ćwiczenie 2 - Pomysl.com

Temat 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja
Literatura:
Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN
1984, Rozdział 5: „Sterylizacja (wyjaławianie) i jej metody” (str. 59 – 77)
Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:
rozumieć różnicę między sterylizacją a dezynfekcją; znać podstawowe metody wyjaławiania
oraz ich wady i zalety, ze szczególnym uwzględnieniem sterylizacji parą wodną pod ciśnieniem
(autoklaw); znać podstawowe grupy chemicznych środków dezynfekcyjnych z podaniem ich
krótkiej charakterystyki; wiedzieć, od jakich czynników i jak zależy działanie środków
dezynfekcyjnych; wiedzieć, co to jest współczynnik fenolowy, jak się go określa i od czego
zależy jego wartość; znać czynniki wpływające na działanie promieniowania UV; wiedzieć, jak
można sprawdzić skuteczność sterylizacji; znać pojęcia: środek bakteriobójczy, środek
bakteriostatyczny, współczynnik temperatury, forma wegetatywna, formy przetrwalne
drobnoustrojów; umieć określić współczynnik fenolowy danego związku (substancji).
1. Sterylizacja
Sterylizacja, czyli wyjaławianie, jest to niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów,
zarówno ich form wegetatywnych (wykazujących aktywność życiową: odżywiających się,
oddychających, rozmnażających się itp.) jak i przetrwalnych (endospory laseczek, zarodniki
grzybów). Efekt taki można uzyskać poprzez zastosowanie czynników fizycznych, takich jak
temperatura i promieniowanie oraz przez filtrację.
Sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem
Metodą tą uzyskuje się najlepsze efekty jałowienia. Prowadzi ona do usunięcia form
wegetatywnych i przetrwalnych wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w
sterylizowanych materiałach. Proces ten można przeprowadzać w szybkowarach i autoklawach.
Najszersze zastosowanie ma autoklaw. Para wodna zasilająca to urządzenie może przechodzić z
zewnętrznego źródła i wówczas przed wprowadzeniem do autoklawu wmontowany jest
reduktor ciśnienia. Większość autoklawów posiada własne wytwornice pary wmontowane do
aparatu. Autoklaw jest to dwuścienny kocioł z grubej blachy, zamykany szczelnie ciężką
pokrywą. Zaopatrzony jest w manometr, termometr i zawór bezpieczeństwa. Zwykle wodę
podgrzewa się za pomocą grzejnika elektrycznego. Wytworzona para wodna wypycha
powietrze przez otwarty wypust. Następnie urządzenie zamyka się i para wytwarza w kotle
ciśnienie wyższe od atmosferycznego. Dzięki temu podnosi się temperatura. Zwiększenie
ciśnienia o 0,5 atmosfery powoduje ogrzanie pary wodnej do 111,70 C, a zwiększenie o 1
atmosferę do 121,60 C. W takich warunkach giną nawet formy przetrwalne drobnoustrojów.
Najczęściej do sterylizacji podłoży bakteriologicznych stosuje się temperaturę 1210 C przez 20
minut. Nie jest to pełny cykl pracy urządzenia, bo należy także doliczyć czas usuwania
powietrza, wprowadzania pary oraz czas schładzania, co razem zajmuje około 100 minut.
Materiały, do których para wodna ma utrudniony dostęp wymagają zwiększenia ciśnienia pary
wodnej lub wydłużenia czasu efektywnej pracy autoklawu.
Dekoktacja
Jest to wyjaławianie w gorącej parze bieżącej o temp. 1000 C. Proces ten prowadzi się w
aparacie Kocha. Urządzenie to ma budowę kotła z pokrywą. Wyposażone jest w grzałkę do
podgrzewania wody wypełniającej dno kotła. Nad wodą znajduje się metalowa siatka, na której
ustawia się przedmioty i podłoża przeznaczone do jałowienia. Następnie kocioł nakrywa się.
