Mutacje
advertisement
Anna Sułek Pracownia Molekularnych Podstaw Chorób Neurodegeneracyjnych Zakład Genetyki, IPiN Sformułował podstawowe prawa dziedziczenia, przeprowadzając badania nad krzyżowaniem roślin, głównie grochu zwyczajnego (Pisum sativum), których wyniki ogłosił w 1865 roku na posiedzeniu lokalnego towarzystwa naukowego w Brnie. W 1866 roku opublikował je drukiem w artykule Badania nad mieszańcami roślin. Jego odkrycia początkowo nie uzyskały rozgłosu i dopiero w roku 1900 trzej uczeni Hugo de Vries, Carl Correns i Erich Tschermak, niezależnie potwierdzili wyniki jego prac 1868 (1871) – Friedrich Miescher – nukleina (białko + inna nieznana substancja) 1889 – Richard Altmann – oddzielenie białka i kw. nukleinowego do 1929 – Phoebus Levene – ustalenie składu chemicznego kw. nukleinowych lata 1927-1943 – Fred Griffin, Oswald Avery – prace fizjologiczne na bakteriach: DNA jako czynnik transformujący 1953 – J. Watson, F. Crick – podwójna helisa model struktury wynikający z modelu sposób replikacji cząsteczek DNA Podstawowe właściwości związku chemicznego - nośnika informacji genetycznej: - zdolność do wytwarzania w procesie replikacji kopii cząsteczek - zdolność do kierowania syntezą i wyznaczania pierwszorzędowej struktury białek Nukleotyd – jednostka monomeryczna Cukier – 2’deoksyryboza Zasady azotowe: – dwupierścieniowe puryny: adenina i guanina - jednopierścieniowe pirymidyny: cytozyna i tymina Grupy fosforanowe Helisa DNA jest prawoskrętna Puryna łączy się wyłącznie z pirymidyną Wiązania wodorowe stabilizują dwuniciową helisę RNA jest jednoniciowy Cukier – ryboza Zasada – uracyl - Transportujący RNA - Rybosomowy RNA - Informacyjny RNA Proces semikonserwatywny Replikacja DNA zachodzi przed podziałem komórkowym DNA ulega powieleniu w kierunku od 5’ końca do 3’ końca Proces katalizują enzymy zwane polimerazami DNA Mechanizmy korekcyjne – 1 nukleotyd na 5 miliardów jest wbudowywany nieprawidłowo 6111192 Copyright © motifolio.com Etapy replikacji • Rozplecenie dwuniciowej helisy – helikaza, białka SSB tworzą bąble replikacyjne • Inicjacja replikacji – starterowy odcinek RNA (prymaza) • Synteza nici wiodącej i opóźnionej (fragmenty Okazaki) W typowej komórce ssaków znajduje się 40-100 000 replikonów a każdy replikuje 40-200 kpz DNA. Jako pierwsze replikują się regiony aktywne transkrypcyjnie Replication bubble |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Local opening of DNA helix RNA primer synthesis New DNA chain starts leading-strand synthesis RNA primers start additional New DNA chains Copyrigt © motifolio.com Przepływ informacji genetycznej – ujęcie klasyczne Jądro komórkowe cytoplazma Przepływ informacji genetycznej – ujęcie współczesne mRNA Regulatorowe RNA DNA białka Transkrypcja zachodzi od 5’ do 3’ końca z nici matrycowej (antysensownej) INICJACJA – miejscem startu transkrypcji musi być początek genu – sekwencja zasad promotora, przyłączenie polimeraz RNA Polimeraza II transkrybuje geny kodujące białka, do przyłączenia wymaga określonych sekwencji promotora np. kasety TATA oraz czynników transkrypcyjnych np. TFIIA, TFIIB Inne sekwencje zawarte w promotorze: CCAAAT, sekwencje wzmacniające (enhancer), sekwencje wyciszające (silencer) ELONGACJA – rozplatanie nici DNA na odcinku kilkunastu par zasad Synteza RNA TERMINACJA – lepiej poznana u Procaryota. Być może dysocjacja jakiegoś czynnika transkrypcyjnego destabilizuje kompleks transkrypcyjny Splicing – usuwanie intronów z pre-mRNA, katalizowane przez snRNP Blokowanie końca 5’ – capping, Poliadenylacja – polimeraza poliA dołącza ciąg reszt adenylowych Informacyjny RNA jest bezpośrednia matrycą do syntezy białka Pierwsze dwa nukleotydy po stronie 5’ intronu to GT a ostanie po stronie 3’ to AG • mRNA • 31-40 rodzajów tRNA • Mała podjednostka rybosomu • Duża podjednostka rybosomu • Czynniki elongacyjne Inicjacja – wiązanie małej podjednostki rybosomowej w obrębie 5’ czapeczki, pierwszy czytany kodon to AUG – kodon start, przyłączenie transferowego tRNAfMet Elongacja – przyłączenie dużej podjednostki rybosomowej Miejsce P- miejsce peptydylowe, miejsce A – miejsce aminoacylowe Terminacja – kodon STOP, czynnik eRF Potranslacyjne modyfikacje: • Przyłączanie grup chemicznych: metylacja, fosforylacja, acetylacja, hydroksylacja, lipidy, oligosacharydy (glikozylacja) • Rozcinanie łańcuchów polipeptydowych: usuwanie pojedynczych aminokwasów, wewnętrznych fragmentów peptydowych, sekwencji sygnałowej białek sekrecyjnych, rozcinanie na mniejsze peptydy • Ok. 15% genów ulega ekspresji w pojedynczej komórce • Regulacja ekspresji na poziomie transkrypcji odbywa się poprzez wiązanie białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi • Domena wiążąca DNA(np. palce cynkowe) • Domena odpowiedzialna z a dimeryzację (np. zamek leucynowy) • Domena transaktywująca (bogata np. w kwaśne aminokwasy) • Regulacja ekspresji przez: • Hormony • Cytokiny • Interferencja RNA – na poziomie potranskrypcyjnym Cell cycle Chromosome replication and cell growth Cell division Cell Cycle S M Chromosome separation 5111181 Copyright © motifolio.com Comparison of Mitosis and Meiosis Parent cell Mitosis Meiosis (before chromosome replication) Meiosis I Prophase Prophase I Chromosome replication Duplicated Chromosome (2 sister chromatids) 2n = 4 Metaphase Chromosomes align at the metaphase plate Anaphase Telophase Tetrads formed by synapsis of homologous chromosomes Tetrads align at the metaphase plate Metaphase I Anaphase I Telophase I Homologous chromosomes separate Sister chromatids separate during anaphase 2n Sister chromatids Remain together 2n Daughter cells of mitosis 5111189 Chromosome replication Sister chromatids separate during anaphase II Meiosis II n n n Daughter cells of meiosis II n Struktura genomu człowieka GENOM JĄDROWY – 3 miliardy nukleotydów GENOM MITOCHONDRIALNY – 15 tysięcy nukleotydów Sekwencje powtórzone 45% Geny – 1,5% ok. 25 000 Sekwencje rozproszone Krótkie SINES Długie LINES Inne - 44% Sekwencje tandemowe minisatelity mikrosatelity Genom człowieka – 3 miliardy par zasad 20-23 tysięcy genów 23 chromosomy – 55-250 mln par zasad Polimorfizmy – ok 10 mln – 1/300 par zasad Rodziny genów: wszystkie geny zlokalizowane w tym samym locus chromosomowym (rodzina hormonów wzrostu – 5 genów, chromosom 17) geny należące do rodziny w różnych loci – 5 genów rodziny aldolaz na różnych chromosomach Serie zespołów genów na różnych chromosomów – np. geny homeotyczne Największą