3. Potranksrypcyjne wyciszanie genu

Badanie funkcji genu
Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami
„Przypadkowa” analizy funkcji genu
MUTACJA
FENOTYP
GEN
Strategia „ukierunkowanej” analizy funkcji genu
GEN
1. wprowadzenie
mutacji w genie
2. nadekspresja
genu
3. potranskrypcyjne
wyciszanie genu
(antysensowne
RNA oraz RNAi)
FENOTYP
1. Inaktywacja (mutacja) genu poprzez homologiczną
rekombinację jest podstawą analizy jego funkcji
„Kopia”” genu, który chcemy wyłączyć
czyli odpowiedni fragment DNA
sklonowany w wektorze w E. coli
Przebudowanie
sklonowanego genu
w E. coli – konstrukt
do mutagenezy
przebudowana kopia
genu dostarczona na
wektorze
Mysz- z „knockoutem” genowym ??????
Problemy:
•Diploidalny genom
•Myszy nie da się wyhodować na płytce z selekcją na antybiotyk
•I wiele innych....
1. Infekcja wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia
wirusowego
wektor
2) Mikroiniekcja in vitro
DNA do jednego z
przedjądrzy
zapłodnionej komórki
jajowej przed
pierwszym jej
podziałem
3) Zastosowanie zarodkowych komórek macierzystych ES
(embrionic stem) – totipotencjalnych tzn. takich które nie są przypisane do
żadnego szlaku rozwojowego i mogą dać początek każdemu typowi
zróżnicowanych komórek. Takie komórki poddaje się modyfikacji in vitro (w
kontrolowanych warunkach). Genetycznie zmienione (po homologicznej
rekombinacji in vitro) komórki ES wprowadza się do zarodka myszy
1. Etap: pozyskanie komórek ES i hodowla in vitro
komórki węzła
zarodkowego są
zdolne do
różnicowania się we
wszystkie typy
komórek
2. Etap: przygotowanie konstruktu do mutagenezy w E. coli na bazie „kopii”
docelowego genu sklonowanego w wektorze
Tylko pewien procent wprowadzonych
konstruktów włącza się, w wyniku homologicznej
rekombinacji w komórkach zarodkowych, we
właściwej pozycji genomowej. Dlatego konstrukt
do mutegenezy wyposaża się w dodatkowe
elementy genetyczne
•neo, gen kodujący enzym, który
inaktywuje antybiotyk neomycynę
oraz jego pochodne, np. G418, który
jest toksyczny dla komórek ssaczych;
•tk, gen kodujący kinazę
tymidynową – enzym, który
fosforyluje analogi nukleozydów np.
gancyklowir. Polimeraza DNA może
wbudować taki analog nukleotydu do
nowosyntetyzowanej nici DNA co
prowadzi do zaburzenia procesu
replikacji DNA. Dlatego komórki
zawierające gen tk, giną po
podaniu gancyklowiru (są
wrażliwe na gancyklowir).
3. Etap: wprowadzenie konstruktu do mutagenezy do komórek
zarodkowych hodowanych in vitro i selekcja komórek z insercją konstruktu
w docelowym genie in vitro
selekcja komórek z insercją
konstruktu w docelowym genie
in vitro
4. Etap: iniekcja wyselekcjonowanych in vitro komórek zarodkowych z
nokautem genowym i uzyskanie potomstwa z nokautem genowym we
wszystkich komórkach ciała
Uzyskujemy celowe „uszkodzenie” (knock-out) genu i uzyskanie
tzw. myszy transgenicznych z nokautem genowym, dzięki
któremu możliwe staje się zbadanie funkcji takiego genu
Cre/lox System
Cre rekombinza miejscowo
specyficzna, która działa na
miejsce loxP (34 pz).
Dlaczego wycinanie DNA za pomocą Cre/loxP jest takie
użyteczne w komórkach eukariotycznych?
loxP pochodzi z bakteriofaga P1, a zatem nie występuje np. w
roślinach czy u zwierząt. Dzięki temu sekwencje loxP mogą być
sztucznie wstawiane do zwierząt i roślin w celu precyzyjnego
wycinania określonych sekwencji DNA, bez obawy że przy
okazji wytniemy jakąś istotną część genomu.
Jak za pomocą systemu cre/loxP otrzymać mysz, z
zablokowaną ekspresją określonego genu, w określonej
tkance/narządzie
Mutageneza sterowana oligonukleotydami
umożliwia wprowadzanie precyzyjnych zmian do
sekwencji genu np. pojedynczych nukleotydów
Strategia „ukierunkowanej” analizy funkcji genu
GEN
1. wprowadzenie
mutacji w genie
2. nadekspresja
genu
3. potranskrypcyjne
wyciszanie genu
(antysensowne
RNA oraz RNAi)
FENOTYP
2. Nadekpresja genu - celem jest ustalenie czy znacząco
zwiększona ekspresja badanego genu ma wpływ na fenotyp organizmu np.
myszy transgenicznej.
Transgeniczna mysz do której komórek wprowadza się cDNA
badanego genu sklonowany w wektorze pod kontrolą silnego promotora,
który powoduje ekspresję cDNA np. w określonych tkankach.
3. Potranksrypcyjne wyciszanie genu
•antysensowne RNA (aRNA)
•interferencja RNA (RNAi)
Antysensowne RNA
ss mRNA może tworzyć struktury dsRNA za pomocą drugiej nici
komplementarnej do nici sensownej. Ta druga nić nazywa się antysensownym
RNA - aRNA.