Para wydzielająca się podczas podgrzewania wody usuwa powietrze z kotła i przy ciśnieniu
równym atmosferycznemu, przepływa przez aparat. Dekoktację prowadzi się przez 20 – 30
minut. W takich warunkach nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów i wirusy
zapalenia wątroby typu B. Metoda ta służy do wyjaławiania pożywek i przedmiotów
termowrażliwych.
Tyndalizacja
Zabieg ten polega na trzykrotnym ogrzaniu materiałów w bieżącej parze wodnej przez 30
minut w odstępach 24 – godzinnych. W takich warunkach przy pierwszym ogrzaniu giną
jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. W okresach 24 – godzinnych pomiędzy
poszczególnymi ogrzewaniami, próby inkubuje się w termostacie w temp. pokojowej. Kiełkują
wówczas formy przetrwane drobnoustrojów. Powstałe z nich formy wegetatywne ulegają
zniszczeniu w czasie następnego ogrzania. Dla pewności, że wszystkie przetrwalniki miały
szansę wykiełkowania, po następnej 24 godzinnej przerwie przeprowadza się trzecie ogrzanie
próby.
Pasteryzacja
Proces ten pozwala na częściowe wyjałowienie materiału i polega na jednorazowym
podgrzaniu płynu do temp. 620 C przez 30 min. W warunkach przemysłowych stosuje się
temp. wyższe (70 – 900 C), krótszy czas pasteryzacji (sekundy) oraz szybkie schładzanie, w
celu maksymalnego ograniczenia rozpadu składników odżywczych (witamin) zawartych w
wyjaławianych produktach oraz uniknięcia zmian smaku i zapachu. Pasteryzuje się m.in.
mleko, soki owocowe i warzywne, moszcz winny i piwo. Zabieg ten niszczy większość bakterii
i innych drobnoustrojów (pierwotniaki, grzyby, glony, wirusy). Natomiast nie giną formy
przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów oraz wirusy zapalenia wątroby typu B. Tych ostatnich
nie usuwa także gotowanie.
Gorące powietrze
Metoda ta służy do sterylizacji przedmiotów opornych na działanie wysokiej temperatury.
Wyjaławianie przeprowadza się w zakresie temperatur od 140-1800 C. Służą do tego celu
urządzenia zwane sterylizatorami lub suszarkami. Przedmioty poddawane sterylizacji muszą
być opakowane w celu ich ochrony przed wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym po
zakończeniu sterylizacji. W praktyce najczęściej używa się do tego celu papieru lub
specjalnych metalowych tubusów. Czas pracy suszarki zależy od zastosowanej temperatury,
stopnia wypełnienia suszarki, czasu jej nagrzewania i oziębiania. W sterylizatorach
wyposażonych w wentylatory przeciętny czas ekspozycji wsadu w temp. 1600 C wynosi 60
minut, a czas cyklu pracy ok. 150 minut, natomiast w temp 1800 C czas ekspozycji wynosi 30
min. W sterylizatorach starego typu, tzw. suszarkach, nie mających wymuszonego obiegu
powietrza, czas sterylizacji jest dłuższy. W 1600 C czas ekspozycji wsadu wynosi 100 – 120
min. a pełny cykl pracy aparatu trwa kilka godzin.
Wyjaławianie przez spalanie i opalanie.
Spalanie służy do niszczenia materiałów i przedmiotów zakażonych drobnoustrojami
chorobotwórczymi. Spala się np. plastikowe płytki Petriego z hodowlą zakaźnych
mikroorganizmów zwłoki zwierząt doświadczalnych. Opalanie nad płomieniem palnika stosuje
się jako jałowienie drobnych przedmiotów nie ulegających spaleniu, takich jak ezy, druciki
platynowe, igły preparacyjne, łopatki, skalpele. Ponadto opala się zawsze brzegi kolb i
probówek, w celu zabezpieczenia hodowli przed zakażeniem z zewnątrz.
