wybrane mechanizmy nabywania odporności organizmów na środki
advertisement
MECHANIZMY ODPORNOCI POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI 137 TOM 33 2006 NR 1 (137158) WYBRANE MECHANIZMY NABYWANIA ODPORNOCI ORGANIZMÓW NA RODKI OCHRONY ROLIN CHOSEN MECHANISMS OF ACQUIRING ORGANISMS RESISTANCE TOWARDS PESTICIDES Katarzyna NOWACZYK, Aleksandra OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Miêdzyzak³adowa Pracownia Biologii Molekularnej, Instytut Ochrony Rolin w Poznaniu Streszczenie: Wyst¹pienie odpornoci jest naturaln¹ konsekwencj¹ zachodz¹cych nieprzerwanie procesów ewolucyjnych wywo³anych presj¹ selekcyjn¹. W przypadku stosowania rodków ochrony rolin presj¹ t¹ s¹ pestycydy, wykorzystywane w celu zapobiegania stratom w uprawach, spowodowanym przez patogeny, szkodniki itp. Wykszta³canie przez agrofagi odpornoci na te preparaty jest zjawiskiem stosunkowo czêstym, pojawiaj¹cym siê nawet po krótkim czasie kontaktu z substancj¹ czynn¹. Nabycie odpornoci jest najczêciej skutkiem mutacji punktowych, wp³ywaj¹cych na zmianê struktury bia³ek docelowych dla dzia³ania pestycydów, czy powoduj¹cych zmianê funkcjonaln¹ innych bia³ek (np. enzymatycznych), lub te¿ zwiêkszonej ekspresji genów koduj¹cych bia³ka odpowiedzialne za detoksykacjê substancji czynnej. Zarówno mechanizmy dzia³ania biocydów, jak i nabywania na nie odpornoci stanowi¹ bardzo szerokie zagadnienie, w zwi¹zku z czym w niniejszej pracy omówione zosta³y wybrane mechanizmy molekularne, wp³ywaj¹ce na pojawienie siê odpornoci na rodki ochrony rolin. Podane przyk³ady dotycz¹ najczêciej wystêpuj¹cych szkodników i patogenów rolinnych owadów, grzybów i patogenicznych bakterii, a tak¿e chwastów. S³owa kluczowe: odpornoæ, biocydy, patogeny rolin, szkodniki. Summary: Pests and plant pathogens are important reason of crops quality and productivity limitation. Chemical drugs and pesticides belong to the most common among the strategies used to restrict losses in agricultural production. However, agrophags frequently acquire the resistance towards these substances, even after short time of contact with them. The occurring resistance is a natural consequence of the continuous evolutionary processes influenced by the selective pression of pesticides. The resistance results from point mutations and, in consequence, the changes of target proteins structure for pesticides or the functional changes of other proteins, for example enzymes. The matter of the mechanisms of pesticides action and the formation of resistance is very extensive, therefore in this paper only chosen molecular mechanisms, that influence the occurrence of resistance towards pesticides are discussed. Given examples had been restricted to the most common pests and plant pathogens insects, fungi, pathogenic bacteria, as well as herbs. Key words: resistance, biocides, plant pathogens, pests. 138 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA WSTÊP Ci¹g³y i szybki wzrost populacji ludzkiej wymaga nieustannego zwiêkszania produkcji ¿ywnoci, a zw³aszcza jej wydajnoci. Jednym ze sposobów jest ograniczenie rozprzestrzeniania siê szkodników rolin, powoduj¹cych wraz z chorobami ok. 60% strat w produkcji rolinnej. Stosowane w ostatnich latach strategie ochrony rolin polega³y g³ównie na krótkoterminowych interwencjach wykorzystuj¹cych pojedynczo dostêpne na rynku technologie, szczególnie chemiczne pestycydy. Nie prowadzono badañ nad mo¿liwym wspó³dzia³aniem ró¿nych technologii i ich kompatybilnoci¹. Dowiadczenia ostatnich lat pokazuj¹, ¿e im wiêksz¹ kontrolê udaje siê uzyskaæ nad patogenami rolin w wyniku dzia³añ krótkoterminowych, tym wiêksze prawdopodobieñstwo powa¿nego za³amania równowagi w poddanych im ekosystemach. Szkodniki zawsze wp³ywa³y na spadek wydajnoci produkcji, jednak wiele z zaistnia³ych obecnie problemów wynika z dzia³añ podjêtych w celu ochrony rolin [39]. Jednym z takich problemów jest pojawienie siê odpornoci u patogenów i szkodników rolinnych na stosowane przeciw nim rodki. Biocydy (ksenobiotyki) to substancje lub mieszaniny substancji przeznaczone do zwalczania chwastów, szkodników i patogenów rolin. S¹ to zwykle zwi¹zki organiczne lub mineralne, toksyczne w okrelonych stê¿eniach dla ka¿dej ¿ywej komórki [28]. Do ich najwa¿niejszych cech nale¿¹: wysoka aktywnoæ i du¿a selektywnoæ, decyduj¹ca o szybkoci dzia³ania zwi¹zku i liczbie koniecznych aplikacji. Istotny jest tak¿e czas rozk³adu substancji w rodowisku i jego ewentualny toksyczny wp³yw na cz³owieka i zwierzêta.W tabeli 1 przedstawiono podzia³ pestycydów ze wzglêdu na grupy organizmów, na które dzia³aj¹. Najliczniejsze i najczêciej stosowane s¹ organiczne biocydy, czyli chemiczne rodki ochrony rolin, ¿ywnoci i cz³owieka, uniemo¿liwiaj¹ce lub ograniczaj¹ce rozwój mikroorganizmów odpowiedzialnych za biologiczny rozk³ad rolin, rodków spo¿ywczych, przemys³owych i tworzyw. Nale¿¹ do nich m.in. aminy, amidy, fenole i ich pochodne, sulfidy, karbaminiany, izotiazole, tioftalimidy, pochodne triazynowe i inne [30]. PRZYK£ADOWE MECHANIZMY DZIA£ANIA PESTYCYDÓW Omówienie mechanizmów nabywania odpornoci na rodki ochrony rolin wymaga uprzedniego zapoznania siê ze sposobem dzia³ania najczêciej stosowanych substancji. Nabywanie odpornoci jest zwykle zwi¹zane z modyfikacj¹ struktur lub cz¹steczek docelowych dla biocydów lub te¿ ze zmianami w transporcie substancji czynnej wewn¹trz organizmu patogena. W celu pe³niejszego obrazowania efektów zmian w genomie patogenów rolinnych, w niniejszej pracy przedstawiono przyk³ady dzia³ania zwi¹zków stosowanych w ochronie rolin. Do najczêciej spotykanych patogenów i szkodników rolinnych nale¿¹ bakterie, grzyby, owady oraz chwasty. Z tego wzglêdu liczbê przyk³adów ograniczono do zwi¹zków skierowanych przeciwko tym organizmom. MECHANIZMY ODPORNOCI 139 TABELA 1 . P o d zia ³ b io c yd ó w w za le ¿no c i o d typ u zwi¹ zk u, je go w³a c iwo c i lub o rga nizmu d o c e lo we go (wg [3 0 ], zmo d yfik o wa no ) Po dzia ³ bio c y dó w w za le ¿no c i o d o rg a nizmó w do c e lo wy c h Ba k te rio c yd y zwa lc za j¹ c e b a k te rie Zo o c yd y zwa lc za j¹ c e o rga nizmy zwie rzê c e : Inse k tyc yd y ro d k i o wa d o b ó jc ze Ro d e ntyc yd y ro d k i gryzo nio b ó jc ze Mo lusk o c yd y ro d k i miê c za k o b ó jc ze N e ma to c yd y ro d k i nic ie nio b ó jc ze La rwic yd y ro d k i la rwo b ó jc ze Afic yd y ro d k i mszyc o b ó jc ze Ak a ryc yd y ro d k i ro zto c zo b ó jc ze O wic yd y ro d k i niszc z¹ c e ja ja i ro zto c za F ungic yd y zwa lc za j¹ c e grzyb y He rb ic yd y zwa lc za j¹ c e c hwa sty Po dzia ³ bio c y dó w w za le ¿no c i o d ty pu zwi¹ zk u c he mic zne g o przy k ³a dy N ie o rga nic zne zwi¹ zk i rtê c i, c ynk u, mie d zi, a rse nu, fluo ru, sia rk a , b o ra k s, c hlo ra n so d u Me ta lo o rga nic zne a lk ilo we p o c ho d ne c yny (e stry i e te ry trib utylo c yny), mie d zi, c ynk u, ma nga nu i rtê c i O rga nic zne a miny, a mid y, c hlo ro wa ne i nie c hlo ro wa ne p o c ho d ne fe no lo we , b ife no le , sulfid y, k a rb a minia ny (d itio k a rb a minia n, a mino k a rb , p ro p o xur, k a rb a ryl), izo tia zo le , tio fta limid y, p o c ho d ne tria zyno we (syma zyna , a tra zyna , p ro p a zyna ) Po dzia ³ bio c y