Biotechnologia
advertisement
- LC/MS typu Single Quad serii 6100 - LC/MS typu TOF serii 6200 - LC/MS/MS typu Triple Quad serii 6400 - LC/MS/MS typu Q-TOF serii 6500 - LC/MS/MS typu Ion Trap serii MS 500 Spis treści Słowo wstępne Kiedy sukces naukowy może stać się sukcesem biznesowym w biotechnologii......4 Biotechnologia - rynek i komercjalizacja osiągnięć naukowych........6 Patentowanie wynalazków biotechnologicznych......................................10 Zielona biotechnologia..................................16 Modyfikacja genetyczna zwierząt wybór czy konieczność?................................24 Nowa technologia Proteon Pharmaceuticals - preparat oparty na bakteriofagach.... ..........................31 Na tropie ukierunkowanej syntezy białek..................................................32 Biotechnologia na rynku NewConnect - coraz trudniej przekonać inwestorów....................................35 Pół wieku syntezy peptydów.........................38 Własna strona internetowa...........................41 Bezpieczeństwo poufnych danych...............45 Adres redakcji i skład osobowy Lipopharm.pl ul. Kościelna 16A 83-210 Zblewo tel. 58 7322364 fax. 58 7322366 [email protected] Biotechnologia, kilkadziesiąt lat po pierwszych odkryciach biologii molekularnej zaczyna odgrywać coraz większą rolę w codziennym życiu. Nowoczesne badania, oparte o wykorzystanie do produkcji substancji organizmów żywych lub komórek, wpływają bezpośrednio na gospodarkę. Osiągnięcia końca XX wieku w zakresie biotechnologii spowodowały ogromny rozwój przemysłu farmaceutycznego. Biotechnologia, 25 lat po wyprodukowaniu pierwszego biotechnologicznego leku, interferonu oraz pierwszej rekombinowanej szczepionki dla ludzi, nadal jest nauką bardzo młodą. Badania współczesnej biotechnologii koncentrują się głównie wokół poszukiwania nowych leków oraz materiałów medycznych. Olbrzymie znaczenie odgrywa wykorzystanie procesów biotechnologicznych w procesach związanych z produkcją żywności. Biotechnologia pozwala na otrzymywanie odpornych na choroby roślin i zwierząt czy żywności o zaprogramowanej ilości określonych składników (np. tłuszczów). Szacuje się, że produkcja czystej energii, opakowań dla żywności ale i wielu innych produktów życia codziennego w przyszłości będzie oparta również o procesy biotechnologiczne. Dynamiczny rozwój biotechnologii jest obserwowany także w Polsce. Jest to szczególnie ważne, gdyż kraj wcześnie zainwestował w kształcenie kadry i rozwój infrastruktury laboratoryjnej w tym zakresie. Olbrzymim zastrzykiem finansowym dla nowopowstających firm była w ostatnich latach możliwość pozyskiwania funduszy na badania z programów europejskich. Wyposażenie i możliwości takich firm jak Blirt czy Selvita pozwala przez to na realizowanie wielu ambitnych tematów z zakresu biotechnologii. Redaktor naczelny: dr hab. Wojciech Kamysz [email protected] Redaktor techniczny: mgr Barłomiej Kraska [email protected] dr hab. Wojciech Kamysz redaktor naczelny 3 Biotechnologia Kiedy sukces naukowy może stać się sukcesem biznesowym w biotechnologii Tadeusz Pietrucha Bio-Tech Consulting Sp. z o.o. Sukces i możliwości biotechnologii wynikają wprost z postępu w naukach medycznych i biologicznych, zwłaszcza w biologii molekularnej. Biotechnologia nie jest nauką w sensie tradycyjnego rozumienia tego terminu. Jej celem nie jest poznanie otaczającej nas przyrody, ale umiejętne wykorzystanie już istniejącej wiedzy dla praktycznych potrzeb Człowieka. Nowe możliwości, w tym zakresie, ujawniły współczesne osiągnięcia biologii molekularnej. To dzięki nim, a także dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy mówić o nowej erze w rozwoju biotechnologii. Staje się ona, chcemy tego czy nie, wiodącym sektorem gospodarki w krajach o największej dynamice rozwoju. Dotyczy to nie tylko, tradycyjnie, USA, ale wielu krajów Azji i Ameryki Łacińskiej. Komercjalizacja nie jest procesem oderwanym od sposobu opracowania i realizacji biotechnologicznego projektu badawczo-rozwojowego. Tylko na użytek wszelkiego rodzaju prezentacji pokazuje się ją jako diagram zawierający następujące po sobie kolejne etapy. Rzeczywistość jest zazwyczaj bardziej złożona. Poniżej przedstawiam najbardziej elementarne aspekty opracowania i realizacji biotechnologicznego projektu B+R. Ich respektowanie jest niezbędne do osiągnięcia sukcesu biznesowego, aczkolwiek o nim nie przesądza. Stan techniki - badanie aktualnego stanu wiedzy z uwzględnieniem baz patentowych Często o sukcesie (lub o jego braku) projektu badawczo-rozwojowego decyduje nie tylko sposób jego realizacji, ale już przesądza się o nim na etapie przygotowania projektu (grantu). Dla naukowców jest oczywistością, że we wniosku o finansowanie projektu B+R należy przedstawić aktualny stan badań w dziedzinie, w ramach której realizowany będzie projekt. Problem w tym, że owego przeglądu piśmiennictwa dokonuje się na bazie publikacji w czasopismach naukowych. Tymczasem 4 ok. 70% odkryć mających wartość aplikacyjną jest ujawniane wyłącznie w opisach patentowych. Nie uwzględnianie więc przeglądu literatury patentowej dostępnej w patentowych bazach danych stwarza wysokie ryzyko wyważania już szeroko otwartych drzwi. Jeśli nawet odkrycia publikowane w patentach są później przedmiotem publikacji naukowych, dzieje się to zazwyczaj z średnio 1,5 rocznym opóźnieniem. Przegląd literatury patentowej należy więc robić przed, a nie po zakończeniu badań, gdy jest on wymuszany przez przygotowanie zgłoszenia patentowego. Dobrze przygotowany wniosek (grant) na realizację biotechnologicznego projektu B+R musi uwzględniać badanie aktualnego stanu wiedzy na podstawie lektury literatury patentowej przynajmniej z okresu ostatnich 5-6 lat przed złożeniem takiego wniosku. Potencjalny produkt Projekt badawczo-rozwojowy ma zawsze cel aplikacyjny. Oznacza to, że na końcu procesu, którego badania B+R są bardzo ważną częścią, musi powstać produkt, czyli coś, co ma wartość rynkową, coś, co można sprzedać. Pojęcie „produkt” w tym przypadku nie zawsze oznacza rzecz materialną. Może to być równie dobrze opracowanie jakiejś niezwykle użytecznej metody (sposobu) wytwarzania produktu już obecnego na rynku. Produkt musi odpowiadać na potrzeby rynkowe. Wytworzenie czegoś, czego nikt lub prawie nikt nie potrzebuje jest działalnością bezsensowną, marnującą nie tylko pieniądze podatników, ale także czas i energię osób zaangażowanych w jego realizację. Naukowiec zarówno przystępując do realizacji projektu B+R jak i w czasie jego realizacji musi sobie odpowiedzieć na pytanie, jaki produkt ma (powinien) powstać w wyniku realizacji tego projektu. Na podstawie swojej wiedzy powinien precyzyjnie określić jego zastosowanie. Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia Rynek docelowy Naukowcy zazwyczaj nie są specjalistami od oceny potencjalnego rynku dla innowacyjnych produktów biotechnologicznych. Znając jednak dobrze zastosowanie opracowywanych przez siebie produktów są w stanie określić przynajmniej szacunkowo potencjalne zapotrzebowanie na nie, wyobrazić sobe liczbę ich potencjalnych klientów. Oczywiście im większa liczba potencjalnych klientów, im bardziej spełnia on oczekiwania rynku (jest przez odbiorców pożądany, jest niezbędny, bo np. tworzymy nowy lek, który stwarza możliwości leczenia takich stanów chorobowych, na które do tej pory nie było skutecznego lekarstwa), tym wartość komercyjna takiego projektu będzie większa. Bez udziału naukowca, lidera projektu, jego partner biznesowy nie będzie w stanie precyzyjnie określić wielkości rynku, a tym samych skali sprzedaży produktu (potencjału komercyjnego projektu) będącego przedmiotem realizacji projektu B+R. To naukowiec zna zastosowanie produktu, jego przewagę nad aktualnie istniejącymi rozwiązaniami. To są niezbędne elementy, by precyzyjnie określić tzw. grupę docelową, czyli grupę potencjalnych klientów najbardziej zainteresowanych nabyciem produktu. Świadomość tego faktu nie może zniknąć z pola widzenia w trakcie realizacji projektu B+R. Jeśli w trakcie realizacji badań okaże się, że zakres praktycznych zastosowań ogranicza się do bardzo niewielkiej grupy odbiorców, należy przemyśleć kwestię dalszej realizacji projektu. Decyzja o zaprzestaniu realizacji projektu wcale nie musi oznaczać porażki. Co więcej, u aktualnych lub przyszłych partnerów biznesowych wzbudzi ona większe zaufanie i chęć współpracy. Zespół, przerywając z racjonalnych (biznesowych) powodów realizację projektu B+R, tak czy inaczej zdobył unikalne doświadczenie, a co najważniejsze, wykazał się dojrzałością i odpowiedzialnością, a więc cechami niezwykle docenianymi w biznesie. Przewaga konkurencyjna Realizując projekt badawczo-rozwojowy powinniśmy świadomie budować jego przewagę technologiczną nad istniejącymi rozwiązaniami w obrębie dziedziny, w ramach której realizowany jest projekt. Mamy przecież wykorzystać istniejącą wiedzę w nowatorski sposób, a nie powielać już istniejące rozwiązania. To nasz wkład intelektualny w produkt bedzie stanowił główny składnik jego wartości i wyceny. www.czasopismolaborant.pl Zespół realizujący biotechnologiczny projekt B+R musi więc być nie tylko świadomy aktualnego stanu wiedzy (patrz „Stan techniki”), ale powinien umieć przekonynywująco wykazać wyższość proponowanych rozwiązań nad już istniejącymi. Trzeba naprawdę wykazać się dużą wiedzą i umiejętnościami, by stworzyć przewagę technologiczną. W biotechnologii zdobycie aktualnej, autentycznej wiedzy nie jest punktem docelowym – jest punktem wyjścia do działalności badawczo-rozwojowej. By wiedzę (naukę) komercjalizować, trzeba najpierw ją zdobyć i posiadać. Tutaj nie można się ukryć za posiadanym tytułem naukowym. Ochrona własności intelektualnej Wiele projektów badawczo-rozwojowych dramatycznie obniżyło, czy wręcz utaciło zdolność do komercjalizacji, pomimo ciekawego pomysłu i obiecujących wyników badawczych, z powodu lekkomyślności ich autorów i realizatorów. Stało się tak w wyniku zbyt szybkiego upublicznienia wyników, przed zapewnieniem im ochrony własności intelektualnej. Projekty B+R w biotechnologii są zazwyczaj bardzo kosztowne i długotrwałe. Sponsor badań, zarówno ten „państwowy” inwestujący pieniądze podatników, czyli nas wszystkich, jak ten prywatny, musi mieć jakąś gwarancję, że ta inwestycja ma sens. Ochrona własności intelektualnej (zgłoszenie patentowe) jest pierwszym i niezbędnym krokiem umożliwjającym komercjalizację uzyskanych wyników badań. Stwarza ona niejako gwarancję, że dalsze inwestycje bedą miały szansę przynieść zwrot i korzyść tym, którzy te badania finasują. Brak zabezpieczenia prawnego własności intelektualnej powoduje, że każdy legalnie może wykorzystać nasze wyniki. Wspieramy w ten sposób rozwój innowacyjnych produktów, które nie tylko przynoszą korzyści finasowe zagranicznym firmom (i wzbogacają państwa, w które i tak są bogatrze od nas), sami stając się dla nich rynkiem zbytu. Zgłoszenie patentowe nie blokuje możliwości dalszych publikacji (np. w czasopismach naukowych, czy materiałach konferencyjnych), natomiast opublikowanie (ujawnienie) wyników (odkrycia) w jakiejkolwiek postaci przed zgłoszeniem patentowym przekreśla możliwości skutecznej ochrony własności intelektualnej (patentu). W przypadku realizacji biotechnologicznych projektów B+R wymóg dokonywania zgłoszeń patentowych przed jakimkolwiek publicznym ujawnieniem wyników badań powinien być absolutną bezwzględną normą. 5 Biotechnologia Biotechnologia - rynek i komercjalizacja osiągnięć naukowych Marek Kuźbicki, Dawid Nidzworski PRO-SCIENCE.eu Małgorzata Matyka Kancelaria Prawno Patentowa Rozwijamy się mimo globalnego kryzysu Biotechnologia powszechnie uważana za jedną z bardziej perspektywicznych dziedzin nauki i gospodarki. Na razie, mimo iż rozwija się bardzo dynamicznie, nadal nie spełniła pokładanych w niej nadziei. W Polsce cały czas liczymy na to, aby w liczbie nowych bio przedsiębiorstw dogonić kraje Europy Zachodniej. Kreujemy nowe platformy i parki naukowo technologiczne, ale warto zadać sobie pytania: czy faktycznie mamy szanse na to, że w nowych bio centrach powstaną firmy, które zaczną się liczyć nie tylko na naszym lokalnym rynku ale i w Europie oraz czy w końcu powstanie u nas nowy biotechnologiczny potentat? W raporcie z 2007 roku pt. ”Perspektywy i kierunki rozwoju biotechnologii w Polsce do 2013 roku” zidentyfikowano zaledwie 20 firm biotechnologicznych, spośród których jedynie 3 firmy mogły być zaliczone do firm dużych. Pozostałe podmioty stanowiły niewielkie nawet jednoosobowe przedsiębiorstwa działające w tym sektorze. Oczywiście raport uzupełniono o kolejne 23 firmy, które zakwalifikowano jako firmy, których plany wskazują na to, że w najbliższym czasie mogą rozpocząć działalność stricte biotechnologiczną. Gdyby przeprowadzić podobne badanie dziś polskich firm związanych z branżą biotechnologiczną z pewnością byłoby więcej. Niestety na polu głównych graczy, których działalność można rozpatrywać w skali przynajmniej europejskiej nic się nie zmieniło. Ani duża ilość środków unijnych wpompowana w rozwój projektów biotechnologicznych, ani też możliwość pozyskania kapitału poprzez rynek alternatywny New Connect nie przyniosły jeszcze przełomu w polskiej biotechnologii. Ponadto pochodną optymistycznego spojrzenia na rozwój tej branży w Polsce jest obecnie przesycenie rynku pracy absolwentami kierunków biotechnologicznych, którzy skuszeni 6 wielkimi perspektywami wybrali studia, które obecnie nie dają im wielkich szans na rynku pracy. Taki obraz polskiej biotechnologii byłby niewątpliwie smutny gdyby nie nieliczne gwiazdy czyli polskie firmy, które nadal próbują rozwinąć własne zaplecze do produkcji biotechnologicznej. Pozostaje pytanie czy firmy takie jak Mabion, Blirt czy ReedGene wykorzystają swoją szansę i zaczną dobudowywać kolejne rozdziały polskiej biotechnologii rozpoznawalnej na świecie. Pocieszający jest też fakt, że polskie firmy biotechnologiczne nie odczuły silnie kryzysu finansowego w ostatnich latach. W Europie załamanie koniunktury w latach 2008/2009 spowodowało zmniejszenie się liczby działających podmiotów o 2%, natomiast w Polsce liczba firm biotechnologicznych wzrosła. Okazuje się więc, że na tle globalnych problemów nasze polskie, jak i europejskie firmy radzą sobie całkiem nieźle. Jak wskazuje ostatni opublikowany raport Ernst & Young – „Beyond Borders Global Biotechnology Report 2010” światowe statystyki nie są już tak różowe. Liczba przedsiębiorstw biotechnologicznych działających w Stanach Zjednoczonych zmalała o 4%. Przy tych, właściwie niewielkich, zmianach wrażenie robi spadek zyskowności firm biotechnologicznych w USA, który wyniósł 14%. Ostatnie lata nie były udane dla branży biotechnologicznej w ujęciu globalnym. Spadek dochodu firm biotechnologicznych wyniósł 9%, co pociągnęło za sobą zmniejszenie wydatków na badania i rozwój o 21%. Według ostatnich danych globalna wartość przychodów wygenerowanych przez firmy biotechnologiczne sięga 79 miliardów dolarów rocznie. Na tle globalnej biogospodarki polska branża biotechnologiczna jest nadal niewielkim elementem. Ostatnie szacunki wskazują, że udział polskiej biotechnologii farmaceutycznej na rynku europejskim jest na poziomie około 2,5%. Być może wkrótce nowe światło na perspektywy Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia tej branży rzucą badania realizowane przez naukowców z Politechniki Łódzkiej w ramach projektu pod tytułem „Uwarunkowania i perspektywy rozwoju przedsiębiorstw biotechnologicznych w Polsce”. Jak wynika z naszych danych, większość polskich firm biotechnologicznych, biorąc pod uwagę wartość sprzedaży, będzie w skali europejskiej traktowana jako spółki na początkowym etapie rozwoju. Dla tego typu firm, jak i dla całej biotechnologii, kluczową rolę odgrywa nie tyle wartość sprzedaży, Komercjalizacja biotechnologii a własność in- co wartość posiadanych zasobów. Zasobów specytelektualna ficznych dla firm technologicznych, bo opartych Wróćmy jednak na pole polskiej biotechnologii. na wartościach niematerialnych, które najprościej Reklama www.czasopismolaborant.pl 7 Biotechnologia można przedstawić biorąc pod uwagę liczbę posiadanych patentów. Analizując polskie patenty biotechnologiczne na podstawie dostępnych statystyk, na przykład tych publikowanych przez Europejski Urząd Patentowy można zauważyć, że liczba polskich wynalazków klasyfikowanych jako biotechnologiczne wzrosła, choć jest to raczej wzrost symboliczny. Pomimo tego nadal jesteśmy na szarym końcu Europy i nie możemy porównywać się z krajami Europy Zachodniej. Nie możemy być zadowoleni z liczby przyznanych polskim podmiotom patentów w ramach procedur realizowanych przez Europejski Urząd Patentowy. Nie oznacza to jednak, że polska biotechnologia, zarówno ze strony przedsiębiorstw jak i nauki, nie tworzy wartościowych rozwiązań. Wiele firm pracuje nad innowacyjnymi produktami i często posiadają one już krajowe zgłoszenia lub patenty. Wydaje się jednak, że nadal nie potrafimy skutecznie wykorzystać tego potencjału. Tworzone przez uczelnie rozwiązania i zgłoszenia patentowe często pełnią tylko funkcję ozdobą i służą zdobywaniu kolejnych punktów w ocenie Ministerstwa Nauki. W wielu przypadkach tzw. komercjalizacja kończy się właśnie na zgłoszeniu patentowym, a brak środków i doświadczenia powoduje, że