Sterylizacja za pomocą radiacji
Do wyjaławiania stosuje się dwa typy promieniowania jonizującego: beta i gamma.
Promieniowanie gamma charakteryzuje się dużą przenikliwością, natomiast promieniowanie
beta jest promieniowaniem elektronowym o dużej energii. Skuteczna dawka promieniowania
gamma waha się w zakresie 0,1 –1 megarada. Przy stosowaniu tego typu wyjaławiania należy
zwrócić uwagę na właściwy dobór dawki. Zbyt mała dawka może spowodować, że wśród
komórek bakterii, które przeżyły wyjaławianie, pojawią się mutanty o zmienionych
właściwościach biologicznych. Niektóre z tych cech mogą okazać się niebezpieczne np.
podwyższenie zjadliwości (zdolności wywoływania choroby). Praktycznie stosowana dawka
sterylizująca jest duża i wynosi 2,5 – 3,0 megaradów. Należy także zwrócić uwagę na fakt, że
promieniowanie jonizujące może powodować zmiany struktury związków chemicznych lub ich
rozpad, co wiąże się ze zmianą cech chemicznych oraz odmiennym oddziaływaniem na
drobnoustroje. Ponadto w wyniku napromieniowania związków organicznych powstają często
nadtlenki, związki o podwójnych wiązaniach i wolne rodniki. Prowadzić to może do powstania
produktów wykazujących działanie mutagenne i rakotwórcze.
Wyjaławianie przez filtrację
Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze. Działa on na
zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra musi być mniejsza od średnicy komórek
oraz form przetrwalnych. Dodatkowo, część mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły
adsorpcyjne na powierzchni filtra. Wyjaławianie tego typu stosowane jest do płynów, których
składniki charakteryzują się dużą wrażliwością na działanie czynników fizycznych. Metoda ta
pozwala na usunięcie nie tylko żywych komórek, form przetrwalnych, ale także komórek
martwych oraz ich części.
Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej, spiekanego szkła
oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory, aby filtrację można było przeprowadzić
z wykorzystaniem siły ciężkości. Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub
podciśnienia. Uzyskuje się je za pomocą pompy próżniowej.
Filtr z ziemi okrzemkowej
Znane są m. in. filtry Berkefelda. Zwykle są to świece otrzymane poprzez spiekanie w
temp. 2000o C ziemi okrzemkowej. Charakteryzują się one dużą sprawnością działania.
Skutecznie usuwają z filtrowanych roztworów formy wegetatywne i przetrwalne, jednakże nie
zatrzymują wirusów. Wadą tych urządzeń jest też zbyt duża kruchość, wypłukiwanie ich
cząstek do filtratu. Ponadto, część sączonego płynu pochłaniana jest przez filtr.
W mikrobiologii stosowane są filtry o najdrobniejszych porach, o symbolu W. Świece
sterylizuje się w autoklawie. Podczas filtracji sączony płyn nalewa się tak, aby świeca była w
nim całkowicie zanurzona.
Filtry ze szkła spiekanego
Najpopularniejsze w tej grupie są filtry Schotta. Powstają one poprzez stopienie w
odpowiedniej temperaturze sproszkowanego szkła. Są to lejki z warstwą filtracyjną na dnie. Do
wyjaławiania roztworów stosowane są tylko filtry nr 5, o najmniejszej średnicy porów. Filtry ze
szkła spiekanego charakteryzują się dużą sprawnością działania oraz brakiem efektów
ubocznych w postaci adsorpcji sączonych płynów, wymywania składników filtrów oraz zmiany
pH przesączu. Ponadto mogą być one jałowione termicznie. Filtry tego typu zatrzymują
wszystkie formy drobnoustrojów oprócz wirusów.
Filtry membranowe
Filtry (sączki) membranowe zbudowane są z pochodnych celulozy (np. z nitrocelulozy). Są
to cienkie błony o grubości 80- 150 μm. Wielkość porów w filtrach jest zróżnicowana.