dó w w za le ¿no c i o d w³a c iwo c i zwi¹ zk u c he mic zne g o przy k ³a dy Utle nia j¹ c e b ro m, b ro mo c hlo ro hyd a nto ina , c hlo r, d wutle ne k c hlo ru, jo d , e stry k wa su izo c yja nuro we go N ie utle nia j¹ c e b ro mo nitro p ro p a nd io l, b ro mo nitro styre n, k a rb a minia n, a ld e hyd gluta ro wy, izo tia zo l Bakteriocydy Stosowane w rolnictwie rodki bakteriobójcze stanowi¹ du¿¹ grupê, w sk³ad której wchodz¹ g³ównie antybiotyki, sulfonamidy, pochodne 8-hydroksychinoliny i in. Antybiotyki, stanowi¹ bardzo liczn¹ grupê zwi¹zków i nie bêd¹ szczegó³owo omawiane w niniejszej pracy. Podstawowe mechanizmy dzia³ania bakteriocydów polegaj¹ na rozbijaniu struktury lub zmianie przepuszczalnoci ciany komórkowej, hamowaniu procesów energetycznych oraz biosyntezy. Przyk³ady zwi¹zków dzia³aj¹cych bakteriobójczo przedstawiono w tabeli 2. K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA 140 TABELA 2 . P rzyk ³a d y b a k te rio c yd ó w (wg [1 8 ], zmo d yfik o wa no ) Ele me nty /me c ha nizmy k o mó rk i do c e lo we dla ba k te rio c y du Przy k ³a dy zwi¹ zk ó w c ia na k o mó rk o wa b a c ytra c yna , c e fa lo sp o ryny, p e nic yliny B³o ny k o mó rk o we jo no fo ry, p o limyk syny S ynte za b ia ³e k a mino glik o zyd y, c hlo ra mfe nik o l, te tra c yk lina S ynte za RN A rifa myc yna S ynte za DN A c hino lo ny S ynte za k wa su fo lio we go sulfo na mid y Jednym ze zwi¹zków stosowanych jako sk³adnik preparatów bakteriobójczych jest inhibitor syntetazy glutaminy, fosfinotricyna (PPT). Zwi¹zek ten jest analogiem kwasu glutaminowego toksycznym dla bakterii i rolin. Form¹ stosowan¹ w ochronie rolin jest tripeptyd L-alanino-L-alanino-fosfinotricyna, z którego komórkowe peptydazy odcinaj¹ dwa aminokwasy, a powsta³a fosfinotricyna dzia³a jako kompetycyjny inhibitor syntetazy glutaminy. Blokada enzymu przyczynia siê do raptownego zwiêkszenia wewn¹trzkomórkowego poziomu amoniaku, co skutkuje rozbiciem struktur b³onowych, a u rolin dodatkowo zahamowaniem fotosyntezy. Konsekwencj¹ jest mieræ organizmu [21]. Sulfonamidy s¹ kompetycyjnymi inhibitorami syntazy dihydropteronianu, analogami kwasu p-aminobenzoesowego. Dzia³anie antybiotyku zaburza wewn¹trzkomórkowy metabolizm bakterii blokuj¹c syntezê kwasu dihydrofoliowego, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania biosyntezy puryn i pirymidyn oraz nukleotydowych kofaktorów, takich jak NAD [17,29]. Czwartorzêdowe zwi¹zki amoniaku (np. chlorek benzalkoniowy) wp³ywaj¹ na przepuszczalnoæ b³on bakteryjnych i powoduj¹ koagulacjê cytoplazmy. Stosowane s¹ g³ównie przeciw bakteriom Gram+, ale te¿ niektórym Gram-, wirusom, grzybom i pierwotniakom [40]. Insektycydy Sporód preparatów insektycydowych najliczniej reprezentowan¹ grup¹ s¹ neurotoksyny, dzia³aj¹ce na receptory synaptyczne, acetylocholinesterazê lub aksony komórek nerwowych owada. Dzia³anie insektycydów nale¿¹cych do grupy tzw. insektycydów o niekonwencjonalnym mechanizmie dzia³ania polega na zaburzeniu rozwoju biologicznego owadów, ich ¿erowania i komunikacji osobniczej. Tego typu preparaty blokuj¹ m.in. syntezê chityny czy receptory b³on komórek nab³onka jelita rodkowego. Hamowanie aktywnoci acetylocholinesterazy (AChE), enzymu hydrolizuj¹cego acetylocholinê w synapsach nerwowych, zachodzi na zasadzie inhibicji kompetycyjnej. Zwi¹zki fosforoorganiczne bêd¹ce sk³adnikami preparatów insektycydowych s¹ hydrolizowane przez AChE, czego skutkiem jest fosforylacja seryny w miejscu aktywnym enzymu i kilkudniowa blokada jego aktywnoci, prowadz¹ca do mierci owada [35]. MECHANIZMY ODPORNOCI 141 Jako tzw. bioinsektycydy stosuje siê pochodne toksyn bakteryjnych grupy bioinsektycydowych bia³ek krystalicznych (Cry) produkowanych przez Bacillus thuringiensis*. Do tej pory zsekwencjonowano ponad 100 genów koduj¹cych bia³ka Cry. S¹ to sekwencje o wysokim stopniu zmiennoci, czêsto kodowane przez plazmidy jako fragmenty wiêkszych struktur, zawieraj¹cych ruchome elementy genetyczne. Toksyczne dzia³anie tych bia³ek zosta³o stwierdzone dla wielu gatunków owadów, jak równie¿ dla niektórych nicieni i pierwotniaków. Kryszta³y bia³kowe po spo¿yciu ulegaj¹ solubilizacji, a uwolnione protoksyny podlegaj¹ obróbce proteolitycznej w jelicie owadów. Powsta³e toksyny wi¹¿¹ siê z receptorami powierzchniowymi komórek nab³onka jelita rodkowego, wnikaj¹ w b³ony i formuj¹ nieselektywne kana³y jonowe lub pory. W wyniku niekontrolowanego nap³ywu wody i jonów komórki pêczniej¹ i nastêpuje ich liza. Geny koduj¹ce krystaliczne bia³ko B. thuringiensis wykorzystuje siê równie¿ do transformacji rolin w celu uzyskania odmian odpornych na owady. Toksycznoæ bia³ek Cry jest wysoce specyficzna i ogranicza siê do niektórych grup owadów i bezkrêgowców. Z tego wzglêdu B. thuringiensis jest obecnie najszerzej stosowanym pestycydem pochodzenia biologicznego [33]. Potencjalnym bioinsektycydem jest równie¿ neurotoksyna z jadu paj¹ka atracotoksyna. Blokuje ona bramkowane napiêciem kana³y wapniowe w b³onie komórkowej neuronów [42]. Dzia³anie owadobójcze bêd¹ce wynikiem specyficznego blokowania kana³ów jonowych wykazuj¹ te¿ syntetyczne insektycydy organiczne (pyretroidy, cyklodieny). Blokuj¹ one kana³y sodowe w os³once neuronów, doprowadzaj¹c do hiperpolaryzacji b³ony, blokady przewodzenia impulsów i parali¿u uk³adu nerwowego [8,34,46]. Fungicydy Wiêkszoæ fungicydów wp³ywa hamuj¹co na procesy zwi¹zane z biosyntez¹ oraz podzia³em j¹dra komórkowego, funkcjonowaniem b³ony cytoplazmatycznej i mitochondriów, a tak¿e na przemiany energetyczne. Natomiast tzw. fungicydy trzeciej generacji wzbudzaj¹ reakcje odpornociowe roliny, dzia³aj¹c jak abiotyczne induktory (elicitory). Za najbardziej aktywne grzybobójczo uwa¿a siê pestycydy blokuj¹ce podzia³ j¹dra komórkowego i biosyntezê ergosterolu. Podzia³y mitotyczne s¹ hamowane przez zwi¹zki benzimidazolowe (karbendazym, tiabendazol, benomyl, tiofanat metylu). Dzia³anie tych zwi¹zków polega na blokowaniu kurczliwoci mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego, po zwi¹zaniu siê herbicydu z podjednostk¹ β bia³ek tubulinowych. Do fungicydów blokuj¹cych syntezê ergosterolu (IBE, inhibitory biosyntezy ergosterolu) nale¿¹ zwi¹zki triazolowe, imidazolowe i strobilurynowe [2]. *Owadzi patogen B. thuringiensis nale¿y do bakterii Gram (+) produkuj¹cych przetrwalniki. Podczas stacjonarnej fazy wzrostu produkuje krystaliczne bia³ko (Cry) o w³aciwociach owadobójczych. Toksyczne bia³ka kodowane s¹ przez licznie wystêpuj¹ce w genomie bakterii plazmidy. Zaobserwowano interakcje (synergistyczne, jak i antagonistyczne) pomiêdzy toksynami pochodz¹cymi z ró¿nych szczepów B. thuringiensis. B. thuringiensis oficjalnie jest gatunkiem odrêbnym od B. cereus, lecz metody biochemiczne i morfologiczne, a nawet niektóre z metod molekularnych nie pozwalaj¹ na jednoznaczne rozró¿nienie obu gatunków. Czêæ badaczy postuluje wiêc traktowanie ich jako cz³onków tego samego gatunku (B. cereus). 