niewiele uczelni myśli lub jest w stanie przygotować wypracowane osiągnięcia do sprzedaży na trudnym rynku nowych technologii. Jedyną szansą wydają się być korzystające z dostępności kapitału nowe spółki spin-off. Niestety ich rozwój często natrafia na liczne bariery. Firmy te tworzone są najczęściej przez naukowców posiadających obszerną wiedzę i zaplecze w postaci zespołu badawczego, jednak w powstających innowacyjnych spółkach często Lata 2004-2005 2005-2006 2006-2007 2007-2008 2008-2009 brakuje doświadczonego biznesowo zarządu. Kolejną barierą jest brak odpowiednich procedur na uczelniach, które w prosty i przejrzysty sposób pozwoliłyby uruchamiać nowe podmioty z udziałem uczelni. W takich sytuacjach uczelnie nadal są zdecydowanie bardziej zainteresowane szybką realizacją zysków poprzez sprzedaż licencji nowopowstałej firmie niż włączeniem się w jej rozwój. Obecnie w związku ze zmianami w ustawodawstwie uczelnie starają się w pośpiechu przygotować odpowiednie regulacje. Jednak można odnieść wrażenie, że podczas prac nad regulacjami pomija się całkowicie aspekt wdrożenia nowych zasad. Skutkiem takiego działania mogą być niestety tylko nowe skomplikowane regulaminy, które w żaden sposób nie przyczynią się do zachęcenia naukowców do działań skoncentrowanych na wykorzystaniu potencjału uczelni w celu realizacji komercyjnych projektów i wdrożeń nowych rozwiązań do biznesu. Z drugiej strony obecnie można obserwować szereg korzystnych zjawisk sprzyjających komercyjnemu wykorzystaniu osiągnięć naukowych. Należy zwrócić uwagę przede wszystkim na coraz większą świadomość młodych naukowców, którzy chętnie poszerzają swoją wiedzę z zakresu zagadnień biznesowych oraz na powstające bezpośrednie relacje między przedstawicielami biznesu i nauki. Wykorzystaniu szans na rozwój nowych firm biotechnologicznych sprzyja również dobra, mimo kryzysu, dostępność kapitału, który być może w końcu doczeka się interesujących projektów z zakresu biotechnologii. Optymizmem napawa również coraz większe otwarcie środowiska naukowego na możliwości współpracy z firmami doradczymi. Dynamika rynku Biotechnologii wzrost przychodów wydatki na B+R 18% 4% 14% 33% 8% 7% 12% 18% -9% -21% Tab 1: Zamiany dynamiki przychodów firm biotechnologicznych oraz ich wydatków na badania i rozwój w latach 2004-2008. (Źródło: Opracowanie własne Marek Kuźbicki na podstawie Ernst&Young Beyond borders - Global Biotechnology report, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010) 8 Liczba Uzyskanych Patentów Biotechnologicznych rok 2007 2009 Polska 1 3 Czechy 3 4 Słowacja 0 0 Niemcy 1065 340 USA 2442 977 Tab 2: Liczba przyznanych patentów w dziedzinie biotechnologii za pośrednictwem Europejskiego Urzędu Patentowego latach 2007 i 2009 Laborant Nr 2/2011 Laboratoryjne systemy uzdatniania wody System HLP - idealne źródło wody do metod chromatograficznych www.hlpolska.pl Prawo patentowe Patentowanie wynalazków biotechnologicznych Izabela Milczarek Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. Czym jest biotechnologia? Wiek XX był wiekiem niezwykle dynamicznego rozwoju wielu dziedzin nauki. Jedną z najbardziej rozwijających się dziedzin jest biotechnologia, która z laboratoriów naukowych przeniosła się do przemysłu tworząc jego gałąź o obrotach sięgających wielu miliardów dolarów. Biotechnologia, według Konwencji o różnorodności biologicznej ONZ z 1993 roku oznacza zastosowanie technologiczne, które wykorzystuje systemy biologiczne, organizmy żywe lub ich pochodne, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy do swoistych zastosowań. Metody biotechnologiczne są wykorzystywane od tysięcy lat np. przy produkcji wina i piwa. W 1920r. w Leeds zorganizowano pierwsze Biuro Biotechnologii, które publikowało gazetę zajmującą się technologią fermentacji. Ostatnio procesy fermentacji wykorzystywano nie tylko do otrzymywania alkoholu, ale również w przemyśle produkcji antybiotyków, przy czym produkcja niektórych antybiotyków do dziś polega na izolacji produktów fermentacji przebiegającej z udziałem mikroorganizmów występujących naturalnie lub zmodyfikowanych genetycznie. Nowoczesna biotechnologia mogła się rozwinąć po ustaleniu w latach 50-tych struktury DNA i opracowaniu w latach 70 dwóch podstawowych technik: metody rekombinacji DNA i technologii tworzenia hybrydoma. Dzięki rozwojowi inżynierii genetycznej stało się możliwe wytwarzanie transgenicznych roślin i zwierząt. Zgodnie z zaproponowanym przez The European Association for Bioindustries (EuropaBio) podziałem można wyróżnić białą biotechnologię dotycząca systemów biologicznych w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska, czerwoną biotechnologię wykorzystywaną w ochronie zdrowia (nowe leki, diagnostyka, genoterapia i transplantologia) i zieloną biotechnologię związaną 10 z rolnictwem (inżynieria genetyczna roślin i zwierząt). Istnieje również fioletowa biotechnologia dotycząca ustawodawstwa związanego z biotechnologią. Szybki rozwój biotechnologii i jej związki z wieloma dziedzinami wiedzy sprawiają, że istnieje potrzeba zapoznania szerszej opinii publicznej z możliwością patentowania wynalazków biotechnologicznych. Najpierw jednak należy wyjaśnić, co jest wynalazkiem biotechnologicznym i jakie kryteria musi spełniać wynalazek, aby mógł być opatentowany. Jaki wynalazek jest wynalazkiem biotechnologicznym? Przez wynalazek biotechnologiczny zgodnie z art. 931 Prawa Własności Przemysłowej (PWP) rozumie się wynalazek w rozumieniu art. 24 dotyczący wytworu składającego się z materiału biologicznego lub zawierającego taki materiał, lub sposobu za pomocą którego ten materiał biologiczny jest wytwarzany, przetwarzany lub wykorzystywany. Artykuł 24 mówi natomiast o tym, że patenty są udzielane – bez względu na dziedzinę techniki, na wynalazki które są nowe, posiadają poziom wynalazczy, tzn. nie wynikają w sposób oczywisty ze stanu techniki, i znajdują przemysłowe zastosowanie. Materiałem biologicznym jest materiał zawierający informację genetyczną, zdolny do samoreprodukcji albo nadający się do reprodukcji w systemie biologicznym. Za wynalazki biotechnologiczne uważa się też takie wynalazki, które stanowią materiał biologiczny wyizolowany ze swojego naturalnego środowiska lub wytworzony sposobem technicznym, nawet jeżeli poprzednio występował w naturze. Natomiast sposób biologiczny jest to taki sposób, w którym bierze udział materiał biologiczny lub który został dokonany na materiale mikrobiologicznym albo wynikiem którego jest ten Laborant Nr 2/2011 Prawo patentowe materiał. W myśl art.932 PWP za wynalazki biotechnologiczne, na które mogą być udzielane patenty, uważa się w szczególności wynalazki: 1) stanowiące materiał biologiczny, który jest wyizolowany ze swojego naturalnego środowiska lub wytworzony sposobem technicznym, nawet jeżeli poprzednio występował w naturze; 2) stanowiące wyizolowany z ciała ludzkiego lub w inny sposób wytworzony sposobem technicznym, włącznie z sekwencją lub częściową sekwencją genu, nawet jeżeli budowa tego elementu jest iden-tyczna z budową elementu naturalnego; 3) dotyczące roślin lub zwierząt, jeżeli możliwości techniczne stosowania wynalazku nie ograniczają się do szczególnej odmiany roślin lub rasy zwierząt. Jednak nie wszystkie rozwiązania biotechnologiczne nadają się do opatentowania. Zgodnie z art. 29: PWP nie udziela się patentów na: 1) wynalazki, których wykorzystywanie byłoby sprzeczne z porządkiem publicznym lub dobrymi obyczajami; 2) odmiany roślin i rasy zwierząt oraz czysto biologiczne sposoby hodowli roślin lub zwierząt; 3) sposoby leczenia ludzi i zwierząt oraz sposoby diagnostyczne na nich stosowane. Ponadto zgodnie z art.933 PWP za wynalazki nie uważa się ciała ludzkiego w jego stadiach formowania się i rozwoju oraz zwykłego odkrycia jednego z jego elementów, włącznie z sekwencją lub częściową sekwencją genu. Za wynalazki biotechnologiczne, których wykorzystywanie byłoby sprzeczne z porządkiem publicznym lub dobrymi obyczajami w rozumieniu art.29 ust.1 pkt.1 lub moralnością publiczną uważa się w szczególności: 1) sposoby klonowania ludzi; 2) sposoby modyfikacji tożsamości genetycznej linii zarodkowej człowieka; 3) stosowanie embrionów ludzkich do celów przemysłowych lub handlowych; 4) sposoby modyfikacji tożsamości genetycznej zwierząt, które mogą powodować u nich cierpienia, nie przynosząc żadnych istotnych korzyści medycznych dla człowieka lub zwierzęcia, oraz zwierzęta będące wynikiem zastosowania takich sposobów. Zatem klasyczne przykłady wynalazków biotechnologicznych obejmują wytwory, takie jak: www.czasopismolaborant.pl -mikroorganizmy (którymi mogą być, na przykład, bakterie, drożdże, grzyby, wirusy, komórki roślinne lub zwierzęce) wyizolowane lub wytworzone (na przykład drogą mutagenezy istniejącego już organizmu, fuzji z inną komórką w celu uzyskania hybrydoma, bądź też transformacji DNA); - mikroorganizmy stosowane w sposobie, na przykład fermentacji, aby uzyskać określony produkt lub stosowane do transformacji rośliny lub komórki zwierzęcej w celu uzyskania transgenicznej rośliny lub zwierzęcia; - cząsteczki DNA (geny, sekwencje, które mogą być sondami lub starterami stosowanymi w oznaczeniach diagnostycznych, wektorami do transformowania gospodarza, np. wektorami wirusowymi do stosowania w terapii genowej); - białka; - przeciwciała monoklonalne; - transgeniczne rośliny; - transgeniczne zwierzęta. Inną grupą wynalazków, która obejmuje uzyskany produkt są kompozycja farmaceutyczna, szczepionka, zestaw lub odczynnik diagnostyczny. Uzyskany wcześniej produkt może być również wykorzystany w takich kategoriach jak zastosowanie medyczne, diagnostyczne, przemysłowe lub 11 Prawo patentowe rolnicze. Jako wynalazek biotechnologiczny można również opatentować aparat służący do np. hodowli mikroorganizmu lub wykorzystywany w sposobie stanowiącym część wynalazku biotechnologicznego, na przykład, w sposobie diagnostycznym. Jak można opatentować wynalazek biotechnologiczny? Mimo, iż wynalazki biotechnologiczne muszą spełniać wszystkie kryteria patentowalności dotyczące innych wynalazków, to charakteryzują się cechami tylko im właściwymi. Prawo patentowe i praktyka w stosunku do wynalazków biotechnologicznych mają wiele trudności z nadążeniem za szybkim postępem naukowym w tej dziedzinie, a ocena poziomu wynalazczego i wystarczającego ujawnienia może czasem nastręczać dużo kłopotów. Dlatego w ostatnich latach wiele patentów było przedmiotem sporu, a sądy miały trudności z ustaleniem, co było dla specjalisty stanem techniki w czasie, gdy powstawał wynalazek. Ponadto w związku ze złożonością układów zawierających żywe organizmy ciężko jest zagwarantować, że gdy stosowany jest mikroorganizm, wszystkie wymagania patentowalności są spełnione. Na przykład, wynalazki mikrobiologiczne zazwyczaj obejmują zastosowanie nowego szczepu mikroorganizmu do wytwarzania nowego związku lub związku znanego, ale w sposób bardziej wydajny lub o polepszonych właściwościach (np. o większej czystości). Nowy organizm może być organizmem występującym w naturze (np. wyizolowanym w wyniku przeszukiwania) lub może być wytworzony w laboratorium w wyniku sztucznej mutacji losowej, albo swoistymi metodami inżynierii genetycznej. Jeżeli mikroorganizm wytwarza nowy produkt, taki jak np. nowy antybiotyk, którego strukturę można łatwo określić lub można scharakteryzować, tak jak charakteryzuje się zwykły związek chemiczny, to wtedy można nowy produkt zastrzegać tak jak związek chemiczny. Wymóg wystarczającego ujawnienia jest spełniony. W przypadku materiału biologicznego wyizolowanego ze swojego naturalnego źródła wcześniejsze istnienie tego materiału biologicznego w jego naturalnym stanie nie zaburza nowości, ponieważ nie był on do tej pory dostępny publicznie, a zatem nie mógł stanowić stanu techniki. Po drugie, 12 materiał biologiczny nie może być uznany za oczywisty tylko dlatego, że był uzyskany standardową metodą. Istota wynalazku polega w tym przypadku na samym materiale biologicznym, jako takim. Jest to nowy produkt, który dotąd nie był dostępny dla ogółu. Zatem nie może być rozważany jako taki, któremu brakuje poziomu wynalazczego. Podobnie nowo wyizolowane i scharakteryzowane białko, którego występowanie było wcześniej nieznane, będzie uważane za nowe. Kryterium, które decyduje o tym, czy mamy do czynienia z patentowalnym wynalazkiem czy z niepatentowalnym odkryciem zależy od stopnia w jakim człowiek ingeruje w substancję, która istnieje w naturze. Nie można opatentować żywego organizmu obecnego w naturze, co najwyżej można opatentować sam sposób jego izolacji. W przypadku gdy chcemy opatentować gen lub sekwencję genu kategorycznie wymagane jest podanie w zgłoszeniu przemysłowego zastosowania tej sekwencji lub częściowej sekwencji genu, ponieważ sama sekwencja genu bez określenia jej funkcji nie zawiera żadnej informacji technicznej. W przypadku, gdy sekwencja genu lub częściowa sekwencja genu jest stosowana do wytwarzania białka, lub części białka, konieczne jest określenie, jakie białko lub jaka jego część jest wytwarzana i jaką funkcję pełni. W przypadku gdy sekwencja nie jest wykorzystywana do wytwarzania białka lub części białka funkcję jej można wskazać przez podanie, na przykład, że sekwencja stanowi promotor aktywności tranaskrypcyjnej lub sondę do oznaczeń. Obok podania sekwencji genu należy również określić produkt jego ekspresji i przedstawić jego funkcję. Dopiero przedstawienie funkcji białka kodowanego przez ten gen w pełni ujawnia wynalazek. Zatem DNA można patentować przez ujawnienie jego sekwencji, przez mapy restrykcyjne, depozyty mikroorganizmów, homologie, sekwencje hybrydyzujące z patentowanym DNA i składniki. Nie można uznać produktu za nowy jedynie na tej podstawie, że wytworzono go nowym sposobem. Ta ogólna zasada oznacza, że białko, które było opisane w stanie techniki, jest wytwarzane metodą rekombinacji, nie jest automatycznie uważane za nowe. Tylko w przypadku, gdy proces rekombinacji da produkt, który różni się cechami technicznymi od naturalnego białka, potwierdzona Laborant Nr 2/2011 Prawo patentowe jest nowość produktu. Na przykład, gdy wyrażanie glikolizowanego białka ssaczego w bakterii daje w wyniku białko nieglikolizowane, a zatem inne niż to występujące naturalnie. Przeciwnie, nawet gdy białko lub peptyd występuje naturalnie można uzyskać dla niego ochronę pod warunkiem, że nie został wcześniej opisany, został wyizolowany i ma zastosowanie przemysłowe. Cechy białka i peptydów, które Urząd Patentowy uważa za wystarczające do właściwego ujawnienia obejmują sekwencje aminokwasowe i parametry fizyko-chemiczne. Białko zastrzega się też przez homologię sekwencji, przez depozyty lub elementy składniki. Jeśli białka nie można określić inaczej można zastrzegać białko sposobem jego otrzymywania, jest to zastrzeżenie typu produkt przez sposób. Przedstawianie białka za pomocą jego sekwencji aminokwasowej często nastręcza dużo problemów, ponieważ naturalnie występujące białka mają tylko pewne, interesujące ze względów aktywności części np. miejsce wiązania enzymu lub epitop antygenu. Te części aktywne białka są wysoce konserwatywne i wśród wyższych kręgowców wykazują duży stopień homologii (80%). Również w miejscu aktywnym nie wszystkie aminokwasy są niezbędne, część z nich można zastąpić aminokwasami podobnymi, nie zmieniając przy tym aktywności biologicznej białka. Zatem ograniczenie zastrzeżeń patentowych tylko do jednej określonej sekwencji, bardzo zawęża zakres ochrony i ułatwia obejście takiego patentu przez osoby trzecie. Białko i peptyd korzystnie identyfikuje się w Europejskim Urzędzie Patentowym (EPO) w sposób otwarty jako np. „obejmujący” sekwencję aminokwasową lub jako mający pewien stopień homologii lub Reklama Krok naprzód Bioreaktory Micro-Flask • Hodowla mikroorganizmów na płytkach mikrotitracyjnych 24- lub 96-dołkowych • Możliwość uzyskania 384 mikro-reaktorów poprzez klamrę spinającą 4 platformy • Powtarzalność, wzrost oraz współczynnik OTR porównywalne z hodowlami w kolbach Erlenmeyera • Brak zanieczyszczeń krzyżowych pomiędzy dołkami • Możliwość nieinwazyjnego pomiaru pH i DO w poszczególnych dołkach • Stosowane m.in. w badaniach i screeningu metabolitów, enzymów, bibliotek klonów, wysoce aktywnych lub produktywnych mutantów Bioreaktory MiniBio • Reaktory o pojemności całkowitej od 250 mL do 1000 mL naśladujące większe reaktory o pojemnościach od 1 L do 15 L – możliwość prowadzenia do 32 hodowli równolegle • Możliwość hodowli tkankowych i kultur mikrobiologicznych w systemie transzowym, ciągłym i z dokarmianiem • Łatwość obsługi, redukcja kosztów, oszczędność miejsca w laboratorium Bioreaktory jednorazowe • Ograniczone do minimum ryzyko zanieczyszczeń krzyżowych • Idealne do aplikacji wymagających bezwzględnej i powtarzalnej czystości urządzeń • Ułatwiona walidacja, zapewniona zgodność z zaawansowanymi procedurami biotechnologicznymi Inkubatory z wytrząsaniem RAM® • Zaawansowane wytrząsanie kultur mikrobiologicznych z wykorzystaniem technologii rezonansu akustycznego (ResonantAcoustic® technology) • Wydajne, nieinwazyjne mieszania • Opatentowane korki Oxy-Pump® zwiększające 6-krotnie współczynnik OTR w porównaniu z tradycyjnym wytrząsaniem o ruchu okrężnym • 6-krotny wzrost biomasy oraz 10-krotny wzrost ekspresji produktu WITKO