Odpowiedni dobór sączka pozwala na całkowite usunięcie z roztworów drobnoustrojów. Filtry
produkowane są w postaci krążków o różnych średnicach. Jałowi się je przez gotowanie w
wodzie destylowanej. Następnie umieszcza w odpowiednich jałowych aparatach filtracyjnych.
Sączenie odbywa się w podciśnieniu lub nadciśnieniu w zależności od konstrukcji aparatu.
Sączony płyn nie ulega żadnym zmianom odczynu, nie jest adsorbowany przez filtr oraz do
przesączu nie są uwalniane składniki filtra.
Filtry membranowe są stosowane nie tylko do sterylizacji płynów, ale także w badaniu stanu
sanitarnego wody, gdzie celem nie jest oczyszczenie z mikroorganizmów, lecz wydzielenie ich
z wody i dalsza hodowla na specjalnych pożywkach.
2. Dezynfekcja
Dezynfekcją nazywamy proces niszczenia wegetatywnych form drobnoustrojów za pomocą
czynników chemicznych i fizycznych. Dezynfekcja nie niszczy wszystkich form przetrwanych.
Celem dezynfekcji jest możliwie szybkie zabicie drobnoustrojów, ale głównym jej zadaniem
jest wyeliminowanie mikroorganizmów chorobotwórczych z powierzchni sprzętów, podłóg,
naczyń, pojemników z płynami, z części ciała ludzkiego (ręce, pole operacyjne), z ciała
zwierząt.. A zatem dotyczy ona tych obiektów, które należy odkazić, nie mogąc poddać ich
sterylizacji. Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych jest tak różny jak różna jest
budowa chemiczna dezynfektantów.
Środki dezynfekcyjne powodują bardzo istotne, nieodwracalne zmiany zarówno struktury
jak i metabolizmu komórki bakteryjnej. Zmiany te mogą mieć charakter okresowego
hamowania rozwoju drobnoustrojów, bądź ich całkowitego wyeliminowania. W związku z tym,
środki dezynfekcyjne można podzielić na dwie grupy:
a) środki bakteriostatyczne – mające właściwości hamowania rozmnażania bakterii (po ich
usunięciu bakterie jednak ponownie zaczynają się rozmnażać);
b) środki bakteriobójcze, posiadające właściwości zabijania bakterii, a więc ich działanie
jest nieodwracalne.
Działanie dezynfektantów zależy od wielu czynników, do których należą :
a) stężenie środka dezynfekcyjnego,
b) czas działania,
c) temperatura,
d) obecność substancji organicznych w środowisku,
e) wilgotność środowiska,
f) odczyn środowiska,
Ad a) Na szybkość procesu dezynfekcji ma wpływ stężenie środka dezynfekcyjnego. Im
stężenie jest wyższe, tym proces przebiega szybciej. Nie jest to jednak zależność
proporcjonalna, np. podwojenie stężenia fenolu skraca czas wymagany do zabicia wszystkich
osobników w hodowli Salmonella paratyphi w przybliżeniu siedmiokrotnie.
Ad b) W celu wyznaczenia zakresu działania środka dezynfekcyjnego oznacza się
przeżywalność drobnoustrojów jako funkcję czasu działania badanego dezynfektanta w
określonym stężeniu i przy określonej gęstości badanej hodowli.
Ad c) Wpływ temperatury na skuteczność procesu dezynfekcji wyraża się za pomocą tzw.
współczynnika temperatury, według wzoru:
Czas wymierania w temp. x
Wsp. temp = ------------------------------------Czas wymierania w temp. x + 10
Wartości współczynnika są tym wyższe im wyższa jest temperatura, w której przebiega proces.