rodzinę u człowieka stanowi 737 genów kodujących receptory rodopsynopodobne sprzężone z białkiem G – białka identyfikujące specyficzne cząsteczki na zewnątrz komórki Pseudogeny: Zmutowane wersje genu wyjściowego Pozagenowy DNA Stanowi większość DNA genomowego rozproszone sekwencje powtórzone (SINE, LINE) zespoły sekwencji powtórzonych – satelitarne DNA Chromatyna – DNA+białka Heterochtomatyna – nieaktywna Euchromatyna – aktywna Poliploidia Aneuploidia Mozaikowatość Aberracje chromosomowe • aberracje liczbowe • aberracje strukturalne • Inne aberracje Mutacje • Mutacje punktowe • Mutacje dynamiczne 33% ogółu stwierdzanych aberracji Typ chromosomu Nr chromosomu Przybliżona częstość występowania Zespół Patau 13 1:15 000 Zespół Edwardsa 18 1:5 000 Zespół Downa 21 1:600 X0 1:3 000 dziewczynek Zespół Klinefeltera XXY 1:700 chłopców Zespół potrójnego chromosomu X XXX 1:2 000 AUTOSOMY CHROMOSOMY PŁCI Zespół Turnera Najczęściej występujące objawy aberracji chromosomowych to: • Opóźnienie rozwoju somatycznego • Dysmorfia w budowie ciała • Mnogie wady rozwojowe • Niepełnosprawność intelektualna Duplikacja jest zazwyczaj mniej groźna niż delecja - trisomie vs monosomie Duplikacja w autosomach cięższa niż w chromosomach płci Monosomie autosomów są letalne Monosomia X jest zazwyczaj letalna Aberracje zrównoważone – nie mają zazwyczaj wpływu na fenotyp (u potomstwa inaczej) Mutacja punktowa to zmiana jednego nukleotydu na inny (też delecje i insercje) Tranzycja: pirymidyna na pirymidynę (C – T), puryny na purynę A – G Transwersja: • pirymidyna na purynę (T-A, T-G, C-A, C-G) • Puryna na pirymidę (A-T, A-C, G-T, G-C) Zmiana nukleotydu powodująca zmianę aminokwasu – missense Zmiana nukleotydu powodująca utworzenie kodonu STOP – nonsense Delecja/insercja powodująca zmianę ramki odczytu - frameshift Zmienność mutacyjna jest podstawą procesów ewolucyjnych Gen to jednostka informacji, odpowiada określonemu segmentowi DNA, kodującemu określoną sekwencję aminokwasów lub cząsteczki RNA Wielkość genów jest różna i waha się od kilkudziesięciu do kilku milionów par zasad Białko kodowane przez gen Liczba eksonów Wielkość genu bp Wielkość białka Histon H1 1 585 195 Insulina 3 1430 51 Hydroksylaza fenyloalaninowa 13 90 000 451 CFTR (mukowiscydoza) 27 250 000 1480 Czynnik koagulacyjny VIII 26 189 000 26 Dystrofina 79 24 000 000 3685 Tityna (koneksyna) 363 280 000 38138 POJĘCIA: fenotyp, linia czysta, dominacja Krzyżówka jednocechowa Stosunek 3:1 Częściowa lub niepełna dominacja Allele letalne Allele wielokrotne Krzyżówka dwucechowa Dwie niezależne cechy kodowane przez dwa geny mające różny charakter Epistaza – geny kodujące szlak biosyntetyczny Jeśli dwa geny są sprzężone to ich allele nie segregują niezależnie Rekombinacja – proces, który prowadzi do powstania nowych kombinacji genetycznych w trakcie mejozy Mutacje – dziedziczne zmiany w sekwencji DNA Wierność replikacji jest wysoka – 1 błąd na 1010 par zasad sprawdzanie i korekta przez egzonukleazę 3’-5’ funkcjonowanie aparatu naprawy Mutageny fizyczne – promieniowanie jonizujące Mutageny chemiczne – czynniki alkilujące, arylujące, kwas azotawy Uszkodzenia DNA – chemiczna reaktywność z egzogennymi związkami może powodować zmiany w strukturze (oksydacja, alkilacja, związki addycyjne) Zmiany letalne – zaburzenie replikacji i transkrypcji Mutacje GENOTYP – FENOTYP Rodzaj i lokalizacja mutacji w danym genie (DMD/BMD) Funkcja genu w zależności od tkanki (ch. Hirschsprunga/rdzeniasty rak tarczycy) Kilka genów (stwardnienie guzowate, wielotorbielowatość nerek) Cecha jednogenowa Zmiany polimorficzne Środowisko Cecha oligo-, poligenowa Imprinting – piętnowanie genomowe Monoalleliczna ekspresja genu – np. w przypadku chromosomów XY Imprinting jest mechanizmem równoważącym dawkę genu Mechanizm wyciszania alleli polega zazwyczaj na metylacji fragmentu DNA Wzór metylacji jest specyficzny jest specyficzny dla komórek rozrodczych (inny dla plemnika, inny dla komórki jajowej), po zapłodnieniu jest wymazywany i nadawany na nowo. Wzór metylacji jest tkankowo specyficzny a jego regulacja odgrywa rolę w rozwoju osobniczym. Charakter losowy: inaktywacja jednego chromosomu X Charakter rodzicielski: uzależniony od matczynego bądź ojcowskiego pochodzenia Brak ekspresji informacji genetycznej pochodzenia ojcowskiego: - Zespół Pradera-Willego - Kociego krzyku - Millera-Dickera - Beckwitha-Wiedemanna Brak ekspresji informacji genetycznej pochodzenia matczynego: - Zespół Angelmana - Di George’a - Zespół włosowo-nosowo-paliczkowy CHOROBY GENETYCZNIE UWARUNKOWANE • ZABURZENIA CHROMOSOMOWE zmiany liczby zmiany strukturalne • CHOROBY JEDNOGENOWE (monogenowe) zmiany w pojedynczych genach, różne sposoby dziedziczenia • CHOROBY WIELOCZYNNIKOWE wiele współdziałających genów, brak typowego mendlowskiego wzoru dziedziczenia Choroby dziedziczone w sposób autosomalny dominujący – przykłady • Neurofibromatoza I • Choroba Huntingtona • Rodzinna hipercholesterolemia *Cechy charakterystyczne dziedziczenia AD * Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć * Choroba ujawnia się u heterozygot * Stan homozygotyczności zazwyczaj prowadzi do bardzo ciężkiej postaci choroby * Ryzyko ponownego urodzenia chorego dziecka wynosi 50% * Zmienna ekspresja * Niepełna penetracja * Mozaikowość germinalna Choroby dziedziczone w sposób autosomalny recesywny – przykłady • Mukowiscydoza • Talasemia • Fenyloketonuria *Cechy charakterystyczne dziedziczenia AR *Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć *Rodzice chorego dziecka są bezobjawowymi nosicielami mutacji *Ryzyko ponownego urodzenia chorego dziecka wynosi 25% *Duże prawdopodobieństwo pokrewieństwa pomiędzy rodzicami *Wszystkie dzieci osoby chorej są obligatoryjnymi nosicielami mutacji Choroby recesywnie sprzężone z płcią: - Dystrofia mięśniowa Duchenne’a/Beckera - Hemofilia A i B - Daltonizm - Zespół Kennedy’ego rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni *Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia AR sprzężonego z płcią * Chorują wyłącznie mężczyźni * Kobiety nosicielki mutacji na X nie wykazują cech choroby * Brak dziedziczenia z ojca na syna – wszyscy synowie chorego ojca są zdrowi * Wszystkie córki chorego ojca są nosicielkami mutacji *Cechy charakterystyczne dla dziedziczenia AD sprzężonego z płcią * Chorują kobiety i mężczyźni * U kobiet objawy choroby mogą być słabiej wyrażone * Brak dziedziczenia z ojca na syna – wszyscy synowie chorego ojca