Sp. z o.o. al. Piłsudskiego 143 92-332 Łódź www.witko.com.pl www.czasopismolaborant.pl tel.: (42) 676 34 35 fax: (42) 676 34 43 e-mail: [email protected] 13 Prawo patentowe identyczności sekwencji. Polski Urząd Patentowy jest w tej kwestii bardziej rygorystyczny i w Polsce przyjmuje się opcję bardziej zawężającą. Przeciwciała można patentować podając ich budowę, czyli sekwencję. Można je zastrzegać przez złożony depozyt hybrydoma, która je wytwarza, lub przez nowy antygen rozpoznawany przez to przeciwciało. Przeciwciała można też zastrzegać przez sposób ich otrzymywania. Plazmidy i wektory można opisywać ich składnikami, mapą restrykcyjną lub sekwencją w zakresie ich sposobu wytworzenia przez odniesienie się do figury przedstawiającej strukturę wektora lub przez odniesienie do depozytu. Jeżeli wynalazek biotechnologiczny jest związany z materiałem biologicznym, którego nie można w inny sposób określić w celu ułatwienia specjaliście zastosowania tego wynalazku w powtarzalny sposób można powołać się na zdeponowanie tego materiału w kolekcji zgodnie z Traktatem Budapesztańskim. W ten sposób można zastrzec mikroorganizmy, linie komórkowe, przeciwciała monoklonalne i hybrydoma. Zastrzeżenia dotyczące zwierząt i roślin są dopuszczone do patentowania pod warunkiem, że stosowanie wynalazku nie jest technicznie ograniczone do pojedynczej odmiany roślin lub rasy zwierząt. Sposoby wytwarzania roślin i zwierząt są patentowalne, pod warunkiem, że zawierają etap nie będący etapem czysto biologicznym. Na podstawie art. 29 ust. 1 pkt. 2 PWP (art. 52(4)) Konwencji o Patencie Europejskim (EPC) patentów nie udziela się na sposoby leczenia ludzi i zwierząt i sposoby diagnozowania ludzi i zwierząt. Zakaz ten nie obejmuje jednak substancji o znaczeniu medycznym, a także metod diagnostycznych, w których część etapów przebiega poza organizmem ludzkim, a więc in vitro. Wynalazki z dziedziny diagnostyki medycznej wymagają bardzo dokładnej charakterystyki, ponieważ niejednokrotnie dwa oznaczenia różnią się od siebie jedynie szczegółami. Z punktu widzenia specjalisty z dziedziny diagnostyki medycznej nawet bardzo mała zmiana w procedurze diagnostycznej może całkowicie zmienić końcowy wynik badania. Niezwykle istotną cechą wynalazku z dziedziny 14 diagnostyki jest jego powtarzalność. Zatem cechą, którą można opatentować w dziedzinie diagnostyki medycznej jest na przykład diagnostyka innego stadium choroby niż znane ze stanu techniki. Zmiana jednego z etapów sposobu np. przez zmianę parametrów technicznych, dzięki czemu poprawiamy czułość metody, bądź jej efektywność. Zmiany takie, choć pozornie wydają się małymi zmianami mają jednak zdolność patentową. Sposoby leczenia jako takie nie podlegają opatentowaniu, ale stworzono furtkę dla patentowania substancji leczniczych w postaci zastosowania medycznego, z których najczęściej stosowane jest drugie i kolejne zastosowanie medyczne. Zastosowanie medyczne może dotyczyć nowego zastosowania substancji, która dotychczas nie była stosowana w medycynie, substancji która była stosowana w medycynie, ale do leczenia innej choroby, na przykład drugie zastosowanie medyczne dla aspiryny. Zastrzeżenie w postaci „zastosowanie substancji X do wytwarzania leku do leczenia choroby Z” jest dostępne dla albo pierwszego albo kolejnego zastosowania. Zastrzeżenia tego rodzaju dotyczą również nowego sposobu dawkowania lub nowej grupy pacjentów. W Polsce stosunkowo niedawno wprowadzono możliwość opatentowania nowego zastosowania medycznego. Drugie zastosowanie medyczne wprowadzono z myślą o możliwości zrekompensowania olbrzymich nakładów poniesionych przez branże medyczne na poszukiwanie nowych leków. Jakie akty prawne są brane pod uwagę przy rozpatrywaniu wynalazków biotechnologicznych? Na koniec wykaz niezbędnych aktów prawnych, z którymi zaznajomienie się jest niezbędne przy planowaniu patentowania wynalazków biotechnologicznych, ponieważ są brane pod uwagę przez Urząd Patentowy RP przy ich rozpatrywaniu. -Dyrektywa UE o wynalazkach biotechnologicznych (1998); -Ustawa Prawo Własności Przemysłowej (2000); -Traktat Budapesztański (1977); -Ustawa o nasiennictwie (1995); -Ustawa o organizmach transgenicznych (2001); -Konwencja o udzielaniu patentów europejskich (EPC) 1973. Laborant Nr 2/2011 [ QU A L I T Y ] www.waters.com/oasis W HY IS OASIS THE MOST T RUST ED SPE BRAND? MINIMIZE YOUR RISK BY USING THE MOST SELECTIV E SAMPLE PREPARATION PRODUCTS AVAILABLE. Highest Data Quality Ac hieve the cleanest extracts by significantly reducing matrix interference. Lowest Method Variability Reduce the number of repeated assays or failed validation runs. Best Reproducibility Rely on the most dependable cartridges and plates for batch-to-batch consistency. ©2010 Waters Corporation. Waters, Oasis, and T he Science of W hat’s Possible are trademarks of Waters Corporation. Biotechnologia Zielona biotechnologia Anna Szpitter, Aleksandra Królicka Zakład Ochrony i Biotechnologii Roślin, Katedra Biotechnologii, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG i GUMed Uniwersytet Gdański Fenomen komórki roślinnej - totipotencja Uważa się, że początkiem rozwoju tzw. „zielonej” biotechnologii była teoria totipotencji zaproponowana w 1902 roku przez austriackiego uczonego Gottlieb’a Haberlandt’a. Według tej teorii każda żywa komórka roślinna odłączona od korelacyjnego wpływu innych komórek, na specjalnych pożywkach, posiada zdolność do odtworzenia dowolnej tkanki, organu czy kompletnego organizmu. Od tamtej pory stopniowo zaczęto doskonalić technikę hodowli roślin w warunkach in vitro (łac. w szkle), pozwalającą na kontrolowanie rozwoju rośliny poprzez dobór odpowiedniego składu pożywki, na której w warunkach aseptycznych prowadzona jest hodowla w fitotronie (Fot. 1). Fragmenty tkanek roślinnych (zwane eksplantatami) podatne są na działanie egzogennych regulatorów wzrostu jak auksyny czy cytokininy, które w znacznym stopniu decydują o kierunku rozwoju komórek roślinnych w hodowli in vitro. Tę właściwość wykorzystano w technologii mikrorozmnażania, polegającej na Fot. 2. Kultura in vitro Dionaea muscipula. Fot. 1. Fitotron – pomieszczenie do hodowli roślin in vitro. 16 stymulowaniu rozwoju pąków czy pojedynczych komórek w kompletne rośliny (Fot. 2). Według teorii Haberlandt’a każda żywa komórka roślinna posiada teoretycznie taką zdolność, więc łatwo sobie wyobrazić potencjał jaki drzemie w niewielkim fragmencie blaszki liściowej czy łodygi. Dodatkowo istnieje możliwość indukcji tworzenia tkanki przyrannej zwanej kalusem (Fig. 1), będącą niezorganizowaną masą komórek o wysokim tempie podziałów, która po odpowiedniej stymulacji regulatorami wzrostu może stać się źródłem zarodków, a następnie całych roślin. Mimo wysokich kosztów, technologia mikrorozmnażania posiada wiele zalet w porównaniu Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia z tradycyjnymi metodami propagacji roślin, pozwalając na otrzymanie niezależnie od warunków klimatycznych dużej liczby roślin jednorodnych genetycznie i wolnych od patogenów. Metoda mikropropagacji znalazła zastosowanie w rozmnażaniu wielu gatunków roślin, których tradycyjna produkcja jest niezwykle trudna. Przykładem są tutaj niektóre rośliny ozdobne np. storczyki oraz drzewa leśne, a także elitarne odmiany roślin użytkowych np. truskawki, maliny. Ponadto technika rozmnażania i hodowli in vitro z powodzeniem stosowana jest do namnażania i reintrodukcji do środowiska roślin zagrożonych wyginięciem z powodu nadmiernej eksploatacji przez człowieka (storczyki, rośliny owadożerne). Sztuczne nasiona Aby namnożony materiał roślinny wysokiej jakości można było w prosty sposób przechowywać oraz wprowadzać do tradycyjnej hodowli „na polu” stosuje się technikę tworzenia sztucznych nasion. Do tego celu najczęściej wykorzystuje się otrzymane w kulturach in vitro zarodki somatyczne, które zwykle poddaje się otoczkowaniu i suszeniu. Obecnie trwają badania nad udoskonaleniem metod tworzenia sztucznych nasion tak, aby ich odporność na przechowywanie i zdolność do rozwoju w prawidłowe rośliny była zbliżona do nasion naturalnych. W tym celu stosuje się m.in. otoczki wzbogacane w inhibitory kiełkowania, sole mineralne, pestycydy czy też korzystne dla rozwoju zarodka mikroorganizmy. Poza zastosowaniem w rolnictwie, odpowiednio przygotowane sztuczne nasiona roślin zagrożonych wyginięciem mogą być poddane krioprezerwacji (Fig. 1) i przechowywane przez długi czas w głębokim inicjacja kultur in vitro transformacja Agrobacterium rhizogenes kultury zawiesinowe kultury kalusa zarodki somatyczne kultury korzeni włośnikowatych sztuczne nasiona automatyzacja (bioreaktory) produkcja metabolitów lub biofarmaceutyków w korzeniach włośnikowatych krioprezerwacja Fig 1. Wykorzystanie „zielonej” biotechnologii. www.czasopismolaborant.pl Fig 1. Wykorzystanie „zielonej” biotechnologii. 17 Biotechnologia zamrożeniu w bankach germplazmy. Roślina jako fabryka cennych substancji Od starożytności człowiek skwapliwie wykorzystywał właściwości lecznicze roślin. Cenione właściwości roślin wynikają z obecności w ich tkankach związków zwanych metabolitami wtórnymi, które biorą udział w interakcji roślin ze środowiskiem. Produkowane są one przez rośliny w celu obrony przed promieniowaniem UV, patogenami, roślinożercami, czy umożliwiają konkurencję z innymi gatunkami roślin. Wiele z ponad 100 000 do tej pory zidentyfikowanych roślinnych metabolitów wtórnych jest stosowanych w przemyśle farmaceutycznym czy kosmetycznym. Szacuje się, że 25% leków będących w użytku w krajach rozwiniętych stanowią związki pochodzenia roślinnego. Ponieważ synteza chemiczna wielu z metabolitów roślinnych jest niezwykle trudna i kosztowna, główną metodą ich otrzymywania pozostaje ekstrakcja tych związków z materiału roślinnego. Takie rozwiązanie niesie ze sobą szereg trudności, takich jak niska wydajność biosyntezy czy niewielkie stężenia pożądanych związków w tkance roślinnej. Dodatkowo wiele metabolitów wtórnych wykazujących aktywność biologiczną produkowanych jest przez gatunki zagrożone wyginięciem. W związku z tymi ograniczeniami tradycyjnego pozyskiwania materiału roślinnego atrakcyjną alternatywę stanowi produkcja z zastosowaniem roślinnych kultur komórkowych lub tkankowych. Jednym z pierwszych związków, który na skalę przemysłową otrzymano tą metodą był wykazujący działanie przeciwnowotworowe naftochinon – szikonina. Związek ten pozyskiwany jest z komórek Lithospermum erythrorizon hodowanych w postaci zawiesiny w bioreaktorach o pojemności 750 litra. Innym przykładem jest paklitaksel, alkaloid o aktywności przeciwnowotworowej wyizolowany z kory Taxus brevifolia, który stosowany jest w leczeniu raka piersi, jajników czy mięsaka Kaposiego. Paklitaksel produkowany jest w roślinie w tak niewielkim stężeniu, że leczenie jednego pacjenta wymaga zniszczenia co najmniej sześciu 100-letnich drzew. Paklitaksel pozyskiwany był ze źródeł naturalnych od czasu odkrycia w 1967 aż do 1993 roku, kiedy to rozpoczęto alternatywną produkcję tego chemioterapeutyku w hodowli in vitro komórek T. brevifolia na skalę przemysłową. 18 Transformacja roślin przy użyciu bakterii Roślinne kultury zawiesinowe (Fig. 1) są stosowane często w produkcji metabolitów roślinnych na skalę przemysłową z powodu swej jednorodności oraz istnienia opracowanych metod hodowli w bioreaktorach o dużej pojemności. Problemem w przypadku tego typu kultur jest zwykle niestabilność genetyczna, niska wydajność produkcji, a także akumulacja wielu związków w wakuolach komórkowych, co sprawia że aby je „wydobyć” z komórek, konieczna jest likwidacja hodowli. Jedną z metod pozwalających na uzyskanie wyższego poziomu roślinnych metabolitów wtórnych w kulturach in vitro jest wykorzystanie bakterii z rodzaju Agrobacterium. Są to Gram ujemne patogeny wielu roślin dwuliściennych. W trakcie infekcji bakterie z rodzaju Agrobacterium wprowadzają do komórek rośliny (gospodarza) fragment DNA plazmidowego, który zawiera geny kodujące enzymy biorące udział w syntezie roślinnych regulatorów wzrostu oraz opin, stanowiących źródło węgla dla bakterii. W wyniku transformacji komórki roślinne w miejscu infekcji rosną i dzielą się intensywnie, co prowadzi do utworzenia narośli mającej postać guza lub „brody korzeniowej”, w zależności od gatunku infekującej bakterii (Fig. 2). O ile w rolnictwie czy sadownictwie choroby wywoływane przez Agrobacterium spp. są przyczyną wielu strat, to w roślinnych kulturach in vitro bakterie te stanowią bardzo użyteczne narzędzie w ręku biotechnologa. Przykładem może być wykorzystanie procesu transformacji roślin w kulturach in vitro do produkcji metabolitów wtórnych. W tym przypadku wykorzystuje się szczepy Agrobacterium rhizogenes. W wyniku procesu transformacji, w miejscu infekcji następuje intensywny wzrost licznych, drobnych korzeni zwanych korzeniami włośnikowatymi (Fig. 1, 2). Korzenie takie charakteryzuje niezwykle szybki i nieograniczony wzrost na pożywkach bez dodatku regulatorów wzrostu. Ponadto kultury korzeni włośnikowatych charakteryzuje znaczne zróżnicowanie komórek w porównaniu z hodowlą zawiesinową, co sprzyja zwiększonej produkcji niektórych metabolitów roślinnych. Dodatkowe podwyższenie poziomu produkowanych związków jest możliwe dzięki zastosowaniu transgenicznych szczepów A. rhizogenes, które w fragmencie wprowadzanym do komórki roślinnej posiadają gen/y kodujące enzymy biorące Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia Fig 2. Transformacja roślin w warunkach naturalnych przez bakterie z rodzaju Agrobacterium oraz zastosowanie tego procesu w kulturach in vitro. A. W warunkach naturalnych w wyniku infekcji przez Agrobacterium rhizogenes lub A. tumefaciens do genomu komórek roślinnych przenoszony jest odpowiednio - fragment plazmidu Ri lub Ti. W rezultacie tkanka ulega rozrostowi i tworzą się narośla w postaci brody korzeniowej lub tumorów. B. W kulturach in vitro fragmenty roślin transformowane są za pomocą dzikich szczepów A. rhizogenes lub zmodyfikowanych genetycznie szczepów obu gatunków, które posiadają transgen(y) we fragmencie plazmidu przenoszonym do komórki roślinnej. W wyniku transformacji otrzymuje się kultury korzeni włośnikowanych lub rośliny transgeniczne. www.czasopismolaborant.pl 19 Biotechnologia udział w szlakach metabolicznych wielu ważnych metabolitów wtórnych. Tą metodą dzięki wprowadzeniu genu 6-β-hydroksylazy pochodzącego z Hyoscymus muticus otrzymano kulturę korzeni włośnikowatych Atropa belladonna o wysokiej zawartości hioscyjaminy. W zastosowaniu korzeni włośnikowatych na skalę przemysłową problem jest technologia hodowli tych kultur. Prowadzone są prace nad zastosowaniem specjalnych bioreaktorów, w których korzenie umieszczone na specjalnych siatkach lub drutach, a pożywka dostarczana jest w postaci mgły. Podwyższanie poziomu metabolitów wtórnych w kulturach in vitro Wykorzystując fakt, że produkcja metabolitów wtórnych jest zwykle odpowiedzią rośliny na czynnik stresowy, do poprawienia produktywności kultur roślinnych stosuje się zabieg elicytacji. Polega on na traktowaniu kultur roślinnych elicytorami, czyli związkami lub czynnikami fizykochemicznymi takimi jak: metale ciężkie, promieniowanie UV, enzymy czy składniki ścian komórkowych bakterii i grzybów. W rezultacie w komórkach roślinnych indukowane są szlaki syntezy metabolitów wtórnych mających na celu neutralizację zewnętrznego zagrożenia. Przykładem skutecznego elicytora jest chitozan, pochodna chityny wchodząca w skład ścian komórkowych grzybów oraz kutikuli stawonogów. Poza stymulacją syntezy wielu metabolitów wtórnych należących do naftochinonów, alkaloidów czy terpenoidów posiada on własności polikationitu, przez co wpływa na przepuszczalność błon komórkowych, zwiększając wydzielanie produktów na zewnątrz komórek. Do innych zabiegów technologicznych pozwalających zwiększyć wydajność produkcji w kulturach in vitro należy metoda immobilizacji komórek. Unieruchomienie zawiesiny komórkowej na nośnikach takich jak alginian wapnia, wata szklana czy włókna bawełniane zwiększa zagęszczenie komórek, przez co imitowane są warunki panujące w tkance roślinnej. Komórki immobilizowane są dużo bardziej odporne na stres mechaniczny, dzięki czemu wydłuża się czas kultury i produkcji. Szlaki syntezy wielu ważnych metabolitów wtórnych są wieloetapowe, a biorące w nich udział enzymy katalizują reakcje z różną wydajnością. Wprowadzenie do pożywki hodowlanej prekursora 20 lub intermediatu szlaku metabolicznego, który wytwarzany jest w komórce na niskim poziomie może pozytywnie wpłynąć na zawartość produktu końcowego. Do często stosowanych prekursorów należą: L- fenyloalanina, kwas ferulowy i kwas cynamonowy, należące do szlaku syntezy fenylopropanoidów, który stanowi źródło szeregu roślinnych metabolitów wtórnych. Na wydajność poszczególnych etapów syntezy metabolitów wtórnych ma także wpływ gromadzenie w komórce produktu końcowego, bardzo często toksycznego w wysokich stężeniach. Podwyższony poziom metabolitów wtórnych hamuje ich syntezę w komórce na zasadzie sprzężenia zwrotnego lub stymuluje ich degradację enzymatyczną. Aby przeciwdziałać tym negatywnym efektom oraz ułatwić odzyskiwanie produktu z hodowli roślinnej dodaje się do pożywki żywice jonowymienne (np. Amberlite), na których powierzchni adsorbowane są metabolity