Ad. d ) Charakter wpływu obecności związków organicznych może być chemiczny bądź
fizyczny, przy czym mogą zachodzić różnego rodzaju reakcje:
1. Środek dezynfekcyjny reaguje ze związkami organicznymi, co powoduje jego
unieczynnienie. W sytuacji, gdy związki organiczne są konkurencyjne w stosunku do
drobnoustrojów, w reakcjach może dojść do całkowitego związania dezynfektanta i
pozbawienia go skuteczności np. chlor stosowany do dezynfekcji wody jest wiązany przez
zanieczyszczające ją związki organiczne tak, że efektywne stężenie dezynfektanta jest znacznie
niższe od zastosowanego.
2. Środek dezynfekcyjny może dawać, w wyniku reakcji ze związkami organicznymi związek
nierozpuszczalny, czego skutkiem jest jego wypadanie z roztworu i wyeliminowanie ze
środowiska.
3. Eliminacja środka dezynfekcyjnego ze środowiska może być wynikiem jego adsorpcji przez
mające postać zawiesiny lub koloidu substancje organiczne.
4. Tłuszcze, fosfolipidy, niektóre kationy i aniony mogą unieczynniać środek dezynfekcyjny
poprzez jego eliminację ze środowiska
5. Związki organiczne mogą tworzyć wokół komórki bakteryjnej warstwę o mniejszej
zawartości wody utrudniając dostęp środowiska dezynfekcyjnego do komórki.
Ad e) Duże znaczenie dla skuteczności dezynfekcji ma wilgotność środowiska, gdyż większość
środków dezynfekcyjnych nie działa w środowisku suchym. Odpowiednia wilgotność
umożliwia prawidłową kondensację czynnika dezynfekcyjnego na powierzchni komórek i
wnikanie w głąb.
Ad f) Stężenie jonów wodorowych wpływa nie tylko bezpośrednio na organizm bakteryjny,
lecz również na same środki odkażające, bowiem dla wielu substancji dezynfekcyjnych
charakterystyczna jest mniejsza aktywność form zjonizowanych niż niezdysocjowanych, np.
fenol w środowisku alkalicznym jest zdysocjowany, co poważnie obniża jego właściwości
bakteriobójcze.
Istotnym problemem jest powstawanie drobnoustrojów opornych na środki dezynfekcyjne.
Główną tego przyczyną jest stosowanie środków w stężeniach subtelnych. Przyczyną oporności
może być adaptacja enzymatyczna. Enzymy indukcyjne biorące udział w rozkładzie środka
dezynfekcyjnego powstają w komórce dopiero po zetknięciu się z odpowiednim związkiem lub
jego analogiem. W okresie adaptacji wzrost bakterii ustaje, część bakterii zamiera, natomiast te,
które przeżyły mają zdolność do enzymatycznego rozkładu (biodegradacji) dezynfektanta.
Poddając dostatecznie dużą populację bakterii działaniu czynnika szkodliwego, jakim są środki
dezynfekcyjne, wśród przeżywających komórek znajdujemy mutanty charakteryzujące się
zwiększoną opornością na stosowany czynnik, w stosunku do komórki macierzystej.
Do najczęściej stosowanych chemicznych środków dezynfekcyjnych zaliczamy:
1) Kwasy i zasady – silne środki dezynfekcyjne – zabijają formy wegetatywne oraz formy
przetrwalne. Stosowanie ich jest jednak ograniczone ze względu na niszczące działanie na
przedmioty i materiały.
Zastosowanie znalazły :
a) mleko wapienne w postaci 20% zawiesiny wodorotlenku wapnia,
b) 10% roztwory zasad do dezynfekcji powierzchniowej,
c) 1-10% gorące roztwory węglanu sodu do dezynfekcji szkła laboratoryjnego,
d) mydła, zwłaszcza bardziej alkaliczne mydło szare, których skuteczność zwiększają
nienasycone kwasy tłuszczowe,
2) Środki utleniające
Do grupy tej należą chlorowce i ich pochodne. Mechanizm ich działania polega na
wydzielaniu zjonizowanego chlorowca lub tlenu po zetknięciu się z komórką.
Są to:
a) podchloryny zawierające około 20% czynnego chloru,
b) chloraminy nieorganiczne oraz organiczne jak np. chloramina T zawierająca 12, 5%
czynnego chloru, chloramina T zawierająca 29,5% czynnego chloru. Są to związki
dobrze rozpuszczalne w wodzie , mało wrażliwe na światło, trwałe w temp. pokojowej,
których działanie bakteriobójcze jest najsilniejsze przy pH 6- 6,2. Do dezynfekcji
rąk np. stosuje się 0,6 – 1% roztwory chloramin. Do odkażania powierzchni podłóg i
stołów 5% roztwór. Do odkażania wody wystarczy 1mg/ dm3.
c) odpowiednie roztwory nadmanganianu potasu,
d) 3% woda utleniona,
e) 10% roztwór jodu (jodyna) lub połączenia organiczne jodu. Związki tego typu niszczą
wirusy, bakterie i pierwotniaki,
f) ozon działający bakterio- i wirusobójczo, stosowany do dezynfekcji wody.
3) Sole metali ciężkich
Działają one zabójczo na drobnoustroje, zwłaszcza przy dłuższym czasie działania i przy
zastosowaniu wyższych stężeń. W niższych stężeniach działanie niektórych metali ma
charakter bakteriostatyczny. Ponieważ metale ciężkie są toksyczne dla organizmów wyższych,
ich stosowanie jako dezynfektantów jest ograniczone. Pewne zastosowania znajdują związki
organiczne rtęci jak merkurochrom, a także sole srebra.
4) Alkohole
Mechanizm ich działania polega na denaturacji białek komórkowych, przy czym wpływ ma
tu obecność wody, dlatego lepiej działają 60- 70 % roztwory alkoholu niż 90%. Jako środek
dezynfekcyjny używany jest:
a) alkohol etylowy w stęż. 70% do odkażania skóry i w mieszaninie z innymi związkami
do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych,
b) 70% mieszanina złożona w 50 % z etanolu i 20% propanolu,
c) alkohol izopropylowy, benzylowy oraz glikol stosowane do dezynfekcji powietrza.
5) Związki fenolowe i pochodne fenolu
Fenole i ich pochodne mają działanie bakteriobójcze. Fenole niszczą bakterie, ale i grzyby.
Największą aktywność dezynfekcyjną mają w środowisku kwaśnym. Fenol jest związkiem
toksycznym i drażniącym, z tego względu nie jest obecnie stosowany do dezynfekcji. Zastosowanie
znajduje natomiast szereg związków fenolu.
a)
b)
c)
d)
mieszanina związków fenolowych i szarego mydła zwana lizolem stosowana w 3-10%
roztworze
alkilowe pochodne fenoli o działaniu dezynfekcyjnym, tym silniejszym im dłuższy jest
łańcuch alkilowy
izomery drugo- i trzeciorzędowe, chlorofenole oraz arylofenole
cały szereg preparatów handlowych zawierających chloroheksydyny. Chloroheksydyna
działa na bakterie gramdodatnie i gramujemne, drożdżaki i wirusy.
6) Czwartorzędowe związki amoniowe
Są to związki działające na wirusy, bakterie, drożdże i grzyby. Związki te charakteryzują
się wysoką aktywnością powierzchniową. W wodzie ulegają dysocjacji na kompleksowe kationy i
ujemnie naładowany jon chlorowca, który wzmaga aktywność bakteriobójcza. W użyciu znajduje
się cały szereg preparatów zawierających różne stężenia związków amoniowych (np.Sterinol)
7) Aldehydy
W praktyce stosuje się aldehyd glutarowy i formaldehyd. Formaldehyd stosowany jest w 5%
roztworze. Ma silne działanie bakteriobójcze pod warunkiem, że temperatura środowiska będzie
niższa niż 400 C. Roztworem 40 % posługują się laboratoria i prosektoria. Materiały biologiczne
utrwala się roztworem formaldehydu. Ponadto może on służyć do gazowej dezynfekcji
pomieszczeń w stężeniu 1-2 mg/ dm3 powietrza. Dla skuteczności dezynfekcji powietrza
formaldehydem konieczna jest duża wilgotność sięgająca 80%
Do fizycznych czynników dezynfekcji należy promieniowanie UV, które stosuje się głównie do
dezynfekcji powietrza i dostępnych powierzchni. Silne działanie przeciwbakteryjne wykazuje
promieniowanie o długości fali 240 - 280 nm (szczególnie 260 – 270 nm). Jednakże poszczególne
gatunki i formy drobnoustrojów wykazują różną wrażliwość na działanie tego promieniowania.