142 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Zwi¹zki metali, siarki oraz wiêkszoæ fungicydów aromatycznych to niespecyficzne inhibitory enzymów uczestnicz¹cych w przemianach energetycznych. Zaburzenia przemian energetycznych mog¹ te¿ wynikaæ z uszkodzeñ b³ony lub zaburzenia transportu elektronów przez b³onê mitochondrialn¹. Zahamowanie biosyntezy bia³ek polega najczêciej na zak³óceniu reakcji w³¹czeania aminokwasów do kompleksu polipeptydowego. Taki sposób dzia³ania charakteryzuje organiczne zwi¹zki fosforu. Uszkodzenie bia³ek b³ony komórkowej zak³óca jej przepuszczalnoæ [2], a stymulacja wzrostu stê¿enia akumulowanego glicerolu wywo³uje w komórkach stres hiperosmotyczny [45]. Sposoby dzia³ania fungicydów oraz przyk³ady substancji czynnych przedstawiono w tabeli 3. TABELA 3. Przyk³adowe fungicydy oraz sposób ich dzia³ania Spos ób dzia³ania fungicydu Przyk³ady zwi¹zków Lite ratura Blokada podzia³u mitotycznego * zwi¹zki benzimidazolowe (karbendazym, tiabendazol, benomyl, tiofanat metylu) [2] Blokada biosyntezy ergosterolu zwi¹zki triazolowe, imidazolowe, strobilurynowe (IBE) [2] Zahamowanie biosyntezy bia³ek organiczne zwi¹zki fosforu (pirazofoz), niektóre fungicydy dichlorofenyloamidowe procymidon, iprodion, winklozolina) [2] Zahamowanie biosyntezy RNA zwi¹zki fenyloamidowe (metalaksyl) [2] Zaburzenia przemian energetycznych: uszkodzenia b³on mitochondrialnych wakuolizacja wewnêtrznej b³ony mitochondrialnej zwi¹zki difenyloamidowe, dinokap terrazol [22] [22] Zaburzenia przemian energetycznych zahamowanie transportu elektronów przez b³onê mitochondrialn¹ zwi¹zki strobilurynowe [22] Zaburzenia przemian energetycznych niespecyficzna inhibicja enzymów zwi¹zki metali (miedzi, cyny, rtêci), zwi¹zki siarki tiokarbaminiany, fungicydy aromatyczne [22] Zak³ócenie przepuszczalnoci b³ony komórkowej dodyna (monooctan guanidyny, kationowy surfaktant), tridemorf Stres hiperosmotyczny fungicydy fenylpirolowe [45] Wzbudzenie reakcji odpornociowej roliny fosetyl glinu [43] [2] *) Dzia³anie tych zwi¹zków polega na blokowaniu kurczliwoci mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego, po zwi¹zaniu siê fungicydu z podjednostk¹ β bia³ek tubulinowych MECHANIZMY ODPORNOCI 143 Herbicydy Dzia³anie herbicydów polega g³ównie na blokowaniu syntezy aminokwasów, karotenoidów lub lipidów, a tak¿e na zaburzeniu cyklu wzrostowego roliny. Wiele zwi¹zków dzia³a te¿ poprzez hamowanie transportu elektronów w chloroplastach. Przyk³adem zwi¹zków uszkadzaj¹cych elementy fotosystemu mog¹ byæ DCMU (dichlorofenylodimetylomocznik) i Parakwat (dichlorek 1,1-dimetylo-4,4-dipirydylu). DCMU blokuje przep³yw elektronów pomiêdzy fotouk³adami PS II i PS I przy przenoniku elektronów cz¹steczce ubichinonu QA, która jest po³¹czona z drug¹ cz¹steczk¹ ubichinonu QB. Struktura QB decyduje o powstaniu po³¹czenia z QA. W przypadku zablokowania transferu elektronów miêdzy cz¹steczkami ubichinonu (na skutek dzia³ania herbicydu lub np. mutacji w genie koduj¹cym QA) mo¿liwe jest powstanie mutacji, zmieniaj¹cej strukturê QB, co decyduje o powstaniu alternatywnego po³¹czenia miêdzy bia³kami, a zatem o odpornoci na DCMU. Parakwat przechwytuje elektrony przekazywane pomiêdzy PS I i NADP+, dzia³aj¹c jako egzogenny akceptor elektronów i przekazuj¹c je nastêpnie na tlen. Skutkiem nieprawid³owego . transportu elektronów jest powstawanie w chloroplastach rodników ponadtlenkowych O2 i uszkodzenie sk³adników chloroplastu, w szczególnoci lipidów i bia³ek [28]. 2,4-D (kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy) nale¿y do pochodnych fenoksykwasów i dzia³a jak regulator wzrostu rolin podobny do auksyn. W wiêkszych stê¿eniach niszczy roliny dwulicienne, zmuszaj¹c je do nadmiernie szybkiego wzrostu, w wyniku czego rolina ginie. Roliny jednolicienne maj¹ szybki sposób detoksykacji 2,4-D, dlatego herbicyd ten stosuje siê do zwalczania dwuliciennych chwastów w uprawach jedno-liciennych [28]. ¸ Glyfosat to herbicyd o szerokim spektrum dzia³ania. Blokuje on aktywnoæ syntazy kwasu 5-enolopirogrono-3-fosfoszikimowego (EPSPS), która uczestniczy w biosyntezie aminokwasów aromatycznych. Herbicyd jest nieszkodliwy dla zwierz¹t, niedokonuj¹cych syntezy tych aminokwasów [28]. Do inhibitorów syntazy acetylomleczanowej (ang. acetolactate synthase, ALS) nale¿¹ herbicydy sulfonynolymocznikowe oraz imidazole. Inhibitory ALS wp³ywaj¹ na zahamowanie szlaku metabolicznego leucyny, izoleucyny i waliny poprzez zablokowanie jednego z dwóch (lub obu) miejsc w cz¹steczce enzymu. Herbicydy mog¹ hamowaæ wzrost komórek poprzez inhibicjê syntazy celulozowej, prawdopodobnie blokuj¹c miejsce wi¹zania pewnych regulatorów lub fragment bia³ka odpowiedzialny za formowanie poru, którym ³añcuchy celulozowe przechodz¹ przez b³onê komórkow¹. Przyk³adem tego typu herbicydów s¹ tiazolidinony i izoksaben [32]. Do najczêciej stosowanych nale¿¹ herbicydy triazynowe, mocznikowe, karbaminianowe, tiokarbaminianowe, amidowe i fenoksyalkanokarboksylowe. Wprowadza siê te¿ herbicydy nowego typu fotodynamiczne. S¹ to herbicydy o strukturze dwupiercieniowej typu difenyl-eter (np. acifluorfen, oksyfluorfen), dzia³aj¹ce na zasadzie inhibicji kompetycyjnej w miejscu przy³¹czenia naturalnego substratu dla oksydazy protoporfirynogenu IX. Jest to ostatni enzym szlaku biosyntezy tetrapirolu, a jego zablokowanie prowadzi do akumulacji protoporfirynogenu IX. Wynikiem jest absorpcja energii wietlnej przez protoporfirynogen IX, fotooksydacja i uwolnienie toksycznych dla komórki reaktywnych form tlenu [19]. 144 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Herbicydy dzia³aj¹ selektywnie w zale¿noci od rozmieszczenia systemu korzeniowego chwastów i rolin uprawnych w glebie. Substancje te dzia³aj¹ na systemy enzymatyczne, funkcjonuj¹ce w okrelonych, wyspecjalizowanych tkankach, dlatego docelowe miejsce dzia³ania herbicydów w rolinie odgrywa równie¿ du¿¹ rolê. Odpornoæ na herbicyd mo¿e byæ wynikiem s³abego przemieszczania siê tego zwi¹zku do tkanki docelowej, na przyk³ad wierzcho³ków wzrostu. Selektywnoæ dzia³ania herbicydu w stosunku do okrelonych gatunków rolin wynika g³ównie ze zdolnoci pewnych rolin (np. uprawnych) do jego detoksykacji. Odpornoæ na 2,4-D polega na jego szybkim metabolizowaniu. Mo¿e siê to odbywaæ drog¹ hydroksylacji piercienia aromatycznego, przy³¹czenia glukozy lub kwasu aspara-ginowego przy grupie karboksylowej, jak te¿ poprzez reakcjê utlenienia ³añcucha bocznego, którego usuniêcie powoduje zanik aktywnoci hormonalnej. Zbyt wolne przeprowadzanie tej ostatniej reakcji jest przyczyn¹ wra¿liwoci chwastów dwuli-ciennych na ten herbicyd [15]. Ka¿dy herbicyd w stê¿eniu wiêkszym ni¿ stê¿enie niszcz¹ce okrelon¹ grupê chwastów mo¿e uszkodziæ lub zniszczyæ tak¿e rolinê uprawn¹. DZIA£ANIE PESTYCYDÓW NA ORGANIZMY INNE NI¯ DOCELOWE Wp³yw biocydów na roliny uprawne mo¿e mieæ dwojaki charakter. Zazwyczaj dzia³ania pozytywne przewa¿aj¹ nad szkodliwymi skutkami ubocznymi ich stosowania. Czêæ pestycydów, jak fungicyd kaptan, mo¿e korzystnie wp³ywaæ na wzrost lici i pêdów, intensywnoæ fotosyntezy oraz zabarwienie owoców poprzez stymulacjê gromadzenia antocyjanów w skórce owoców, np. jab³ek [2]. Stosowanie fungicydów chroni roliny przed akumulacj¹ mykotoksyn w tkankach, a herbicydów przed nadmiern¹ konkurencj¹ o wodê i energiê wietln¹ [28]. W wielu przypadkach trudno jest jednak wyeliminowaæ negatywny wp³yw pestycydów na roliny uprawne. Stosowa-ne substancje s¹ czêsto toksyczne dla rolin, wywo³uj¹c powstawanie nekroz na liciach, kwiatach i owocach. Zwi¹zki miedzi i siarki mog¹ przyczyniaæ siê do silnego uszkodzenia lici i owoców, a nieorganiczne zwi¹zki siarki powoduj¹ ponadto zahamowanie fotosyn-tezy. Substancje te zwiêkszaj¹ równie¿ transpiracjê kutykularn¹ kosztem zatrzymania transpiracji szparkowej. Z kolei zaprawy do nasion czêsto obni¿aj¹ zdolnoæ i energiê ich kie³kowania. Wiêkszoæ chemicznych pestycydów ma bardzo szerokie spektrum dzia³ania i niszczy, oprócz szkodników, tak¿e organizmy po¿yteczne, wywo³uj¹c niekorzystne zmiany w sk³adzie i strukturze fauny glebowej [30]. Powszechne stosowanie rodków ochrony rolin, a tak¿e nieorganicznych nawozów wp³ywa redukuj¹co na produktywnoæ i jakoæ gleby, która w pewnym stopniu zale¿y od procesów fizjologicznych ¿yj¹cych w glebie mikroorganizmów. Pestycydy mog¹ wp³ywaæ na gêstoæ wystêpowania glebowych bakterii i grzybów, ich aktywnoæ i wzrost, przyczyniaj¹c siê do niekorzystnych zmian w liczebnoci i strukturze populacji tych mikroorganizmów. Zmiany te prowadz¹ do spadku ró¿norodnoci i zaniku funkcji mikrorganizmów glebowych i zachwiania równowagi dynamicznej rodowiska glebowego [13]. MECHANIZMY ODPORNOCI 145 Stosowanie chemicznych rodków ochrony rolin nie pozostaje równie¿ bez wp³ywu na cz³owieka. Pestycydy wywieraj¹ du¿y wp³yw na system immunologiczny osób pracuj¹cych przy ich produkcji, stosuj¹cych je rolników, a tak¿e mieszkañców terenów rolniczych oraz konsumentów wyprodukowanej przy ich u¿yciu ¿ywnoci. Wp³yw ten jest najczêciej immunosupresywny, czasem jednak immunostymuluj¹cy, w zale¿noci od rodzaju stosowanego rodka oraz dawki. Immunosupresja zwiêksza ryzyko wyst¹pienia nowotworów. Immunostymulacja przyczynia siê do pojawiania siê chorób autoimmunologicznych i alergii [41]. Dyrektywy Unii Europejskiej cile okrelaj¹ rodzaj i iloæ zwi¹zków stosowanych jako biocydy, wprowadzanych na rynki krajów UE. Wyklucza siê u¿ycie zwi¹zków dzia³aj¹cych niekorzystnie na organizm, np. wydzielaj¹cych formaldehyd, tworz¹cych rakotwórcze nitrozoaminy. Tak¿e produkty przemian chemicznych i mikrobiologicznych u¿ywanych pestycydów nie mog¹ wykazywaæ dzia³ania toksycznego, rakotwórczego, uczulaj¹cego itp. [30]. Pestycydy organiczne maj¹ okrelony czas trwa³oci, determinuj¹cy czas karencji (najkrótszego okresu, jaki musi up³yn¹æ od ostatniego kontaktu rolin z preparatem do terminu ich zbioru i spo¿ycia) [28]. MECHANIZMY NABYWANIA ODPORNOCI NA RODKI OCHRONY ROLIN Rozwój odpornoci na pestycydy jest procesem ewolucyjnym, w którym dany pestycyd dzia³a jako presja selekcyjna na populacjê zró¿nicowan¹ genetycznie pod wzglêdem odpornoci na niego. Tempo tego procesu zale¿y od zró¿nicowania genetyczn-ego tej populacji oraz od intensywnoci selekcji [23]. Okrelenie charakteru odpornoci i zidentyfikowanie odpowiedzialnych za ten mechanizm mutacji powinno w przysz³oci pozwoliæ, w powi¹zaniu z badaniami z dziedziny genetyki populacyjnej i ekologii, na stworzenie zintegrowanych technik ochrony rolin (ang. Integrated Pest Management, IPM) [39]. Wra¿liwoæ organizmu na dany zwi¹zek zale¿y od trzech cech: istnienia w komórce elementu docelowego dla pestycydu, posiadania mechanizmu transportu substancji do wnêtrza komórki oraz braku enzymów inaktywuj¹cych lub modyfikuj¹cych te zwi¹zki. Zmiana którejkolwiek z tych cech prowadzi do nabycia odpornoci przez organizm [18].W ka¿dej populacji, obok dominuj¹cych form wra¿liwych, mog¹ w wyniku mutacji, krzy¿owania i heterokariozy (u grzybów) pojawiæ siê osobniki odporne. Formy te, pocz¹tkowo nieliczne, wskutek selekcyjnego dzia³ania pestycydu, stopniowo zaczynaj¹ dominowaæ w populacji. Prawdopodobieñstwo nabycia odpornoci w du¿ym stopniu, obok zmiennoci gatunkowej organizmu, zale¿y od mechanizmu dzia³ania zwi¹zku. Pestycydy dzia³aj¹ce na kilka uk³adów enzymatycznych jednoczenie (np. zak³ócaj¹ce funkcje energetyczne) stwarzaj¹ mniejsze niebezpieczeñstwo uodpornienia siê osobnika ni¿ zwi¹zki selektywne, dzia³aj¹ce na cile okrelone funkcje. Odpornoæ na pestycydy wchodz¹ce w specyficzne reakcje z elementami komórki (np. inhibitory syntezy ergosterolu zwi¹zki benzimidazolowe) wykszta³ca siê czêsto w bardzo krótkim czasie na skutek pojedynczych mutacji punktowych. Przyk³ady mutacji punktowych nadaj¹cych odpornoæ przedstawiono w tabeli 4. 146 TABELA 4. Przyk³ady mutacji punktowych nadaj¹cych odpornoæ na biocydy Biocyd Ge n i je go rola Zmiana aminokwas u Uwagi Lit. Neisseria gonorrhoeae tetracyklina rpsJ1 koduje rybosomalne bia³ko S10 Val 57 → Met/Leu/Gln zmiana struktury RNA w pobli¿u miejsca przy³¹czenia antybiotyku [16] Escherichia coli microcin B17* gyrB koduje podjednostkê ß bakteryjnej gyrazy Trp751 → Arg podwójna tranzycja AT w GC [6] Neisseria gonorrhoeae fluorochinolony np. ciprofloksacyna parC koduje bakteryjn¹ topoizomerazê IV Asp 86 → Asn Ser 87 → Ile Ser 88 → Pro Glu 91 → Gly [7] Pseudomonas aeruginosa ciprofloksacyna ofloksacyna norfloksanyna gyrA koduje podjednostkê α bakteryjnej gyrazy parC koduje bakteryjn¹ topoizomerazê IV Thr 83 → Ile Asp 87 → Gly/Asn Ser 80 → Leu Glu 84 → Lys 25] Chlamydomonas reinhardt ii, Synechococcus sp. atrazynan DCMU metribuzin psbA1 gen koduj¹cy bia³ko QB np. Ser 264 → Gly/Glu/Ala Pro/Thr/Cys Phe 255 → Leu/Tyr Leu 271 → Val/Met/Ala u rolin wy¿szych mutacja Ser264Gly powoduje zmniejszon¹ produktywnoæ efektywnoæ fotosyntezy kumulacja mutacji wp³ywa na stopieñ odpornoci [31] Synechocyst is metribuzin atrazyna ioxynil psbA1 gen koduj¹cy bia³ko QB Ala 251 → Val Ile 248 → Thr Asn 266 → Thr Ser 264 → Ala zwiêkszona wra¿liwoæ na stres wietlny kumulacja mutacji wp³ywa na stopieñ odpornoci [27] Glycine max atrazyna psbA gen koduj¹cy bia³ko QB Ser 268 → Pro zwiêkszona wra¿liwoæ na stres wietlny [1] 25] K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Organizm TABELA 4. cd. Biocyd Ge n i je go rola Zmiana aminokwas u Uwagi Lit. Solanum t uberosum atrazyna psbA gen koduj¹cy bia³ko QB Ser 264 → Thr brak spadku efektywnoci fotosyntezy, prawdopodobnie dziêki zachowaniu grupy - OH ³añcucha bocznego aminokwasu i utrzymaniu wi¹zañ chemicznych w cz¹steczce [37] Lucilia cuprina, Musca domest ica insektycydy fosforoorganiczne, np. diazinon LcaE7 gen koduj¹cy karboksylesterazê Gly 137 → Asp Ala 267 → Val Met 283→ Leu Thr 335 → His Ile 358 → Phe zmiana karboksylesterazy w hydrolazê insektycydu, [26] zmiana konformacji miejsca aktywnego pozwalaj¹ca na ustawienie cz¹steczki wody w pozycji dogodnej do przeprowadzenia reakcji hydrolizy i regeneracji ufosforylowanego enzymu; czêsto dodatkowo wystêpuje podwy¿szona ekspresja GST, cyt. p450, esteraz Drosophila melanogast er insektycydy fosforoorganiczne, np. malation ace gen acetylocholinesterazy, AChE Phe 268 → Tyr Gly 256 → Val** Ile 161 → Val Phe 330 → Tyr Gly 368 → Ala nastêpuje zmiana w³aciwoci katalitycznych enzymu; poziom odpornoci koreluje z liczb¹ kopii genu ace mutacje dotycz¹ miejsca aktywnego lub jego s¹siedztwa; wp³ywa to negatywnie na stabilnoæ enzymu; kumulacja mutacji wp³ywa na szerszy zakres odpornoci, jednoczenie zmniejszaj¹c stabilnoæ enzymu; tylko jedna z mutacji kompensuje to podwy¿szon¹ aktywnoci¹ AChE [10] [35] MECHANIZMY ODPORNOCI Organizm *) dzia³anie polega na inhibicji podj. β bakteryjnej gyrazy. Bakteriocyd prawdopodobnie blokuje miejsce, przez które przeplatana jest nieprzeciêta niæ DNA **) mutacja powoduje wzrost