wtórne uwolnione poza komórkę. Dzięki temu równowaga szlaków metabolicznych przesuwa się w kierunku syntezy, a jednocześnie produkt łatwo odzyskiwany z wymiennika, poddawany jest wstępnemu oczyszczeniu. Przykładem skutecznego zastosowania polimerowego adsorbentu w kulturach roślinnych jest użycie ciągłej recyrkulacji pożywki przez kolumnę wypełnioną żywicą jonowymienną w hodowli zawiesinowej komórek Duboisia leichardtii powodujące wzrost sekrecji oraz pięciokrotne zwiększenie produkcji alkaloidu - skopolaminy. Rośliny w kulturach in vitro posiadają zdolność do enzymatycznego przekształcania związków podanych egzogennie do podłoża hodowlanego. Umożliwia to otrzymanie z wysoką wydajnością wielu metabolitów występujących na bardzo niskim poziomie lub zupełnie nowych związków nie występujących w naturze. Zastosowanie komórek roślinnych umożliwia wieloetapowe przekształcenie substratów, a także gwarantuje regio- i stereo specyficzność przeprowadzanych reakcji. Kultury zawiesinowe Stewia rebaudiana i Digitalis purpurea są wykorzystywane do przekształcania diterpenu stewiolu do jego glukozydów – stewiozydu i stewiobiozydu, związków 100-krotnie słodszych niż cukier trzcinowy. Niezróżnicowane komórki Digitalis lanata mogą przeprowadzać liczne reakcje modyfikacji egzogennych glikozydów kardenolidowych, mimo iż nie są one zdolne do produkcji żadnego z tych Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia związków. Przykładem jest hydroksylacja digitoksygeniny w hodowli zawiesinowej D. lanata, w wyniku której otrzymuje się digoksygeninę – lek nasercowy o dużo niższej toksyczności niż substrat. Ponadto zaawansowane testy kliniczne prowadzone są na antygenach wirusa HBV oraz wścieklizny, wytwarzanych w roślinach ziemniaka i szpinaku w celu zastosowania ich jako szczepionek jadalnych. Biofarmaceutyki Poza zainteresowaniem roślinnymi metabolitami wtórnymi jako źródłem leków, istnieje rosnące zapotrzebowanie na wysoko przetworzone produkty naturalne zwane biofarmaceutykami. Należą do nich preparaty stosowane do celów diagnostycznych, w lecznictwie (np. leki hormonalne) i profilaktyce (np. antygeny wirusowe wchodzące w skład szczepionek). Biofarmaceutyki, których większość stanowią białka, wykazują zwykle wysoką skuteczność w działaniu. Niestety preparaty takie produkowane w komórkach bakteryjnych są zwykle nieaktywne z powodu braku modyfikacji posttranslacyjnych charakterystycznych dla organizmów wyższych. Alternatywą jest wykorzystanie eukariotycznych systemów ekspresji w postaci hodowli komórek owadzich czy zwierzęcych, jak również transgenicznych zwierząt. Takie rozwiązania niosą jednak ze sobą bardzo wysokie koszty, a także, w przypadku modyfikowanych zwierząt, problemy natury etycznej i prawnej. Ponadto w systemach zwierzęcych istnieje ryzyko przeniesienia wraz z produktem białkowym groźnych dla ludzi patogenów jak wirus zapalenia wątroby typu C czy priony. Z tego względu zastosowanie transgenicznych roślin do produkcji biofarmaceutyków na dużą skalę wydaje się być obiecującym rozwiązaniem. W systemie tym produkcja biomasy jest bardzo ekonomiczna, a oczyszczanie produktu białkowego często może być ominięte, jak to ma miejsce w przypadku roślin jadalnych produkujących białka szczepionkowe. Rewolucję jakiej dokonało wprowadzenie roślinnych systemów ekspresyjnych do produkcji biofarmaceutyków obrazuje fakt, iż technologia ta spowodowała spadek ceny 1 kg przeciwciał monoklonalnych z 3 mln $ do około 100 $. Do tej pory uzyskano wiele roślin transgenicznych produkujących szereg białek ludzkich, antygenów wirusowych czy przeciwciał. Spośród tych produktów najbliższe wprowadzeniu na rynek jest produkowane w roślinach tytoniu przeciwciało skierowane przeciwko Streptococcus mutans – bakterii powodującej próchnicę. Jak ulepszyć pomidora i pozbyć się rtęci z gleby? Jedną z ważniejszych gałęzi „zielonej” biotechnologii jest ulepszanie właściwości odmian uprawnych. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod hodowli wykorzystujących krzyżowanie roślin i selekcję, obecnie dysponujemy licznymi narzędziami umożliwiającymi usprawnienie oraz większą kontrolę tego procesu. Jedną z nich jest tworzenie odmian transgenicznych poprzez wprowadzenie genu z innego gatunku lub modyfikację stopnia ekspresji genu istniejącego. Do tej pory otrzymano liczne odmiany roślin użytkowych posiadające przewagę nad tradycyjnymi wariantami w zakresie odporności na patogeny, pestycydy, tolerancji na metale ciężkie czy jakości otrzymywanego produktu. Pierwszą zmodyfikowaną genetycznie rośliną, wprowadzoną na rynek w 1994 roku, była odmiana pomidora o nazwie „Flavr-Savr”, o obniżonej aktywności genu kodującego pektynazę, co skutkowało spowolnionym procesem dojrzewania owoców i umożliwiło wydłużenie okresu ich przechowywania. Obecnie większość areału upraw transgenicznych na świecie zajmują rośliny posiadające cechy odporności na herbicydy o sze- www.czasopismolaborant.pl Reklama 21 Biotechnologia rokim spektrum takie jak Roundoup (glifosat), a także, odporności na owady dzięki obecności genu kodującego toksyczne białko Cry pochodzącego z bakterii Bacillus thuringensis. Ponadto prowadzone są badania nad odmianami o zmodyfikowanej zawartości skrobi, mikroelementów, witamin, a także o obniżonej zawartości kofeiny czy białek alergennych. Transgeniczne rośliny tworzą również obiecującą perspektywę dla fitoremediacji, procesu polegającego na wykorzystaniu roślin do usuwaniu szkodliwych związków ze środowiska. Najczęściej stosowane są do tego celu geny pochodzące z mikroorganizmów, które są naturalnie zdolne do degradacji toksyn lub redukcji jonów metali ciężkich. Dzięki wprowadzeniu zmodyfikowanego genu MarA z Escherichia coli kodującego reduktazę rtęciową do genomu Arabidopsis thaliana oraz Populus sp., rośliny te uzyskały zdolność do redukcji jonów rtęci obecnych w glebie do rtęci metalicznej uwalnianej następnie do atmosfery. Ponieważ odporność roślin na abiotyczne czynniki stresowe takie jak susza czy zasolenie jest cechą warunkowaną przez liczne procesy metaboliczne, otrzymanie odmiany odpornej za pomocą modyfikacji pojedynczych genów jest niezwykle trudne. W tym celu można zastosować proces selekcji w roślinnych kulturach in vitro, a warunkiem jej skuteczności jest istnienie zmienności w obrębie puli testowanych genotypów. Roślinne kultury kalusa czy zawiesiny komórkowej charakteryzują się wysokim poziomem mutacji spontanicznych, niespotykanym w warunkach naturalnych w roślinach, wynikających głównie z szybkiego tempa podziałów komórkowych. Traktując kulturę kalusa Cuccumis sativus filtratem z kultury grzyba Fusarium oxysporum uzyskano odmianę odporną na tego patogena, natomiast hodowla kalusa Nicotiana tabacum na pożywce zawierającej wysokie stężenie NaCl umożliwiła wyselekcjonowanie roślin odpornych na zasolenie. Dodatkowo, aby zwiększyć zmienność w kulturze in vitro, a tym samym poprawić wydajność selekcji, stosuje się mutagenezę z użyciem czynników fizycznych (np. promieniowanie UV) lub chemicznych (np. nitrozo -guanidyna). Inną metodą pozwalającą na tworzenie nowych odmian roślin o unikatowych kombinacjach cech jest hybrydyzacja somatyczna. Technika ta polega na enzymatycznym usunięciu ścian komórkowych z komórek roślinnych, a w dalszym 22 etapie na fuzji tak wyizolowanych protoplastów z różnych odmian lub gatunków. W ten sposób otrzymywane są mieszańce posiadające nowe kombinacje genomów jądrowych oraz cytoplazmatycznych (chloroplastów i mitochondriów) np. nowe odmiany Brassica napus odporne na patogeny grzybowe czy nicienie, a powstałe w wyniku hybrydyzacji B. napus z protoplastami innych gatunków. Wszystkie wspomniane wyżej modyfikacje roślin w celu otrzymania odmian użytkowych czy też produkcji biofarmacetyków nie byłyby możliwe do osiągnięcia bez opracowania wydajnych metod modyfikacji genomu roślinnego. Jedną z często stosowanych technik jest wprowadzanie transgenów do komórek roślinnych z użyciem wspomnianych już bakterii z gatunku Agrobacterium jako wektorów. Szczepy wykorzystywane do transformacji posiadają zmodyfikowany plazmid Ti, w którym interesujący gen wraz z genem umożliwiającym selekcję umieszczone są w rejonie przenoszonym do komórki w trakcie infekcji. Innym wektorem do transformacji są zmodyfikowane wirusy roślinne np. wirus mozaiki tytoniu, stosowane do indukowania przejściowej ekspresji transgenu w rozwiniętych roślinach. Modyfikacji genomu roślinnego można także dokonać za pomocą metod bezwektorowych takich jak transformacja roślinnych protoplastów z użyciem elektroporacji czy glikolu polietylenowego, a także coraz powszechniej stosowane mikrowstrzeliwanie polegające na wprowadzaniu do komórek mikronośników opłaszczonych DNA. Zaletą techniki mikrowstrzeliwania jest możliwość wprowadzania transgenu do organelli komórkowych, a także stosowania jej praktycznie do wszystkich typów tkanek. Człowiek od wieków zależał od roślin, które stanowiły źródło pożywienia, budulec, a także źródło leków, natomiast dynamiczny przyrost liczby ludności oraz zmiany kulturowe wymusiły zmiany w podejściu do wykorzystania tej części zasobów naturalnych. Rozwój najnowszej biotechnologii umożliwia zmniejszenie negatywnego wpływu na środowisko pochodzącego z intensyfikacji produkcji rolnej wynikające z odpowiedniego kształtowania predyspozycji genetycznych hodowanych odmian. Osiągnięcia tej dziedziny pozwalają także na pełniejsze wykorzystanie potencjału roślin w takich gałęziach gospodarki jak przemysł farmaceutyczny czy kosmetyczny. Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia Modyfikacja genetyczna zwierząt – wybór czy konieczność? Patrycja Koszałka Zakład Biologii Komórki, Katedra Biotechnologii Medycznej Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG i GUMed Gdański Uniwersytet Medyczny Ludzkość zawsze była zainteresowana kontrolowaniem cech fenotypowych (ogół cech organizmu mających podłoże genetyczne modyfikowanych przez wpływy środowiska) zwierząt jak np. masy ciała i jakości mięsa u zwierząt rzeźnych, prędkości biegu u konia czy ilości i wielkości jajek składanych przez kury. Także w przypadku zwierząt domowych jak np. psów, kotów czy myszy, dzięki czemu powstały ich stałe rasy, znacząco różniące się cechami fenotypowymi między sobą i to nie tylko wyglądem ale także takimi cechami jak podatność na niektóre schorzenia czy agresywność. Od tysięcy lat pożądane cechy były selekcjonowane i rozprzestrzeniane w populacji poprzez staranne krzyżowanie wybranych par rodzicielskich. Zwykle polegało to na selekcjonowaniu cech już występujących w populacji, ale których natężenie nie było stałe i charakteryzowało się rozkładem Gaussa w populacji. W ten sposób można było utrwalić cechy rzadko występujące w populacji a pożądane np. krzyżując świnie o najszybszym przyroście masy ze sobą lub największych psów w stadzie. Często jednak polegało to na selekcjonowaniu spontanicznych mutacji, które od czasu do czasu pojawiają się w po24 pulacji. Takie mutacje jeśli były użyteczne lub po prostu wyglądały interesująco hodowcy starali się utrzymywać w populacji. Jako przykład użytecznej mutacji można tu podać odmianę bydła zwaną belgijską błękitną (Belgian Blue) będącą rasą mięsną (dochodzą do 2 ton masy) ze względu na tzw. ‘podwójne umięśnienie’ wynikające z mutacji w genie miostatyny, genie, którego produkt odpowiedzialny jest za ograniczenie przyrostu mięśni. Jako interesującą mutację ze względów estetycznych można wskazać tutaj mutację związaną z prawidłowym formowaniem sierści u rasy kotów Cornish Rex. Jednakże czasami częstotliwość spontanicznych mutacji była dla hodowców niewystarczająca i stosowali oni mutageny chemiczne lub fizyczne. Przykładem jest tutaj uzyskanie szczepu myszy o czarnym ubarwieniu (nonagouti) za pomocą mutagenu chemicznego. W ciągu tysiącleci w wyniku selektywnego krzyżowania uzyskano olbrzymią różnorodność ras zwierząt hodowlanych i domowych. Jednakże ta nadmierna specjalizacja ras zwierząt doprowadziła do licznych zaburzeń rozwojowych. Selektywne krzyżowanie pozwoliło na utrzymanie w populacji niepożądanych cech feno- typowych, których loci są sprzężone z loci cech pożądanych i zgodnie z teorią dziedziczenia Morgana ulegają wspólnemu przekazaniu do potomstwa. Dla ras kur, których selektywne krzyżowanie oraz wyselekcjonowanie spontanicznych mutacji trwa już 10 tysięcy lat dzięki czemu uzyskaliśmy rasy zdolne składać 300 jaj rocznie, daje to jednocześnie znacząco zwiększoną agresywność tych zwierząt (nie jest to jedynie efekt hodowania na niewielkiej powierzchni), postępującą degenerację kości czy też zaburzenia układu immunologicznego. Rasy bydła o zwiększonej mleczności mają zwiększoną podatność na zakażenia bakteryjne prowadzące do zapalenia wymion oraz zwiększoną podatność na spontaniczną aborcję (5% płodów ulega aborcji do 40 dnia ciąży) oraz posiada słabsze potomstwo (10% cielaków umiera w wieku do 10 dni). Rasy mięsne bydła, gdzie można mówić o tzw. „syndromie dużego potomstwa” wymagają interwencji weterynaryjnej przy porodzie. A wspomnieć jeszcze trzeba o odwrotnej korelacji między tempem wzrostu a płodności zwierząt, czyli im masa danej rasy szybciej przyrasta tym są one mniej płodne. Zabrnęliśmy więc już w ślepą Laborant Nr 2/2011 www.czasopismolaborant.pl Reklama uliczkę selekcji, zwłaszcza w przypadku zwierząt hodowlanych i należy zamienić metody tak by móc uzyskać takie zwierzęta, które zaspokoją ciągle wzrastający popyt populacji ludzkiej na produkty odzwierzęce. Kolejnym krokiem naprzód może być więc modyfikacja genetyczna zwierząt metodami nowoczesnej biotechnologii. Nie będzie to znacząca zmiana kierunku, bo jak widzimy genetyczne modyfikowanie zwierzęta towarzyszą nam już od tysięcy lat, jedynie nie są to modyfikacje wprowadzone w zamierzony sposób przez nas a zmiany przypadkowe, niekontrolowane, mogące być zarówno pożyteczne jak i wręcz szkodliwe, zarówno w przypadku mutacji spontanicznych jak i zastosowania przez nas mutagenów chemicznych lub fizycznych. Inżynieria genetyczna pozwala nam na wprowadzenie pożądanej cechy do genomu zwierzęcia z dużą wydajnością i pod sporą kontrolą uzyskanych rezultatów. I w tym przypadku zwykle posługujemy się terminem zwierzęta transgeniczne, od transgenu czyli fragmentu materiału genetycznego, który został przeniesiony z jednego organizmu do innego. Fragment ten może zawierać gen kodujący białko lub funkcjonalne RNA i tak być skonstruowany aby po wbudowaniu do genomu ulegać wydajnej ekspresji. Może też zostać użyty do wprowadzenia zmiany w sekwencji genomu np. w wyniku rekombinacji homologicznej, pozwalającej na wymianę fragmentów sekwencji między dwoma cząsteczkami DNA (jak Spektrometria mas proteomika analiza biomarkerów metabolomika farmakologia analiza środowiska Innovation with Integrity Biotechnologia w przypadku procesu crossingover). W tym drugim przypadku, ze względu na niską częstotliwość zajścia procesu rekombinacji homologicznej (zwykle 0,1-10 % wszystkich przypadków rekombinacji) metoda uzyskiwania zwierząt transgenicznych musi pozwolić na wyselekcjonowania komórek w których zaszedł ten typ rekombinacji (są to zwykle metody z użyciem zarodkowych komórek pnia jak i transferu jądrowego). Najpopularniejsze obecnie metody uzyskiwania zwierzęcia transgenicznego, pozwalają na wprowadzenie zmiany w taki sposób, że modyfikacja jest dziedziczona przez potomstwo, a więc modyfikacji zostały poddane także komórki linii płciowej: spermatogonia produkujące plemniki i oogonia, przekształcające się w oocyty. W metodach tych wykorzystujemy modyfikację genetyczną embriona przedimplantacyjnego: zapłodnionej komórki jajowej, moruli czy niezagnieżdżonej jeszcze blastocysty. Na tym etapie jesteśmy w stanie zmodyfikować komórki embriona, które dopiero na dalszych etapach rozwoju embrionalnego przekształcą się w komórki linii płciowej i będą chronione przed możliwymi modyfikacjami przez komórki je otaczające. Dodatkowo takie embriony można wyizolować a następnie przez krótki czas utrzymywać poza organizmem w celu modyfikacji a następnie ponownego wprowadzenia do układu rozrodczego. Aby zmodyfikować taki embrion możemy bezpośrednio do przedjądrza męskiego (jest to haploidalne jądro plemnika, który 26 wniknął do komórki jajowej) zapłodnionej komórki jajowej wprowadzić za pomocą delikatnej szklanej igły nasz materiał genetyczny zawierający transgen i liczyć na to, że ulegnie on wbudowaniu do genomu. Możemy użyć retrowirusa, który ma zdolność wbudowywania się do genomu, jako biologicznego nośnika naszego transgenu i użyć go do zakażenia embriona przedimplantacyjnego. Możemy także użyć zarodkowych komórek pnia, komórek wyizolowanych z wewnętrznej masy blastocysty, które to komórki zwykle utworzyłyby większość embriona a mogą być utrzymywane w hodowli bez utraty potencjału do różnicowania. Takie komórki możemy modyfikować in vitro a następnie wprowadzić ponownie do nowej blastocysty, licząc na to, że połączą się z komórkami wewnętrznej masy i utworzą organizm chimeryczny, częściowo zbudowany z komórek modyfikowanych a częściowo z niezmodyfikowanych. Możemy zmodyfikować także komórkę somatyczną w hodowli in vitro a następnie wprowadzić jej jądro do niezapłodnionej komórki jajowej pozbawionej materiału genetycznego (tzw. ooplast) i pobudzić taką komórkę do podziałów oraz utworzenia embriona przedimplantacyjnego. Są oczywiście także inne metody ale wszystkie one służą uzyskaniu zwierzęcia o wybranej przez nas, pożądanej modyfikacji genetycznej. Są to metody oczywiście kosztowne i pracochłonne. Pytanie tylko czy ten koszt i praca się opłacają? Najbardziej oczywistym za- stosowaniem takich zwierząt transgenicznych jest ulepszenie zwierząt gospodarskich. Czasami są to modyfikacje, których logika jest bardzo prosta jak np. wprowadzenie genu wyrażającego hormon wzrostu łososia do genomu tilapii, karpia, okonia, ostryg, małży czy krewetek. Dla tilapii obecność tego hormonu oznacza znacząco szybszy wzrost (3-11 razy) jak i zwiększoną odporność na zimno. Jednakże co z innymi zwierzętami gospodarskimi, jak krowy i świnie, u których zwiększony przyrost masy oznacza problemy z porodem? Proste podejście czyli wprowadzenie genu wyrażającego ludzki czynnik wzrostu do genomu świni nie tylko znacząco zmniejszyło płodność tych zwierząt ale także zwiększyło ich problemy zdrowotne. Zastosowano więc zupełnie inne podejście. Wyprodukowano transgeniczne świnie mające ekspresję bydlęcej laktoalbuminy zwiększając w ten sposób znacząco stężenie białka w mleku czym uzyskano przyspieszony przyrost masy zwierząt karmionych takim mlekiem (brak „syndromu dużego potomstwa” przy narodzinach takich zwierząt) i zmniejszone problemy zdrowotne. Ale nie tylko przyrost masy może być regulowany, także skład mleka zwierząt w taki sposób, że zostanie on dostosowany do spożycia przez niemowlęta i osoby z zaburzeniami żywienia. Wprowadzenie dodatkowych kopii bydlęcych genów kodujących kazeiny mleka do bydła mlecznego znacząco zwiększyło przyswajalność mleka z układu pokarmowego Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia a w 2009 roku opatentowano metodę uzyskiwania mleka o niskiej zawartości laktozy poprzez genetyczną modyfikację zwierząt. Możemy także zmniejszyć prawdopodobieństwo pojawienia się patogenów w produktach odzwierzęcych oraz sprawić że same zwierzęta będą zdrowsze. Co trzecia krowa mleczna ulega zakażeniu patogenami wywołującymi zapalenie wymion a mleko takiej krowy jest niezdatne do spożycia przez człowieka. W ciągu ostatnich lat wyprodukowano transgeniczne krowy wyrażające lizostafinę rozkładającą peptydoglikany S. aureus, głównego patogenu wywołującego zapalenie wymion jak i krowy wyrażające ludzkie geny kodujące naturalne peptydy przeciwbakteryjne: lizozym i laktoferynę znacząco zwiększające oporność tych zwierząt na to schorzenie. Przy czym poziom lizozymu i laktoferyny zwiększono do poziomu występującego naturalnie w ludzkim mleku. Z innej strony uszkodzenie genu PrP metodami inżynierii genetycznej sprawiło, że tak zmodyfikowane owce stały się oporne na choroby prionowe. I coś dla ekologów: możemy sprawić, że hodowla zwierząt gospodarskich stanie sie przyjaźniejsza dla środowiska. Obe- cnie związki fosforu znajdujące się w przeciekających do gleby i wód gruntowych odchodach zwierzęcych prowadzą do zakwitu alg w zbiornikach wodnych i ich zarastania. Może temu zapobiec hodowla tzw. ‘enviropigs’, transgenicznych świni wyrażających w gruczołach ślinowych fytazę, enzym bakterii pałeczki okrężnicy, który jest w stanie zredukować zawartość związków fosforu w ich odchodach o 75%. Co z bezpieczeństwem takich produktów dla człowieka? Czy może nastąpić horyzontalny transfer wprowadzonych genów między transgenicznymi zwierzętami a człowiekiem Reklama www.czasopismolaborant.pl 27 Biotechnologia np. poprzez pośrednika jaki mi są mikroorganizmy żyjące w układzie pokarmowym i glebie? Opublikowane w tym roku dane nad horyzontalnym transferem genów wykonane w Chinach przy ocenie bezpieczeństwa biologicznego wspomnianych powyżej krów mających ekspresję ludzkiego lizozymu i laktoferyny, wykazały brak tego typu horyzontalnego transferu genów, za pomocą metod o wysokiej czułości jakimi są reakcja PCR i real-time PCR. Koreluje to z innymi pracami analizującymi bezpieczeństwo biologiczne produktów GMO. Produkty te są więc bezpieczne w użyciu. Jednakże nie jest to jedyna możliwość wykorzystania zwierząt genetycznie modyfikowanych. Możemy takie zwierzęta wykorzystać jako bioreaktory do produkcji biofarmaceutyków. Dlaczego wykorzystywać takie zwierzęta jeśli możemy wyprodukować leki w bakteriach, drożdżach, komórkach ssaczych czy owadzich, ostatecznie wyizolować z krwi? Hodowla komórkowa lub bakteryjna musi odbywać się w odpowiednim medium odżywczym, prawidłowo zbuforowanym, o właściwej temperaturze i wolnym od patogenów a na dodatek ciągle wymienianym. Jest to kosztowne. Są białka takie jak np. czynnik IX (lek w hemofilii B) lub białko C (lek przeciwkrzepliwy) wymagające modyfikacji poprzez gamma-karboksylację dla dostatecznej trwałości a taka modyfikacja zachodzi jedynie w komórkach ssaczych, czyli w najkosztowniejszym typie hodowli komórkowej. Problemem w ho28 dowli komórkowej jest także produkcja dużych białek jak np. fibrynogenu (heksamer z 2 zestawów po 3 polipeptydy połączone 29 mostkami dwusiarczkowymi) z dostateczną wydajnością. Natomiast pozyskiwanie białek z ludzkiej surowicy krwi jest nie tylko niebezpieczne ze względu na patogeny (np. wirus HIV) ale nie pokrywa także potrzeb rynkowych. Początkowy wkład kapitałowy w wyprodukowanie zwierzęcia transgenicznego ostatecznie zwraca się w wyniku oszczędności w kosztach pozyskania biofarmaceutyku. W 2006 roku na rynek dopuszczony został pierwszy biofarmaceutyk będący produktem GMO czyli ATryn® - rekombinowana ludzka antytrombina (ATIII) produkowana przez transgeniczne kozy spod promotora dla beta-kazeiny w gruczole mlecznym. Szereg kolejnych biofarmaceutyków czeka na dopuszczenie na rynek jak np. fibrynogen, kolagen, alfa-1-antytrypsyna czy też ludzka hemoglobina produkowana we krwi transgenicznych świń. Innym zastosowaniem są badania podstawowe analizujące funkcję danego genu czy fragmentu genomu. I tutaj jednym z najciekawszych przykładów z ostatnich lat jest tzw. „brainbow mouse”, mysz, która w wyniku modyfikacji genetycznej ma ekspresję różnych zestawów białek fluorescencyjnych w komórkach układu nerwowego. Pozwala to na uzyskanie olbrzymiego zróżnicowania kolorystycznego miedzy poszczególnymi neuronami i umożliwia dokładne prześledzenie procesu rozwoju układu nerwowego i formowania połączeń między neuronami. Zastosowanie to wiąże się wprost z zastosowaniem modyfikacji genetycznej w celu uzyskania zwierzęcych modeli ludzkich chorób. Zwierzęta od dawna były organizmami modelowymi służącymi do analizy etiologii i patogenezy ludzkich chorób i zaburzeń. Jest to możliwe ze względu na pewne podobieństwa między organizmem człowieka a organizmami innych zwierząt co w przypadku niektórych zaburzeń pozwala na użycie zwierząt do badań i przeniesienia wyników na człowieka. Przykładem takiego schorzenia jest genetycznie warunkowana polidaktylia występująca zarówno u ludzi, jak u myszy czy kurczaka. Jednakże wiele występujących u człowieka schorzeń nie ma swoich odpowiedników wśród zwierząt i tutaj rozwiązaniem są transgeniczne organizmy modelowe. Przykładem takiego modelu może być mysi model zwłóknienia torbielowatego (mukowiscydozy). Zwierzęta takie pozwalają dopracować leki i metody terapii przed przystąpieniem do prób klinicznych na chorych pacjentach. Innym zastosowaniem jest np. zwiększenie częstotliwości zapadania na pewne schorzenia, tak by móc testować na nich leki. Przykładem jest pierwsza opatentowana mysz transgeniczna tzw. „oncomouse” lub „Harvard mouse” niosąca onkogen c-myc. Ma dzięki temu tendencję do formowania spontanicznych brodawczaków i jest używana do zarówno testowania leków przeciwnowotworowych jaki i karcinogenności pewnych leków i substancji. Obecnie moLaborant Nr 2/2011 Biotechnologia deli zwierzęcych służących doanalizy karcinogenności czy genotoksyczności leków jest wiele. Jednakże zwierzęce modele chorób człowieka ciągle mają pewne ograniczenia – wyniki mogą zależeć od tła genetycznego zwierząt, środowiska, diety, zakażenia pewnymi patogenami. Jednakże nie można nie docenić wagi dobrze dobranego modelu zwierzęcego w leczeniu chorób człowieka. Kolejnym zastosowaniem może być użycie inżynierii genetycznej do pozyskania odzwierzęcego źródła organów do transplantacji. Ksenotransplantacja organów od np. świni dałaby nam nielimitowane i przewidywalne źródło organów, możliwość starannego zaplanowania operacji, przedoperacyjnego traktowania dawcy lekami, możliwość analizy pod kątem zakażenia patogenami przed pobraniem organu. Jednakże ksenotransplantacja między człowiekiem a dalej spokrewnionymi z człowiekiem zwierzętami niż małpy człekokształtne jest, jak na razie, niemożliwa. Jest to przede wszystkim efekt nadostrego odrzucenia przeszczepu – reakcji związanej z układem dopełniacza, białkami znajdującymi sie w naszej krwi i zdolnymi do utworzenia tzw. kompleksu atakującego błonę, który powoduje martwicę przeszczepionej tkanki w ciągu kilku minut od przeszczepu. Można oczywiście z krwioobiegu człowieka usunąć białka dopełniacza jednakże są to zwykle zbyt drastyczne metody dla osób oczekujących na przeszczep (np. użycie jadu kobry). Rozwiązaniem jest więc taka modyfikacja świni, by jej organy nie były odrzucane jako obce gatunkowo narządy. Częściowym rozwiązaniem zastosowanym przez firmę Imutran było wprowadzenie do genomu świń ludzkiego genu kodującego DAF www.czasopismolaborant.pl (human decay accelerat ing factor), który jest w stanie rozłożyć białka dopełniacza i zredukować jego aktywność. Innym częściowym rozwiązaniem było usunięcie przez PPL Therapeutics genu alfa-1,3-galaktozylotransferazy świni co daje w efekcie brak antygenu Gal i brak reakcji przeciwciał biorących udział w jednej ze ścieżek aktywacji układu dopełniacza. Alternatywnym podejściem zastosowanym przez Instytut Zootechniki w Balicach było wprowadzenie genu alfa-l,2-fukozylotransferazy (transferazy H) człowieka, konkurującej z alfa-1,3galaktozylotransferazą o ten sam substrat dając w efekcie obniżenie bariery immunologicznej wynikającej z nadostrego odrzucenia przeszczepu. Jednakże choć efekt działania dopełniacza na ksenotransplant został w ten sposób zminimalizowany, ciągle nie jest to efekt wystarczający do zastosowania ksenotransplantacji w klinice. Dodatkowym problemem może być także przeniesienie retrowirusów świni na człowieka. Wszystkie metody opracowane do modyfikacji genetycznej zwierząt mogą także zostać wykorzystane w terapii genowej człowieka, która ciągle czeka na dopracowanie i eliminację efektów ubocznych. A także do wielu innych celów jak np. wyprodukowanie rybek – danio pręgowanego, świecących światłem fluorescencyjnym w wodzie zanieczyszczonej metalami ciężkimi i służących jako indykator zanieczyszczenia lub stabilnie świecących światłem fluorescencyjnym służących jako ozdobne rybki akwaryjne. Jak widzimy w genetycznej modyfikacji zwierząt drzemie olbrzymi potencjał, który zaczyna być wykorzystywany dopiero od ostatnich kilkunastu lat. Potencjału tego nie możemy lekceważyć, zwłaszcza przy ciągle wzrastającym zapotrzebowaniu ludzkości na lepsze zwierzęta hodowlane, tańsze i bardziej dostępne leki, nowe terapie, organy do przeszczepów i wiele innych zapotrzebowań obecnych i przyszłych, których rozwiązaniem może być jedynie kolejny krok w modyfikacji genetycznej zwierząt. Do obecnych otaczających nas ze wszystkich stron spontanicznych mutantów, selekcjonowanych przez tysiące lat dołączą zwierzęta transgeniczne ze starannie dopracowaną i sprawdzoną w laboratorium modyfikacją, oraz sprawdzonym poziomem bezpieczeństwa biologicznego. 29 Biotechnologia Nowa technologia Proteon Pharmaceuticals - preparat oparty na bakteriofagach Spółka Proteon Pharmaceuticals planuje wprowadzić na rynek nowoczesny i bezpieczny preparat oparty na bakteriofagach zapobiegający jednej z głównych chorób drobiu – salmonellozie. W Polsce notuje się 20-30 tys. przypadków rocznie zakażeń bakteriami salmonelli u ludzi. Na targach biotechnologicznych BioForum 2010 w Łodzi, spółka zajęła trzecie miejsce w kategorii najbardziej innowacyjnych spółek biotechnologicznych w regionie. Na świecie istnieje kilkanaście firm biotechnologicznych, w których pracuje się nad zastosowaniem bakteriofagów do leczenia chorób zakaźnych – od gruźlicy po salmonellozę. Bakteriofagi były powszechnie stosowane w latach 30 i 40 XX wieku, ale później zostały wyparte przez antybiotyki. Jednak w związku z narastającym problemem antybiotykooporności, bakteriofagi wracają do centrum zainteresowania biomedycyny. Bakteriofagi są bezpieczne dla ludzi, ponieważ nie atakują komórek człowieka. Preparat opracowany przez Proteon Pharmaceuticals będzie stosowany w formie dodatku paszowego. Z dotychczasowych badań wynika, że preparat jest bezpieczny i efektywny. Szansa na sukces rynkowy projektu jest bardzo duża, gdyż podawanie antybiotyków jest obecnie zabronione przez przepisy unijne. Ponadto poza zakazanymi już antybiotykami istnieje alternatywna metoda zwalczania salmonelli z wykorzystaniem szczepionki, ale metoda ta jest droga, gdyż wymaga indywidualnego szczepienia każdej sztuki drobiu. Warto również wspomnieć, że światowy rynek dodatków paszowych to 11 mld Euro, z czego rynek polski szacowany jest na około 225 mln Euro. Spółka opierając się na uzyskanym już doświadczeniu rozpocznie wkrótce badania nad stworzeniem nowego produktu opartego na bakteriofagach. Będzie to biologiczny preparat ochrony roślin zwalczający bakteriozy ziemniaków takie jak czarna nóżka, mokra zgnilizna bulw, czy choroba pierścieniowa. Projekt będzie realizowany we współpracy z Uniwersytetem Rzeszowskim. Spółka zamierza również rozwinąć preparat bakteriowww.czasopismolaborant.pl fagowy zwalczający antybiotykooporne szczepy H. pylori (odpowiadające w przybliżeniu za 80% przypadków choroby wrzodowej żołądka i 90% przypadków choroby wrzodowej dwunastnicy). Pierwotnym celem powołania spółki była komercjalizacja unikalnej, opatentowanej w USA i UE metody badania negatywnego wpływu substancji leczniczych na system odpornościowy człowieka (immunotoksyczności) - Fluorescent Cell Chip (FCC). Metoda ta jest rezultatem dużego międzynarodowego projektu badawczego obejmującego współpracę z naukowcami z Polski, Norwegii, Szwecji i Holandii, którego pomysłodawcą i koordynatorem był Prof. Jarosław Dastych. Technologia ta może służyć do testowania bezpieczeństwa istniejących substancji chemicznych i leczniczych, co pozwoli ograniczyć do minimum ich wpływ na system immunologiczny człowieka. Niestety rynek tego typu usług nie jest jeszcze dostatecznie rozwinięty, głównie z uwagi na brak precyzyjnych przepisów dotyczących testowania immunotoksyczności. Możliwą szansą dla zaistnienia Proteonu w tym segmencie rynku jest oferowanie firmom farmaceutycznym testowania bezpieczeństwa ich leków, co mogłoby być przez nie wykorzystywane jako atut w walce z konkurencyjnymi podmiotami. Metody FCC można wykorzystać także do poszukiwania w bibliotekach chemicznych (należących do koncernów farmaceutycznych) takich substancji chemicznych, które charakteryzowałyby się określonym działaniem na system odpornościowy człowieka. Umożliwiłoby to stworzenie znacznie bezpieczniejszych i efektywniejszych leków. Pomimo udanej akcji próbnego przeszukania biblioteki chemicznej jednej z krajowych firm farmaceutycznych potwierdzającej skuteczność tej metody, to jednak i na tym polu trudno oczekiwać szybkich decyzji, gdyż rozmowy z koncernami farmaceutycznymi potrafią trwać miesiącami. na podst. materiałów Proteon Pharmaceuticals 31 Biotechnologia Na tropie ukierunkowanej syntezy białek Piotr Hildebrandt Blirt S.A. Białka to makrocząsteczki zbudowane z kilkuset reszt aminokwasowych połączonych ze sobą w określonej kolejności, posiadających zorganizowaną strukturę przestrzenną, niekiedy zmodyfikowanych poprzez przyłączenie łańcucha węglowodanów. Mogą one pełnić szereg różnych funkcji m.in.: być biokatalizatorem, cząsteczką sygnalną, bądź terapeutykiem - niejednokrotnie łączącym te obie funkcje. Synteza chemiczna białek, przy obecnym zaawansowaniu technologicznym, jest bardzo trudna, ze względu na ich skomplikowaną budowę. Z tego powodu najczęściej w celu produkcji określonego białka wykorzystuje się wyspecjalizowane narzędzia biologiczne, takie jak: komórki mikroorganizmów, linie komórkowe czy też rośliny lub zwierzęta transgeniczne. Pełnią one funkcję niejako małych fabryk produkujących białka docelowe. Wykorzystanie tych narzędzi umożliwił silny rozwój technik DNA in vitro dzięki opanowaniu konstrukcji plazmidów rekombinantowych będących nośnikami informacji, które można wprowadzić do komórek. Plazmidy rekombinantowe to odpowiednio zbudowane cząsteczki DNA stanowiące przepis na produkcję białka, składające się z promotora, czyli fragmentu DNA pozwalającego na kontrolę biosyntezy, genu – fragmentu DNA niosącego informację o budowie aminokwasowej białka oraz terminatora – fragmentu DNA stanowiącego nakaz zakończenia składania z „cegiełek życia” danego pojedynczego białka. W zależności od samego białka, jak i wydajności procesu jego wytwarzania, stosowane narzędzia biologiczne różnią się przydatnością. Białka, które nie są zmodyfikowane i składają się jednie z reszt aminokwasowych, jak niektóre enzymy, antygeny czy toksyny, są bardzo dobrze wytwarzane przez bakteryjne (np. Escherichia coli) lub/i drożdżowe komórki (np. Pichia