Metoda dezynfekcji powietrza promieniami nadfioletowymi jest skuteczna przy zachowaniu
odpowiednich warunków i zależy od szeregu czynników:
a) stopnia zanieczyszczenia powietrza cząstkami mechanicznymi,
b) objętości napromieniowanego powietrza,
c) intensywności ruchu powietrza,
d) długości fal emitowanych przez promiennik,
e) czasu napromieniowania,
f) bezpośredniego padania promieniowania,
g) wilgotności powietrza,
h) odległości, na jaką działają promienie.
Stosując odpowiednią dawkę promieniowania UV można uzyskać nawet efekt całkowitego
wyjałowienia (sterylizacji).
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Zadanie 1. Badanie skuteczności działania promieniowania ultrafioletowego na drobnoustroje
obecne w powietrzu
Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu przed włączeniem lampy UV:
1. Położyć dwie szalki Petriego z agarem odżywczym i dwie z podłożem Sabourauda w
pobliżu wyłączonej lampy UV i zdjąć wieczka na 10 minut.
2. Po 10 min. nałożyć wieczka i usunąć szalki, a na ich miejsce położyć nowe.
Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu po włączeniu lampy UV:
3. Włączyć lampę UV na przynajmniej 30 minut.
Uwaga: nie przebywać w strefie działania promieni UV !
4. Po 30 minutach wyłączyć lampę i otworzyć szalki Petriego na 10 minut.
5. Po 10 minutach zamknąć szalki.
6. Opisać użyte szalki Petriego odpowiednio: „przed UV” i „po UV” i wszystkie
inkubować w temp. pokojowej przez tydzień.
Po okresie inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na płytkach z agarem odżywczym i
podłożem Sabourauda przed i po działaniu promieniowania UV. Postaraj się odróżnić
kolonie bakteryjne (zwykle wypukłe i kolorowe, lub płaskie i matowe) od grzybowych
(zwykle nitkowate, „watowate”).
Oceń skuteczność działania promieniowania UV i wyjaśnij, od jakich czynników ona
zależy. Które drobnoustroje są bardziej wrażliwe: bakterie czy grzyby ?
Zadanie 2. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji parą wodną w autoklawie.
Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników
określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali A). Zarodniki te zdolne są do
przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną
charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji parą wodną pod zwiększonym
ciśnieniem.
1. Z opakowań wyjąć torebki papierowe z krążkami Sporal A i umieścić w różnych
miejscach komory autoklawu lub wewnątrz sterylizowanych materiałów.
2. Włączyć autoklaw (osoby posiadające uprawnienia do obsługi) i dokonać sterylizacji w
ciągu 20 minut w temperaturze nie mniejszej niż 1210 C.
3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do
probówki z bulionem (użyć sterylnej pęsety).
4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni
5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji w bulionie wystąpi zmętnienie, a na powierzchni
podłoża pojawi się kożuch z komórek bakterii. Jeżeli sterylizacja była skuteczna
bulion pozostanie klarowny.
Zadanie 3. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji w suchym gorącym powietrzu.
Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników
określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali S). Zarodniki te zdolne są do
przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną
charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji w suchym i gorącym powietrzu.