aktywnoci enzymu 147 148 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Mo¿liwe jest równie¿ wyst¹pienie zjawiska odpornoci krzy¿owej, polegaj¹cego na wykszta³ceniu odpornoci na kilka substancji, nale¿¹cych do grupy zwi¹zków o podobnym mechanizmie dzia³ania. Zablokowanie mechanizmu dzia³ania substancji czynnej pozwala na uodpornienie siê na kilka zwi¹zków w wyniku kontaktu tylko z jednym z nich. Przyk³adem mo¿e byæ powi¹zanie odpornoci bakterii na streptomycynê z odpornoci¹ na inne antybiotyki z grupy aminoglikozydów (odpornoæ krzy¿owa miêdzy metycylin¹, streptomycyn¹ i tetracyklin¹) [9]. U grzybów czêsto wystêpuje zjawisko nabywania odpornoci krzy¿owej, którego przyczyn¹ jest nadu¿ywanie fungicydów benzimidazolowych, dikarboksyimidowych i fenyloamidowych [2]. Zale¿noci miêdzy nabywaniem odpornoci na najczêciej stosowane insektycydy przedstawiono na rycinie 1. Dzia³anie presji selekcyjnej w kierunku zwiêkszania puli genów odpornoci w populacji przejawia siê ju¿ w najwczeniejszych stadiach rozwoju organizmów. Przyczyn¹ bardzo szybkiego uodpornienia siê chwastów na herbicydy inhibitory ALS jest wyst¹pienie mutacji punktowych w genie enzymu syntazy acetylomleczanowej. Uwa¿a siê, ¿e na s³upku kie³kuj¹ jedynie zmutowane ziarna py³ku, co zwiêksza prawdopodobieñstwo utrzymania siê i rozprzestrzenienia mutacji w populacji [12]. Ewolucyjny proces nabywania odpornoci na rodki ochrony rolin mo¿e s³u¿yæ jako dobry model adaptacji organizmów. Adaptacja ta mo¿e odbywaæ siê ró¿nymi drogami, które zazwyczaj determinuj¹ szybkoæ wykszta³cenia odpornoci oraz jej mechanizm. Przyk³ady niektórych mechanizmów nabywania odpornoci zaprezentowano w tabeli 5. Mutacje punktowe powoduj¹ce zmianê w³aciwoci i/lub struktury bia³ka docelowego Mutacje punktowe mog¹ zmieniaæ konformacjê miejsca wi¹zania pestycydu do bia³ka, przez co wi¹zanie z pestycydem jest nietrwa³e lub wrêcz niemo¿liwe. Przyk³adem mo¿e byæ mutacja w genie kana³u sodowego owadów, powoduj¹ca niewra¿liwoæ tego kana³u na pyretroid [46]. Za zmianê w interakcji enzymu z inhibitorem (tzw. herbicydami typu fop i dim haloxyfop, sethoxydim) odpowiada te¿ mutacja punktowa w genie plastydowej karboksylazy acetylo-CoA, dziêki czemu herbicydy te nie inaktywuj¹ docelowego enzymu [44]. Ocenia siê, ¿e minimum 5 ró¿nych mutacji punktowych w miejscu wi¹zania insektycydu przez AChE odpowiada, pojedynczo lub wspólnie, za zró¿nicowany stopieñ odpornoci na zwi¹zki fosforoorganiczne i insektycydy karbamylowe [3,35]. Dwie mutacje punktowe powoduj¹ powstanie izoformy syntazy celulozowej niewra¿liwej na herbicydy izoksabenowe i tiazolimidowe [32]. Z kolei, wywo³ane mutacjami punktowymi zmniejszone powinowactwo enzymu sterolo-14α-demetylazy do fungicydów imidazolowych i triazolowych odpowiada za znaczne zmniejszenie skutków dzia³ania prochlorazu i innych fungicydów nale¿¹cych do tych grup [8]. Zmutowane odporne bia³ko mo¿e byæ jednak mniej stabilne, przy czym stabilnoæ jest skorelowana z liczb¹ mutacji punktowych w pierwotnym genie. Zale¿noæ tak¹ udokumentowano w przypadku zmutowanego genu dla AChE u Drosophila melano-gaster [35]. MECHANIZMY ODPORNOCI 149 RYCINA 1. Zale¿noci w wystêpowaniu odpornoci krzy¿owej na najczêciej u¿ywane grupy insektycydów. W ramkach podano grupy zwi¹zków bêd¹cych sk³adnikami preparatów insektycydowych. Kursyw¹ wypisane zosta³y nazwy enzymów detoksykuj¹cych odpowiadaj¹cych za odpornoæ na dane grupy insektycydów (wg [3], zmieniono): kdr* (ang. knockdown resistance) odpornoæ na szok, odpornoæ uk³adu nerwowego owadów na parali¿ wywo³any insektycydami blokuj¹cymi kana³y jonowe; ** iwermektyny nale¿¹ do syntetyzowanych przez bakterie z rodzaju Streptomyces zwi¹zków z grupy laktonów makrocyklicznych stosowanych jako nematocydy i insektycydy, blokuj¹ bramkowane kwasem glutaminowym kana³y sodowe bezkrêgowców, co prowadzi do parali¿u miêni 150 TABELA 5. Przyk³ady molekularnych mechanizmów odpornoci patogenów i szkodników rolin na pestycydy Przyk³ad - me chanizm odporno ci Typ pe s tycydu, rodzaj zwi¹zku Lite ra.tura Mutacja punktowa mutacja w genie kana³u sodowego w miejscu wi¹zania pyretroidu zmiana aminokwasu w receptorze GABA (kwasu γ- aminomas³owego) zmiana 1 aminokwasu, zmiana specyficznoci esterazy w hydrolazê insektycydu mutacja w silnie konserwatywnym regionie genu syntazy celulozowej Insektycydy (pyretroid) Insektycydy organofosforowe (malation) i karbamylowe (propoxur) Insektycydy organofosforowe (malation) i karbamylowe (propoxur) Herbicydy (tiazolidinony, izoksaben) [46] [3] nadekspresja monooksygenazy cytochromu p450 wzrost liczby kopii esterazy Insektycydy (pyretroid), Herbicydy (fenylomocznik). Insektycydy organofosforowe (malation) i karbamylowe (propoxur) Herbicydy chloracetanilidow e(acetochlor, metolachlor) [46][36] [3] Amplifikacja kopii genu nadekspresja transferaz glutationowych [3] [32] [14] Zmiana stabilnoci mRNA zwiêkszenie stabilnoci transkryptu genu monooksygenazy cytochromu p450 wskutek mutacji Insektycydy (pyretroid) [46] Nadekspresja lub zmiana powinowactwa do bia³ka docelowego zmiana powinowactwa sterolo- 14α- demetylazy wiele zmian w miejscach przy³¹czania bia³ka Cry do receptorów komórkowych w jelicie owadów mechanizm nieznany zmiany w miejscu przy³¹czenia herbicydu typu difenyleter do oksydazy protoporfirynogenu IX. Po³¹czenie inhibitora nietrwa³e Fungicydy imidazolowe (prochloraz) i triazolowe Bioinsektycydy (Cry) [8] [33] Herbicydy (acifluorfen, oxyfluorfen) [19] Minimalizacja skutków dzia³ania pestycydu hiperaktywacja MAP kinaz szlaku transdukcji sygna³ów w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny usuwanie pestycydu przez pompy b³onowe, transport aktywny zmiana sk³adu kwasów t³uszczowych b³ony komórkowej Fungicydy fenylpirolowe (fludioxonil),herbicydy dikarboksyimidowe Fungicydy imidazolowe (prochloraz) i triazolowe Bakteriocyd (chlorek benzalkoniowy) [45] [8] [40] K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA M e chanizm nabycia odporno ci MECHANIZMY ODPORNOCI 151 Amplifikacja kopii genu Strategia ta ma na celu osi¹gniêcie wy¿szego poziomu ekspresji genów koduj¹cych bia³ka odpowiedzialne za detoksykacjê ksenobiotyków. Najczêstszym przyk³adem jest zwiêkszenie kopii genu esterazy do ponad 250 u owadów, m.in. komarów, zwiêkszaj¹ce odpornoæ na zwi¹zki fosforoorganiczne i karbaminiany, dziêki szybszej detoksykacji tych insektycydów [24]. Mutacje punktowe powoduj¹ce zmianê w³aciwoci i/lub struktury bia³ka innego ni¿ docelowe Istnieje równie¿ mechanizm odpornoci polegaj¹cy na modyfikacji niektórych enzymów detoksykuj¹cych, niespecyficznych w stosunku do danego pestycydu i nie bêd¹cych celem dzia³ania tych zwi¹zków. W wyniku mutacji specyficznoæ takiego enzymu mo¿e zostaæ zmieniona w kierunku wiêkszego powinowactwa do konkretnego zwi¹zku, co pozwala organizmom na skuteczn¹ detoksykacjê lub inhibicjê pestycydu. Przyk³adem mog¹ byæ esterazy, tworz¹ce rodzinê z³o¿on¹ z szeciu grup bia³ek enzymatycznych. U Diptera wystêpuj¹ one jako zgrupowanie genów na tym samym chromosomie. Poza mechanizmem odpornoci polegaj¹cym na amplifikacji kopii wielogenowych, mog¹ wyst¹piæ równie¿ mutacje punktowe modyfikuj¹ce pojedyncze geny danej grupy. Na przyk³ad zmiana niespecyficznej esterazy w specyficzn¹ dla danego