pastoris). Natomiast proteiny, takie jak ludzkie przeciwciała 32 monoklonalne, które mają ogromne znaczenie jako substancje czynne leków, mogą być poprawnie wytworzone jedynie przy zastosowaniu ludzkich linii komórkowych takich jak linie komórkowe HEK293. Przy wyborze właściwego narzędzia należy wziąć pod uwagę strategię produkcji samej proteiny. Trzeba zdecydować, czy dane białko ma zostać przetransportowane po biosyntezie przez komórkę na zewnątrz, czy też może pozostać w jej wnętrzu przez cały proces produkcji. W celu ukierunkowania transportu białka stosuje się informacje poprzedzające sam gen, które po biosyntezie znakują białko i są rozpoznawane przez komórkę. Zaletą wytwarzania białka na zewnątrz komórki jest niejednokrotnie łatwiejszy proces jego oczyszczania. Przy takiej strategii stosowane narzędzia biologiczne różnią się zdolnością przeprowadzania transportu. W przypadku, gdy białko docelowe posiada w swej strukturze mostki disiarczkowe powstałe przez dimeryzację grup -SH dwóch cystein, większą zdolnością prawidłowego składania białka cechują się komórki drożdżowe i komórki organizmów wyższych. Zalety i wady dostępnych narzędzi biologicznych do celu biosyntezy białek zostały przedstawione w tabeli 1. Pomimo braku możliwości produkcji białek zmodyfikowanych, jak i słabych zdolności poprawnego składania białek zawierających mostki disiarczkowe w aktywną cząsteczkę, komórki Escherichia coli są jednym z najczęściej wybieranym narzędziem biologicznym do biosyntezy. Za wyborem tego narzędzia przemawia nie tylko krótki czas konieczny od projektu do gotowego białka - gdyż konstrukcja plazmidu i sama produkcja białek odbywa się tutaj najszybciej, ale także cena - gdyż otrzymanie nawet powyżej 10 gram białka z 1 litra hodowli czyni proces opłacalnym. W sytuacji gdy białko docelowe posiada mostki disiarczkowe i nie wymaga obecności właściwej Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia modyfikacji cukrowej, alternatywą dla komórek bakteryjnych w przypadku biosyntezy są komórki drożdżowe. Zawsze wówczas, gdy istnieje tylko szansa na wykorzystanie komórek bakterii lub drożdży do produkcji białka, wybiera się te narzędzia. Przeciwciała monoklonalne, które mają szerokie zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, cechują się wysoką specyficznością rozpoznawania antygenu, fragmentu danego białka, orazwymagają obecności modyfikacji w postaci odpowiednich grup cukrowych. Struktura samych reszt węglowodanowych białka jest w tym przypadku istotna, gdyż decyduje również o immunogenności substancji aktywnej. Dlatego też w takich przypadkach wykorzystuje się unieśmiercone linie komórkowe komórek ludzkich, które produkują te białka na zewnątrz komórki. Zmuszenie tych komórek do ukierunkowanej biosyntezy jest dużo trudniejsze niż w przypadku prokariotycznych układów ze względu na problemy ze stabilnością takich komórek (wówczas gdy dostarczany plazmid funkcjonuje jako cząsteczka autonomiczna) oraz z wydajnością otrzymania stabilnych, wydajnie produkujących linii komórkowych (ze względu na fakt wysokiej organizacji genomowego DNA tych komórek i wyłączenia z użycia dużej części tej informacji genetycznej). W tym przypadku konieczne jest stosowanie odpowiednich protokołów gwarantujących szybką selekcję odpowiedniego klona komórek rekombinantowych. bakterii, aż do komórek ludzkich, wykorzystują jeden język- kod genetyczny. Kod genetyczny zbudowany z czterech różnych par zasad po przepisaniu go na użyteczne w etapie biosyntezy białka cząsteczki matrycowego RNA, zostaje przepisany na strukturę białka poprzez identyfikację kolejno ułożonych po sobie kodonów, zbudowane z trzech par nukleotydów. Jest 64 możliwości różnego ułożenia trzech nukleotydów, ale reszt aminokwasowych budujących białka w organizmach żywych jest 20. Trzy z możliwości wykorzystywane są jako sygnał zakończenia budowy białka z reszt aminokwasowych, natomiast pozostała część jest przypisana do różnych reszt aminokwasowych. Zdolność „interpretacji” tych sygnałów przez komórkę różni się w zależności od organizmu. Można powiedzieć, że występują różne gwary języka, jakim jest kod genetyczny, stosowane przez komórki. Ostatnio opanowanie techniki syntezy genów in silico pozwalają na skonstruowanie plazmidu rekombinantowego niosącego informację o budowie białka we właściwej gwarze, tj. zoptymalizowanej dla danego rozwiązania biologicznego. Wyodrębnianie białka Posiadając mini fabrykę do produkcji białka wykorzystuje się ją do ukierunkowanej biosyntezy według przyjętych założeń. Podobnie jak w przypadku syntez chemicznych, związki chemiczne, białko otrzymane przy pomocy jednego z narzędzi biologicznych nie jest pozbawione zanieczyszczeń. Po wyborze właściwego dla danego białka narzędzia W celu otrzymania czystego preparatu białka biologicznego do biosyntezy należy wziąć pod wykorzystuje się szereg technik separacji takich uwagę także właściwość przepisu, który wpro- jak: separacja na zasadzie sita, ekstrakcja czy techwadzany jest do komórki. Komórki, począwszy od niki chromatograficzne. Niektóre z tych metod Tabela 1. Porównanie narzędzi biologicznych do produkcji białek. www.czasopismolaborant.pl 33 Biotechnologia zostały stworzone specjalnie do celów wyodrębniania tego typu molekuł z mieszaniny. Etap oczyszczania podczas produkcji białka jest jednym z najtrudniejszych. Z tego względu opracowano szereg metod ułatwiających separację jak np. znakowanie białka poprzez dołączenie domeny ułatwiającej ten etap. Domeny te przyłączane są na etapie inżynierii genetycznej - budowania przepisu na białko, w taki sposób, ażeby możliwe było oddzielenie białka docelowego od tej domeny przy zastosowaniu narzędzi biologii molekularnej takich jak specyficzna proteoliza. Wadą tego ułatwienia jest niekiedy pozostałość w białku docelowym pochodząca z domeny oczyszczającej po jej odłączeniu, która może mieć wpływ na aktywność białka. Strategię rozdzielania białek bez takiej domeny opracowuje się w oparciu o narzędzia bioinformatyczne, dostarczające informacji o właściwościach biofizycznych białka, takich jak punkt izoelektryczny czy stopień hydrofobowości. Jednak z reguły konieczne jest przeprowadzenie szeregu doświadczeń optymalizacyjnych w celu dobrania właściwych warunków separacji. Warto wspomnieć, że w celu oczyszczenia białka do poziomu przewyższającego 95% konieczne jest zastosowanie kombinacji metod separacji. Formulacja białek Proteiny przeważnie charakteryzują się niską stabilnością. Niektóre z nich wykazują tendencję do tworzenia agregatów, bądź też podatne są na degradację. Z tego względu żeby zagwarantować stabilność białka, tak aby mogło być wykorzystane w doświadczeniach lub też jako narzędzie, wymagane jest dobranie właściwych warunków roztworu, w którym się ono znajduje. Stosuje się wówczas przyśpieszone testy stabilności, testy zamrażania i rozmrażania, które przeprowadzone przy wykorzystaniu odpowiedniej ilości dobranych warunków i wyrafinowane techniki analityczne jak rozdzielanie chromatograficzne z ciekła fazą ruchomą ze spektrometrią masową, pozwalają na określenie najlepszych składników roztworu do przechowywania. Reklama 34 Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia Biotechnologia na rynku NewConnect – coraz trudniej przekonać inwestorów Blanka Majda Bio-Tech Consulting Sp. z o.o. Rynek NewConnect, prowadzony przez Giełdę Papierów Wartościowych, został stworzny z myślą o inwestorach, którzy akceptują podwyższone ryzyko, w zamian oczekując wysokich zwrotów z inwestycji. Wydaje się zatem, że doskonale pasują tutaj inwestycje w nowatorski sektor biotechnologii. Badania i rozwój firm tej branży wymagają dużych kapitałów, ale jej rozwój pozwala na osiągnięcie krociowych zysków. Science NewConnect uległa diametralnej zmianie. Skąd ten wniosek? Mabion wchodząc na rynek alternatywny miał komfortową sytuację. Jako pierwszy wszedł z biotechnologią - projektem innowacyjnym. Znaleźli się więc inwestorzy, którzy chcieli ten projekt sfinansować. Teraz, każdy następny podmiot wchodzący na giełdę musi przekonać akcjonariuszy, że ma lepszy pomysł na biznes lub proponuje bardziej atrakcyjną wycenę. Wprowadzając Blirt na rynek NewConnect, by pozyskać inwestorów, musieliśmy obniżyć cenę emisyjną akcji wobec pierwotnych założeń. W chwili obecnej akcje Blirt’u są notowane w okolicach ceny emisyjnej. Analizując kurs Blirt’u można zaryzykować stwierdzenie, że popyt ze strony inwestorów na akcje został wyczerpany na etapie oferty prywatnej. W obecnej sytuacji negatywnego senmentu do spółek biotechnologicznych nie widać wzmożonego popytu wtórnego od innych uczestników rynku, którzy inwestują w spółki już notowane – mówi Bartosz Krzesiak, Starszy Analityk Navigator Capital S.A. Obserwując start branży biotechnologicznej na rynku alternatywnym zachwyciła nas jej początkowo wysoka koniunktura. Przykładem i zachętą do wejścia na giełdę stał się ewidentny sukces Mabionu. Spółka, której przewodniczy Maciej Wieczorek, powstała w wyniku współpracy konkurujących ze sobą podmiotów polskiego rynku farmaceutycznego. Celem powstania spółki było wprowadzenie na rynek światowy leków onkologicznych najnowszej generacji. By to osiągnąć Mabion planował pozyskanie z oferty prywatnej kapitału w wysokości 15mln zł. Inwestorzy zaryzykowali, a firma uzyskała wówczas prawie 23mln zł. Od debiutu tej spółki minęło zaledwie kilka miesięcy, a sytuacja w sektorze Life Plan działalności Blirt’u został przygotowany w odpowiedzi na spodziewany wzrost finansowania badań nad nowymi lekami właśnie w formule outsourcingu. Posiadane przez spółkę zaplecze naukowe i technologiczne, w połączeniu z silnym zespołem zarządczym oraz skutecznością z pozyskiwaniu finansowania, powodują, że spółka ma szansę na wysoką pozycję wśród firm o podobnym profilu biotechnologicznym. Ambitne plany nie wystarczyły jednak, by inwestorzy zapłacili za akcje firmy tyle, ile wymagały jej potrzeby kapitałowe. Poprzez przeprowadzenie prywatnej oferty akcji spółka spodziewała się pozyskać 15-25mln zł. Ostatecznie wartość emisji wyniosła 9,6mln zł. Polski NewConnect rozpoczął działalność w sierpniu 2007 r. choć podobne rynki działają w zachodnich krajach od dawna. Zarówno światowy lider rynków alternatywnych amerykański NASDAQ jak i najbardziej znany w Europie londyński AIM, doprowadziły zachodnie firmy biotechnologiczne na sam szczyt. Polska, pomimo, że posiada ogromny potencjał naukowy i stale rozwijający się rynek nowych produktów i usług, musi ciężko pracować by przekonać inwestorów do finansowania innowacyjnych przedsięwzięć. www.czasopismolaborant.pl 35 Biotechnologia Identycznie sytuacja zdaje się wyglądać w przypadku Selvity. Obie firmy mają hybrydowy model biznesowy i podobną strategię. Z jednej strony stawiają na innowacyjność i rozwój własnych projektów badawczo-rozwojowych, z drugiej działają na zasadzie outsourcingu, świadcząc usługi podmiotom zewnętrznym. Selvita to największy w Polsce zespół pracujący nad innowacyjnymi cząsteczkami. Ogromne, w skali polskich możliwości, przychody spółki, stawiają ją w pozycji lidera firm innowacyjnych. Pomimo tak wysokiej pozycji, również na akcje Selvity zabrakło chętnych. Zarząd zdecydował więc o przeprowadzeniu oferty prywatnej, a nie publicznej jak wcześniej planowano. Za tę samą ilość akcji, której wartość wcześniej spółka oszacowała na 40mln zł, teraz spodziewa się max 20mln zł. Selvita nie ma także akcjonariusza, który mógłby w dowolnym momencie wesprzeć firmę finansowo. Taką rolę z pewnością spełniłby Marian Popinigis wobec Blirt’u. Warto zwrócić również uwagę na bardzo szeroką gamę usług Selvity. Z jednej strony jest to doskonały sposób na współpracę z wieloma ośrodkami w Polsce, z drugiej jednak, nasuwa się sugestia, że oferując tak wiele, firma nie specjalizuje się w niczym konkretnym. Właśnie brak przełomowej technologii może zastanawiać potencjalnych inwestorów. Zarówno Blirt jak i Selvita prowadziły rozmowy z inwestorami na przełomie grudnia i stycznia. Wtedy to oferta Blirtu okazała się bardziej atrakcyjna i zyskała uznanie inwestorów, ale kosztem obniżenia ceny emisyjnej akcji. Sytuacja rynkowa w jakiej Selvita będzie prowadziła emisję akcji na pewno nie będzie czynnikiem sprzyjającym. Kursy akcji spółek z indeksu NCX Life Science spadły od początku 2011 r. średnio o ok. 15%. Inwestorzy biorący udział w ofertach prywatnych spółek innowacyjnych to przede wszystkim inwestorzy długoterminowi, którzy decyzje inwestycyjne podejmują na podstawie informacji ze spółki o kolejnych etapach realizowanych projektów. Można więc przypuszczać, że obecne spadki kursów akcji wynikają głównie z aktywności inwestorów indywidualnych, którzy zwyczajowo mają krótszy horyzont inwestycyjny. Inwestorzy finansowi mogą się obawiać kolejnych inwestycji w ryzykowną branżę i się wycofać, ale skoro zdecydowali się na działalność w biotechnologii, nie mogą pozwolić sobie na brak udziałów w firmie będącej liderem rynku. W mojej ocenie sukces emisji akcji Selvity będzie w dużej mierze uzależniony od elastyczności zarządu w podejściu do wyceny spółki w rozmowach z inwestorami – mówi Bartosz Krzesiak. Reklama Użytkownicy portalu Najlepsze Statystyki Management firm sektora BioBiznesu, Inwestorzy i Prawnicy, Managerowie i Pracownicy działów badawczo-rozwojowych (R&D) i marketingu, Przedstawiciele firm biosektora, Przedsiębiorcy, Środowisko naukowe, Doktoranci i Studenci. Ponad 40 tys. użytkowników i 160 tys. wejść na portal w skali miesiąca! Więcej niż 10 tyś. subskrybentów największej branżowej bazy newsletterowej! Biotechnologia.pl Lider mediów o tematyce innowacyjnego BioBiznesu. Jedyny portal o tak bogatym i specjalistycznym przekazie informacji branżowych i pełnej ofercie biznesowej dla firm biosektora. Specjalistyczna platfo rma informacyjno-bizneso wa Twój zaufany partner w BioBiznesie Wydawca Portalu: Bio-Tech Consulting Sp. z o.o. tel.: + 48 42 299 60 83, GSM: + 48 664 461 606 e-mail: [email protected] JE D EN P O R TA L D WA O B LI C Z A Biotechnologia * Farmacja * Kosmetologia * Żywność * BioEnergia * BioBi znes ww w.b iot ech nol ogi a.p l 36 Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia Kolejnym przykładem złej sytuacji na NewConnect dla rynku biotechnologicznego jest brak odpowiedzi inwestorów na ofertę brytyjskiej spółki Lectus Therapeutics. Grupa Lectus PLC dała możliwość inwestycji w pierwszą biotechnologiczną firmę z Wielkiej Brytanii. Spółka jednego z najbardziej znaczących europejskich ośrodków biotechnologicznych, liczyła na zainteresowanie zarówno ze strony inwestorów instytucjonalnych, jak i indywidualnych. Firma planowała strategię rozwoju nowej generacji lecznictwa walki z bólem, wykorzystującej do tego celu kanały jonowe, za pomocą bardzo strzeżonej technologii LEPTICS. Oferta Lectusa nie doszła do skutku chociaż model finansowy przypominał częściowo ten zaproponowany przez Mabion. Lectus specjalizuje się w opracowywaniu leków na ból neuropatyczny i inne zbliżone dolegliwości w oparciu o kanały jonowe. Niepowodzenie tej oferty wskazuje, że popyt na projekty biotechnologiczne jest niestety ograniczony – podkreśla Bartosz Krzesiak. Patrząc na tę sytuację, przyczyny ograniczonego popytu na akcje spółek biotechnologicznych moglibyśmy doszukiwać się we wzroście konkurencji i ilości podmiotów poszukujących obecnie finansowania. Jednak polski NewConnect charakteryzuje się zdecydowanie niewielką ilością podmiotów life-science. Gdyby chodziło tutaj wyłącznie o ceny akcji konkurencyjnych spółek, to akcje Blirt’u, która obecnie zdaje się być najtańsza, cieszyłyby się dużym zainteresowaniem, a niestety tak nie jest. Jeśli popatrzymy na rynek spółek biotechnologicznych to w ich akcjonariacie nie ma żadnego inwestora finansowego wyspecjalizowanego w inwestycjach w tej branży. Nie mamy w Polsce inwestorów, którzy na podstawie doświadczenia i wiedzy o biotechnologii mogliby ocenić, które spółki mają lesze perspektywy w stosunku do innych. Obecnie wydaje się, że inwestorzy podchodzą do firm innowacyjnych w sposób portfelowy. Jeżeli notowanych jest 6 spółek, to inwestują w każdą z nich, mając nadzieję, że przynajmniej jeden z tych podmiotów osiągnie sukces. www.czasopismolaborant.pl Dodatkowy problem stwarza firmom biotechnologicznym brak możliwości pozyskania kapitału z wyspecjalizowanych funduszy Private Equity czy Venture Capital, których po prostu w Polsce jeszcze nie ma. Można zatem zaryzykować stwierdzenie, że obecnie rynek NewConnect pozostaje jedynym źródłem finansowania projektów w tej branży – dodaje Bartosz Krzesiak. Przedstawiona powyżej sytuacja na rynku NewConnect niczego nie przekreśla. Mimo wskazanej bariery w pozyskiwaniu środków finansowych, zainteresowanie inwestorów biotechnologią wzrasta z roku na rok. Kolejne spółki z tej branży przygotowują się do debiutu na rynku alternatywnym. Biotechnologia w Polsce dopiero się rozwija, ale potencjał badawczy polskich naukowców oraz coraz większa współpraca tych środowisk z biznesem, pozwala wierzyć, że to właśnie Polska osiągnie sukces w międzynarodowym środowisku BioBiznesu. Portfel indeksu NCX Life Science (Stan na 14 kwietnia 2011) * na podstawie ostatnich 20 sesji ** kurs ostatniej transakcji *** zmiana procentowa kursu ostatniej transakcji w stosunku do kursu odniesienia **** iloczyn zmiany procentowej kursu i udziału