NGS

NEXt Generation
Sequencing
Paulina Kania
Rafał Klimek
09.06.2015
Plan prezentacji
• Sekwencjonowanie
• Metody
– Sanger
– Illumina
– Ion Torrent
– Porównanie
• Przyszłośd NGS
• Analiza danych z NGS
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie
Po co nam sekwencjonowanie?
• Medycyna
– Terapie genowe
– Choroby dziedziczne
– Szczepionki
• Medycyna sądowa
• Bromatologia
• Znajomośd genomów -> znajomośd gatunków
3,2
3
13
38
20 tys.
Metody sekwencjonowania
Metoda Sangera
•
•
•
•
•
używane od ponad 30 lat
uniwersalne
zautomatyzowane
wysoka jakośd – gold standard
długie sekwencje (>500 pz)
Metoda Sangera
Metoda
Sangera
Metoda Sangera
• Wymaga oczyszczonej, jednorodnej matrycy
• Jeżeli produkt PCR zawiera kilka różnych
sekwencji trzeba go klonowad w plazmidzie i
sekwencjonowad wiele klonów
• ograniczona wydajnośd
• Pracochłonna i kosztowna
• Założona w 1998 roku
• 1800+ pracowników
• Siedziba w San Diego
• Projektuje oraz produkuje
urządzenia analityczne
dla genomiki
• Producent również reagentów
oraz mikromacierzy
https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
Ilumina
Przygotowanie biblioteki:
Ilumina
Amplifikacja klasterów:
Ilumina
Sekwencjonowanie:
Ilumina
Sekwencjonowanie:
Ilumina
Odczyt sygnałów:
Ilumina
Analiza danych:
Ilumina
Ograniczenia:
• Punkty sygnałów mogą się nakładad
• Mała wielkośd readów (100 – 2000 bp, zależne
od modelu)
Ion Torrent
https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
Ion Torrent
Ion Torrent
Ion Torrent
Ion Torrent
Ograniczenia:
• Sekwencje powtarzające się (np. GGGGGGGG)
• Mała wielkośd readów (400 bp)
Wydajnośd platform
Koszty dla poszczególnych platform
Przyszłośd NGS
Nanopory
MinION
PromethION
Nanopory
Analiza bioinformatyczna
• składanie (ang. assembly)
• adnotacje
• mapa genetyczna, analiza strukturalna i
funkcjonalna genów (mikroorganizmy)
FASTQ
!"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRS
TUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~
Składanie
Adnotacje
• sekwencja, zwykle FASTA
• cztery popularne formaty annotacji:
– GenBank
– GFF3
– GTF
– EMBL
Analiza strukturalna i funkcjonalna
• adnotacja strukturalna – skupia się na
metodach bioinformatycznych, w tym
porównawczych
• adnotacja funkcjonalna – skupia się na
metodach laboratoryjnych i porównawczych
Big Data
Big Data
Big Data
https://genome.ucsc.edu/
Źródła
• Sanger F, Coulson AR (May 1975). "A rapid method for determining
sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J.
Mol. Biol. 94 (3): 441–8.
• http://www.illumina.com/content/dam/illuminamarketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.
pdf
• https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
• https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
• https://nanoporetech.com/science-technology/how-it-works
Dziękujemy za uwagę