insektycydu hydrolazê mo¿e zajæ w wyniku zmiany jednego aminokwasu w sekwencji bia³ka [3,26]. Zwiêkszenie poziomu transkrypcji genów enzymów detoksykuj¹cych Najczêciej wystêpuj¹cym mechanizmem odpornoci owadów na insektycydy jest wzmo¿ona transkrypcja genów enzymów detoksykuj¹cych: esteraz, oksydaz, transferaz glutationowych [3,10]. Na przyk³ad w odpowiedzi na presjê selekcyjn¹ wywieran¹ przez insektycydy chloracetanilidowe (atrazyna) u muchy domowej wystêpuje zwiêkszenie poziomu transkrypcji transferaz glutationowych i esteraz bior¹cych udzia³ w detoksykacji tych zwi¹zków [11]. Przyk³adem podobnego mechanizmu u rolin mo¿e byæ nadekspresja syntetazy γ-glutamylocysteiny (γECS), enzymu regulatorowego w procesie biosyntezy glutationu. Podwy¿szenie ekspresji γECS oraz transferaz glutationowych jest ród³em odpornoci na herbicydy chloracetanilidowe u topoli [14]. Nadekspresja bia³ka docelowego dla pestycydu W wyniku stosowania insektycydów karbamylowych i zwi¹zków fosforoorganicznych mo¿e wykszta³ciæ siê mechanizm odpornoci polegaj¹cy na biosyntezie wiêkszej iloci kopii acetylocholinesterazy. Czêæ cz¹steczek enzymu pozostaje wówczas zdefosforylowana i aktywna, a poziom aktywnej AChE cile koreluje ze stopniem odpornoci [10]. Zazwyczaj jednak mechanizm ten wi¹¿e siê z wystêpowaniem mutacji punktowych w genie AChE. Ze wzglêdu na to, ¿e mutacje punktowe w genie enzymu powoduj¹ jego zmniejszon¹ aktywnoæ i stabilnoæ, nadekspresja kompensuje te niekorzystne zmiany poprzez zwiêkszenie iloci kopii bia³ka [35]. 152 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA Stabilizacja mRNA Poziom enzymów mo¿e zostaæ zwiêkszony dziêki zapewnieniu wiêkszej stabilnoci transkryptu. Prawdopodobnie mutacja w jednym z genów monooksygenazy cytochromu p450 wp³ywa na zwiêkszon¹ stabilnoæ transkryptu tego genu i w ten sposób zwiêksza wewn¹trzkomórkowy poziom enzymu, co wp³ywa na odpornoæ owadów na pyretroid [46]. Metabolizm i detoksykacja pestycydu Czêstym ród³em odpornoci jest zwiêkszenie poziomu i/lub aktywnoci zwi¹zków wi¹¿¹cych ksenobiotyki (np. glutation, fitochelatyny) lub specyficznych enzymów bior¹cych udzia³ w inaktywacji pestycydu [8,10]. Przyk³adem mog¹ byæ bakterie odporne na analog kwasu glutaminowego fosfinotricynê. Syntetyzuj¹ one enzym specyficznie go inaktywuj¹cy acetylotransferazê fosfinotricyny [21]. Odpornoæ mo¿e wynikaæ równie¿ z braku aktywnej formy enzymu, np. owady odporne na toksyczne bia³ko Cry B. thuringiensis nie maj¹ w jelicie proteaz zwykle trawi¹cych protoksynê, w zwi¹zku z czym niepoddany obróbce proteolitycznej bioinsektycyd pozostaje w formie nieaktywnej [33]. Minimalizacja skutków dzia³ania pestycydu Tego typu strategie odpornociowe skutkuj¹ zwiêkszon¹ odpornoci¹ na toksyczne dotychczas zwi¹zki poprzez: zmniejszenie stopnia wch³aniania pestycydu do komórki (zmiany w sk³adzie ciany komórkowej, jej uszczelnienie, zmiany w budowie kana³ów b³onowych, którymi toksyczne substancje przedostaj¹ siê przez b³onê, zwiêkszenie iloci i aktywnoci pomp b³onowych usuwaj¹cych toksyny na zewn¹trz komórki). Zwykle za os³abienie skutków dzia³ania pestycydów odpowiada zwiêkszenie naturalnej zdolnoci detoksykacji reaktywnych form tlenu powsta³ych w wyniku dzia³ania pestycydu na drodze szlaku antyoksydacyjnego. Czêsto tego typu odpornoæ, zwi¹zana ze zwiêkszon¹ aktywnoci¹ lub iloci¹ kopii enzymów szlaku antyoksydacyjnego, wystêpuje u rolin odpornych na herbicydy uszkadzaj¹ce fotosystem II. W odpowiedzi na herbicydy dikarboksyimidowe i fungicydy fenylpirolowe, zwiêkszaj¹ce poziom akumulacji glicerolu w komórkach, u odpornych rolin i grzybów nastêpuje hiperaktywacja MAP kinaz szlaku transdukcji sygna³ów zwi¹zanego ze stresem osmotycznym i przywrócenie prawid³owego cinienia osmotycznego w komórce [45]. Mo¿liwe jest te¿ aktywne usuwanie ksenobiotyku poza komórkê w drodze transportu aktywnego, jak to ma miejsce u niektórych grzybów odpornych na prochloraz [8]. U bakterii czêstym mechanizmem odpornoci jest zmiana sk³adu kwasów t³uszczowych b³ony, jej struktury oraz zwiêkszona synteza kwasów tejchojowych, co radykalnie zmniejsza przepuszczalnoæ b³ony dla wielu antybiotyków [40]. Najczêstsz¹ drog¹ przekazywania genów odpornoci u bakterii jest koniugacja. W genomie bakteryjnym odpornoæ mo¿e byæ kodowana zarówno na chromosomie bakteryjnym, jak i przez plazmidy. Je¿eli plazmid wystêpuj¹cy w komórce nale¿y do koniugacyjnych, odpornoæ mo¿e byæ przekazywana nawet miêdzy ró¿nymi gatunkami bakterii, w dodatku proces ten nie zale¿y od obecnoci lub braku antybiotyków w MECHANIZMY ODPORNOCI 153 rodowisku. Na przyk³ad gen odpornoci na metycylinê u Staphylococcus aureus (Gram+) powsta³ z genu β-laktamazy S. aureus i fragmentu genu pochodz¹cego z innej bakterii, prawdopodobnie z E. coli (Gram-), koduj¹cego bia³ko wi¹¿¹ce penicylinê [18]. Mechanizm dzia³ania biocydów wp³ywa na czas wykszta³cenia siê odpornoci na dany zwi¹zek. Odpornoæ na substancje niespecyficznie blokuj¹ce ró¿ne uk³ady enzymatyczne wykszta³ca siê wolniej ni¿ w przypadku zwi¹zków wysoce selektywnych w stosunku do substratu. EWOLUCJA ODPORNOCI Genetyczne podstawy odpornoci na pestycydy graj¹ decyduj¹c¹ rolê dla ryzyka dalszego rozprzestrzenienia siê odpornoci. Nag³y spadek efektywnoci pestycydu jest bardziej prawdopodobny, gdy odpornoæ jest skutkiem mutacji w jednym genie (np. gwa³towny rozwój opornoci na benzimidazole w populacji grzybowych patogenów rolin). Je¿eli odpornoæ pojawia siê dopiero w efekcie synergistycznego dzia³ania dwóch zmienionych genów, dopiero mutacja w obu loci powoduje jej wyst¹pienie. Stopniowe zmiany w kierunku zmniejszonej wra¿liwoci na rodki ochrony rolin maj¹ miejsce, gdy odpornoæ jest w danej populacji pod kontrol¹ poligenow¹. Selekcja jest w tym przypadku raczej kierunkowa ni¿ ró¿nicuj¹ca [8]. Wykorzystywane jest wówczas zjawisko naturalnego zró¿nicowania wra¿liwoci na pestycydy u organizmów w populacji [19]. Mechanizmy odpornoci s¹ bardzo z³o¿one, gdy¿ na efekt dzia³ania pestycydu wp³yw ma, poza genotypem patogena, równie¿ jego stan fizjologiczny i czynniki rodowiskowe, w tym obecnoæ i aktywnoæ naturalnych wrogów. Skutki nabycia odpornoci równie¿ bywaj¹ zró¿nicowane. Substytucja w jednym locus z allelu wra¿liwoci w allel odpornoci mo¿e mieæ wp³yw na zmianê biochemicznych i fizjologicznych w³aciwoci rozwojowych organizmu. Nabycie odpornoci na pestycydy mo¿e mieæ negatywny wp³yw na ¿ywotnoæ patogena w warunkach braku kontaktu z pestycydem, jak równie¿ na jego ogóln¹ kondycjê i p³odnoæ. Teoretycznie, wobec tego, ¿e mutacje w allel odpornoci wp³ywaj¹ negatywnie na ¿ywotnoæ organizmów, allele te s¹ z powodu selekcji naturalnej rzadkie w populacjach atakuj¹cych roliny niechronione pestycydami. Nabyta cecha odpornoci mog³aby wiêc, w warunkach zaprzestania stosowania pestycydu, ulec rewersji pod wp³ywem selekcji naturalnej. Tak siê jednak nie dzieje, badania empiryczne wskazuj¹ bowiem, ¿e negatywne koszty nabycia odpornoci s¹ w warunkach polowych w znacznym stopniu ograniczane [23]. Zamiast rewersji, czêciej wystêpuje ewolucja kompensacyjna. Istotnie, po nabyciu odpornoci przez pierwotnie wra¿liwego patogena, jego ¿ywotnoæ i tempo metabolizmu mog¹ siê zmniejszyæ. Jednak w warunkach braku pestycydu w rodowisku, w genomie patogena zachodz¹ mutacje kompensuj¹ce, zwiêkszaj¹ce poziom metabolizmu i ogóln¹ kondycjê organizmu. W warunkach ponownego zastosowania pestycydu, patogeny pozostaj¹ odporne, a ich ¿ywotnoæ utrzymuje siê na wysokim poziomie. Ewolucja i adaptacja s¹ bowiem procesami postêpowymi i nieodwracalnymi [20]. 154 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA WPROWADZANIE ODPORNOCI JAKO STRATEGIA OCHRONY ROLIN Przyk³ady omówione powy¿ej koncentrowa³y siê na zgadnieniu odpornoci naturalnej. W celu podwy¿szenia produktywnoci upraw mo¿na równie¿ zastosowaæ biotechnologiczne wprowadzanie odpornoci do genomów organizmów. Coraz popularniejsze staje siê wykorzystanie biotechnologicznych metod konstruowania rolin uprawnych odpornych na substancje stosowane dla ich ochrony. Alternatyw¹ dla bezpiecznego dla jednoliciennych stosowania 2,4-D coraz czêciej staje siê wprowadzanie do genomu rolin uprawnych genu odpornoci na stosowany herbicyd. Dziêki odpornoci rolin uprawnych mo¿na zwiêkszyæ dawkê stosowanego rodka chwastobójczego bez obaw o wysokoæ plonu. Niebezpieczeñstwu przeniesienia siê tych genów do genomu chwastów w wyniku zapylenia zapobiega siê poprzez klonowanie genów odpornoci do genomu plastydowego lub przez podzielenie konstruktu i umieszczenie go w dwóch ró¿nych genomach roliny: plastydowym i j¹drowym [5,38]. Zwykle wprowadzana jest odpornoæ na herbicydy o szerokim spektrum dzia³ania. Przyk³adem mo¿e byæ wprowadzenie dodatkowej kopii genu enzymu EPSPS do genomu rolin uprawnych, co w znacznym stopniu zwiêkszy³o ich odpornoæ na glyfosat [28]. Odpornoæ na szkodniki mo¿na uzyskaæ poprzez produkcjê rolin produkuj¹cych toksyny (m.in. bawe³na z wklonowanym i ulegaj¹cym ekspresji genem bia³ka Cry pochodz¹cym z genomu B. thuringiensis). Podejcie takie jest bardzo korzystne, mo¿na bowiem ograniczyæ ekspresjê toksyn jedynie do tkanek zagro¿onych inwazj¹ szkodników. Ponadto odpornoæ na patogena staje siê dziedziczna, co ogranicza koszty ochrony uprawy [33]. Niebezpieczeñstwo nabycia przez szkodniki odpornoci wystêpuje równie¿ w przypadku wykorzystywania toksyn syntetyzowanych przez roliny. Dlatego metoda syntezy bioinsektycydów w organizmach rolinnych (tak jak i podczas konwencjonalnego stosowania pestycydów) wymaga osi¹gniêcia na tyle wysokiej ekspresji bia³ka (stê¿enia pestycydu), by wyeliminowaæ osobniki heterozygotyczne pod wzglêdem odpornoci. Wówczas odporne homozygoty bêd¹ krzy¿owaæ siê z osobnikami wra¿liwymi, co wp³ynie na opónienie wykszta³cenia siê fenotypu odpornoci w populacji. STRATEGIE ZAPOBIEGANIA NABYWANIU ODPORNOCI NA RODKI OCHRONY ROLIN Wobec szybkiego nabywania odpornoci przez patogeny i szkodniki rolin, szczególnie najszybciej i najskuteczniej na dzia³aj¹ce selektywnie pestycydy organiczne, straty w uprawach s¹ bardzo wysokie. Poszukuje siê zatem strategii zapewniaj¹cych ochronê przed wykszta³caniem przez szkodniki odpornoci na rodki ochrony rolin. Zaleca siê przede wszystkim stosowanie, zamiennie lub jednoczenie, kilku ró¿nych metod zwalczania szkodników upraw, ³¹czenie chemicznych i niechemicznych metod ochrony rolin, wykorzystanie naturalnych antagonistów patogena (biokontrola) oraz rotacjê upraw na danym obszarze. Odpornoci krzy¿owej zapobiega stosowanie MECHANIZMY ODPORNOCI 155 mieszanek lub zamienne stosowanie pestycydów o ró¿nym mechanizmie dzia³ania [12]. Zalecane jest te¿ pozostawianie obszarów, na których nie stosuje siê pestycydu, aby mog³a przetrwaæ czêæ populacji patogena nios¹ca geny wra¿liwoci na dany pestycyd. Zwiêksza to prawdopodobieñstwo krzy¿owania siê homozygotycznych form odpornych z homozygotami wra¿liwymi, co zapobiega dryfowi genetycznemu prowadz¹cemu do wykszta³cenia form homozygotycznych, odpornych na stosowany rodek [4]. Na rycinie 2. przedstawiono schemat zmian w populacji poddanej takiej presji selekcyjnej. Wystêpowanie naturalnych wrogów szkodników upraw mo¿e w du¿ym stopniu wp³ywaæ na powodzenie strategii ochrony rolin. Nawet jedynie czêciowo skuteczna biokontrola w po³¹czeniu z metodami chemicznymi daje korzystny efekt synergistyczny, wp³ywaj¹c znacz¹co na obni¿enie liczebnoci szkodników [39]. Wydaje siê, ¿e w przysz³oci najbardziej efektywne i najszerzej stosowane bêd¹ tzw. zintegrowane techniki ochrony rolin, ³¹cz¹ce technologie biokontroli ze stosowaniem biopestycydów, pestycydów chemicznych i odmian rolin uprawnych odpornych na pestycydy. Jest to podejcie ekologiczne, uwzglêdniaj¹ce liczne interakcje zachodz¹ce miêdzy organizmami, wp³yw elementów rodowiska oraz mechanizmy adaptacyjne i ewolucyjne w populacjach szkodników. Poza znacznym ograniczeniem kosztów ochrony rolin techniki te pozwol¹ ograniczyæ stopieñ dewastacji rodowiska naturalnego [39]. LITERATURA [1] ALFONSO M, PUEYO JJ, GADDOUR K, ETIENNE A-L, KIRILOVSKY D, PICOREI R. lnduced new mutation of D1 Serine-268 in soybean photosynthetic cell cultures produced atrazine resistance, increased stability of S2QB-, and S3QB- states and increased sensitivity to light stress. Plant Physiol 1996; 112: 14991508. [2] BORECKI Z. Nauka o chorobach rolin. Pañstwowe Wyd. Rolnicze i Lene, Warszawa 2001. [3] BROGDON WG, McALLISTER JC. Insecticide resistance and vector control. Emerg Infect Dis 1998; 4: 605613. [4] CARRIERE Y, TABASHNIK BE. Reversing insect adaptation to transgenic insecticidal plants. Proc R Soc Lond B 2001; 268: 14751480. [5] CHIN HG, KIM GD, MARIN I, MERSHA F, EVANS TC Jr., CHEN L, XU MQ, SRIHARSA P. Protein transsplicing in transgenic plant chloroplast: Reconstruction of herbicide resistance from split genes. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 45104515. [6] DEL CASTILLO FJ, DEL CASTILLO I, MORENO F. Construction and Characterization of Mutations at Codon 751 of the Escherichia coli gyrB Gene That Confer Resistance to the Antimicrobial Peptide Microcin B17 and Alter the Activity of DNA Gyrase. J Bacter 2001; 183: 21372140. [7] DEGUCHI T, YASUDA M, NAKANO M, KANEMATSU E, OZEKI S, NISHINO Y, EZAKI T, MAEDA SI, SAITO I, KAWADA Y. Rapid screening of point mutations of the Neisseria gonorrhoeae parC gene associated with resistance to quinolones. J Clin Microb 1997; 35: 948950. [8] DYER PS, HANSEN J, DELANEY A, LUCAS JA. Genetic control of resistance to the sterol 14αdemethylase inhibitor fungicide prochloraz in the cereal eyespot pathogen Tapesia yallundae. Appl Envir Microb 2000; 66: 45994604. [9] FALKINER FR. The consequences of antibiotic use in horticulture. J Antimicr Chemoth 1998; 41: 429431. [10] FOURNIER D, BRIDE JM, HOFFMANN F, KARCH F. Acetylcholinesterase. Two types of modifications confer resistance to insecticide. J Biol Chem 1992; 267: 1427014274. [11] FOURNIER D, BRIDE JM, POIRIE M, BERGE JB, PLAPP FW Jr. Insect glutathione S-transferases. Biochemical characteristics of the major forms from houseflies susceptible and resistant to insecticides. J Biol Chem 1992; 3: 18401845. 156 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA RYCINA 2. Presja selekcyjna wywierana na populacjê przez zastosowanie pestycydu i mo¿liwoæ wp³ywania na rozwój odpornoci (wg [18], zmieniono): 1. Populacja w warunkach braku kontaktu z pestycydem; w populacji pierwotnej wiêkszoæ osobników jest wra¿liwa. 2. Zastosowanie pestycydu prze¿ywaj¹ i rozmna¿aj¹ siê tylko osobniki odporne. 