instrumentu w portfelu indeksu Wykres indeksu NCX Life Science (Od 2010-08-30 do 2011-04-14) 37 Biotechnologia Pół wieku syntezy peptydów Wojciech Kamysz Laboratorium Badawczo-Rozwojowe Lipopharm.pl Peptydy i białka należą do biopolimerów z którymi w obecnych czasach wiąże się duże nadzieje aplikacyjne. Fascynacja ta trwa jednak już ponad pięćdziesiąt lat. W roku 1954 została opisana przez Vigneaud’a synteza oksytocyny. Wraz z tym wydarzeniem powstały teorie, że peptydy mogą zastąpić konwencjonalne leki. Obecnie roczna produkcja leków peptydowych (z wyłączeniem insuliny) sięga około jednej tony. Insulina produkowana jest w ilości około 20 ton rocznie, przez dwóch światowych gigantów Novo Nordisc (Dania) oraz Eli Lilly (USA). Wynika z tego, że rynek leków peptydowych poza insuliną jest bardzo ubogi. Dzieje się to głównie za sprawą problemów z jakimi borykają się producenci. Najważniejszym jest wysoki koszt otrzymywania peptydów. Do tego dochodzą poważne problemy ze stworzeniem postaci leku (niska biodostępność, niska trwałość chemiczna i biologiczna), ale i typowe problemy z przechowywaniem leków peptydowych. Odizolowanie produktu (substancji leczniczej lub postaci leku) od niesprzyjających warunków poprzez np. właściwe opakowanie, powlekanie postaci leku (całej lub fragmentów), stosowanie postaci mikrokompartmentowych (liposomy, mikro- i nanokapsułki), stosowanie cyklodekstryn, zmiana stopnia rozdrobnienia nie zawsze pomaga. Czasami najskuteczniejsze okazuje się stosowanie substancji pomocniczych gwarantujących trwałość, stosowanie inhibitorów enzymów (np. inhibitorów proteaz), przeciwutleniaczy (kwas askorbinowy, askorbinian sodu, glutation, tiosiarczan sodu), czy modyfikacja struktury związków chemicznych (zastosowanie aminokwasów w konfiguracji D zamiast L). Synteza na nośniku stałym Synteza na nośniku stałym ma niespełna 50 lat. Powszechnie znane podejście, nazywane od nazwiska twórcy metodą Merrifielda, posiada wiele 38 zalet, dzięki którym peptydy w obecnych czasach syntezuje się stosunkowo szybko, często z wykorzystaniem urządzeń, zwanych syntezatorami peptydów. Pierwsze tego typu urządzenia powstały już w latach 60-tych. Technika syntezy z wykorzystaniem nośników polega na przyłączeniu do nierozpuszczalnego w fazie organicznej polimeru substratu, do którego dobudowuje się kolejne segmenty, aminokwasy. Sam nośnik wcześniej jednak specjalnie przygotowuje się celem uzyskania odpowiedniego linkera, do którego przyłącza się pierwszy z aminokwasów. Linker jest ugrupowaniem chemicznym łączącym nierozpuszczalny Laborant Nr 2/2011 Biotechnologia polimer z pierwszym przyłączanym aminokwasem. Gwarantuje trwałość połączenia w trakcie syntezy oraz łatwe odszczepianie zbudowanego peptydu podczas deprotekcji gotowego produktu. Synteza na nośniku stałym ma olbrzymie zalety, dzięki którym w ostatnich latach gwałtownie rozwinęła się synteza organiczna różnorakich molekuł, począwszy od biopolimerów takich jak kwasy nukleinowe, oligo- i polisacharydy, kończąc na związkach niskocząsteczkowych. Nadmiar nieprzereagowanych substratów z łatwością odmywa się w specjalistycznych naczyniach, zwanych powszechnie naczyniami Merrifielda. Podejście Cl P Cl wykorzystaie ortogonalności stosowanych osłon łańcuchów bocznych stosowanych aminokwasów oraz osłony grupy α-aminowej każdorazowo przyłączanego substratu. Już od czasów pionierskich odkryć dotyczących syntez na nośniku do osłony grup aminowych stosuje się osłonę tertbutyloksykarbonylową (Boc). Ugrupowanie to odszczepiane zwykle z wykorzystaniem kwasu trifluorooctowego nie należy do osłon chętnie wykorzystywanych w syntezie krok po kroku. Dodatkowo strategia Boc wymaga do odszczepianie peptydów od nośnika ciekłego fluorowodoru. Równolegle w latach 70-tych do syntezy wprowadzono osłonę Fmoc (9-fluorenylometoksy- to pozwala na stosowanie dużych nadmiarów reagentów, minimalizację skali syntezy oraz stosowanie często substratów toksycznych. Wspominana wcześniej możliwość automatyzacji syntezy na nośniku w ostatnim pięcioleciu została wzbogacona w możliwość syntezy w pełni automatycznych syntezatorach mikrofalowych, dzięki czemu procesy kondensacji aminokwasów można przyspieszyć nawet 10 krotnie. Chemia Boc, Fmoc i nic więcej… Chemiczna synteza peptydów opiera się na zastosowanie grup ochronnych. Kluczową sprawą w projektowaniu syntezy jest P O HO P O P Cl Cl HO Cl P P Cl Rys. 1. Przykłady nośników (żywic) do syntezy peptydów. A – Merrifielda, B – Barlosa, C – Wanga CH CH3 3 HC CH H3C 3 CH3 3 O tBu O TFA CH CH3 3tBu TFA O CH O CH3 3 zywica Wanga O CH zywica Wanga O CH3 3 tBu piperydyna piperydyna Fmoc Fmoc NH NH H H O O O O NH NH O O tBu NH NH NH NH O O O O O O O O P P TFA TFA Rys. 2. Schemat reakcji podczas syntezy metodą Fmoc. www.czasopismolaborant.pl 39 Biotechnologia karbonylową), która ulega odszczepieniu z użyciem piperydyny. Ze względu na koszt pochodnych aminokwasowych, powszechna stała się ona w laboratoriach dopiero 20 lat później. W obu podejściach syntetycznych stosuje się identyczne środki kondensujące i przeciwracemizacyjne (od 50 lat te same!). Pomimo, że powstają nowe nośniki a katalogi dedykowane laboratoriom peptydowym są pełne „nowości” w gruncie rzeczy opierają się na tych samych linkerach. Ze względów marketingowych nośnikom przypisuje się nadzwyczajne właściwości. W rzeczywistości są to zwykle polimery bazujące na polistyrenie sieciowanym diwinylobenzenem w ilości 0,5-2%. Szacuje się, że żywice oparte o polistyren stanowią 90% wszystkich nośników stosowanych w syntezie organicznej. W praktyce wybór żywicy zastosowanej do syntezy peptydu zależy od struktury syntezowanego peptydu (np. od tego czy syntezowany peptyd ma posiadać wolna grupę karboksylową na C-końcowym aminokwasie, czy też grupę amidową) oraz czy peptydy posiadają krótki, czy długi łańcuch. W przypadku peptydów dłuższych stosuje się nośniki o mniejszym osadzeniu grup funkcyjnych. Oczyszczanie i analiza Oczyszczanie peptydów należy do czynności o dużej trudności. Pozostające w próbce zanieczyszczenia często bowiem są też peptydami o podobnej strukturze. Proces oczyszczania komplikuje często fakt możliwości zmian chemicznych w trakcie przygotowania próbki lub samego 40 rozdziału. Przykładami jest utlenianie wolnych reszt cysteiny do wiązań disulfidowych, cyklizacja N- końcowej glutaminy do kwasu piroglutaminowego czy modyfikacja reszt aminokwasów poprzez przyłączanie się aktywnych pochodnych osłon podczas deprotekcji z nośnika. Pierwszymi sposobami oczyszczania peptydów była klasyczna chromatografia kolumnowa na krzemionce. Szybko jednak została wyparta przez filtrację żelową na złożach Sephadex oraz chromatografię jonowymienną. Do lat 80-tych techniki te były jedynymi sprawnymi sposobami oczyszczania syntetycznych peptydów. Wraz z wprowadzeniem do chemii wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), metody te często mają znaczenie historyczne i młode pokolenie badaczy zajmujących się peptydami nawet ich nie umie. HPLC w układzie faz odwróconych wymaga jednak drogiego sprzętu co powoduje, że w obecnych czasach nie wszystkie zespoły naukowe są zdolne do samodzielnej syntezy i oczyszczania peptydów. Najprostszy chromatograf preparatywny wraz z kolumną kosztuje około 100 tyś PLN. Do tego dochodzi koszt eluentów i materiałów oraz kosztów serwisowania sprzętu, który jest podatny na awarie. Otrzymanie suchej próbki jest realizowane poprzez suszenie sublimacyjne z użyciem liofilizatorów. Kolejnym ograniczeniem jest badanie tożsamości otrzymanych produktów. Zarówno wykonanie analizy aminokwasowej (obecnie odchodzi się od tego) jak i uzyskanie widma masowego wymaga posiadania specjalistycznego sprzętu lub zlecenia drogich analiz specjalistycznym pracowniom. Zdarza się, że po syntezie otrzymuje się kilka produktów i te koszty są jeszcze wyższe. W chwili obecnej największe korzyści przynosi spektrometria mas z jonizacją techniką desorpcji laserowej na matrycy i analizatorem czasu przelotu (MALDITOF). Najnowocześniejsze spektrometry mas posiadają też możliwość określenia sekwencji aminokwasowej oraz przypisania struktury zanieczyszczeniom. Chemia kombinatoryczna i niespełnione nadzieje Możliwość łączenia aminokwasów w różne kombinacje w połączeniu z metodą syntezy na nośniku polimerowym zaowocowała rozwojem chemii równoległej i chemii kombinatorycznej. Do kluczowych podejść należy procedura opracowana w 1984 r. przez Geysena (osadzanie aminokwasów na prętach polietylenowych, które zanurzane są w naczyniach reakcyjnych z odpowiednim aminokwasem), czy rok później opublikowana metoda torebek herbacianych Houghtena (żywica umieszczona w perforowanych torebkach polipropylenowych). Kamieniem milowym mogła okazać się upubliczniona w 1988 r. metoda portioning– mixing Arpada Furki, polegająca na rezygnacji z kontroli sekwencji syntezowanych peptydów i wymagająca wyłącznie sekwencyjnego dzielenia i mieszania nośników wraz z peptydami. Patrząc na liczbę doniesień naukowych związanych z chemią kombinatoryczną faktyczne efekty nie są jednak imponujące. Laborant Nr 2/2011 Internet i komputery Własna strona internetowa Część I Bartłomiej Kraska czasopismolaborant.pl W dobie obecnego rozwoju internetu oraz jego wpływu na cywilizację warto rozważyć możliwość posiadania własnej strony internetowej. Dziś jest to podstawowa forma reklamy każdej działalności gospodarczej, może jednak także przynieść wymierne korzyści dla osób prywatnych. Niniejszy artykuł przedstawi zalety posiadania strony oraz ewentualne przeszkody na drodze jej tworzenia. Pomysł na stronę Pod pojęciem strony internetowej może kryć się zarówno prywatna strona domowa jak i, mniejszy bądź większy portal informacyjny. Strona domowa pozwoli zaczerpnąć informacji o naszych pasjach i sukcesach zawodowych, a także ułatwi kontakt, np. celem podjęcia współpracy naukowej bądź przemysłowej. Dlatego też obowiązkowo należy umieszczać adres poczty elektronicznej, www.czasopismolaborant.pl a w menu nie powinno zabraknąć pozycji z informacjami o zajmowanym stanowisku, tytule naukowym oraz dorobku w postaci spisu publikacji czy osiągnięć. Jeżeli zaś uda się wygospodarować choćby jedną lub dwie godziny tygodniowo to przy szczerych chęciach podzielenia się wiedzą i/lub doświadczeniem, można pokusić się o stworzenie strony informacyjnej lub nawet niewielkiego portalu naukowego. Co ciekawe, wystarczy zaledwie jeden artykuł z zakresu nauk ścisłych lub przyrodniczych, aby w krótkim czasie zaobserwować kilka unikalnych wizyt dzie-nnie. Jeśli zaś artykuł będzie zawierał trudno dostępne informacje to liczba wizyt wzrośnie nawet kilkakrotnie. Obecnie, ze względu na trudność w rozumieniu technicznych zwrotów w językach obcych (nawet dla biegle władających językiem), studenci oraz młodzi naukowcy i pra41 Internet i komputery cownicy chętniej wyszukują polskie artykuły. Cena Stronę internetową możemy mieć oczywiście nie ponosząc absolutnie żadnych kosztów, podobnie zresztą jak pocztę elektroniczną czy konto na portalach społecznościowych. Jednak zgodnie z regułą iż nie ma nic za darmo, za naszą oszczędność przyjdzie nam zapłacić w postaci wyskakujących reklam które są dla nas sponsorem. Wyjątkiem mogą być strony prywatne tworzone na uczelniach, gdzie do póki jesteśmy pracownikami takiej placówki, miejsce na serwerze bez reklamowych niespodzianek na pewno się znajdzie. W opcji bezpłatnej nie możemy jednak liczyć na dowolność wyboru naszej domeny, czyli adresu internetowego który prowadzi do strony. Będzie on zawierał nazwę usługodawcy z którego usług korzystamy. Inne ograniczenia to ilość miejsca na serwerze, limit wielkości plików, dozwolone typy plików czy transfer miesięczny (wszystkie te parametry zostaną wyjaśnione w dalszej części artykułu). W przypadku gdy jesteśmy w stanie wydać kilkadziesiąt (lub kilkaset) złotych na stronę, możliwości staną się praktycznie nieograniczone. Za utrzymanie domeny przyjdzie nam zapłacić rocznie od około 50 – 100 PLN netto, przy czym pierwszy rok jest zwykle całkowicie lub prawie darmowy. Natomiast przyzwoity serwer to koszt minimum kilkadziesiąt złotych – w przypadku prostej strony, kilkaset dla bardzo rozbudowanych strony (a nawet kliku, a serwer zawsze można współdzielić ze znajomymi) do kliku tysięcy jeśli mamy zamiar postawić wielki portal internetowy. w korespondencji elektronicznej, np. w celach konsultacyjnych może spowodować jej przechwycenie i automatyczne zarejestrowanie przez szpiegujące strony internetowe które mamy otwarte wraz z pocztą w przeglądarce internetowej. Dostępność wymyślonej przez nas nazwy możemy sprawdzić na stronach usługodawców, wpisując ją w wyszukiwarkę domen. Raz wybranej nazwy nie powinno się zmieniać dlatego że wszelkie osoby które nas odwiedziły, będą nas ponownie szukać w tym samym miejscu. Jeśli jednak zmiana jest nieunikniona to powinniśmy zachować starą domenę na co najmniej rok, i umieścić na niej informację o przeniesieniu strony. Jeśli nasza strona była popularna to możemy mieć pewność że po porzuceniu starej domeny, szybko znajdzie się jej nowy właściciel. Może ona bowiem pozostać w niektórych wyszukiwarkach oraz notatkach pewnych osób, trafią na nową stronę szukawszy naszej. Wybór serwera Każdy serwer charakteryzuje kilka parametrów ściśle zależnych od jego ceny. W przypadku prostej strony domowej lub informacyjnej to właściwie można je zignorować i wybrać najtańszą opcję. Natomiast jeżeli zapragniemy rozbudowanej galerii, forum dla szerszej ilości internautów lub portal informacyjny, parametry serwera mają istotny wpływ na nasz wybór. Do najważniejszych należy zaliczyć ilość miejsca na serwerze które zajmie strona, umieszczone załączniki, pliki do pobrania oraz poczta w naszej domenie (o ile chcemy taką posiadać); transfer miesięczny/roczny czyli ilość danych pobranych do i wysłanych z serwera (głównie na pobieranie strony przez odwiedzających oraz pocztę przychodzącą i wychodzącą) oraz możliwość zakładania baz danych. Ten ostatni pozwala na zakładanie stron, których modyfikowanie i zmiana zawartości nie wymaga żadnej wiedzy o tworzeniu stron. Przekroczenie któregokolwiek z parametrów może skutkować zablokowaniem strony na jakiś czas lub skróceniem okresu rozliczeniowego który zwykle trwa jeden rok, i potrzeby uiszczenia opłaty za przedłużenie abonamentu znacznie szybciej. Wybór domeny Warto zatroszczyć się aby nazwa domeny była łatwa do zapamiętania. Zapewni to niewątpliwie wzrost odwiedzin. Zadanie to może się jednak okazać trudne gdyż rejestracja domen trwa już od bardzo dawna i zdecydowana większość prostych nazw czy choćby nazwisk jest już zajęta. Dodatkowo od jakiegoś czasu istnieją firmy specjalizujące się hurtową rejestracją za grosze ciekawie brzmiących domen aby je później odsprzedać z zyskiem za niemałe kwoty. Dlatego też nie warto Wykonanie strony O wykonanie strony możemy pokusić się sami, chwalić się nikomu jaką domenę chcemy nabyć do póki tego nie zrobimy, bo ktoś może nas w tym o ile dysponujemy większą ilością wolnego czasu. uprzedzić. Również umieszczanie takich nazw W Internecie nie trudno znaleźć poradniki i kursy 42 Laborant Nr 2/2011 Stowarzyszenie „Wolna Przedsiębiorczośd” zaprasza do udziału w bezpłatnych szkoleniach z zakresu biotechnologii: Metoda PCR do diagnostyki patogenów w produktach biotechnologicznych, Metoda Real-time PCR w diagnostyce, Analiza substancji z wykorzystaniem metody HPLC. Walidacja metody, HPLC - komputerowa optymalizacja metody oraz analiza danych statystycznych, Wykorzystanie metody HPLC do porównywania produktów, Spektrometryczne metody analityczne – kontrola jakości, Toksykologia in vitro – alternatywa dla doświadczeo na zwierzętach, Wykorzystanie metod elektrochemicznych do wykrywania związków w produktach spożywczych. Szkolenia: skierowane są do pracowników mikro-, małych i średnich firm. Szczególnie serdecznie zapraszamy kobiety i osoby w wieku 45+. będą miały praktyczny charakter (zapewniamy specjalistyczny sprzęt i niezbędne odczynniki), trwają po 2 dni (16 godzin), są bezpłatne (zapewniamy noclegi, wyżywienie, materiały, zaświadczenie o ukooczeniu szkolenia). Szczegóły i zapisy: Stowarzyszenie „Wolna Przedsiębiorczośd” Oddział Terenowy w Gdaosku ul. Piekarnicza 12a, 80-126 Gdaosk tel. 58 751 40 13, 58 751 40 02 e-mail: [email protected] www.swp.gda.pl Projekt „Szkolenia dla MSP z zakresu metod biotechnologicznych” jest współfinansowany przez Unię Europejską w ramach środków Europejskiego Funduszu Społecznego. Internet i komputery tworzenia takich stron. Dodatkowo możemy skorzystać z bazy darmowych, gotowych szablonów, dostępnych w sieci. Warto choćby w tej chwili wejść na strony www.opendesigns. org oraz www.joomla24.com i zapoznać się z bogatą ofertą zachwycających wyglądem i profesjonalizmem gotowych szablonów, które wystarczy tylko uzupełnić własnymi informacjami. Nierzadko chęć posiadania własnej strony zostaje wyindukowana po odwiedzeniu właśnie takiego miejsca. Natomiast za kwotę rzędu 29-65 USD możemy stać się właścicielami szablonów Premium, które są na jeszcze wyższym poziomie, np. www.templatemonster.com. W przypadku braku czasu wykonanie strony można powierzyć firmie lub znajomym, o których dziś nie trudno. Za taką usługę przyjdzie nam zapłacić w profesjonalnej firmie czterocyfrową sumę, i to nie koniecznie tą najniższą, natomiast u osoby prywatnej… zwykle tyle samo. O ile firmę da się zrozumieć, gdyż od tej kwoty musi odliczyć VAT, podatki, ZUS, ubezpieczenie, i pokryć jeszcze inne koszty działalności gospodarczej, plus krótkie terminy realizacji i gwarancja poprawnego działania, o tyle wynagrodzenie samodzielnych twórców nie zawsze jest do końca uczciwe, gdyż można się spodziewać że skorzysta z darmowego szablonu (lub Premium), podda niewielkiej modyfikacji, wstawi zawartość, a całość zajmie tylko jeden wieczór. Administrowanie stroną Posiadając już stronę będziemy zapewne potrzebować uaktualniać co jakiś czas zawartość. Aby ta czynność nie przysparzała zbyt wiele trudu należy zadbać aby strona wykonana została w oparciu o system zarządzania treścią (w skrócie CMS - Content Managment System). Każdy CMS posiada tzw. zaplecze administracyjne (zwane również panelem administracyjnym), w którym po zalogowaniu otrzymujemy pełną władzę nad stroną, bez szczególnej wiedzy o tworzeniu stron, i z każdego komputera z dostępem do Internetu. Za pomocą formularzy przypominających popularne programy tekstowe oraz szeregu pól i opcji możemy tworzyć bądź usuwać pozycje w menu oraz modyfikować podstrony. Również i w tym przypadku możemy skorzystać z usług osób trzecich. Powinniśmy wtedy jednak zażądać pełnej informacji o stawce oraz maksymalnym terminie realizacji zmian od czasu 44 otrzymania nowych materiałów. Trudno tutaj o jakiś ujednolicony cennik. Na pewno za nie więcej jak jedną drobną zmianę w ciągu miesiąca, wynagrodzenie nie powinno przekroczyć 100PLN, natomiast za gwarancję szybkich zmian gdy takie są potrzebne (np. aktualizacja w ciągu maksymalnie 24 godzin od przesłania materiałów drogą elektroniczną) dwukrotność tej kwoty. Nie do rzadkości należą jednak przypadki gdzie administratorzy pobierają wielokrotnie większe sumy, nie wprowadzając absolutnie żadnych zmian w ciągu nawet roku! Spowodowane jest to zwykle wykorzystaniem niewiedzy właściciela strony, któremu można wmówić skomplikowanie procesu aktualizacji. Dzieje się tak też często gdy ta sama osoba sporządzi nam stronę w taki sposób że trudno byłoby nowej osobie poradzić sobie z obsługą. Reklama strony Bezwzględnie każdą nową stronę, o ile intencje nie były inne, warto dodać do wyszukiwarek internetowych. Jest to najlepsza forma reklamy, gdyż to właśnie za ich pomocą poszukiwane są informacje w Internecie. W przeciwnym wypadku przeciętny kowalski nie odnajdzie naszej strony bez znajomości adresu internetowego. Aby dodać witrynę do najpopularniejszej wyszukiwarki Google, należy udać się na stronę znajdującą się pod adresem www.google.com/addurl i w odpowiednim polu dokonać zgłoszenia. Nasza strona jednak nie będzie widoczna od razu po tym zabiegu. Roboty skanujące strony wyszukiwarki Google odwiedzają dziennie miliony stron w poszukiwaniu nowej zawartości, i do nas dotrą po około dwóch tygodniach lub nawet więcej. Dlatego też warto witrynę zgłosić już na samym początku jej tworzenia. Co jeszcze warto wiedzieć Wiele osób zabierających się za realizację własnych stron, dość szybko traci swój zapał. Jest to wynik zdania sobie sprawy jak wiele czasu i wysiłku trzeba włożyć podczas tworzenia zawartości, już po pierwszym artykule. Z tego powodu warto przez zainwestowaniem pieniędzy i czasu w sam projekt strony, utworzyć dokument tekstowy i zapełnić go całą wstępną zawartością. Jeśli czynność ta się powiedzie, będzie to zielone światło aby podjąć następne kroki. Laborant Nr 2/2011 Internet i komputery Bezpieczeństwo poufnych danych Część I Bartłomiej Kraska czasopismolaborant.pl Bez względu na miejsce pracy i obejmowane stanowisko, powierzane są nam mniej lub bardziej poufne informacje. Mogą być to testy egzaminacyjne, patenty, wyniki badań czy też dane kontrahentów. Niestety wszystkie te informacje mogą zostać skradzione przez niepowołane osoby. Niniejszy artykuł przedstawia kilka prostych sztuczek, które wykorzystując naszą niewiedzę bądź naiwność, dając absolutnie każdemu możliwość stania się nowym posiadaczem dokumentów i tajemnic firm oraz instytucji. www.czasopismolaborant.pl Programy typu Keylogger Keylogger to program który zapisuje pliku każdą literę wpisaną z klawiatury komputera. Z tego ciągu liter i cyfr bez problemu można odczytać później hasła do skrzynek pocztowych czy treść poufnej korespondencji elektronicznej. Współczesne Keyloggery są w stanie zarejestrować nawet współrzędne kursora w miejscach kliknięcia, zapisać nazwy używanych programów czy nawet przechwycić załączniki i dokumenty, a następnie przesłać wszystko na zdefiniowany wcześniej adres e-mail, należący do osoby szpiegującej. 45 Internet i komputery Popularność tych programów zwiększa fakt iż część z nich jest zupełnie darmowa, natomiast wersje płatne powiązane są ze wsparciem technicznym, dzięki czemu nie potrzeba żadnych umiejętności informatycznych do instalacji. Wyciek informacji może w ten sposób trwać latami. Nawet dobre programy antywirusowe, zapory ogniowe czy wreszcie oprogramowanie do odnajdywania i zwalczania aplikacji szpiegujących, mogą okazać się nieskuteczne. Tak więc aby stać się, nie koniecznie szczęśliwym, posiadaczem keyloggera wystarczy pozostawić komputer na około 10-20 minut bez opieki, lub udostępnić na moment innej osobie która np. rzekomo chce sprawdzić pocztę lub rozkład jazdy autobusów. Użytkownicy nadal popularnego sys temu Windows XP winni także uważać na pamięci przenośne typu pendrive gdyż mogą one zawierać programy które zainstalują się automatycznie po włożeniu go do portu USB. Nie posiadając dobrej ochrony komputera należy wystrzegać się przyniesionym na takim nośniku dokumencie czy innym pliku od osób niezaufanych. Na szczęście w nowszych systemach operacyjnych zostaniemy zapytani o autostart takiego programu, aczkolwiek zawsze możemy pozwolić na to przez pomyłkę. Bezpiecznie mogą czuć się użytkownicy komputerów, które po każdym uruchomieniu wczytują „świeżą” konfigurację systemu operacyjnego, dzięki czemu wszystko co zostało zainstalowane przez osoby mające dostęp do komputera, przepada. Jednak do tego będzie potrzebny informatyk, który sporządzony w ten sposób system będzie aktualizował. Są jednak niestety także keyloggery sprzętowe, przy których nie jest wymagana ingerencja w system operacyjny. Mają one postać niewielkiej przejściówki, którą umieszcza się pomiędzy wtyczkę klawiatury a port w komputerze. Żeby jednak odczytać dane z takiego urządzenia niezbędna jest osobista wizyta jego właściciela. O ile takie rozwiązanie może zostać wykryte poprzez sprawdzanie portów w komputerze, tak instalowanie keyloggerów wewnątrz klawiatury jest praktycznie nie do wykrycia. Raczej nikt nie będzie codziennie odkręcać klawiatury aby zobaczyć co jest w środku, zwarzywszy że możemy nie odróżnić „dodatku” od właściwych elementów elektronicznych. Zakup identycznej klawiatury podłożenie „szpiega” i podpłacenie sprzątaczki, 46 czy stróża aby podmienili urządzenia może być więc scenariuszem w każdej firmie czy instytucji. (nie)Bezpieczeństwo dokumentów Najpopularniejszym i najprostszym sposobem skradzenia danych jest skopiowanie ich z komputera pod nieobecność właściciela. Cały proces może trwać kilka chwil i rzadko pozostawia jakiekolwiek ślady. Nie powinno się więc pozostawiać na dysku, szczególnie na pulpicie, wyjątkowo wrażliwych dokumentów. W systemach operacyjnych można oczywiście ustawić hasło użytkownika, lecz chroni ono tylko i wyłącznie przed „laikami komputerowymi”. W internecie dostępnych jest wiele mini systemów operacyjnych które można uruchomić z Pendrive’a. Wystarczy tylko podłączyć pendrive, zrestartować komputer i uruchomić mini system z nośnika. Wszelkie dane na dysku komputera będzie można wtedy bez problemu skopiować na tą samą lub inną pamięć przenośną. Oczywiście takie postępowanie pozostawi ślad w postaci uruchomionego ponownie komputera, z drugiej strony nikt nie będzie w stanie udowodnić czy nie było to wynikiem zwieszenia się systemu połączonego z automatycznym restartem, lub chwilowym brakiem prądu. Najlepszą metodą zabezpieczania plików jest ich zaszyfrowanie, przy czym nie każdy program szyfrujący jest wygodny i bezpieczny. Np. zabezpieczanie za pomocą hasłowanych archiwów ZIP czy RAR jest nie tylko niewygodne ze względu na potrzebę każdorazowego dekompresowania i kompresowania, ale także, w tzw. tymczasowym folderze systemowym mogą pozostać kopie tych plików. Pozycją szczególnie godną polecenia jest darmowy program TrueCrypt. Potrafi on szyfrować całe dyski lub tworzyć plik dowolnego rozmiaru, wewnątrz którego zaszyfrowane są poufne dane. Największą zaletą jest jednak to że po wprowadzeniu hasła korzystamy z tych plików zupełnie swobodnie, a cały proces deszyfrowania i szyfrowania odbywa się w pamięci operacyjnej, co przy współczesnych komputerach jest zupełnie niezauważalne jeśli chodzi o wydajność. Następnie jednym kliknięciem, wyjęciem nośnika lub wyłączeniem komputera, nasze dane są znów bezpieczne. Do dyspozycji mamy m.in. wojskowy algorytm szyfrowania Laborant Nr 2/2011 Internet i komputery AES 256 bitów, a także możliwość mieszania różnych algorytmów, dzięki czemu dane będą nie do złamania. Nowa wersja TrueCrypt umożliwia także uruchamianie zawartości z dysków przenośnych bez instalacji programu (tzw. wersja portable). Szyfrowanie plików jest ważne szczególnie wtedy, gdy często przemieszczany się z naszymi danymi. Zgubiony pendrive może stać się powodem do zmartwień, gdyż znalazca może wykorzystać jego zawartość np. publikując w sieci. Problem może wystąpić także wtedy gdy były na nim jedyne kopie ważnych dokumentów. Warto więc doczepić informację (lub zapisać w pliku na urządzeniu) iż znalazca otrzyma dwukrotną wartość Pendrive jeśli zwróci nam zgubę. Pozorne kasowanie plików Jeśli plik zostanie przeniesiony do systemowego kosza, który potem jest opróżniany, to w rzeczywistości nie znika z twardego dysku. Staje się tylko niewidoczny, i później jest nadpisywany innym plikiem. Jednak do tego czasu można go z dysku odzyskać! Służy do tego cała gama programów dostępnych w sieci, które dla zainteresowanego są łatwe do zdobycia. Niektóre z nich są w stanie odzyskać fragment bądź całość dokumentu który został już nadpisany innym. W zależności od opcji skanowania oraz wielkości dysku, cały procesmoże potrwać nawet klika godzin. Aby całkowicie, w 100% pozbyć się danych należy twardy dysk fizycznie zniszczyć lub skorzystać z usług firm posiadających do tego celu wyjątkowo silne elektromagnesy. Takie działanie jest wymagane gdy komputer zmienia właściciela. Nieco mniej niż 100% pewności bezpowrotnego usunięcia danych przyniesie nam darmowy program Eraser, który kasuje wybrany plik nadpisując www.czasopismolaborant.pl go zdefiniowaną ilość razy losowymi danymi. Jest to proces czasochłonny gdyż nadpisywanie pliku np. 35 razy trwa tyle samo co nagranie go na dysk tyleż samo razy. Eraser pozwala jeszcze na nadpisanie całego wolnego miejsca na dysku gdzie mogą wciąż fizycznie istnieć poufne dane. Warto wiedzieć że popularne programy (np. edytor tekstu MS Word) zapisują co kilka minut kopię pliku jako zabezpieczenie przed zwieszeniem komputera. Plik ten po prawidłowym zamknięciu programu zostaje skasowany standardową metodą. Więcej o Pendrive Przenośne pamięci z poufnymi danymi należy zawsze nosić przy sobie, gdyż dane mogą zo-stać niezauważalnie skradzione, bez potrzeby sko-rzystania przy tym z komputera. Wyobraźmy sobie następującą sytuację: przyjmujemy do gabinetu lub innego pomieszczenia przedstawiciela handlowego pewnej firmy. Po chwili rozmowy przypomniało się nam o konieczności wysłania pocztą elektroniczną ważnego dokumentu znajdującego się na pendrive, który jak nam się wydawało, pozostawiliśmy na stole obok naszego gościa. Podczas poszukiwań otrzymujemy pomoc od przedstawiciela, który znajduje szczęśliwie zgubę na podłodze. W rzeczywistości historia mogła wyglądać następująco: rzeczywiście pozostawiliśmy pendrive na stole. Udawany (bądź realny, wynajęty) przedstawiciel handlowy położył swoje broszury na stole w tym samym miejscu na stole, jednocześnie biorąc (pod zasłoną broszur) nasz pendrive do kieszeni, w której miał, wielkości telefonu komórkowego, urządzenie do bezpośredniego kopiowania zawartości pamięci. W chwili gdy zaszła potrzeba wysłania pliku, gość wyjął z kieszeni pendrive i udał że podnosi go z podłogi. Dla większości czytelników ta historia wyda się scenariuszem rodem z Hollywood, być może nie zdając sobie sprawy o wartości niektórych poufnych danych dużych firm, zachęcając niepowołane osoby do zastosowania wszelkich sposobów na ich zdobycie. Zważywszy że takie urządzenia, zaprojektowane do tworzenia szybkiej kopii zapasowej przenośnych pamięci, są dziś w miarę tanie i łatwo dostępne. Pendrive można wykorzystać jeszcze w inny sposób. Osoba której uda się podłączyć go do naszego komputera, np. celem przekopiowania 47 Internet i komputery jakiegoś pliku, może uruchomić z niego działający niepostrzeżenie program, który błyskawicznie przeszuka dysk komputera w poszukiwaniu zdefiniowanych plików, np. dokumentów z rozszerzeniami doc, docx lub PDF, zawierających słowa kluczowe w nazwach, a nawet grafiki, i skopiować na urządzenie. Następnie ta sama osoba na spokojnie będzie mogła przejrzeć zawartość zdobytych plików. czasie. Tak więc bezpośrednio po skorzystaniu z Internetu można bez problemu sprawdzić ich zawartość. Dodatkowo znajdą się tam grafiki odwiedzanych stron internetowych. Nie znajdziemy ich za pomocą wyszukiwarki gdyż nazwy plików mają postać ciągu znaków bez rozszerzeń. Dlatego też warto w każdej przeglądarce internetowej włączyć opcję usuwania zawartości offline podczas zamykania aplikacji, a także zapamiętywania haseł oraz historię odwiedzin. Z tego ostatniego chętnie korzystają internetowe strony szpiegujące, które są w stanie sprawdzić jakie strony nas interesują, zeskanować adres poczty elektronicznej która jest otwarta na innej karcie lub w nowym oknie, a następnie błyskawicznie przesłać nam reklamę. Jeżeli zaś w książce znajdują się adresy pocztowe znajomych, to również i oni dostąpią wątpliwego zaszczytu obejrzenia tej samej bądź innej reklamy. Oczywiście te same mechanizmy można wykorzystać do przechwycenia treści korespondencji. Oczy „Wielkiego Brata” Mnogość tanich mini kamer ukrywanych w brelokach czy długopisach rodzi kolejne niebezpieczeństwo. Za kwotę poniżej 100 PLN można nabyć sprzęt dzięki któremu można podejrzeć hasła wpisywane z klawiatury, a nawet, w przypadku lepszych modeli, treść dokumentów czy korespondencji. Próżno rozglądać się w poszukiwaniu takiego maleństwa, gdyż spreparowanych przedmiotów codziennego użytku wciąż przybywa, a poza tym obudowę można rozmontować i wnętrze kamery umieścić praktycznie wszędzie, od szczeliny w książce po butelce z napojem. Popularne są także listwy zasilające oraz gniazdka sieci elektrycznej, wyposażone w dodatkową dziurkę na obiektyw, z których można pobierać zasilanie. W połączeniu z kartą SIM, taka kamera może pracować nieprzerwanie. Podsumowanie Niestety jakiekolwiek kroki podejmiemy, osoba której niezwykle zależy, zawsze prędzej czy później zdobędzie poufne dane. Nie ma możliwości przewidzenia wszystkich sytuacji, które mogą do tego celu zostać wykorzystane. Można jedynie utrudnić to zadanie, trzymając ważne dokumenty na komputerze który nie jest podłączony do Internetu (ochrona przed atakiem hakera z zewnątrz), oraz stosując ochronę od wewnątrz poprzez całodobowy monitoring. Na pewno, posiadając dokumenty od których zależy nasz sukces bądź bankructwo, należy kwestii bezpieczeństwa poświęcić wiele uwagi. Zdradzieckie przeglądarki internetowe Każdy załącznik otwarty bezpośrednio z poczty elektronicznej, który nie został uprzednio zapisany, w rzeczywistości jest zapisywany w tymczasowym folderze systemowym, skąd dopiero jest wyświetlany. Domyślnie, o ile ustawienia przeglądarki nie zostaną przez nas zmodyfikowane, te pliki są usuwane dopiero po jakimś 48 W drugiej części artykułu “Bezpieczeństwo poufnych danych” zostaną przedstawione programy pozwalające ogranicznyć ryzyko kradzieży informacji i dokumentów. Zamieszczone zostaną również krótkie instrucje użytkowania programów TrueCrypt oraz Eraser. Przeprowadzony zostanie także test sprzętu wspomagającego bezpieczeństwo, m.in. czytnik linii papilarnych lub dysk z klawiaturą numeryczną, zabezpieczany kodem PIN. Laborant Nr 2/2011 Operational Simplicity is a trademark, Chromeleon and UltiMate are registered trademarks of Dionex Corporation, PIN 988 UHPLC czy HPLC Po co wybierać? Nowe rewolucyjne technologie zintegrowane w systemach UltiMate™ 3000 RSLC firmy Dionex stanowią kompleksowe rozwiązanie dla wszystkich technik opartych na chromatografii cieczowej. Discover Dionex Innovations www.polygen.com.pl Kolumny flash do 330 g Gradient: 2-składnikowy Ciśnienie: do 10 barów Przepływ: do 150 ml/min Kolumny flash do 1,6 kg Kolumny półpreparatywne LC Kolumny preparatywne LC do 80 mm id Gradient: 4-składnikowy Ciśnienie: do 30 barów Przepływ: do 200 ml/min Kolumny flash do 1,6 kg Kolumny półpreparatywne LC Kolumny preparatywne LC do 80 mm id Gradient: 4-składnikowy Ciśnienie: do 50 barów Przepływ: do 250 ml/min Kolumny flash powyżej 1 kg Gradient: 2-składnikowy Ciśnienie: do 10 barów Przepływ: do 800 ml/min Nowa seria systemów PuriFlash do chromatografii typu flash
