporządzenie krzywej standardowej
Przygotować 1 ml wzorcowego roztworu albuminy o stężeniu 1mg/ml.
Następnie sporządzić 1 ml roztworu albuminy o stężeniu 0.2mg/ml w probówce
b.
eppendorfa.
c.
W kolejnych probówkach eppendorfa umieścić 1 ml odczynnika Bradforda i
kolejno następujące objętości roztworu albuminy (0.2 mg/ml): 5l, 10l, 15l, 20l,
30l, 50l. Zawartość probówek dokładnie wymieszać.
d.
Po upływie 5 min mierzyć absorbancję przy 595nm wobec próby kontrolnej zawierającej
tylko 1 ml odczynnika Bradforda.
W każdej z prób wyznaczyć ilość białka (mg) i sporządzić wykres zależności ilości
e.
białka od absorbancji- krzywa standardowa.
2. Oznaczanie ilości białka w ekstrakcie bezkomórkowym metodą Bradforda.
a.
b.
W kolejnych próbówkach eppendorfa umieścić po1 ml odczynnika Bradforda
Następnie dodawać odpowiednie ilości badanego roztworu otrzymanego po
dezintegracji: 5l, 7l, 10l, 15l, 20 l. Zawartość probówek dokładnie wymieszać.
c.
Po upływie 5 min zmierzyć absorbancję przy 595nm wobec próby kontrolnej (odczynnik
Bradforda).
d.
Korzystając z krzywej standardowej, obliczyć ilość białka uwolnioną z komórek drożdży
w wyniku procesu dezintegracji (mg).
Plik z chomika:
BiotechnologPWr
Inne pliki z tego folderu:



Lab_7_Izolacja.docx (17 KB)
Lab_8_-_Lipazy.docx (29 KB)
 Lab_10_Immobilizacja.doc (29 KB)
 Lab_11_Biokataliza_1_.docx (23 KB)
Lab_2_Dezintegracja_mechaniczna.doc (69 KB)
Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl
Sprawozdania