są zdrowi * Wszystkie córki chorego ojca będą chore * Chora kobieta ma 50% ryzyko, że jej potomstwo będzie chore * Często choroby letalne dla płci męskiej *Cechy charakterystyczne dziedziczenia mitochondrialnego * Objawy choroby ujawniają się bez względu na płeć * Choroby mitochondrialne przekazywane są wyłącznie w linii żeńskiej - chory ojciec nie przekazuje choroby * Chora matka zawsze przekazuje mutację * Specyficzność tkankowa * Nasilanie się objawów z wiekiem Zanik nerwów wzrokowych Lebera Neuropatie, miopatie, encefalopatie Genom mitochondrialny – 16 569 pz W komórce jajowej znajduje się ok. 100 000 cząsteczek mtDNA Ze względu na losową segregację mitochondrialnego DNA – duża heterogenność objawów Objawy kliniczne mogą dotyczyć wszystkich układów i narządów Uważa się, że jeśli mutacje dotyczą genów kodujących tRNA (mutacje punktowe) musi ich być 95% a w przypadku delecji – 60% Wiele zaburzeń pojawia się dopiero w wieku dorosłym Mutacja genu 12S rRNA + antybiotyki aminoglikozydowe - głuchota u dzieci śr. wiek zach. 5 lat Specyficzność tkankowa – na niedobory tlenu wrażliwe są najbardziej komórki nerwowe, komórki mięśni szkieletowych i gruczołów wydzielniczych. Zjawisko heteroplazmii – nie we wszystkich chorobach, Zespół Lebera i głuchota – 100% mutacji Choroby, które wykazują rodzinne występowanie, ale ich rozkład genetyczny nie wykazuje mendlowskiej segregacji cech Choroby wieloczynnikowe = wiele genów + środowisko Etiologia chorób kompleksowych może być oligenowa, poligenowa i wieloczynnikowa Cechy (choroby)wieloczynnikowe: cechy jakościowe – cecha/brak cechy cechy ilościowe – reprezentowane przez parametry mierzalne (stężenie glukozy, wzrost) Common disorders – wysoka częstość populacyjna Choroby nowotworowe Choroby psychiczne Choroby układu krążenia • Interakcja genotypu i środowiska • Interakcje genów • Wzory segregacji odbiegające od mendlowskich modeli • Obecność alleli wielokrotnych Brak homogenności badanych grup! CYKRZYCA INSULINOZALEŻNA – IDDM1, IDMM2, locus DQ, inne CHOROBA HIRSCHSPRUNGA – protoonkogen RET, endotelina i receptor endoteliny receptor alfa dla glejopochodnego czynnika neurotropowego, SOX 10, inne ASTMA – geny kodujące receptory o dużym i małym powinowactwie do IgE, interferonu gamma, limfocytów T (TCR); geny układu HLA; zespołu interleukin, czynników wzrostowych i inne Poradnictwo genetyczne Diagnoza: fenotypowa, genotypowa, określenie wielkości ryzyka Ryzyko: uwzględnienie czynników modyfikujących penetracja Mozaicyzm germinalny imprinting Populacyjne ryzyko: empiryczna częstość występowania wady Przykład zastosowania sekwencji mikrosatelitarnych w praktyce • Jakość i wiarygodność • Profesjonalna porada • Dobrowolność • Poufność • Zakaz dyskryminacji Prawo a testy genetyczne Kraje obszaru niemieckojęzycznego: Austria, Szwajcaria, Niemcy – Gendiagnostikgesetz 2009; Portugalia, Francja, Szwecja, Norwegia, Hiszpania, Dania, Łotwa, Estonia POLSKA: ustawa o diagnostyce laboratoryjnej, o zawodzie lekarza i dentysty, ustawa transplantacyjna, prawo farmaceutyczne, ustawa o prawach pacjenta 2012 r. projekt ustawy – celem regulacji jest zwiększenie wiarygodności i bezpieczeństwa badań genetycznych Ustawa utknęła w Ministerstwie Zdrowia