3. Zaprzestanie stosowania rodka mo¿liwe s¹ min. 2 drogi rozwoju populacji. 4a. D³u¿szy czas bez kontaktu z pestycydem pojawiaj¹ siê spontaniczne mutanty wra¿liwe, w populacji obecnych jest du¿o homozygot odpornych. Nast¹pi³a zmiana pierwotnej struktury populacji w kierunku fenotypu odpornoci. 4b. Rozwój sytuacji przy pozostawieniu obszarów, na których nie stosowano pestycydu mo¿liwe jest krzy¿owanie siê homozygot odpornych z wra¿liwymi homozygotami z terenów, na których nie stosowano rodków ochrony rolin. Powstaje struktura populacji sprzyjaj¹ca odrodzeniu siê fenotypu wra¿liwoci MECHANIZMY ODPORNOCI 157 [12] GAWROÑSKI SW. Chwasty odporne: mechanizm odpornoci, rozprzestrzenianie i zapobieganie wyst¹pieniu. XLV Sesja Naukowa IOR 2005. [13] GIRVAN MS, BULLIMORE J, BALL AS, PRETTY JN, OSBORN MA. Responses of active bacterial and fungal communities in soil under winter wheat to different fertilizer and pesticide regimens. Appl Envir Microb 2004; 70: 26922701. [14] GULLNER G, KÖMIVES T, RENNENBERG H. Enhanced tolerance of transgenic poplar plants overexpressing γ-glutamylcysteine synthetase towards chloracetanilide herbicides. J Exp Bot 2001; 52: 971979. [15] HARBORNE JB. Ekologia biochemiczna. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 1997. [16] HU M, NANADI S, DAVIES C, NICHOLAS RA. High level chromosomally mediated tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeae results from a point mutation in the rps-J gene encoding ribosomal protein S10 in combination with the mtrR and penB resistance determinants. Antimicrob Agents Ch 2005; 49: 43274334. [17] KANG TJ, SEO JE, LOC NH, YANG MS. Herbicide resistance of tobacco chloroplasts expressing the bar gene. Molec Cells 2003; 16: 6066. [18] KHACHATOURIANS GG. Agricultural use of antibiotics and the evolution and transfer of antibioticresistant bacteria. Canad Med Assoc J 1998; 159: 11291136. [19] LERMONTOVA I, GRIMM B. Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen. Plant Physiol 2000; 122: 7583. [20] LEVIN BR, PERROT V, WALKER N. Compensatory mutations and the population genetics of adaptive evolution in bacteria. Genetics 2000; 154: 985997. [21] LUTZ KA, KNAPP JE, MALIGA P. Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance. Plant Physiol 2001; 125: 15851590. [22] LYR H, LAUSSMANN B, CASPERSON G. Mechanism of action of terrazol. Z Allg Mikrobiol 1975; 15: 345355 [23] MIYO T, OGUMA Y, CHARLESWORTH B. The comparison of intrinsic rates of increase among chromosome-substituted lines resistant and susceptible to organophosphate insecticides in Drosophila melanogaster. Genes Genet Syst 2000; 78: 373382. [24] MOUCHES C, PASTEUR N, BERGE JB, HYRIEN O, RAYMOND M, de SAINT VINCENT BR, de SILVESTRI M, GEORGHIOU GP. Amplification of an esterase gene is responsible for insecticide resistance in a California Culex mosquito. Science 1996; 233: 778780. [25] NAKANO M, DEGUCHI T, KAWAMURA T, YASUDA M, KIMURA M, OKANO Y, KAWADA Y. Mutations in the gyrA and parC genes in fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicr Agents Ch 1997; 41: 22892291. [26] NEWCOMB RD, CAMPBELL PM, OLLIS DL, CHEAH E, RUSSELL RJ, OAKESHOTT JG. A single amino acid substitution converts a carboxylesterase to an organophosphorus hydrolase and confers insecticide resistance on a blowfly. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 74647468. [27] PEREWOSKA I, ETIENNE A-L, MIRANDA T, KIRILOVSKY D. S1 destabilization and higher sensitivity to light in metribuzin-resistant mutants. Plant Physiol 1994; 104: 235245. [28] PULLIN AS. Biologiczne podstawy ochrony przyrody. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2004. [29] QUINLIVAN EP, McPARTLIN J, WEIR DG, SCOTT J. Mechanism of the antimicrobial drug trimethoprim revisited. FASEB J 2000; 14: 25192524. [30] RUPIÑSKI S. Substancje z licencj¹ na zabijanie. Chem Rev 2004; 4: 2532. [31] SAJJAPHAN K, SHAPIR N, JUDD AK, WACKETT LP, SADOWSKY MJ. Novel psbA1 gene from a naturally occurring atrazine-resistant cyanobacterial isolate. Appl Environ Microb 2002; 68: 1358 1366. [32] SCHEIBLE WR, ESHED R, RICHMOND T, DELMER D, SOMERVILLE C. Modifications of cellulose synthase confer resistance to isoxaben and thiazolidinone herbicides in Arabidopsis Ixr1 mutants. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 1007910084. [33] SCHNEPF E, CRICKMORE N, van RIE J, LERECLUS D, BAUM J, FEITELSON J, ZEIGLER DR, DEAN DH. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microb Mol Biol Rev 1998; 62: 775806. [34] SHAFER TJ, MEYER DA, CROFTON KM. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides: critical review and future research needs. Environ Health Perspect 2005; 113: 123136. [35] SHI MA, LOUGARRE A, ALIES C, FRÉMAUX I, TANG ZH, STOJAN J, FOURNIER D. Acetylcholinesterase alterations reveal the fitness cost of mutations conferring insecticide resistance. BMC Evol Biol 2004; 4: 5. 158 K. NOWACZYK, A. OBRÊPALSKA-STÊPLOWSKA [36] SIMINSZKY B, CORBIN FT, WARD ER, FLEISCHMANN TJ, DEWEY RE. Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 17501755. [37] SMEDA RJ, HASEGAWA PM, GOLDSBROUGH PB, SINGH NK, WELLER SC. A serine-to-threonine substitution in the triazine herbicide-binding protein in potato cells results in atrazine resistance without impairing productivity. Plant Physiol 1993; 103: 911917. [38] SUN L, GHOSH I, PAULUS H, XU MING-QUN. Protein trans-splicing to produce herbicide-resistant acetolactate synthase. Appl Envir Microb 2001; 67: 10251029. [39] THOMAS MB. Ecological approaches and the development of truly integrated pest management. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 59445951. [40] TO MS, FAVRIN S, ROMANOVA N, GRIFFITHS MW. Postadaptional resistance to benzalkonium chloride and subsequent physicochemical modifications of Listeria monocytogenes. Appl Envir Microb 2002; 68: 52585264. [41] TOKARSKA-RODAK M, TO-LUTY S, HARATYM-MAJ AN. Selected parameters of immunological response in hop growers during the period of intensive application of pesticides. Ann Agric Environ Med 2004; 11: 227231. [42] WANG XIU-HONG, SMITH ROSS, FLETCHER JAMIE I, WILSON HARRY, WOOD CHRIS J, HOWDEN MERLIN E H, KING GLENN F. Structure-function studies of ω-atracotoxin, a potent antagonist of insect voltage-gated calcium channels. Eur J Biochem 1999; 264: 488494. [43] www.bayercs.pl [44] ZAGNITKO O, JELENSKA J, TEVZADZE G, HASELKORN R, GORNOCKI P. An isoleucine/leucine residue in the carboxyltransferase domain of acetyl-CoA carboxylase is critical for interaction with aryloxyphenoxypropionate and cyclohexanedione inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 6617 6622. [45] ZHANG Y, LAMM R, PILLONEL C, LAM S, XU JIN-RONG. Osmoregulation and fungicide resistance: the Neurospora crassa os-2 gene encodes a HOG1 mitogen-activated protein kinase homologue. Appl Envir Microb 2002; 68: 532538. [46] ZHU YC, SNODGRASS GL. Cytochrome P450 CYP6X1 cDNAs and mRNA expression levels in three strains of the tarnished plant bug Lygus lineolaris (Heteroptera: Miridae) having different susceptibilities to pyrethroid insecticide. Insect Mol Biol 2003; 12: 3949. Redaktor prowadz¹cy Maria Olszewska Otrzymano:15.09.2005 r. Przyjêto:25.01.2006 r. ul. Miczurina 20 60-318 Poznañ e-mail: [email protected]