1. Wyjąć z opakowania foliowego torebki papierowe z krążkami sporalu S
2. Sterylizować co najmniej 2 godziny w temp. 160o C
Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do
probówki z bulionem
3. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni
4. W przypadku nieskutecznej sterylizacji, w bulionie wystąpi zmętnienie i pojawi się
kożuch na powierzchni pożywki. Jeżeli sterylizacja była skuteczna, bulion pozostanie
klarowny.
Zadanie 4. Badanie skuteczności działania wybranych środków dezynfekcyjnych
1. Podzielić pisakiem do szkła denko szalki Petriego z agarem odżywczym na 5 sektorów i
opisać je następująco: K, -OH, H2O2, NaCl, M, co oznacza odpowiednio: kontrolę –
palec nie dezynfekowany, dezynfekcję alkoholem, wodą utlenioną, przetarcie
roztworem soli fizjologicznej i mycie mydłem. Na wieczku szalki napisać swoje
inicjały, datę i godzinę.
2. Uchylić wieczko szalki i delikatnie przyłożyć opuszkę jednego z palców do
powierzchni agaru w sektorze kontrolnym K. Szybko zamknąć szalkę.
3. Sterylną pęsetą pobrać sterylną watę, namoczyć ją w alkoholu uważając, aby nie była
zbyt nasiąknięta, a następnie przetrzeć nią opuszkę innego palca.
4. Przetarty palec przyłożyć do sektora –OH jak w pkt. 2. Zużytą watę wyrzucić.
5. W podobny sposób przetrzeć palce: wodą utlenioną i roztworem soli, oraz wykonać
odciski w odpowiednich sektorach (za każdym razem użyć inny palec).
6. Wymyć ręce mydłem i wytrzeć ręcznikiem, a następnie nieużywany dotąd palec
przyłożyć do sektora M.
7. Szalkę inkubować w temp. pokojowej przez tydzień.
Po okresie inkubacji porównać wzrost w poszczególnych sektorach, uwzględniając
liczbę kolonii i ich zróżnicowanie morfologiczne, a nie powierzchnię wzrostu (dlaczego?).
O czym świadczą stwierdzone różnice? Czy mycie mydłem radykalnie usunęło
drobnoustroje z powierzchni palca? Jeśli nie, to jakie znaczenie higieniczne ma mycie rąk ?
Zadanie 5. Oznaczenie współczynnika fenolowego
Współczynnik fenolowy pozwala na określenie siły działania środka dezynfekcyjnego w
porównaniu do bakteriobójczego działania fenolu w tych samych warunkach.
1. Wykonać rozcieńczenia fenolu i rozlać po 5 ml do sterylnych probówek. Równolegle
ustawić taką samą ilość opisanych probówek z podłożem bulionowym.
2. Przygotować rozcieńczenia wybranych środków dezynfekcyjnych i rozlać po 5ml do
sterylnych probówek Równolegle ustawić taką samą ilość opisanych probówek z
podłożem bulionowym
3. W odstępach co 30 sek. zaszczepiać kolejne rozcieńczenia fenolu inoculum (E. coli) o
objętości 0,5 ml i wymieszać na wstrząsarce.
4. Po 15 minutach inkubacji (czas kontaktu ze związkiem) przenosić ezą co 30 sek.
materiał z zaszczepionych rozcieńczeń do probówek z bulionem odżywczym.
5. Postąpić analogicznie jak w pkt. 3 i 4 z wybranymi związkami dezynfekcyjnymi
6. Wszystkie zaszczepione podłoża bulionowe inkubować 48 godzin w 37o C.
7. Wyniki zestawić w tabeli określając wzrost obserwowany jako zmętnienie bulionu
znakiem „+ „ i brak wzrostu znakiem „ – „
8. Wyznaczyć współczynnik fenolowy ( WF )
Największe rozcieńczenie badanego związku zabijające bakterie
WF = -----------------------------------------------------------------------------Największe rozcieńczenie fenolu zabijające bakterie
Zadanie 6. Zapoznanie się z podstawowym sprzętem służącym do sterylizacji
a. autoklaw
b. suszarka