Utworzenie dsRNA może zahamować ekspresję genu
Pomidor Flavr Savr to przykład transgenicznej rośliny z zablokowanym przez
aRNA enzymem poligalakturonazy, która rozkłada pektyny powodując
mięknięcie pomidorów
Interferencja RNA (RNAi)
1990 Napoli i wsp. przeprowadzili doświadczenie którego celem było uzyskanie
odmiany petunii z kwiatami o bardziej intensywnej purpurowej barwie.
W tym celu do komórek roślinnych wprowadzono dodatkowe kopie genu (cDNA)
syntazy chalonowej odpowiedzialne za syntezę fioletowego barwnika kwiatów
W wyniku doświadczenia zamiast ciemniejszych kwiatów uzyskano odmiany pstrokate
lub zupełnie białe.
Wprowadzenie dodatkowego genu nie prowadziło do wydajniejszej syntezy
barwnika, ale spowodowało zahamowanie wytwarzania barwnika kwiatu
Pomiar w komórce roślinnej petunii poziomu mRNA genu, którego dodatkową kopię
dodano wykazał, że jego poziom znacząco spadł, a obserwowane zjawisko miało
tendencję do rozprzestrzeniania się po całym organizmie rośliny.
Zjawisko to nazwano kosupresją (cosuppression), ponieważ zahamowanie
ekspresji dotyczyło zarówno
„normalny” gen kodujący purpurową
barwę, jak również jego
wprowadzonych dodatkowych kopii
W 1998 r. Fire i wsp. scharakteryzowali na poziomie molekularnym
potranskrypcyjny mechanizm regulujący poziom mRNA u C. elegans.
Zjawisko nazwane interferencją RNA (RNA interference – RNAi), polegało
na wyciszaniu ekspresji przez dwuniciowy RNA którego jedna nić była
komplementarna do fragmentu mRNA wyciszanego genu.
Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genu może odbywać się na zasadzie:
a) degradacji mRNA
b) blokowanie translacji mRNA
A) Degradacja mRNA
• w przypadku degradacji mRNA pośrednikami interferencji są małe dwuniciowe
RNA tzw. interferujące RNA (siRNA, z ang. small interfering RNA, długości 2123 pz). Jedna z nici siRNA jest komplementarna do transkryptu wyciszanego
genu
Skąd się biorą w komórce takie cząsteczki RNA?
• Powstają w wyniku trawienie z większych cząsteczek dsRNA, które
może być dla komórki np. sygnałem „nienormalności”, może pojawić się np.
w wyniku infekcji wirusem RNA czy nadmierną ilością kopii genu
•W konsekwencji degradacji mRNA odpowiedni gen jest wyciszany, bo w
komórce nie powstaje białko kodowane przez ten gen
•Mechanizm siRNA powstał najprawdopodobniej jako mechanizm obronny przed
dwuniciowymi wirusami RNA (dsRNA).
Jak to działa?
dsRNA jest dla komórki czymś
niezwykłym i sygnałem
„nienormalności”. W komórkach
występuje rybonukleaza Dicer, który
rozpoznaje dsRNA i tnie go małe
fragmenty 21-23 pz– siRNA.
Następnie powstaje tzw. kompleks
wyciszającego zwany RISC (RNAinduced silencing complex). Kompleks
RISC ulega aktywacji wtedy kiedy
siRNA rozdzieli się na pojedyncze
nici, wiąże się do mRNA za pomocą
antysensownego RNA. W skład
kompleksu RISC wchodzi
rybonukleaza Slicer, która tnie
związane mRNA powodując
wyciszenie ekspresji genu.
•RNAi jest powszechne u Eukariota (oprócz drożdży S.
cerevisiae), występuje u pierwotniaków, jamochłonów, muszki
owocowej, ryb, płazów, grzybów, myszy, człowieka, u różnych
gatunków roślin niższych i wyższych.
•Zjawisko RNAi jest niezwykle specyficzne: dostarczenie do
komórki (cytoplazmy) dwuniciowych cząsteczek RNA
odpowiadających np. eksonom konkretnego genu powinno
wywołać skuteczne obniżenie poziomu mRNA specyficznego
genu (poprzez degradację transkryptu).
Zastosowania
1. Precyzyjne i ukierunkowane blokowanie ekspresji genów
2. Terapia genowa: np. nowotworów – wstrzykiwanie siRNA
komplementarnego do znanych protoonkogenów
Otrzymywanie siRNA do wyciszania genów
1. Iv vivo
W wektorze umieszcza się odpowiednio spreparowane DNA:do nici sensownego
RNA wprowadza się krótkie odcinki antysensowne, które
celowo„zanieczyszczają” sensowną nić RNA. W wyniku ekspresji w komórkach
docelowych nić sensowna i antysensowna będą mogły utworzyć odcinki
dwuniciowego RNA, które po przekształceniu w siRNA spowodują zahamowanie
ekspresji konkretnego genu.
2. Otrzymywania siRNA in vitro
•synteza chemiczna
•transkrypcja n vitro małych RNA
(siRNA)
• transkrypcja in vitro długich RNA,
które będą wprowadzane do komórki
i na które zadziała Dicer
Potranskrypcyjne wyciszanie genu może odbywać się na zasadzie:
a) degradacji mRNA
b) blokowanie translacji mRNA
W przypadku mechanizmu interferencji z translacją mRNA, mediatorami są tzw. mikroRNA (miRNA), kodowane przez genom, jak normalne geny.
Prekursorem są długie cząsteczki miRNA, które powstają poprzez transkrypcję z DNA
komórkowego na RNA przez polimerazę RNA II i tworzą struktury typu szpilki do
włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA.
Następnie wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących
specyficznie translację mRNA.
W odróżnieniu od siRNA, miRNA nie muszą być w 100% identyczne w sekwencji do
docelowego mRNA. miRNA są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów
np. podczas rozwoju
Ocenia się, że miRNA biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów