Morfologia bakterii
advertisement
ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW ANALITYKI POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014 1 AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk ISBN: 978-83-64344-03-9 Wydanie drugie zmienione i poprawione 2 Spis treści: Część I Rozdział 1 Morfologia komórki bakteryjnej………………………………………………….5 Rozdział 2 Pożywki do hodowli bakterii………………………………………………....….23 Rozdział 3 Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii…………………………………………………………………………………..….31 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii…………………………………….……….….41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii …51 Rozdział 6 Liczenie bakterii …………………………………………………………………………75 Rozdział 7 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie plazmidów……………………………………………………………………………….…87 Rozdział 8 Oddziaływanie na bakterie w środowisku. Dezynfekcja i antyseptyka………………………………………………………………………………99 Rozdział 9 Sterylizacja………………………………………………………………………….……115 Rozdział 10 Bakterie w lekach i żywności – kontrola czystości mikrobiologicznej………………………………………………………………….…125 Część II Rozdział 1 Badanie wrażliwości bakterii na antybiotyki i monitorowanie leczenia………………………………………………………………………………….143 Rozdział 2 Podstawy diagnostyki wirusologicznej……………………………………167 3 4 Część I Rozdział 1 Morfologia komórki bakteryjnej Część teoretyczna Bakterie to organizmy prokariotyczne. Cechą charakterystyczną komórek bakteryjnych jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie posiadają one również dobrze wykształconych organelli komórkowych i układu błon wewnętrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosomy, mitochondria. Bakterie (poza mikoplazmami) mają ścianę komórkową, membranę cytoplazmatyczną, a w cytoplazmie zawieszone są rybosomy. Niektóre gatunki wytwarzają otoczki, przetrwalniki, fimbrie, ziarnistości zapasowe, a zdolność ruchu zawdzięczają rzęskom lub włóknu osiowemu. Z punktu widzenia diagnostyki najistotniejsze są te cechy morfologii komórek bakterii, które można uwidocznić prostymi metodami w mikroskopie świetlnym. Mikroskop elektronowy w laboratorium szpitalnym nie jest przydatny. Cechy morfologiczne komórek bakterii ważne dla ich identyfikacji to: kształt komórek i ich charakterystyczne dla rodzaju czy gatunku układy popodziałowe; budowa ściany komórkowej warunkująca różnicowe barwienie metodą Grama; otoczka; przetrwalniki; ziarnistości zapasowe; zdolność ruchu. 5 Wielkość, kształt i układy popodziałowe Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi od 1 µm do 10 µm. Rozmiar najmniejszych wynosi od 0,15 µm do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 µm do 600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica 1-2 µm. Wyróżniamy następujące kształty komórek bakteryjnych: kulisty, cylindryczny i spiralny. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe: dwoinki (np. dwoinki zapalenia płuc) – komórki po podziale pozostają po dwie, ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach, pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki, paciorkowce (Streptococcus) – komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki, gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (np. Pseudomonas), laseczki (np. Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne: dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki 6 (np. Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się miedzy sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do różnorodności morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Kształt i układy podpodziałowe bakterii możemy zaobserwować w preparatach przyżyciowych (np. w mikroskopie kontrastowo-fazowym lub w ciemnym polu widzenia, a nawet w zwykłym mikroskopie świetlnym), a także w preparatach utrwalonych, barwionych. Ściana komórkowa Ściana komórkowa wszystkich bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on z łańcuchów wielocukrowych, połączonych poprzecznie peptydami. Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu. Peptydoglikanu jest składnikiem ściany komórkowej wszystkich tworzących ją bakterii. Ściana komórkowa jednych bakterii (gramdodatnich) jest stosunkowo gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw peptydoglikanu, co może stanowić 90% suchej masy ściany. W ich ścianie występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka. Ściana innych bakterii (gramujemnych) jest cienka i ma budowę wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu, który stanowi tylko 10% suchej masy ściany, pokrywa dominujący u nich element - błona zewnętrzna. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii są przyczyną różnego ich barwienia w metodzie opracowanej przez Grama. Stało się to podstawą do bardzo przydatnego w identyfikacji, a tym samym diagnostyce, podziału bakterii na gramdodatnie i gramujemne. 7 Otoczka Bakterie mogą syntetyzować i wydzielać na zewnątrz ściany zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią związany – nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę, swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem. Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy najczęściej mają charakter polisacharydów. Otoczki tylko niektórych bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową. Otoczki są tworzone w naturalnych miejscach bytowania bakterii. W przypadku bakterii chorobotwórczych, w organizmie człowieka lub zwierząt. Można je zobaczyć w barwionych (np. metodą Grama) preparatach wykonanych z zakażonych tkanek. W organizmie otoczki odgrywają ważną rolę ochronną przed aktywnością układu immunologicznego. Tylko niektóre spośród tych bakterii wytwarzają otoczki także w hodowlach sztucznych. Sprzyja temu duża zawartość cukrów w pożywce. Otoczki trudno się wybarwiają, należy zastosować specjalne metody. Z hodowli najczęściej ogląda się je w preparatach barwionych metodą pozytywno-negatywną, w zwykłym mikroskopie świetlnym. W przypadku badania materiałów klinicznych otoczki mają ważne znaczenie, gdyż ich skład u drobnoustrojów je wytwarzających (np. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis czy otoczkowych Haemophilus influenzae) jest ważną cechą charakterystyczną i umożliwia identyfikację serologiczną patogenów (także po ich rozpadzie np. wykrywanie antygenów otoczkowych w płynie mózgowordzeniowym), a także określenie serotypów w obrębie poszczególnych gatunków. Stosuje się tu testy lateksowe i niekiedy, metodę pęcznienia otoczek w obecności specyficznych przeciwciał. 8 Przetrwalniki Formy przetrwalne (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Spośród bakterii związanych z człowiekiem są to laseczki z rodzajów Bacillus i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek wegetatywnych – jeden przetrwalnik powstaje z jednej komórki. Proces ten nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na wysoką temperaturę. Wiele bakterii (laseczek) odpowiedzialnych za choroby u ludzi, bytuje w środowisku w postaci przetrwalników. Stąd dostają się do organizmu w postaci aerozoli lub po urazach – z glebą. Przetrwalnik w środowisku nieożywionym zachowuje przez długi czas żywotność, a w dogodnych warunkach (np. w organizmie) kiełkuje w komórkę wegetatywną, która wytwarza toksyny i enzymy odpowiedzialne za chorobotwórczość tych bakterii. W warunkach hodowli laseczki wytwarzają przetrwalniki w późnej jej fazie. Można je wtedy oglądać w preparatach. Przetrwalnik może mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt. Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować w komórkach nie zabarwionych, szczególnie dobrze w mikroskopie fazowo-kontrastowym, gdzie są widoczne jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki. Można je również obserwować w preparatach barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy bezbarwny przetrwalnik. Jeśli właśnie powstaje, jest czasami zabarwiony, a gdy zostanie już uwolniony z komórki widoczny jest w preparacie jako twór bezbarwny, czasem z cieniutką warstewką barwnika na obwodzie. 9 Ziarnistości zapasowe W komórkach niektórych bakterii gromadzone są w cytoplazmie materiały zapasowe, nazywane też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, a zużywane w warunkach głodu. Do najczęściej występujących u bakterii ciał zapasowych należy kwas poli-β-hydroksymasłowy. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy – skrobię, glikogen. Wśród bakterii związanych z człowiekiem, najważniejsze są występujące u bakterii grupy Maczugowate ziarnistości polimetafosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów. Nazywamy je także wolutyną. Wykrywane poprzez odpowiednie barwienie preparatów mają istotne znaczenie taksonomiczne. Ruch bakterii Dzięki rzęskom czy włóknom osiowym, które są elementami budowy niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, bakterie te wykazują zdolność poruszania się w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym. Wykazanie zdolności ruchu bakterii może być ważną cechą identyfikacyjną. W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów urzęsienia: monotrichalny – jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny – pojedyncza rzęska lub ichpęczek na obu biegunach, perytrichalny – wiele rzęsek dookoła komórki. Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna komórki i tworząc włókno osiowe, spiralnie je oplatają. Barwienie rzęsek jest trudne i kłopotliwe. Dlatego o ich istnieniu dowiadujemy się pośrednio, obserwując ruch bakterii. W preparatach „mokrych” w mikroskopie świetlnym najlepiej temu służy preparat w „kropli wiszącej”. Ruch żywych komórek bakterii można także obserwować w mikroskopie kontrastowo-fazowym oraz w mikroskopie 10 z ciemnym polem widzenia. Ten ostatni jest szczególnie dogodny dla obserwacji krętków w przyżyciowych preparatach. Metody Mikroskopowanie Drobne wymiary bakterii sprawiają, że do oglądania ich komórek musimy korzystać z mikroskopu. Żywe komórki bakterii najczęściej obserwujemy w mikroskopie fazowo-kontrastowym i z ciemnym polem widzenia. Preparaty trwałe, barwione różnymi metodami, ogląda się w zwykłym mikroskopie świetlnym lub mikroskopie fluorescencyjnym. Mikroskop fazowo-kontrastowy przekształca, niewidzialny dla naszego oka, obraz fazowy na obraz kontrastowy – zróżnicowany pod względem przechodzącego natężenia światła. Różnice te są rozpoznawalne przez wzrok ludzki. Struktury silniej załamujące światło będą widziane jako elementy ciemniejsze na jasnym tle. Mikroskop ten stwarza możliwości obserwowania żywych, niezabarwionych komórek bakterii, a nawet pewnych ich struktur, np. przetrwalników, materiałów zapasowych. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia bakterie widoczne są jako jasne obiekty na ciemnym tle. Efekt taki uzyskujemy dzięki specjalnemu kondensorowi ciemnego pola, który zapobiega przechodzeniu światła bezpośrednio do soczewki obiektywu. Obiektyw odbiera tylko promienie świetlne ugięte przez elementy preparatu. Ten typ mikroskopu używany jest do oglądania bakterii żywych i ich ruchu. Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop świetlny z jasnym polem widzenia, ale komórki nie zabarwione są w nim źle widoczne, więc stosuje się różne metody barwienia. Mikroskop fluorescencyjny wyposażony jest w lampę emitującą promieniowanie UV, co pozwala na oglądanie preparatów barwionych różnicowo barwnikami fluorescencyjnymi. Mikroskop taki jest bardzo przydatny w diagnostyce; pozwala na stosowanie metody immunofluorescencji. Preparaty zawierające bakterie należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 x i okularów powiększających 11 5-10 razy. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 x), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpływ ma oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym lusterko wklęsłe. Preparaty trwałe należy oglądać przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Preparaty przyżyciowe mające wykazać ruch bakterii, lub zawierające inne większe niż bakterie elementy można oglądać przy pomocy obiektywu powiększającego 60 x , wtedy, przy obniżonym kondensorze. Preparaty przyżyciowe - „mokre” Preparaty takie mogą być wykonywane bezpośrednio z materiału klinicznego – wtedy ocenia się obecność w nim leukocytów i bakterii. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia ogląda się przyżyciowo krętki. Można także oglądać takie preparaty z hodowli. Więcej cech bakterii w tym niektóre elementy ich struktury, można zobaczyć w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Preparat z "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii. Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką") i szkiełka nakrywkowego. Wykonanie Brzeg wgłębienia na szkiełku podstawowym smarujemy cienką warstwą wazeliny. Na środek szkiełka nakrywkowego nanosimy oczko ezy płynnej 12 hodowli bakteryjnej. Następnie odwracamy szkiełko podstawowe i przyklejamy je do szkiełka nakrywkowego tak, aby kropla hodowli zawisła nad wgłębieniem. Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość zebranej ezą masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Przygotowanie rozmazu z hodowli płynnej polega na dwu lub trzykrotnym naniesieniu jej ezą na szkiełko. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, jak wymiar, kształt sposób układania się komórek i pewne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki 13 zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą: nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy: fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W pH hodowli zwykle obojętnym lub lekko zasadowym białka bakteryjne posiadają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła – otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki określamy barwieniem negatywnym. Barwienie metodą Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); odbarwiacz - alkohol etylowy; barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10). Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; 14 - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, który przez cienką warstwę peptydoglikanu bakterii gramujemnych wydostaje się na zewnątrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. Barwienie metodą Ziehla-Neelsena Barwienie metodą Ziehla-Neelsena umożliwia wykrycie bakterii kwasoalkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie te przyjmują i utrzymują w toku barwienia barwnik podstawowy. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy - fenolowy roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna karbolowa); odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol zakwaszony); barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór błękitu metylenowego (błękit metylenowy). 15 Wykonanie barwienia - Na ułożony na statywie do barwienia, utrwalony preparat należy nalać roztworem fuksyny zasadowej i krótko podgrzać szkiełko od spodu płomieniem palnika. Ukaże się para, gdy zniknie, czynność powtórzyć jeszcze dwa razy; - po ostudzeniu preparat należy spłukać wodą; - zalać preparat zakwaszonym alkoholem i pozostawić do całkowitego odbarwienia na ok. 1 minutę (czas odbarwiania zależy od grubości rozmazu); - spłukać wodą ; - dobarwić preparat błękitem metylenowym przez 2 minuty; - spłukany wodą preparat należy wysuszyć odciskając go w bibule. Wynik barwienia: Bakterie kwaso-alkoholo-oporne - różowe, inne elementy preparatu, w tym bakterie inne niż kwaso-alkoholo-oporne – niebieskie. Barwienie metodą Neissera Barwienie metodą Neissera umożliwia wykrycie w komórkach bakterii polifosforanowych (wolutynowych) ziarnistości zapasowych. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik Neissera złożony z dwóch składników łączonych bezpośrednio przed barwieniem: alkoholowo-wodnego roztworu błękitu metylenowego (Neisser I) i alkoholowo-wodnego roztworu fioletu krystalicznego (Neisser II); wodny roztwór chryzoidyny. W barwieniu tym nie spłukujemy barwników wodą. Wykonanie barwienia - Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera przez zmieszanie w cylinderku: dwie części barwnika Neisser I i jedną część barwnika Neisser II; - na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik; - po 5 minutach dokładnie zlać barwnik, nie spłukiwać wodą; - nalać na szkiełko roztwór chryzoidyny na 10-15 sekund; - po zlaniu barwnika preparat od razu odcisnąć w bibule. Wynik barwienia: Ziarnistości wolutynowe są granatowoczarne, komórki – żółte. 16 Barwione metodą negatywno-pozytywną Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania otoczek u bakterii. Zabarwiana jest komórka bakteryjna i innym barwnikiem tło. W metodzie tej można używać różnych barwników. Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub kolargol. Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat nalewamy: roztwór fuksyny i kilka kropli fuksyny zasadowej, a następnie leżące na statywie do barwienia szkiełko podgrzewamy od spodu płomieniem palnika do ukazania się pary; - po ostudzeniu, preparat należy spłukać wodą i osuszyć w bibule; - na brzeg szkiełka nanieść kroplę nigrozyny lub kolargolu i rozciągnąć barwnik równomiernie po powierzchni rozmazu krawędzią drugiego szkiełka podstawowego; - preparat wysuszyć w powietrzu. Wynik barwienia: Komórka barwi się na różowo, tło jest szare (nigrozyna) lub żółtobrązowe (kolargol). Otoczka pozostaje bezbarwna. Zadania do wykonania Zadanie 1. Mikroskopowanie i ocena preparatów Otrzymujesz gotowe preparaty wykonane z hodowli Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, które zabarwione zostały metoda prostą. - Nastaw je i obejrzyj pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. - Narysuj obraz preparatów widzianych w mikroskopie. - Określ powiększenie oglądanych preparatów oraz kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. Pamiętaj aby w swoich rysunkach uwzględnić różnice w wielkości komórek oglądanych drobnoustrojów. Do zapisania swoich obserwacji wykorzystaj poniższe tabele. 17 Obraz mikroskopowy (rysunek) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Powiększenie: Opis obraz mikroskopowego Oglądany drobnoustrój Bacillus subtilis Kształt bakterii Sposób układania się komórek Staphylococcus aureus Escherichia coli 18 Zadanie 2. Identyfikacja na podstawie morfologii komórki Otrzymujesz hodowlę płynną nieznanych bakterii. - Wykonaj preparat z tej hodowli, zabarw go metodą Grama i oceń pod mikroskopem. - Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. - Ile rodzajów bakterii można odróżnić? - Określ ich kształt, sposób układania się komórek i zabarwienie. Kształt bakterii i ich układ (rysunek) Kształt bakterii i ich układ (opis ) 19 Zadanie 3. Barwienie metodą pozytywno-negatywną Otrzymujesz hodowlę stałą Klebsiella pneumoniae w płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. Wykonaj preparat z tej hodowli i zabarw go metodą pozytywno-negatywną. Narysuj obraz widziany pod mikroskopem. - Czy badany przez ciebie drobnoustrój charakteryzuje się zdolnością wytwarzania otoczki? 20 - Dlaczego w powszechnie stosowanych metodach barwienia otoczka pozostaje niewybarwiona? Zadanie 4. Kropla wisząca Otrzymujesz płynną hodowlę Proteus vulgaris, do której dodano kilka kropli zawiesiny czerwonych krwinek baranich. - Wykonaj preparat z "kropli wiszącej" i nastaw go pod mikroskopem. Pamiętaj, że tego typu preparat oglądamy przy obniżonym kondensorze z wykorzystaniem obiektywu powiększającego 40x lub 60x. - Oglądając preparat zwróć uwagę na różnicę w wielkości pomiędzy poruszającymi się bakteriami, a nie wykazującymi ruchu krwinkami czerwonymi. 21 22 Rozdział 2 Pożywki do hodowli bakterii Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Pewne grupy bakterii, o wysokim stopniu pasożytnictwa, nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie uzyskują gotowych złożonych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B, które są koenzymami lub grupami prostetycznymi niektórych enzymów. Inną grupę czynników wzrostowych stanowią aminokwasy oraz zasady purynowe i pirymidynowe, które wykorzystywane są jako składniki budulcowe komórki. Czynnikami wzrostowymi niezbędnymi dla niektórych bakterii są: cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Bakterie do wzrostu i mnożenia wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg2+, Fe 2+, Ca2+ , Mn 2+, Zn2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Jony Mg2+ stabilizują strukturę ściany komórkowej bakterii gramujemnych. Stabilność struktury i prawidłową czynność rybosomów zapewniają jony 23 2+ + 2+ Mg i K . Jony Ca są niezbędne w procesie wytwarzania przetrwalników. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki. Podłoża do hodowli bakterii Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Zdolność wyrastania bakterii na określonych podłożach lub jej brak, jest bardzo ważną cechą diagnostyczną. Bakterie hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój bakterii na pożywkach pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost wszystkim bakteriom. Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny: zawierać odpowiednie składniki pokarmowe, mieć odpowiednią wilgotność, mieć odpowiednie pH, mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na czystych, chemicznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Są to podłoża zawierające różne składniki, 24 w tym surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Składniki pochodzenia naturalnego najczęściej wykorzystywane w pożywkach złożonych przedstawiono w tabeli 1. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. Tabela 1. Składniki pochodzenia naturalnego stosowane w pożywkach złożonych. Ekstrakty mięsne – wodne wyciągi bogate źródło azotu, węgla z tkanki mięsnej, serca, wątroby i witamin dobre źródło azotu, węgla, Ekstrakty z drożdży bogate źródło witamin z grupy B Peptony – produkty częściowej, bogate źródło azotu, węgla enzymatycznej hydrolizy białek Hydrolizaty enzymatyczne lub bogate źródło wolnych kwasowe kazeiny, białek soi, białek aminokwasów (azotu), węgla mięsa. Białka – kazeina, żelatyna, białka bogate źródło azotu, węgla, jaja, surowicy krwi mikroelementów Podstawową prostą pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie 1,5-2% agaru do bulionu odżywczego otrzymujemy podłoże stałe. Agar jest to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 4548°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii, ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające dodatkowe składniki. Elementami wzbogacającymi mogą być: węglo- 25 wodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają stymulująco lub hamująco na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na: - namnażające lub namnażająco-wybiórcze, - wybiórcze (selektywne), - diagnostyczne (różnicujące), - transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają składniki, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże LoewensteinaJensena do hodowli prątków gruźlicy. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża 26 stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają wodę i składniki optymalizujące środowisko dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić (wysterylizować), stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha, a czasem przez przesączenie przez filtr o odpowiednio małych porach. Czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną 27 rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okresy międzypodziałowe większości bakterii trwają od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Są jednak i takie, które hodować trzeba przez wiele dni lub nawet tygodni (np. prątki). Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowują swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie 28 geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. k e r ó m o k h c y w y ż y b z c il lg 4 5 6 3 1 2 czas hodowli Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego, 4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych. 29 Ważne definicje Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju (gatunku, szczepu). Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. 30 Rozdział 3 Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii Część teoretyczna Posiew na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) jałowymi: ezą, pipetą lub wacikiem. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Czyste hodowle W większości przypadków przy badaniu bakteriologicznym materiałów klinicznych, żywności, wody czy leków spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Identyfikacja drobnoustrojów występujących w badanym materiale, może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, że każda z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej. Morfologia wzrostu bakterii na podłożach Sposób, w jaki bakterie wyrastają na pożywkach jest ważną cechą, która może być istotna przy ich identyfikacji. 31 Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego (to cecha bakterii bardzo ruchliwych). Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; CFU – ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy pojedynczą komórkę lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy) albo przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. Metody Posiewy Posiewając ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Jeśli używa się jałowych pipet i wacików należy pamiętać o ich umieszczeniu w odpowiednich naczyniach (np. w słoju z chloraminą) po zakończeniu posiewu. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia – probówki lub kolbki. 32 Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL pożywki. Posiew na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje się w różny sposób – zależnie od jego celu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. Rycina 1. Posiew redukcyjny A C B D 33 W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne (zwykle 4) sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. Przy posiewie na podłoże stałe w probówce w postaci skosu agarowego należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Zwykle prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. Półskosy posiewa się wkłuwając ezę w część słupkową, a dopiero potem wyprowadzając ją zygzakiem po powierzchni skosu ku wylotowi. Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków. 34 Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże. Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną. Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki. Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię. Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii. Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama. Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: wielkość - średnica (mm); kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, ... ; brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ; powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, ..; wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata, wrastająca w podłoże, ... ; 35 przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ; barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ; otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli Etap I - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). - Wykonaj preparat barwiony metodą Grama z posiewanej hodowli. - Narysuj i opisz obraz mikroskopowy 36 Etap II - Obejrzyj wykonany wczoraj posiew redukcyjny, zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki. - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny). Kolonia: Preparat: Kolonia: Preparat: 37 Kolonia: Preparat: Oceń zgodność otrzymanych obrazów mikroskopowych z preparatem wykonanym w pierwszym etapie doświadczenia. Jak oceniasz znaczenie preparatu bezpośredniego z hodowli wyjściowej dla określenia jej czystości i rodzaju drobnoustrojów w niej się znajdujących? 38 Etap III Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych. Zadanie 2. Ocena morfologii kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku namnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy. 39 40 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów. Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na: autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do związków organicznych; heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na: 41 prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych; - auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska. Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu. - Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii: fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące), chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych. W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na: litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych, organotrofy - korzystające z donatorów organicznych. 42 Zatem, zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii i donatorów elektronów, możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowiące mikrobiota człowieka i te, które są dla niego chorobotwórcze, są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze związków organicznych. Wymagania tlenowe bakterii Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględne beztlenowe rosną przy jego braku, a względne beztlenowe rosną zarówno przy dostępie, jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, w którym końcowym akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek organiczny. Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru. Jest on rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane są m.in. bakterie z rodzajów Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu, jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydoredukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą 43 przestawić metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na oddychanie beztlenowe. Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko i wyłącznie przy braku dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie mają żadnych mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie. Niektóre z nich mogą rosnąć w obecności tlenu, jednak pod warunkiem obniżenia potencjału oksydoredukcyjnego poprzez dodanie do hodowli glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą liczne bakterie chorobotwórcze dla człowieka, m.in. z rodzajów Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium. Wymagania temperaturowe bakterii Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatury kardynalne to temperatura minimalna, która wyznacza dolną granicę, poniżej której wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna, która jest temperaturą, powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy. Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40°C do 70°C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus, czy Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych temperaturach, np. Thermus aquaticus w 65°C. Znane są i takie, które mnożą się w temperaturze 90-110°C. Określane są one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z możliwości, jakie ciepłoodporne enzymy tych bakterii stwarzają np. dla biologii molekularnej. Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie temperatur 25-45°C. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju w temperaturze 37°C, blisko związane z człowiekiem jako patogeny i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella). Niektóre z mezofili mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur, jak na 44 przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki Listeria spp. – o o spektrum od 1 C do 45°C . Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne o optymalnej temperaturze 20°C, ale mogące też rosnąć w 0°C, występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 0°C, mnożąc się w żywności przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter, a także Bacillus czy Lactobacillus. Metody Badanie zdolności wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla Określenie przynależności bakterii do prototrofów oraz zbadanie zdolności do metabolizowania określonego związku organicznego jako jedynego źródła węgla może mieć znaczenie diagnostyczne. Cechę tę można zbadać na podłożu Simmonsa. Jest to podłoże stałe, które może zawierać w swoim składzie cytrynian sodowy lub np. malonian jako jedyne źródło węgła i siarczan amonowy jako źródło azotu. Do pożywki dodany jest wskaźnik pH – błękit bromotymolowy, który w środowisku obojętnym, jakie posiada podłoże wyjściowe, ma zabarwienie zielone. Na podłożu wyrastają jedynie bakterie, które mają zdolność wykorzystywania tego organicznego substratu, a alkaliczne produkty ich metabolizmu – amoniak i aminy zmieniają jego barwę na niebieską. Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub aminokwasów jako źródła azotu Bakterie posiane na stałe podłoże niezawierające źródła azotu, na które punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków) naniesiono odpowiednio roztwory: NH4(SO4)2 i aminokwasów, wyrosną 45 tylko w pobliżu tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać. Bakterie o dużych możliwościach biosyntetycznych (korzystające z formy nieorganicznej) zazwyczaj także dobrze przyswajają azot organiczny. Metody hodowli bakterii tlenowych Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce. Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne wstrząsanie lub mieszanie hodowli na mechanicznych wytrząsarkach. W hodowlach płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie tlenu zwiększa się przepuszczając przez pożywkę powietrze lub tlen. Metody hodowli bakterii beztlenowych Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki. W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną parafiną. Niektóre bakterie beztlenowe dobrze rosną na podłożach zawierających tkanki zwierzęce jako absorbent tlenu. Wiele bakterii można też wyhodować na podłożach o obniżonym potencjale oksydoredukcyjnym, co jest osiągane poprzez dodanie odpowiednich związków chemicznych. W powszechnie używanym podłożu Brewera jest to tioglikolan sodu, a w podłożu Schaedlera – chlorowodorek cysteiny. Warunki atmosfery gazowej najlepiej można dostosować do potrzeb określonych bakterii hodując je w specjalnych, szczelnych słojach, wewnątrz których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej wytwórcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu wydzielane są wodór, CO2 lub mieszanina gazów optymalna dla danych bakterii. Jeśli wydzielany jest wodór, to reaguje on z tlenem obecnym w słoju, tworząc wodę. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunków beztlenowych. Efektywność tego procesu sprawdza się przy 46 pomocy wskaźnika, błękitu metylenowego, który w warunkach beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach saszetek wymagają do swojej aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć szybkość łączenia się wodoru z tlenem stosuje się wtedy katalizator palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka słoja. W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%). Zadania do wykonania Zadanie 1. Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii na podłożach stałych w słojach do hodowli beztlenowców - Otrzymujesz hodowle bulionowe szczepów: Bacteroides fragilis i Escherichia coli oraz podłoża – dwie płytki zawierające agar z krwią i dwie płytki wypełnione stałym podłożem Schaedlera wzbogaconym krwią (podłoże to stwarza dogodne warunki dla hodowli beztlenowców, gdyż zawiera składniki obniżające potencjał oksydoredukcyjny). - Podpisz płytki nazwami drobnoustrojów: agar z krwią i podłoże Schaedlera dla każdego z drobnoustrojów. - Zanurz jałowy wacik w hodowli Escherichia coli, odciśnij o ścianki probówki i posiej metodą redukcyjną na dwie płytki (agar z krwią i podłoże Schaedlera). - Szczep Bacteroides fragilis posiej w identyczny sposób. - Posiewy na płytce krwawej inkubuj w cieplarce (37°C, 20 godzin) – warunki tlenowe. - Dwie pozostałe płytki (Schaedlera) wstaw do słoja do hodowli bakterii beztlenowych. Przed zamknięciem słoja włóż do niego odpowiednią 47 saszetkę np. Gas Pak, a do jego wieczka przytwierdź papierek wskaźnikowy. - Zamknij wieko słoja i pozostaw go w temperaturze pokojowej na ok. 30 minut. Zaparowanie słoja (wytworzenie wody) wskazuje na powstanie atmosfery beztlenowej. - Posiewy w słoju także inkubuj w cieplarce (37°C, 20 godzin). - Na podstawie obecności wzrostu określ wymagania tlenowe tych bakterii. - Wyniki zestaw w tabeli. Tabela. Wyniki doświadczenia Warunki Określenie Warunki tlenowe beztlenowe wymagań tlenowych agar podłoże agar podłoże z krwią Schaedlera z krwią Schaedlera bakterii Bacteroides fragilis Escherichia coli - Jakie znasz związki, które dodane do podłoża wzrostowego będą obniżały jego potencjał oksydoredukcyjny? 48 Zadanie 2. Typy pokarmowe bakterii Uzupełnij poniższą tabelę Typ pokarmowy Źródło energii Źródło węgla Donatory elektronów związki nieorganiczne CO2 i inne związki nieorganiczne związki nieorganiczne związki nieorganiczne związki nieorganiczne Chemoorganotrofy światło Fotoorganotrofy związki organiczne 49 50 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii. Część teoretyczna Metabolizm bakterii Podobnie, jak w innych żywych komórkach, metabolizm bakterii obejmuje anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu). Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP. W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy, kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów. W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa będący końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda, dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów anabolicznych wymagających jej nakładu. Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest angażujące cykl Krebsa oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha oddechowego. Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki 51 nieorganiczne, np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów ich rozkładu, a także enzymów biorących udział w tych procesach także wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów. Oddychanie azotowe może angażować jeden z dwóch procesów: denitryfikację polegającą na redukcji azotanu do podtlenku azotu (N2O) oraz uwalnianego do środowiska azotu atmosferycznego. Bakterie posiadające takie zdolności to m.in.: Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis. amonifikację polegająca na redukcji azotanów do azotynów, + a następnie do amoniaku w formie jonu amonowego NH4 . Przeprowadzana jest ona m.in. przez: Escherichia coli, Klebsiella mobilis. Oddychanie siarkowe polega na redukcji siarczanów bądź siarki do siarczków. Zdolność do redukcji siarczanów mają bakterie z rodzaju Desulfovibrio, natomiast siarkę redukują bakterie z rodzaju Desulfuromonas. Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego, w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego. Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne powstałe jako produkty pośrednie, np.: etanol, mleczan, maślan, bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy fermentacji. W identyfikacji bakterii znaczenie diagnostyczne mają: fermentacja mlekowa, propionowa, masłowa i mrówkowa. Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe (Lactobacillus spp.), ale także inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie mlekowe stanowią mikrobiota przewodu pokarmowego niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też mikrobiota pochwy u kobiet. Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy tej fermentacji powstaje kwas propionowy. 52 Fermentacja masłowa prowadzona jest przez beztlenowe bakterie przetrwalnikujące z rodzaju Clostridium, w tym laseczki zgorzeli gazowej. Jako produkty końcowe tego procesu powstają kwasy masłowy, octowy, alkohole oraz CO2 i H2. Fermentacja mrówkowa jest charakterystyczna dla bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Produktami końcowymi jest wiele związków, a wśród nich kwasy organiczne, etanol, glicerol, acetoina, 2,3-butandiol, a także CO2 i H2. Możliwe są dwa szlaki przemian, a ich cechy wykrywa się dla celów identyfikacyjnych. Pierwszy z nich charakteryzuje się powstawaniem silnych kwasów organicznych, co obniża pH pożywki poniżej 4,5 (próba Metyl-Red). W innym szlaku kwasy organiczne mogą powstawać w mniejszej ilości, a głównymi produktami są acetoina i 2,3-butandiol (próba Voges- Proskauera). Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste, oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy. Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele substratów, zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku większości bakterii jest to glukoza. Bakterie metabolizują węglowodany według trzech szlaków. Pierwszym jest glikoliza, w wyniku której glukoza utlenia się do kwasu pirogronowego, przekształcanego w warunkach tlenowych do CO2 i H2O, natomiast w warunkach beztlenowych podlegającego dalszym przemianom w procesie fermentacji. Drugi to cykl pentozowy. Jest on alternatywnym sposobem spalania glukozy u bakterii. Dostarcza prekursorów do syntezy węglowodanów, aminokwasów, kwasów nukleinowych. Trzeci: szlak Entnera-Doudoroffa, występuje rzadziej, powoduje spalanie glukozy, ale jest mniej wydajny energetycznie, dostarcza prekursorów do syntezy nukleotydów. Metabolitem pośrednim tych szlaków jest aldehyd 3-fosfoglicerynowy, przekształcany następnie do kwasu pirogronowego. Kwas ten ulega dalszym przemianom na drodze oddychania tlenowego, beztlenowego lub fermentacji. 53 Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie niezmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są zwykle degradowane przez esterazy, enzymy o szerokiej swoistości substratowej. Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności – na przykład lecytynazę. Obecność tych enzymów u bakterii jest jedną z cech wykorzystywanych w ich identyfikacji. Metody Diagnostyka bakteriologiczna Standardowe postępowanie zależy od rodzaju materiału i spodziewanych drobnoustrojów. Zwykle rozpoczyna je charakterystyka mikroskopowa badanej próbki. Barwienie metodą Grama pomaga ocenić materiał i wybrać rodzaj podłoża do pierwszego posiewu. Można posłużyć się metodami fenotypowymi, na które składają się: charakterystyka wzrostu na podłożach, na których dokonano izolacji (pierwszego posiewu materiału); otrzymanie czystej hodowli i charakterystyka morfologii kolonii oraz opis mikroskopowego obrazu komórek bakterii; próby biochemiczne badające właściwości sacharolityczne, proteolityczne, lipolityczne, utleniająco-redukujące; badanie właściwości serologicznych (poszukiwanie charakterystycznych antygenów) lub metodami genotypowymi (badającymi genom) w których stosuje się techniki biologii molekularnej i poszukuje charakterystycznych dla danych bakterii markerów (sekwencji nukleotydów). Znalazły one swoje miejsce w diagnostyce bakterii odpowiedzialnych za szereg chorób uzupełniając fenotypowe metody identyfikacyjne, skracając czas badania, a w przypadku drobnoustrojów wolno rosnących na podłożach sztucznych czy też w ogóle nie dających się na nich hodować stały się niezastąpione. 54 W określaniu właściwości biochemicznych wykorzystuje się przede wszystkim reakcje kataboliczne, a więc zdolność rozkładu szeregu związków, który możliwy jest dzięki obecności w komórkach bakterii odpowiednich enzymów. W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi, próby oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie, poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii. Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą w nich mieć także takie cechy, jak morfologia mikroskopowa bakterii i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze z krwią), wytwarzanie enzymów (np. katalazy, oksydazy), czy też charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych gatunków próby, takie jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce) stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi. Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne: związane z metabolizmem azotowym, związane z metabolizmem węglowodanów, związane z metabolizmem lipidów, związane z procesami oddechowymi (enzymy redukująco-utleniające). Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne, należą do grupy pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób w najczęściej stosowanych wariantach. 55 Metabolizm azotowy Badanie enzymów proteolitycznych Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa) Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok. 22°C) ma konsystencję stałą, ale w cieplarce (37°C) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji ulega stałemu upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury. Właściwości proteolityczne - rozkład kazeiny mleka Zdolność do wytwarzania kazeinazy sprawdza się posiewając bakterie na podłoże agarowe z dodatkiem 10% odtłuszczonego mleka. Po 48 godzinach inkubacji w 37°C można zaobserwować przejaśnienie wokół kolonii produkujących ten enzym. Badanie rozkładu aminokwasów i wytwarzania produktów ich przemian Deaminacja fenyloalaniny W celu sprawdzenia zdolności bakterii do deaminacji fenyloalaniny posiewa się je na podłoże z dodatkiem D-α-fenyloalaniny. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C nakrapla się 10% roztwór chlorku żelazowego. Zielone zabarwienie świadczy o wyniku dodatnim. Próbę można wykonać na podłożu płynnym lub stałym. Dekarboksylacja aminokwasów na podłożu Falkowa Podłoże Falkowa wykorzystuje się do badania zdolności bakterii do dekarboksylacji aminokwasów w warunkach beztlenowych. Wyjściowo ma ono barwę fioletową, a w swoim składzie zawiera glukozę oraz lizynę, ornitynę bądź argininę jako substrat i purpurę bromokrezolową jako wskaźnik. W celu wykonania tego testu bakterie należy posiać na dwie probówki: jedną z pełnym podłożem Falkowa, a drugą z podłożem kontrolnym bez badanego aminokwasu. Obie probówki należy pokryć płynną parafiną. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C ocenia się wynik. Jeśli po tym czasie oba podłoża są żółte - świadczy to o braku zdolności do dekarboksylacji w tych warunkach. Za wynik dodatni przyjmuje się żółte zabarwienie probówki kontrolnej i fioletowe probówki zawierającej w podłożu badany aminokwas. W początkowym etapie wzrostu bakterie 56 wykorzystują glukozę, co powoduje zakwaszenie podłoża i zmianę jego barwy na kolor żółty. Późniejsza dekarboksylacja aminokwasu powoduje ponowną alkalizację podłoża i powrót do barwy fioletowej. Wytwarzanie indolu z tryptofanu Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą DL-tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C na podłoże należy nawarstwić zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli bakterie rozłożyły tryptofan, pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej warstwie pożywki. Rozkład mocznika Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe. Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez bakterie H2S, ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka i na skos. Wynik odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37°C. Wytwarzany siarkowodór reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek żelaza powoduje zaczernienie podłoża. Metabolizm węglowodanów Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych wymaganiach Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową (fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy (zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji 57 w 37°C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym szeregiem cukrowym. Podłoże Schaedlera dodatkiem 1% cukru Podłoże Schaedlera pozwala na ocenę rozkładu cukrów przez bakterie beztlenowe. Zawiera ono wyciąg mięsny, wyciąg drożdżowy, pepton, chlorowodorek cysteiny mający na celu obniżenie potencjału oksydoredukcyjnego oraz badany cukier w stężeniu 1%. Posiane bakterie inkubuje się w warunkach dla nich optymalnych, po czym dodaje się purpurę bromokrezolową jako wskaźnik pH. W przypadku fermentacji danego cukru pojawia się, wynikające z zakwaszenia żółte zabarwienie podłoża. Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy - podłoże MacConkeya Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Zawiera ono sole żółciowe i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej wybiórczości i hamują wzrost bakterii gramdodatnich. Jest to także podłoże diagnostyczne, gdyż zawarta w nim laktoza, jeśli jest rozkładana (przez bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko, co manifestuje się różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika - czerwieni obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii w kolorze nieposianej pożywki. Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na podłożu Hugh-Leifsona Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym, wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia, jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nierozkładających cukru, barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast, jeśli bakterie rozkładają cukier tylko w warunkach tlenowych, zmienia się barwa pożywki w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji. 58 Określanie produktów fermentacji glukozy - Próba Voges-Proskauera Bakterie posiewa się na podłoże Clarka. Zawarta w nim glukoza rozkładana jest do kwasu pirogronowego, a dalej do różnych produktów końcowych m.in. do acetoiny. Acetoinę wykrywamy po 48-72 godzinach inkubacji dodając 0,5 mL roztworu KOH, a po wymieszaniu 0,2 mL alkoholowego roztworu α-naftolu. Hodowlę po ponownym wymieszaniu odstawia się na 15 minut. Pojawiające się karminowe zabarwienie powstaje w wyniku utlenienia acetoiny w obecności tlenu do diacetylu, reagującego następnie w obecności α-naftolu z obecną w peptonie resztą guaninową argininy. - Próba MR (Metyl-Red) Próbę MR wykonuje się także na podłożu Clarka. Po inkubacji należy dodać do pożywki kilka kropli czerwieni metylowej. Pojawienie się barwy czerwonej świadczy o zakwaszeniu podłoża do pH poniżej 4,5 powstałego wskutek fermentacji glukozy do silnych kwasów organicznych. Barwa żółta świadczy o pH wyższym niż 4,5 i taki wynik jest uznawany za ujemny. Metabolizm lipidowy Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80 W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80 (polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce jonami wapnia, powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł wapniowych. Wytwarzanie lecytynazy na agarze z żółtkiem jaja kurzego W celu sprawdzenia zdolności do wytwarzania przez bakterie enzymu – lecytynazy, należy je posiać na podłoże agarowe zawierające żółtko jaja kurzego. Pojawiająca się po 24 godzinach inkubacji w 37°C strefa zmętnienia wokół linii posiewu lub kolonii świadczy o wyniku dodatnim. 59 Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących Wytwarzanie reduktazy azotanowej Zdolność bakterii do redukcji azotanów do azotynów można sprawdzić metodą sulfanilową, posiewając je na pożywkę zawierającą azotan potasu. Po inkubacji (24 godziny w 37°C) do hodowli dodaje się kilka kropli odczynnika Griessa. W skład tego odczynnika wchodzą w proporcji 1:1 roztwory kwasu sulfanilowego i α-naftyloaminy w kwasie octowym. W środowisku kwaśnym kwas sulfanilowy ulega diazowaniu jonami azotynowymi, po czym łącząc się z α-naftyloaminy daje ciemnoczerwoną barwę. Wytwarzanie katalazy Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą o obecności katalazy. Wytwarzanie oksydazy cytochromowej Enzym – oksydaza cytochromowa odpowiada za przenoszenie elektronów na tlen w końcowym etapie oddychania tlenowego. Obecność tego enzymu sprawdza się rozcierając masę bakteryjną pobraną z podłoża przy użyciu plastikowej pałeczki na pasku bibuły zwilżonym 1% wodnym roztworem chlorowodorku di- lub tetra-metylo-p-fenylenodiaminy. Nie należy używać metalowej ezy. Próbę można także wykonać przez nalanie odczynnika bezpośrednio na hodowlę bakterii na pożywce stałej. Granatowe zabarwienie świadczy o wyniku dodatnim testu. Istotne jest przygotowanie odczynnika tuż przed użyciem poprzez rozpuszczenie w probówce substancji - 10 mg w 1 mL destylowanej. 60 Redukcja błękitu metylenowego W stężeniach nietoksycznych dla bakterii błękit metylenowy może, pod nieobecność tlenu, pełnić rolę sztucznego akceptora protonów. Jest wtedy redukowany przez niektóre drobnoustroje za pomocą dehydrogenaz do bezbarwnego leukozwiązku. Próbę przeprowadza się na podłożu płynnym zawierającym mleko i błękit metylenowy. Hodowle inkubuje się w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Białe zabarwienie pożywki świadczy o redukcji błękitu metylenowego. Wytwarzanie fosfatazy Fosfataza jest enzymem katalizującym odłączanie reszty fosforanowej od takich związków, jak tłuszcze, białka czy węglowodany. Jej obecność sprawdza się na podłożu płynnym lub stałym z dodatkiem soli sodowej difosforanu fenoloftaleiny. O wyniku dodatnim świadczy różowa barwa powstała po dodaniu kilku kropel NaOH lub stężonego amoniaku. Jest ona wynikiem odłączenia przez fosfatazę reszty fosforanowej i uwolnienia fenoloftaleiny. Badanie zdolności hemolitycznych bakterii Hemolizyny bakteryjne są cytolizynami, które niszczą krwinki czerwone ludzi i zwierząt. Zdolność wytwarzania ich przez bakterie można wykazać na podłożu agarowym zawierającym dodatek 5% odwłóknionej krwi baraniej lub ludzkiej. Podłoże takie jest jednocześnie podłożem diagnostycznym, jak i wzbogaconym. Bakterie posiewa się redukcyjnie, a następnie inkubuje w optymalnych dla nich warunkach. W pobliżu kolonii wytwarzających hemolizyny pojawiają się charakterystyczne zmiany. Wyróżnia się dwa typy hemolizy: α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej strefy wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu krwinek (przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny); β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne przejaśnienie wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy krwinek i wyługowania barwnika. 61 Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy szczepów. Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie wyników i przy użyciu książki kodowej zidentyfikowanie zwykle do gatunku. Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie niektórych cech biochemicznych bakterii wykorzystywanych do ich identyfikacji Opisz (narysuj) wszystkie przedstawione na ćwiczeniach demonstracje: Metabolizm azotowy 62 63 Metabolizm węglowodanowy 64 Metabolizm lipidowy 65 Enzymy oksydoredukcyjne Właściwości biologiczne 66 Szybkie testy biochemiczne 67 Zadanie 2. Określanie zapotrzebowań pokarmowych wybranych bakterii. Kwalifikacja podłoży - Otrzymujesz hodowle stałe: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella mobilis, Salmonella Enteritidis oraz pożywki: - agar z krwią, - agar z 7% NaCl, - podłoże MacConkeya, - podłoże Chapmana. - Drobnoustroje posiej ezą w sposób redukcyjny (przed posianiem odpowiednio podpisz płytki). - Na agar z krwią: S. aureus i S. epidermidis; - Na agar z 7% NaCl: S. aureus i Klebsiella mobilis; - Na podłoże Chapmana: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Klebsiella mobilis; - Na podłoże MacConkeya: Salmonella Enteritidis, Klebsiella mobilis i Staphylococcus aureus. - Inkubuj płytki w 37°C około 20 godzin. - Oceń posiewy, wyniki wpisz do tabeli. Rozkład laktozy Podłoże MacConkeya Wzrost Rozkład mannitolu Podłoże Chapmana Wzrost Hemoliza Wzrost Agar z 7% NaCl Agar z krwią Wzrost Drobnoustrój S. aureus 68 S. epidermidis K. mobilis S. Enteritidis Zakwalifikuj podłoża, na które posiewałeś do odpowiednich kategorii: Podłoże diagnostyczne to: Podłoże wybiórcze to: Podłoże diagnostyczno-wybiórcze to: 69 Zadanie 3. Analiza mieszanej hodowli w podłożu płynnym Otrzymujesz hodowlę płynną. Scharakteryzuj możliwie jak najdokładniej znajdujące się w niej bakterie. Badanie będziesz wykonywał przez trzy dni. Pierwszy dzień badania Wykonaj preparat z hodowli, zabarw go metodą Grama, oceń pod mikroskopem. Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. Ile rodzajów bakterii można odróżnić? Kształt bakterii i ich układ (rysunek) Kształt bakterii i ich układ (opis) 70 - Posiej redukcyjnie badaną hodowlę na następujące pożywki: - płytkę agarową, - płytkę krwawą, - podłoże MacConkeya, - Posiewy umieść w cieplarce (37°C) na 20 godzin. Cechy bakterii Wymagania odżywcze płytka agarowa płytka krwawa podłoże MacConkeya Drugi dzień badania - Oceń posiewy. Wpisz w tabelę najważniejsze cechy bakterii, które możesz ocenić za pomocą zaproponowanych podłóż. - Określ wygląd i liczbę rodzajów kolonii na każdej z płytek. - Wykonaj z poszczególnych kolonii preparaty barwione metodą Grama i oceń ich obrazy mikroskopowe. Obserwacje zapisz w skonstruowanej przez siebie tabeli pokazującej wyniki posiewów mieszanej hodowli na różne podłoża (zależność: rodzaj podłoża, wygląd kolonii, obraz mikroskopowy). 71 72 - Posiej redukcyjnie różniące się od siebie kolonie na wybrane, wymienione powyżej pożywki, dobierając je tak, aby zbadać wszystkie możliwe do określenia cechy biochemiczne badanych bakterii. - Posiej bakterie, aby następnego dnia móc zbadać wytwarzanie przez nie tryptofanazy. - Posiewy inkubuj w temperaturze 37°C przez ok. 20 godzin. Trzeci dzień badania - Oceń hodowle na płytkach i odczytaj próbę na indol. Sprawdź, czy wytwarzana jest katalaza metodą na szkiełku podstawowym. - Wyniki obserwacji z trzech etapów doświadczenia wpisz do tabeli. Cechy mikroskopowe bakterii z badanej hodowli (wyjściowej) kształt, układ, barwienie Cechy fizjologiczne bakterii z badanej hodowli (wyjściowej) hemoliza laktoza katalaza indol 73 74 Rozdział 6 Liczenie bakterii Część teoretyczna Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach mikrobiologii. Jest ono wykonywane w diagnostyce laboratoryjnej w ocenie liczby bakterii w moczu, ale także w ocenie czystości mikrobiologicznej leków, kosmetyków i żywności, w badaniu bakteriologicznym wody, ścieków, powierzchni produkcyjnych i powietrza, przy produkcji szczepionek, w kontroli skuteczności działania środków myjących i dezynfekujących. Oznaczać można całkowitą liczbę bakterii, to znaczy łącznie komórki żywe i martwe lub tylko liczbę żywych komórek. Obliczanie całkowitej liczby komórek można wykonać mikroskopowo przez bezpośrednią obserwację i liczenie komórek bakteryjnych w preparacie barwionym, w hemacytometrach, np. kamerze Thoma, na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości. Bakterie obecne na sączku barwi się najczęściej błękitem metylenowym lub roztworem erytrozyny. Metoda stosowana jest na przykład przy badaniu wody i ścieków. Można też posłużyć się metodami turbidymetrycznymi - porównując zmętnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie komórek - wzrokowo lub za pomocą fotometru. Przy stosowaniu tych metod potrzebne są krzywe wzorcowe odnoszące liczbę komórek (policzonych innymi metodami) do gęstości optycznej zawiesiny. Całkowitą liczbę bakterii można też określić metodami chemicznymi – przez oznaczenie całkowitego azotu, fosforu, białek lub kwasów nukleinowych. Metoda ma zastosowanie głównie w pracach badawczych. Liczbę żywych, to znaczy zdolnych do podziału, komórek bakteryjnych oznacza się wymienionymi poniżej metodami hodowlanymi. 75 Metoda posiewu na podłoże stałe (metoda płytkowa) – polega na liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpływem sił grawitacyjnych metoda Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowozderzeniowa) osiadaniu bakterii na powierzchni podłoża. Metoda stosowana jest przy badaniu czystości mikrobiologicznej powietrza. Metoda płytek odciskowych – wykorzystuje podłoże agarowe, tworzące w płytce Petriego menisk wypukły, który przykłada się na kilka sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie, a wynik ocenia w zależności od przyjętych kryteriów. Metoda służy do monitorowania mikrobiologicznego skażenia powierzchni szpitalnych i przemysłowych (ściany, podłogi, sprzęt). Metoda posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane) jest najczęściej stosowana w praktyce laboratoryjnej. Dotyczy przede wszystkim preparatów o spodziewanej dużej liczbie drobnoustrojów, dlatego konieczne jest wstępne wielokrotne rozcieńczenie badanej próbki. Metoda posiewu na podłoże płynne (metoda probówkowa) jest oznaczeniem najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL). Metoda filtrów membranowych - polega na przesączeniu określonej objętości badanego płynnego preparatu przez odpowiedni filtr. Filtr ten nakłada się następnie na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji liczy się wyrosłe na sączku kolonie. Żywe bakterie można zliczyć także innymi metodami. Jedna z nich jest metodą mikroskopową (bezpośrednia epifluorescencja), w której barwi się barwnikiem fluorescencyjnym żywe bakterie na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości. Metoda ta stosowana jest w przemyśle mleczarskim do oceny bakteriologicznej mleka surowego. Można także zastosować metody pośrednie. Są to metody szybkie, ponieważ skracają zwykle 24-48-godzinny (lub dłuższy) okres inkubacji typowy dla metod hodowlanych, ale wymagają drogiej aparatury i odczynników. 76 Jedną z nich jest luminometria - pomiar chemiluminescencji lub bioluminescencji, będącej efektem hydrolizy adenozynotrójfosforanu ATP, obecnego w każdej żywej komórce. Metoda stosowana jest w kontroli czystości mikrobiologicznej powierzchni produkcyjnych, urządzeń i rękawic na rękach pracowników w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym, przy badaniu żywności, czystości wody pitnej, a także kontroli skuteczności działania środków myjących i dezynfekujących. Można także zastosować metody manometryczne – dokonując pomiaru zużycia O2 lub wytwarzania CO2 przez rosnące drobnoustroje. Metoda hodowlana z użyciem pożywki o zmienionych parametrach elektrycznych pozwala na szybkie wykrycie drobnoustrojów, które namnażając się wytwarzają silnie zjonizowane metabolity. Znajduje ona zastosowanie między innymi w biodetektorach służących do oceny skażenia mikrobiologicznego środowiska. Każda z tych metod wymaga odpowiedniej standaryzacji, aby pomiar mógł być ilościowy. Metody Standaryzacja zawiesin bakteryjnych Badania mikrobiologiczne wymagają niekiedy zastosowania standaryzacji gęstości zawiesin czy hodowli tak, aby do badań używać próbek o powtarzalnej liczbie bakterii. Najczęściej stosuje się standaryzację według powszechnie przyjętego wzorca zmętnienia - skali opracowanej przez McFarlanda. W skład zestawu tej skali wchodzi kilka probówek zawierających mieszaniny 1% roztworu chlorku baru i 1% roztworu kwasu siarkowego. Zmętnienie powstałe w wyniku wytrącenia się osadu siarczanu baru optycznie przypomina bardzo zmętnienie, jakie tworzy w wodzie zawiesina bakterii. Odpowiednia standaryzacja uzyskana poprzez liczenie bakterii różnymi metodami pozwoliła przypisać odpowiedniemu określonemu numerem zmętnieniu wzorca, odpowiednią gęstość zawiesiny bakterii. Porównania zmętnienia badanej zawiesiny bakteryjnej ze zmętnieniem w probówkach skali McFarlanda dokonuje się 77 wzrokowo lub przy użyciu prostego, przenośnego nefelometru. Pozwala ono na oszacowanie liczby bakterii w 1 mL zawiesiny. Ważnym czynnikiem decydującym o dokładności odczytu jest przygotowanie badanej zawiesiny w probówce z takiego samego szkła i o takiej samej średnicy, jak probówki ze wzorcem skali McFarlanda. Ta metoda określania całkowitej liczby bakterii martwych i żywych jest wykorzystywana przy standaryzacji zawiesin bakteryjnych przed wykonaniem antybiogramu czy testów identyfikacyjnych. Wzorce zmętnienia wg skali McFarlanda można przygotować w każdym laboratorium mikrobiologicznym mieszając określone objętości roztworu chlorku baru z kwasem siarkowym. Można także korzystać z gotowych numerowanych wzorców skali McFarlanda oferowanych przez różnych producentów. Przyjęte numery wzorców i odpowiadające im wartości CFU/mL podano dalej, w tabeli w zadaniu 1. Rozcieńczanie hodowli bakterii dla potrzeb liczenia bakterii żywych Płyny zawierające dużą liczbę bakterii należy przed posiewem rozcieńczyć metodą seryjnych rozcieńczeń tak, aby zawierały zawiesiny komórek policzalnych metodą posiewu. Stopień rozcieńczenia musi być znaczny, gdyż na płytkę o średnicy ok. 9 cm posiewa się 0,1 mL zawiesiny, a jako 2 osobne (policzalne) może się na niej utworzyć najwyżej 300 (3x10 ) kolonii. Tymczasem hodowla płynna większości bakterii zawiera przeciętnie 107-1012 komórek bakterii w mililitrze. Najczęściej wykonuje się szereg kolejnych 10- krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym. Rozcieńczenia wykonuje się następująco: do szeregu, najczęściej 7 do 12 probówek, nalewa się po 9 mL fizjologicznego roztworu NaCl; do pierwszej dodaje się 1 mL rozcieńczanej zawiesiny; następnie przenosi się po 1 mL zawiesiny z probówki do probówki tak jak pokazuje to schemat na poniższej rycinie; z ostatniej probówki, po wymieszaniu 1 mL wylewa się do słoja ze środkiem dezynfekcyjnym. Rozcieńczenia wykonuje się przy użyciu szklanych jałowych pipet lub pipet automatycznych z jałowymi końcówkami. Trzeba pamiętać, aby po 78 wymieszaniu zawartości każdej probówki i przeniesieniu 1 mL do następnej zmienić pipetę lub końcówkę pipety automatycznej. Unika się w ten sposób błędu wynikającego z przylegania bakterii do szkła czy plastiku. W niektórych sytuacjach wykonuje się szereg 100-krotnych rozcieńczeń. Wtedy przenosi się po 0,1 mL hodowli do kolejnych probówek zawierających po 9,9 mL fizjologicznego roztworu NaCl. Ten sposób, choć wymaga użycia mniejszej liczby probówek, obarczony jest jednak większym błędem. Rycina 1. Schemat wykonywania 10-krotnych rozcieńczeń 1 mL hodowli 9 mL roztworu NaCl wielokrotność rozcieńczenia 101 102 103 104 105 106 107 108 109 Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże stałe Liczenie żywych bakterii metodą posiewu na podłoże stałe polega na liczeniu powstających z nich kolonii. Liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek lub dokładniej - liczbie jednostek tworzących kolonie (jtk; CFU – ang. colony forming units). Liczenia bakterii żywych dokonuje się metodą posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane). 79 Posiew powierzchniowy polega na rozprowadzeniu zagiętą ezą lub głaszczką na powierzchni płytek z podłożem po 0,1 mL wybranych rozcieńczeń badanego materiału. Na płytki o średnicy większej niż 10 cm można nanieść odpowiednio więcej zawiesiny. W wyniku takiego posiewu uzyskuje się wzrost w postaci kolonii na powierzchni agaru. Posiew głębinowy polega na wlaniu do jałowych płytek Petriego po 1 mL zawiesiny z poszczególnych rozcieńczeń, zalaniu roztopionym i przestudzonym agarem i wymieszaniu. W wyniku takiego posiewu uzyskuje się wzrost w postaci kolonii zarówno na powierzchni, jak i w głębi agaru. Kolonie w głębi agaru są znacznie mniejsze i różnią się też kształtem (często są soczewkowate). Najczęściej przygotowuje się płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń. Aby zmniejszyć błąd, którym obarczone są obie metody, z każdego rozcieńczenia sporządza się po trzy płytki, z których wylicza się średnią liczbę wyrosłych kolonii. Na płytce łatwo odróżnić jako pojedyncze około 300 kolonii, które można policzyć korzystając z licznika kolonii. Gdy na płytce wyrosło więcej kolonii, należy wyliczyć średnią liczbę kolonii 2 2 przypadającą na 1 cm (zliczając kolonie z 10 cm ). Liczbę kolonii na całej płytce oblicza się uwzględniając pole jej powierzchni (P = Пr2). Liczba kolonii wyrosłych na płytce pomnożona przez rozcieńczenie i przeliczona na 1 mL materiału wyjściowego daje nam liczbę żywych komórek bakteryjnych w badanej zawiesinie. Bakterie w zawiesinie można też policzyć metodą Milesa i Misry’ego. Jest ona modyfikacją posiewu powierzchniowego zalecaną do badania próbek zawierających około 100 CFU/mL. Przy spodziewanej większej liczbie bakterii wymagane jest wstępne rozcieńczenie. Z każdego rozcieńczenia badanego materiału pobiera się małą jego objętość (np. 5-50 L) i nakrapla w oznaczonym miejscu powierzchni płytki z odpowiednim stałym podłożem. Po inkubacji ocenia się wzrost bakterii w miejscu nakroplenia. W przypadku dużej liczby bakterii będzie to wzrost w postaci „murawy”. Wraz z kolejnymi rozcieńczeniami uzyskuje się wzrost pojedynczych kolonii. Znając liczbę kolonii, objętość kropli i współczynnik rozcieńczenia można obliczyć liczbę żywych bakterii w badanym materiale. 80 We wszystkich tych metodach liczbę żywych bakterii w dodanej do podłoża próbce można obliczyć ze wzoru: Liczba żywych bakterii = liczba kolonii x rozcieńczenie/objętość próbki [mL] Liczenie bakterii membranowe żywych metodą sączenia przez filtry Metoda ta służy do określania liczby żywych bakterii w płynach zawierających niewielką ich ilość. Znalazła ona zastosowanie w oznaczaniu liczby bakterii w wodzie pitnej, płynnych artykułach spożywczych, kosmetykach czy lekach zawierających substancje przeciwbakteryjne. Metodą sączenia przez filtry membranowe możemy oznaczać całkowitą liczbę bakterii lub, gdy zastosujemy odpowiednie podłoża diagnostycznowybiórcze, określone ich grupy – rodzaje, a nawet gatunki. Przez filtr membranowy sączona jest próbka o określonej objętości. Filtr następnie przenosi się na powierzchnię podłoża w płytce Petriego. Składniki podłoża, dyfundując przez pory sączka, umożliwiają wzrost w postaci kolonii. Po policzeniu wyrosłych kolonii przelicza się otrzymaną wartość na jednostkę objętości (np. mL) próbki lub określa liczbę bakterii w całej objętości sączonego płynu. W celu zatrzymania na sączku wszystkich bakterii obecnych w badanym materiale należy zastosować filtr membranowy o wielkości porów 0,22 µm. Na filtrze o wielkości porów 0,45 µm zatrzyma się tylko część bakterii, ale wszystkie komórki i zarodniki grzybów. Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże płynne W metodzie tej, zwanej probówkową, liczbę bakterii ocenia się na podstawie występowania lub braku wzrostu na pożywkach płynnych, do których uprzednio wprowadzono odpowiednie objętości rozcieńczeń badanej próbki. 81 Jest to badanie określające najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) (ang. most probable number, MPN) bakterii obecnych w preparacie. Odczytywanie wyników oparte jest na statystycznym obliczeniu prawdopodobieństwa występowania wzrostu drobnoustrojów w zależności od ich liczby w próbce. Dokładność metody NPL jest mniejsza niż innych metod hodowlanych. Metoda NPL jest zalecana tylko w sytuacji, gdy nie może być zastosowana inna metoda. Badanie polega na przygotowaniu kolejnych w postępie geometrycznym, 10-krotnych rozcieńczeń badanego preparatu. Następnie próbki każdego z nich posiewa się, w trzech powtórzeniach, na podłoża płynne. Na podstawie wzrostu lub jego braku w próbkach z odpowiednich rozcieńczeń wnioskuje się o ilości bakterii w preparacie. Służą do tego tablice statystyczne, z których oblicza się najbardziej prawdopodobną liczbę bakterii (lub grzybów) występującą w jednostce wagowej lub objętościowej preparatu. Metoda NPL może być zastosowana zarówno do oceny ogólnej zanieczyszczeń mikrobiologicznych badanego materiału, jak i w badaniach ukierunkowanych, zmierzających do oznaczenia wybranych bakterii. Metodę probówkową stosuje się do określenia prawdopodobnej liczby bakterii grupy coli i/lub Escherichia coli w wodzie. Metoda NPL wymieniona jest także w Farmakopei Polskiej IX przy badaniu czystości mikrobiologicznej leków i surowców farmaceutycznych. Stosowana jest także przy badaniu żywności. Zadania do wykonania Zadanie 1 Standaryzacja zawiesin bakteryjnych - Zmyj ze skosu bakterie: nalej z butelki fizjologiczny roztwór NaCI (do połowy skosu) i zawieś w nim bakterie mieszając zawartość ruchem rotacyjnym. Nie wstrząsaj! - Przelej jałowo zawiesinę do probówki. Twoim zadaniem jest określić liczbę komórek w 1 mL tej zawiesiny. 82 - Odpipetuj 0,1 mL tej zawiesiny do drugiej probówki zawierającej 9,9 mL 2 roztworu NaCl (uzyskasz rozcieńczenie 10 ). - Zmętnienie zawiesiny porównaj z wzorcami skali McFarlanda. - Oblicz liczbę wszystkich bakterii - żywych i martwych w 1 mL badanej zawiesiny (uwzględnij wykonane rozcieńczenie). Skala McFarlanda Numer wzorca standardu 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Liczba bakterii (CFU/ mL) 8 1,5 x 10 8 3 x 10 6 x 108 8 9 x 10 1,2 x 109 1,5 x 109 1,8 x109 2,1 x109 9 2,7 x10 9 3 x 10 Zadanie 2. Liczenie bakterii metodą posiewu powierzchniowego i głębinowego - Rozcieńcz hodowlę płynną Staphylococcus epidermidis 108 razy. - W metodzie posiewu powierzchniowego posiej zawiesinę z trzech ostatnich rozcieńczeń (po 0,1 mL). - W metodzie posiewu głębinowego z trzech kolejnych rozcieńczeń pobierz po 1 mL i wykonaj płytki lane. - Po inkubacji (37°C, 24 godz.) policz kolonie wyrosłe na każdej płytce. Zwróć uwagę, że w posiewie głębinowym kolonie wyrastają w całej objętości podłoża. - Wpisz swoje dane do tabeli. 83 - Uwzględniając rozcieńczenie i ilość posiewanego materiału, oblicz liczbę bakterii w 1 mL nierozcieńczonej hodowli. Tabela. Wyniki doświadczenia Liczba kolonii na płytce Rozcieńczenie hodowli w probówce, z której posiewano Liczba żywych bakterii w 1 mL hodowli Posiew Posiew powierzchniowy głębinowy Posiew Posiew powierzchniowy głębinowy Posiew Posiew powierzchniowy głębinowy 1 2 3 Śr . - Otrzymane wyniki powinny być zbliżone, wylicz z nich średnią. 84 Zadanie 3. Liczenie bakterii metodą sączenia przez filtry membranowe - Używając jałowego zestawu przesącz przez filtr membranowy 100 mL wody wodociągowej. - Ułóż filtr (jałową pęsetą) na powierzchni płytki z podłożem diagnostycznym w taki sposób, aby górna strona sączka, na której zostały zatrzymane bakterie, zwrócona była ku górze. W przypadku badania mikrobiologicznego wody, przy poszukiwaniu bakterii grupy coli, możemy stosować podłoże Endo. - Po inkubacji (37°C, 24 godz.) policz kolonie wyrosłe na powierzchni sączka i oceń różnice w ich wyglądzie. Gramujemne pałeczki z grupy coli: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter należące do rodziny Enterobacteriaceae wyrastają w postaci różowych kolonii. Zwróć uwagę na kolonie o barwie różowokarminowej z metalicznym połyskiem - tak wyrasta Escherichia coli. W 100 mL wody pitnej wymagana jest nieobecność Escherichia coli i bakterii grupy coli. 85 Zadanie 4. Liczenie bakterii w moczu Badany mocz rozcieńczono 1000x i wysiano powierzchniowo (0,1 mL). Po 24 godzinach inkubacji policzono kolonie. Było ich 84. Podaj liczbę bakterii w 1 mL moczu. 86 Rozdział 7 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie plazmidów. Część teoretyczna Genom bakterii stanowi jego pojedynczy chromosom – nukleoid, a także elementy pozachromosomalne – plazmidy. Stanowiące wyposażenie genowe sekwencje DNA bakterii stanowią ich genotyp. Jest to zapis informacji o wszystkich potencjalnych możliwościach komórki. Fenotyp to obserwowana, objawiająca się w określonym środowisku forma ekspresji tego genotypu. Genotyp zatem, określa granice fenotypu. Bakterie, w odróżnieniu od organizmów eukariotycznych, mają tylko jedną kopię swego materiału genetycznego, co sprawia, że jest on bardzo podatny na wszelkie zmiany. Źródłem zmian w obrębie genomu i nowej aranżacji genów bakteryjnych jest horyzontalny transfer genów związany z rekombinacją, a także mutacje oraz ruchome elementy genetyczne takie, jak plazmidy, bakteriofagi czy elementy transpozycyjne. Mutacje i ich naprawa Mutant to zmieniona postać bakterii, różna od organizmu wyjściowego – postaci dzikiej. Różnica dotyczy genotypu i może być widoczna także na poziomie fenotypu. Zmiany mutacyjne mogą polegać na drobnych uszkodzeniach pojedynczych nukleotydów (mutacje punktowe), mogą także dotyczyć dłuższych fragmentów łańcucha DNA (mutacje chromosomowe). Mutacje punktowe mogą prowadzić do zmiany sensu kodu genetycznego i powodować wbudowanie innego aminokwasu do białka. Mogą one także być nonsensowne i niespodziewanie kończyć syntezę białka, ale mogą także zmieniać ramki odczytu, powodując duże zmiany w syntetyzowanym 87 białku. Te dwa ostatnie rodzaje mutacji punktowych prawie zawsze objawiają się fenotypowo. Mutacje chromosomalne prowadzą do zmian w obrębie dużych odcinków DNA i zazwyczaj są letalne – prowadzą do śmierci komórek. W czasie replikacji DNA może dojść do mutacji wynikających ze wstawienia błędnych nukleotydów, czy przesunięcia matrycy w stosunku do nowo syntetyzowanej nici. Są to mutacje spontaniczne. Występują one dość rzadko – w jednej na kilka milionów rund replikacji. Częstość mutacji ulega znacznemu zwiększeniu pod wpływem różnych czynników, zarówno fizycznych, jak i chemicznych, nazywanych mutagenami. Ten rodzaj mutacji to mutacje indukowane. Mutacje takie zachodzą ze znacznie większą częstością – zmutować może nawet jedna na tysiąc komórek. Czynnikami mutagennymi mogą być różne związki chemiczne jak też czynniki fizyczne. Mutacja, która utrwaliła się w komórce, może ulec odwróceniu – mamy wtedy do czynienia z mutacją powrotną. Może ona zajść na drodze rewersji, czyli odtworzenia pierwotnego genotypu lub supresji, czyli zmiany prowadzącej do odtworzenia jedynie efektu fenotypowego. Bakterie wykształciły wiele systemów naprawczych i potrafią bardzo skutecznie bronić się przed uszkodzeniami DNA. Jest kilka mechanizmów tej naprawy. Wśród nich jest system nazywany SOS. System ten kontrolowany jest przez wiele genów. Ich produkty naprawiają DNA generując jednak wiele błędów i prowadząc do nowych zmian mutacyjnych. Często są one letalne, ale mogą też być korzystne, umożliwiając adaptację do nowych warunków. W systemie tym działa polimeraza DNA V zdolna do syntezy krótkich odcinków DNA bez udziału matrycy. Plazmidy Dodatkowe elementy genetyczne występujące w wolnej postaci w cytoplazmie bakterii to plazmidy. Są one autonomiczną pętlą DNA, replikującą się niezależnie od nukleoidu i chociaż nie są niezbędne do życia 88 komórki, mogą zwiększyć jej zdolności adaptacyjne do środowiska. Wielkość plazmidów (liczba par zasad tworzących sekwencje DNA) jest zróżnicowana. Mogą one być nośnikami wielu genów, a co za tym idzie, cech komórek. Plazmidy mają określony zakres komórek – gospodarzy, w których mogą przebywać. Są plazmidy o wąskim zakresie i o szerokim zakresie gospodarzy (BHR; ang. broad host range), mogące być przeniesione niemal do każdej bakterii. Plazmidy mogą zawierać + kompletny system koniugacyjny (Tra ), który umożliwia im przenoszenie komórki do komórki na drodze koniugacji. Są to tzw. plazmidy koniugacyjne. Szczególnie ważne dla praktyki klinicznej są plazmidy niosące takie cechy, jak oporności na chemioterapeutyki i antybiotyki, sole metali ciężkich oraz środki dezynfekcyjne. Przekazanie takich plazmidów z komórki do komórki może zachodzić między szczepami, gatunkami, a nawet rodzajami bakterii, prowadząc do rozprzestrzeniania się fenotypu oporności na stosowane leki przeciwbakteryjne. Znanych jest wiele koniugacyjnych plazmidów opornościowych określanych jako plazmidy R. Mogą one nosić geny oporności na szereg antybiotyków jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że geny oporności na antybiotyki mogą być ulokowane także w chromosomie bakterii, te rozprzestrzeniają się jednak ze znacznie mniejszą częstością. Metody Badanie kancerogenności z wykorzystaniem bakterii Ze względu na dużą wrażliwość bakterii na czynniki mutagenne i łatwość manipulacji genami tych organizmów wykorzystuje się je do wykrywania czy związki, które mają być wprowadzone do użytku człowieka nie mają właściwości rakotwórczych (kancerogennych). Właściwości te bowiem ściśle korelują ze zdolnością do powodowania mutacji (prowokowania mutagenezy). Popularnym testem stosowanym w takich badaniach jest test skonstruowany w latach 70-tych przez Amesa – amerykańskiego genetyka. Pozwala on ocenić czy badany związek jest mutagenem, a nawet określić 89 siłę działania mutagennego. Podstawą testu są odpowiednio skonstruowane szczepy Salmonella Typhimurium (np. TA97a, TA98 i TA102) mające mutacje różnych typów, uniemożliwiające im wytwarzanie w komórkach histydyny (są więc auksotrofami określanymi jako His-). W formie dzikiej bakterie te są prototrofami (His+) zdolnymi do syntezy tego niezbędnego do życia aminokwasu. Mutacje w szczepach są różnych typów: punktowe, dotyczące pojedynczych nukleotydów albo przesuwające otwartą ramkę odczytu. Mutanty te są ponadto szczególnie wrażliwe na działanie mutagenów ze względu na zwiększoną przepuszczalność ściany i upośledzenie mechanizmów naprawczych. W warunkach doświadczenia hodowle tych szczepów miesza się z badanym związkiem w środowisku, w którym nie ma histydyny. Jeżeli działanie badanej substancji spowoduje mutacje, będą one wielokierunkowe, a wśród nich pojawią się i takie, które zniosą działanie pierwotnej mutacji na drodze rewersji lub supresji i dadzą szansę syntezy histydyny, a tym samym wzrostu kolonii tego szczepu na podłożu bez tego aminokwasu. Im więcej takich kolonii, tym silniejsze działanie mutagenne badanego związku. W teście Ames’a do badanych mieszanin dodaje się frakcję mikrosomalną wątroby, zawierającą enzymy zdolne przekształcać badaną substancję tak, jak to się dzieje w organizmie człowieka. Pozwala to wykryć kancerogenność także tych związków, które cechę tę zyskują dopiero po transformacji metabolicznej. W badaniu stosuje się kontrolę pozwalającą każdorazowo obliczyć liczbę rewertantów powstających spontanicznie, bez obecności badanej substancji. Test Amesa można przeprowadzić w sposób klasyczny posiewając zawiesiny bakterii na płytki Petriego ze stałym podłożem minimalnym pozbawionym histydyny. O mutacji powrotnej świadczy zdolność wyrastania bakterii w postaci kolonii. Test Amesa fluktuacyjny przeprowadza się w minimalnym podłożu płynnym, niezawierającym histydyny, w 96 lub 384-dołkowych płytkach titracyjnych. Do podłoża dodany jest wskaźnik barwny wskazujący na mnożenie się szczepu. O rewersji świadczy zmiana barwy podłoża w dołku. 90 Oprócz testu Amesa są także systemy badania mutagenności wykorzystujące inne bakterie, np. Escherichia coli i jej mutanty niezdolne do rozkładania laktozy i tym samym wykorzystywania jej jako jedynego źródła węgla lub mutanty, które utraciły zdolność do syntezy tryptofanu. Zadania do wykonania Zadanie 1. Wykrywanie mutantów spontanicznych opornych na streptomycynę wśród komórek hodowli pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) - Wylej po 100 μL płynnej hodowli badanych bakterii na dwie płytki: - z podłożem Muellera-Hinton zawierającym 50 μg/mL streptomycyny, - z tym samym podłożem bez antybiotyku i rozprowadź materiał na powierzchni płytki zagięta ezą. - Po inkubacji w cieplarce 37°C przez 20 godzin oceń wzrost na obu płytkach i policz kolonie mutantów opornych na streptomycynę. 9 Przy założeniu, że w hodowli wyjściowej E. coli było około 10 żywych komórek w mililitrze, oblicz częstość mutacji spontanicznej (C). C = liczba mutantów w mL/ liczba wszystkich komórek w mL 91 Zadanie 2. Otrzymywanie indukowanych promieniami UV mutantów Proteus mirabilis ze zmienioną strukturą ściany komórkowej Bakterie gramujemne, do których należy pałeczka odmieńca (P. mirabilis), są z natury oporne na fiolet krystaliczny, który nie wnika do żywych komórek. Zmiana struktury ściany komórkowej umożliwia dotarcie barwnika do wnętrza komórek, powodując ich śmierć. - Zbierz wacikiem z hodowli agarowej „dzikiego” szczepu P. mirabilis bakterie rosnące w pobliżu położonego na płytce krążka z fioletem krystalicznym (na pewno oporne na fiolet). - Zawieś materiał w fizjologicznym roztworze NaCl. - Wlej zawiesinę do jałowej płytki Petriego. - Naświetlaj ją przez 15 sekund pod lampą UV. - Zanurz wacik w naświetlonej zawiesinie. - Posiej bakterie na kolejną płytkę, zasiewając dokładnie całą jej powierzchnię i umieść na środku zasianej płytki krążek nasycony fioletem krystalicznym - Po inkubacji w cieplarce 37°C przez ok. 20 godzin zinterpretuj wynik doświadczenia. Zaobserwowane zmiany w hodowli naświetlanego UV P. mirabilis w porównaniu do szczepu „dzikiego”: 92 Zadanie 3. Wykrywanie mutagenów chemicznych.Test Amesa (wersja uproszczona) - Trzy płytki z podłożem minimalnym (bez histydyny) podpisz 1, 2 i K. - Do dwóch probówek z roztopionym i ochłodzonym do temperatury ok. 50°C agarem powierzchniowym dodaj: - do pierwszej: 0,1 mL badanej substancji I, - do drugiej: 0,1 mL badanej substancji II. Trzecia probówka stanowić będzie kontrolę (nie dodajemy żadnej substancji). Do wszystkich trzech probówek dodaj po 0,1 mL hodowli bulionowej szczepu testowego Salmonella Typhimurium His-.. - Wylej zawartość probówek na odpowiednie płytki (płytka „K”- kontrola bez badanej substancji). - Po zestaleniu w temperaturze pokojowej warstwy agaru powierzchniowego, wstaw płytki do cieplarki 37°C i inkubuj przez 48 godzin. + - Policz wyrosłe kolonie rewertantów His na płytkach 1, 2 i K i oblicz indeks mutagenności (I) dla badanych substancji: I = Mi/ Ms Mi- liczba kolonii rewertantów indukowanych Ms - liczba kolonii rewertantów spontanicznych 93 Wiedząc, że: I < 1,7 – substancja nie działająca mutagennie 1,7 ≤ I ≤ 1,9 – substancja o potencjalnym działaniu mutagennym I > 1,9 – substancja o działaniu mutagennym wydaj opinię o badanych substancjach. Zadanie 4. Wykrywanie mutagenów chemicznych. Test reperacji DNA (wersja uproszczona) - Posiej wacikiem materiał z hodowli bulionowej Escherichia coli PolA+ (posiadającej polimerazę DNA) i hodowli Escherichia coli PolA- (bez genu polimerazy) na całe powierzchnie dwóch płytek agarowych. - Podziel płytki na trzy sektory i oznacz je: K+, K- i Bz. - Ułóż w sektorach na powierzchni zasianego agaru krążki bibułowe: K+ (kontrola pozytywna) – krążek z mitomycyną C (mutagen hamujący replikację DNA), K- (kontrola negatywna) – krążek z cefalotyną (antybiotyk blokujący syntezę ściany komórkowej, nie jest mutagenem), Bz – badany związek (nanieś na ułożony krążek 10 µL badanej substancji). 94 - Pozostaw dla dyfuzji substancji do podłoża na około 30 minut w temperaturze pokojowej. - Umieść płytki w cieplarce 37°C i inkubuj ok. 20 godzin. Podaj i zinterpretuj wynik doświadczenia Zadanie 5. Omówienie doświadczenia ilustrującego przekazywanie czynnika R in vitro. Geny determinujące oporność nabytą na antybiotyki są bardzo często zlokalizowane w plazmidach. Mogą być one przekazywane w procesie koniugacji od szczepu dawcy do biorcy. 1. Na podstawie antybiogramów oceń lekooporność: - “dawcy” Salmonella Enteritidis R+ 95 - ”biorcy” Escherichia coli R- 2. Hodowla płynna po zmieszaniu komórek „dawcy” i „biorcy” (krzyżówka) i inkubacji w cieplarce będzie zawierać: 96 3. Na płytce zawierającej podłoże minimalne z laktozą (jedyne źródło węgla) i streptomycynę, na którą posiano hodowlę po krzyżówce, wyrosły kolonie: 4. Powyższe kolonie przesiano na płytkę z pożywką diagnostyczną MacConkeya. Zinterpretuj wygląd otrzymanej hodowli: Jak wyglądają kolonie koniuganta (R+) na tym podłożu i czym jest to spowodowane? 97 5. Porównaj lekooporność szczepów biorących udział w doświadczeniu: Bakterie streptomycyna kanamycyna ampicylina tetracyklina dawca biorca koniugant 98 Rozdział 8 Oddziaływanie na bakterie w środowisku. Dezynfekcja i antyseptyka. Część teoretyczna Na kształt ekosystemów istotny wpływ mają czynniki fizyczne takie jak: temperatura, pH, wilgotność, ciśnienie osmotyczne, potencjał oksydoredukcyjny, a także promieniowanie. Związki chemiczne zawarte w środowisku mają także istotne znaczenie dla różnorodności i liczebności populacji żyjących w nim mikroorganizmów. Znajomość stopnia indywidualnej wrażliwości poszczególnych gatunków bakterii na te czynniki pozwala je namnażać w warunkach laboratoryjnych, ale także ograniczać ich rozprzestrzenianie, sprawować nad nimi kontrolę. Temperatura jest jednym z czynników najsilniej oddziałujących na drobnoustroje. Dla większości bakterii temperatura nieco poniżej 0oC jest bójcza, gdyż tworzące się kryształki lodu niszczą struktury komórki. Nagłe obniżenie temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera (–70oC), szczególnie w obecności glicerolu, nie uszkadza komórek i pozwala zachować żywotność przez długie okresy czasu, co wykorzystuje się przy przechowywaniu szczepów. Podwyższenie temperatury otoczenia powyżej maksymalnej temperatury kardynalnej powoduje śmierć drobnoustrojów. Drobnoustroje różnią się wrażliwością na podwyższoną temperaturę, większość z nich ginie po 30 minutach ogrzewania w temperaturze około 60oC, jednak niektóre z nich, a także zarodniki grzybów czy przetrwalniki bakterii, znoszą nawet bardzo wysokie temperatury. Inne warunki środowiskowe mogą wpływać na skutek działania wysokiej temperatury na drobnoustroje. W środowisku wodnym są one bardziej wrażliwe na wysoką temperaturę niż w stanie wysuszenia. Obecność węglowodanów, białek i tłuszczów chroni je przed działaniem ciepła, zaś sole obecne w środowisku mogą podwyższać lub obniżać ciepłoodporność, zależy to od rodzaju soli i drobnoustroju. 99 Kwasowość środowiska może stymulować lub hamować rozwój drobnoustrojów. Optymalne dla rozwoju większości drobnoustrojów pH mieści się w granicach 6,5-7,5. Bakterie chorobotwórcze rozwijają się najlepiej w pH obojętnym lub lekko alkalicznym, grzyby preferują środowisko lekko kwaśne, a wirusy zachowują zakaźność w pH 5 do 8. Niekorzystny dla bakterii odczyn środowiska jest często czynnikiem wspomagającym procesy dekontaminacji, np. pod wpływem temperatury. Woda to podstawowy składnik i warunek rozwoju drobnoustrojów, ale niektóre z nich mogą w stanie wysuszenia przetrwać wiele lat (np. prątki gruźlicy). Oporność drobnoustrojów na wysychanie zwiększa obecność w środowisku materii organicznej (materiał kliniczny, żywność, kosmetyki). Wilgotne środowisko sprzyja procesom dekontaminacji. Dla ciśnienia osmotycznego drobnoustroje wykazują dużą tolerancję, ale tylko nieliczne bakterie mogą przeżywać i rozwijać się w środowisku hipertonicznym. Fakt ten wykorzystuje się w praktyce do konserwacji produktów spożywczych. Niektóre bakterie mają mechanizmy adaptacyjne, które pozwalają im na wyrastanie w środowisku o wysokim stężeniu soli – zjawisko nazywamy halotolerancją. Fakt ten wykorzystuje się do konstrukcji odpowiednich podłoży wybiórczych. Wysokie ciśnienie osmotyczne uzyskane dodatkiem cukrów także może stanowić o wybiórczości podłoży, np. do hodowli grzybów. Są też bakterie, których wzrostowi sprzyja podwyższone stężenie chlorku sodu – to halofile. Mają one szczególne wymagania dotyczące stężenia sodu. Potrzeby te zaspokaja woda morska, która stanowi optymalne środowisko ich wzrostu. Promieniowanie ultrafioletowe (UV) i jonizujące działa na drobnoustroje w zależności od dawki i czasu ekspozycji mutagennie lub letalnie. Promieniowanie ultrafioletowe działa najsilniej przy długości fali 260 nm. Jest ono wybiórczo pochłaniane przez zasady purynowe i pirymidynowe kwasów nukleinowych i powoduje ich uszkodzenie. Największą, chociaż zróżnicowaną, wrażliwość na działanie promieniowania UV wykazują formy wegetatywne bakterii, znacznie bardziej oporne są wirusy i przetrwalniki bakterii, a najbardziej oporne są zarodniki pleśni. 100 Drobnoustroje w otoczeniu człowieka mogą stanowić zagrożenie, które minimalizuje się stosując następujące zabiegi określane wspólnym mianem dekontaminacji. Dezynfekcja to proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych, a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu zmniejszeniu. Zatem dezynfekcja nie eliminuje wszystkich niepożądanych drobnoustrojów, w tym przetrwalników czy niektórych wirusów. Procesem prowadzącym do usunięcia wszystkich form życia z określonego materiału jest sterylizacja, której dokonuje się specjalnymi metodami (rozdział 9). Dezynfekcję powinna poprzedzać, jeśli to możliwe, sanityzacja. Polega ona na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na przedmiotach i skórze za pomocą środków myjących i czyszczących. Antyseptyka to eliminacja lub hamowanie rozwoju drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach śluzowych. Aseptyka to zgodne z określonymi procedurami postępowanie, które ma na celu zapobieganie zakażeniu. Takie postępowanie obowiązuje w laboratoriach mikrobiologicznych, w medycynie zabiegowej, aptekach, zakładach farmaceutycznych oraz produkujących kosmetyki i żywność, także w gabinetach kosmetycznych. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy sanityzacji, dezynfekcji i sterylizacji. Konserwacja ma na celu zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów i zabezpieczenie produktu przed wtórnym (w czasie użytkowania) skażeniem. Konserwuje się m.in. żywność, leki, preparaty biologiczne, kosmetyki. 101 Metody Dezynfekcja, antyseptyka i konserwacja Dezynfekcję można przeprowadzać metodami z zastosowaniem czynników fizycznych (temperatury, promieniowania, filtracji) i przy użyciu związków chemicznych. W antyseptyce i konserwacji stosuje się środki chemiczne. Dezynfekcję można osiągnąć poprzez gotowanie w temperaturze wrzenia wody (dekoktację) – w ciągu 10 minut ginie większość form wegetatywnych drobnoustrojów, ale przeżywają przetrwalniki i niektóre wirusy. Pasteryzacja – ogrzewanie w temperaturze 62oC przez 30 minut lub gwałtowne podniesienie temperatury na 15 sekund do 72oC powoduje zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych, maleje także ogólna liczba drobnoustrojów. Dezynfekcja za pomocą promieniowania UV ze względu na nieprzenikliwość tego promieniowania jest ograniczona do powietrza i odkrytych gładkich powierzchni w pomieszczeniach takich jak sale zabiegowe i operacyjne, boksy aseptyczne. Działanie ultradźwiękami pozwala na dokładne oczyszczenie sprzętu (sanityzacja), ale usuwane są także drobnoustroje, z których znaczna część ginie w wyniku zniszczenia osłon komórkowych. Ta metoda czasem poprzedza sterylizację w autoklawie. Znaczne ograniczenie liczby drobnoustrojów w płynach lub gazach (powietrzu) można osiągnąć przez filtrację. Stopień oczyszczenia zależy od wielkości porów zastosowanego filtra. Większość bakterii zatrzymywana jest przez filtry o średnicy porów 0,45 m. Znanych jest wiele grup związków chemicznych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Wybierając najbardziej odpowiedni środek należy uwzględnić: - jego właściwości i spektrum działania, - rodzaj spodziewanych zanieczyszczeń mikrobiologicznych, 102 - dodatkowe zanieczyszczenie materią organiczną (np. płynami ustrojowymi, pozostałościami leków, kosmetyków czy żywności), stopień toksyczności. Niektóre środki dezynfekcyjne mogą być antyseptykami. Związki chemiczne, zwane konserwantami, stosowane są w celu przedłużenia trwałości produktów, przede wszystkim tych, zawierających w składzie wodę. Tylko nieliczne środki chemiczne mają działanie sterylizujące. Alkohole działają bakteriobójczo powodując denaturację białek. Najskuteczniejsze są 70% roztwory wodne. Powszechnie stosowane alkohole to etanol i izopropanol. Oba wykorzystywane są zarówno do dezynfekcji, jak i antyseptyki. Używane są także jako środki konserwujące. Służą również jako rozpuszczalniki innych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych wzmagając ich aktywność przeciwdrobnoustrojową. Aldehydy to najskuteczniej działające bójczo związki chemiczne, które mogą być wykorzystywane także do sterylizacji. Ich działanie polega na alkilowaniu białek i kwasów nukleinowych. Do dezynfekcji i sterylizacji narzędzi medycznych używany jest aldehyd glutarowy. Aldehyd ortoftalowy – nowy związek tej grupy, ma podobne spektrum do aldehydu glutarowego, ale nie działa drażniąco na oczy i śluzówki nosa i jest stabilny w szerokim zakresie pH. Stosując go uzyskuje się wysoki poziom dezynfekcji endoskopów i innych narzędzi stosowanych w medycynie czy kosmetyce. Aldehyd mrówkowy (formaldehyd) m.in. ze względu na przykry zapach ma ograniczone zastosowanie, ale użyteczne okazały się jego kondensaty z innymi związkami. Zachowują one aktywność formaldehydu przy zredukowanym działaniu drażniącym. Jako konserwanty w produktach kosmetycznych stosuje się pochodne formaldehydu: urotropinę i aminoform. Jako środki antyseptyczne stosuje się też kwasy organiczne i ich pochodne, np. kwas salicylowy, borowy czy działający przeciwgrzybowo kwas undecylenowy. Są one stosowane także jako konserwanty. Mało toksyczny kwas benzoesowy używany jest do konserwacji żywności. Jego hydroksypochodne (estry: parabeny, nipaginy) są skuteczne przeciw 103 grzybom i bakteriom i są powszechnie stosowane jako konserwanty w kosmetykach. Pochodne biguanidyny – chlorheksydyna i aleksydyna to środki, które znalazły zastosowanie głównie jako antyseptyki. Działają bójczo uszkadzając błonę cytoplazmatyczną komórek. Działają przeciwbakteryjnie, ale są nieaktywne w stosunku do prątków gruźlicy i przetrwalników oraz mają ograniczoną aktywność w stosunku do grzybów. Spektrum aktywności chlorheksydyny poszerza się w roztworach alkoholowych lub w połączeniu z czwartorzędowymi związkami amoniowymi. Aleksydyna znalazła zastosowanie jako składnik preparatów do pielęgnacji jamy ustnej i stosowanych w okulistyce. Chlorowce, głównie chlor, jod i ich związki działają skutecznie i szerokowidmowo na bakterie, grzyby i wirusy. Chlor jako gaz lub składnik wielu dostępnych komercyjnie związków (jako kwas podchlorawy) jest szeroko stosowany jako środek dezynfekcyjny. Skroplony chlor jest używany do dezynfekcji wody i ścieków, a jego połączenia nieorganiczne (np. podchloryn sodu) i organiczne (np. chloraminy, halazon) są skutecznymi środkami dezynfekcyjnymi. Jod to jeden z najaktywniejszych antyseptyków; w postaci J2 działa utleniająco inaktywując białka i enzymy komórki. Stosowany jest w postaci roztworów alkoholowo-wodnych (jodyna) lub jodoforów. Jodyna ma szerokie spektrum działania. Jodofory to połączenia jodu z nośnikami. Mogą nimi być organiczne polimery zdolne do kompleksowania jodu i jego jonów lub związki powierzchniowo czynne. Jod jest powoli uwalniany z tych połączeń. Jodofory zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową, eliminują zaś niekorzystne cechy preparatów jodu: przykry zapach, barwienie skóry, reakcje uczuleniowe czy małą stabilność roztworów. Związki fenolu są stosowane jako środki dezynfekcyjne. Sam fenol nie jest używany, gdyż jest toksyczny. Dostępnych jest jednak wiele produktów zawierających jego pochodne: krezole i dwufenole. Są one zwykle przeznaczone do dezynfekcji podłóg w placówkach służby zdrowia. Zsyntetyzowano też wiele nowych pochodnych o znacznie korzystniejszych właściwościach. Najczęściej wykorzystywane to 104 chlorowcoalkilofenole: chlorokrezol (PCMC) – używany jako środek konserwujący i para-chlorometa-ksylenol (PCMX) – stosowany do dezynfekcji skóry. Trzy inne: 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol i paraamylofenol stanowią substancje czynne wielu środków dezynfekcyjnych. Dwufenol – triklosan jest składnikiem mydeł i płynów do odkażania skóry. Związki utleniające: nadtlenek wodoru i kwas nadoctowy to silnie działające środki, które zawdzięczają swą aktywność tworzeniu wysoce reaktywnych rodników hydroksylowych. Ważną ich zaletą jest nietoksyczność i zdolność ulegania biodegradacji. Nadtlenek wodoru (woda utleniona) w stężeniu 3% stosowany jest jako słaby antyseptyk. Stabilizowane roztwory w stężeniach od 3% do 6% działają skutecznie jako środki dezynfekcyjne. W wysokich stężeniach (do 35%) i w podwyższonej temperaturze nadtlenek wodoru działa bójczo, nawet na przetrwalniki. Kwas nadoctowy ma szersze spektrum działania. Szybko działa bójczo na bakterie, także prątki oraz grzyby, wirusy i przetrwalniki. Działa w obecności materii organicznej. Jest zaliczany do chemicznych środków sterylizujących. Stosowany jest do sterylizacji np. endoskopów, a w połączeniu z nadtlenkiem wodoru do zimnej sterylizacji urządzeń do dializ. Niestety powoduje korozję niektórych metali i działa drażniąco. Związki powierzchniowo czynne można podzielić na kilka grup. Aktywność przeciwdrobnoustrojową wykazują związki o charakterze amfoterycznym, działające także jako detergenty. Są bardzo często wykorzystywane w chirurgii do higienicznego i chirurgicznego mycia rąk, do dezynfekcji instrumentów medycznych i odkażania podłóg w szpitalach. Najważniejszą z punktu widzenia aktywności przeciwdrobnoustrojowej grupą są związki kationowe. Działają one bójczo na bakterie, grzyby i wirusy osłonkowe. Niestety obecność materii organicznej zmniejsza ich aktywność. Do najczęściej stosowanych do dezynfekcji, antyseptyki, a także jako środki konserwujące należą chlorek i bromek benzalkoniowy i cetrimid (bromek cetylotrimetyloamoniowy). Wśród innych związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym na uwagę zasługują organiczne związki azotu: dichlorowodorek oktenidyny (anilid) 105 i izotiocyjanoguanidyna (poliamina). Dichlorowodorek oktenidyny wchodzi w skład preparatów antyseptycznych o silnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym, a izotiocyjanoguanidyna należy do nielicznych związków inaktywujących priony. Popularnym konserwantem stosowanym szeroko w kosmetyce jest Katon CG – heterocykliczny związek o szerokim spektrum przeciwdrobnoustrojowymi dobrze działający w różnym pH. Działanie odkażające mają także jony metali: srebra, rtęci, cynku. Szczególnie korzystne działanie ma srebro np. w roztworach koloidalnych, czy zastosowane w specjalnych opatrunkach. Sól srebrowa sulfadiazyny znajduje zastosowanie jako środek odkażający i ściągający w leczeniu oparzeń. Na rynku dostępnych jest wiele środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych. Zwykle są to połączenia kilku substancji czynnych. Antyseptyki najczęściej są różnymi połączeniami alkoholi, chlorheksydyny, bromku lub chlorku benzalkoniowego, w ich skład wchodzą też związki jodu czy chlorowodorek oktenidyny. Środki dezynfekcyjne zawierają często związki chloru, a także aldehydy czy fenole. Wiele produktów zawiera te same substancje czynne, choć składniki towarzyszące mogą wyraźnie podnosić ich skuteczność i nadawać im szczególne cechy. Związki stosowane jako środki konserwujące zawsze stosuje się w mieszaninie kilku preparatów. Zwiększa to zakres ich działania, co jest szczególnie ważne wobec oczekiwanej skuteczności w stosunku do bakterii, ale także pleśni i grzybów chorobotwórczych. Badanie środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych Środki te ocenia się metodami mikrobiologicznymi, uwzględniając różne czynniki wywierające wpływ na ich działanie. Trzeba wziąć pod uwagę: naturalną oporność drobnoustrojów, spodziewaną ich liczbę, warunki (temperaturę, pH) w jakich związek będzie stosowany, obecność zanieczyszczeń (szczególnie organicznych) oraz określić stężenie stosowanego środka i czas ekspozycji. Badania takie przeprowadza się w laboratoriach przed wprowadzeniem nowych środków do obrotu. Aktywność tych związków określa się 106 wyznaczając ich najniższe stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów – MIC (ang. minimum inhibitory concentration) i najniższe stężenie powodujące śmierć drobnoustrojów – MBC (ang. minimum bactericidal concentration) w mg/L lub g/mL. W przypadku środków dezynfekcyjnych rozpuszczalnych w wodzie stosuje się metodę oceny skuteczności ich działania bakteriobójczego znaną jako „metoda zawiesinowa”. Polega ona na sporządzeniu standaryzowanej zawiesiny testowych drobnoustrojów i wystawieniu jej na działanie odpowiednich rozcieńczeń badanego związku w określonym czasie i temperaturze. Drobnoustroje testowe są pochodzącymi ze specjalnie przechowywanych kolekcji szczepami o naturalnej wrażliwości na związki chemiczne. Wykorzystuje się bakterie Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, saprofityczne prątki (Mycobacterium terre) i przetrwalniki Bacillus subtilis oraz grzyby Candida albicans, Trichophyton sp. Badanie należy także przeprowadzić w roztworze w obecności albuminy, co pozwala na ocenę działania środka w środowisku zanieczyszczonym materią organiczną. Ocena działania bójczego wymaga zastosowania odpowiednich metod neutralizacji dla zahamowania działania badanego środka i metod liczenia komórek (CFU), które przeżyły ekspozycje. Pozwala to na ustalenie takiego stężenia środka, które spowodowało śmierć wyznaczonej normą liczby komórek drobnoustrojów (np. 99,999% CFU bakterii). Badanie to można przeprowadzić odnosząc efekty działania środka badanego do znanego wzorca. W kolejnym etapie badań nowych preparatów wykonuje się symulację działania środka w stosunku do drobnoustrojów, którymi skażone są powierzchnie drobnych przedmiotów (np. metalowych płytek) w „metodzie nośnikowej”. Po określonym czasie ekspozycji na różne stężenia badanego środka określa się stopień redukcji liczby komórek naniesionych na powierzchnię nośnika. Można w ten sposób wyznaczyć stężenie użytkowe, czyli takie, które pozwoli osiągać odpowiedni poziom odkażenia w żądanym czasie. Środki antyseptyczne badane są w podobny sposób, przy czym w metodzie zawiesinowej przewiduje się inne wielkości redukcji inokulum 107 drobnoustrojów oraz inny czas kontaktu drobnoustrojów z antyseptykiem, a stężenie użytkowe wyznacza się w teście sztucznego skażenia skóry ochotników. W praktyce, na przykład w szpitalach czy w laboratoriach, gdy stosowane są określone procedury dezynfekcji znanymi środkami, istotne znaczenie ma ocena skuteczności tych zabiegów. Stosuje się badanie pośrednie, przez określenie zmniejszenia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza czy powierzchni po zastosowaniu odpowiednich środków. Najczęściej stosuje się metodę sedymentacji (przy ocenie skuteczności odkażenia powietrza) i metodę odcisków (przy badaniu powierzchni). Badanie działania środków konserwujących Środki konserwujące są stosowane w preparatach farmaceutycznych i kosmetykach, szczególnie konfekcjonowanych w opakowaniach wielodawkowych. W badaniu skuteczności działania konserwantów, potencjalną możliwość skażenia leku z zewnątrz symuluje się przez dodanie odpowiedniej dawki (inokulum) znanych drobnoustrojów. Właściwości konserwujące preparatu są zadowalające, jeżeli w zakażonym pojemniku w określonych odstępach czasu następuje znaczący spadek lub nie dochodzi do wzrostu liczby żywych komórek drobnoustrojów testowych. W badaniu wykorzystywane są wrażliwe szczepy bakterii Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i grzybów Candida albicans, Aspergillus niger. 108 Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie bakteryjnego zanieczyszczenia powietrza metodą sedymentacji - Ustaw otwartą płytkę agarową w wybranym miejscu i pozostaw przez 30 minut. o - Zamknij płytkę i umieść w cieplarce o temperaturze 37 C na 24 do 48 godzin. - Po inkubacji policz wyrosłe na płytce kolonie i określ liczbę drobnoustrojów w 1 m3 powietrza podstawiając dane do wzoru: 3 Liczba drobnoustrojów w 1 m powietrza = x · 100 · 100/Πr2 · t · 1/5 gdzie x – liczba kolonii na płytce r – promień płytki (cm) t – czas ekspozycji (min) 109 Zadanie 2. Kontrola bakteryjnego zanieczyszczenia powierzchni metodą odcisków - Płytkę odciskową przyłóż agarem do suchej kontrolowanej powierzchni na czas 10 sekund (nacisk 500 g). - Zamkniętą płytkę umieść w cieplarce o temperaturze 30oC lub 25oC i inkubuj 72 godziny, gdy chcesz wyhodować grzyby przedłuż inkubację do 7 dni. - Po inkubacji policz kolonie wyrosłe na płytce (powierzchnia płytki wynosi 25 cm2). Porównaj wyniki z normami dla różnych powierzchni. Zadanie 3. Określanie skuteczności działania środka antyseptycznego w stosunku do bakterii obecnych na skórze dłoni Badanie działania środka antyseptycznego i kontrola liczby bakterii na skórze nieodkażanej musi być wykonane przez jedną osobę (ilość bakterii na skórze jest cechą osobniczą zależną od wielu czynników i może wahać się w znacznym stopniu). Zatem jedna osoba bada kolejno lewą i prawą rękę. Ocena liczby bakterii na skórze nieodkażanej: - Wlej 10 mL bulionu do jałowej płytki Petriego, płucz w nim opuszki palców jednej ręki przez 1 minutę. - Określ liczbę żywych bakterii uwolnionych ze skóry do bulionu metodą posiewu powierzchniowego, przenosząc 0,1 mL bulionu na płytkę krwawą i równomiernie rozprowadź zagiętą ezą. Ocena liczby bakterii na skórze dłoni po zastosowaniu środka antyseptycznego (np. 1% Sterinolu, 0,5% Abacilu w etanolu, 2% Chloraminy lub Manusanu). 110 - Wlej 10 mL środka antyseptycznego do jałowej płytki Petriego. - Wlej 10 mL bulionu do drugiej płytki. - Płucz w środku antyseptycznym opuszki palców nie badanej wcześniej ręki przez 1 minutę. - Opłucz palce polewając je jałową wodą i wysusz w jałowym powietrzu (w pobliżu zapalonego palnika). - Zanurz opuszki palców w płytce z bulionem i płucz je przez 1 minutę. - Określ liczbę żywych bakterii uwolnionych do tego bulionu metodą posiewu powierzchniowego tak jak poprzednio. - Opróżnij płytki z płynów, a pożywki z posiewami umieść w cieplarce o (37 C, ok. 20 godzin). - Po inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na obu płytkach. - Porównaj liczbę bakterii przed i po działaniu środka antyseptycznego. - Oceń jego skuteczność 111 Zadanie 4. Wrażliwość różnych form bakterii na działanie środków dezynfekcyjnych - Do probówek zawierających przetrwalniki Bacillus subtilis dodaj po 0,5 mL następujących roztworów środków dezynfekcyjnych: 0,5% glukonian chlorheksydyny w 70% etanolu 0,5% glukonian chlorheksydyny w H2O 0,5% fenol 70% etanol 2% aldehyd glutarowy - Inkubuj 60 minut w temperaturze pokojowej. - Odsiej ezą zawartość poszczególnych probówek do bulionów podpisanych nazwą środka dezynfekcyjnego. o - Wstaw buliony do cieplarki 37 C na ok. 20 godzin. - Oceń, w których probówkach pojawił się wzrost zapisz w tabeli. Środek dezynfekcyjny Żywotność przetrwalników po ekspozycji na środki dezynfekcyjne (wzrost) 0,5% chlorheksydyna w 70% etanolu 0,5% chlorheksydyna w H2O 0,5% fenol 70% etanol 2% aldehyd glutarowy 112 Zadanie 5. Wpływ materii organicznej na aktywność przeciwbakteryjną środków dezynfekcyjnych W tym doświadczeniu materię organiczną reprezentować będą inaktywowane komórki drożdży. W zależności od rodzaju badań zadanie to spełniać może także albumina, mleko lub wyciąg drożdżowy. - Dostajesz dwie płytki agarowe, na które odsiejesz zawiesiny po kontakcie ze środkiem dezynfekcyjnym trwającym 1, 5, 10 i 20 minut (dla mieszaniny testowej i dla kontroli) – każdą z nich opisz dzieląc na 4 sektory. - Dostajesz dwie probówki zawierające po 0,5 mL hodowli bulionowej S. aureus: - do tej, w której będziesz badać same bakterie dodaj 0,5 mL roztworu NaCl - to twoja kontrola, - do tej, w której będą one chronione przez materię organiczną dodaj 0,5 mL zawiesiny inaktywowanych drożdży - mieszanina testowa. - Do probówki z mieszaniną testową i do kontroli dodaj po 0,5 mL środka dezynfekcyjnego. Wymieszaj delikatnie zawartość probówek. Po 1, 5, 10 i 20 minutach odsiej materiał na odpowiednie sektory płytek. Używaj ezy o oczku tej samej wielkości i dbaj o pobranie pełnego oczka materiału. o - Płytki wstaw do cieplarki 37 C na ok. 20 godzin. - Oceń wyniki i wpisz je do tabeli używając następujących symboli: 1 - 15 lub mniej kolonii w sektorze 2 - więcej niż 15 kolonii, ale mniej niż wzrost zlewny 3 - wzrost zlewny lub niepoliczalna liczba kolonii - Wyniki zapisz w tabeli. 113 1 minuta 5 minut 10 minut 20 minut Mieszanina testowa Kontrola 114 Rozdział 9 Sterylizacja Część teoretyczna Wyjaławianie (sterylizacja) to proces, którego celem jest uwolnienie wyjaławianego materiału od form życia w każdej postaci. Oznacza zatem dekontaminację obejmującą wszystkie drobnoustroje i ich formy. Wyjaławianie ma podstawowe znaczenie w medycynie, farmacji, i kosmetologii. W medycynie sterylizacji podlegają wszystkie przedmioty tzw. wysokiego i średniego ryzyka przeniesienia zakażenia: narzędzia chirurgiczne, cewniki, wszczepy, oraz sprzęt diagnostyczny mający kontakt z błonami śluzowymi i uszkodzonymi powłokami. Zabiegi sterylizacji wymagają często odpowiedniego wstępnego przygotowania materiałów. Ważny jest też wybór właściwej metody, stosowanie jej zgodne z procedurami oraz systematyczna kontrola sprawności urządzeń. Sterylizowane przedmioty muszą być odpowiednio zabezpieczone (zapakowane), aby po zakończeniu procesu można je było bezpiecznie przenieść i przechować do chwili użycia. Metody Sterylizację wykonuje się stosując metody z wykorzystaniem wysokiej temperatury (wysokotemperaturowe). Sterylizacja bieżąca parą wodną – tyndalizacja Do sterylizacji płynów zawierających termolabilne składniki stosuje się wyjaławianie parą wodną w ciśnieniu atmosferycznym. Przeprowadza się je w aparacie Kocha, w którym, w bieżącej parze wodnej osiąga się temperaturę 100oC. W tej temperaturze w ciągu 60 minut giną wszystkie formy wegetatywne drobnoustrojów, a przetrwalniki ulegają termicznej aktywacji i następnie, pozostawione w temperaturze pokojowej, kiełkują. Po upływie doby, już jako formy wegetatywne zostają zabite w kolejnym 115 cyklu sterylizacyjnym. Aby uzyskać pewność, że materiał jest jałowy ogrzewamy go po raz trzeci. Metoda ta jest stosowana prawie wyłącznie do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych. Sterylizacja parą wodną w nadciśnieniu Jest to najczęściej stosowana metoda sterylizacji przeprowadzanej w specjalnych urządzeniach – autoklawach. Zastosowanie nasyconej pary wodnej w nadciśnieniu 1 Atm. pozwala osiągnąć temperaturę 121oC. Czas sterylizacji w tych warunkach wynosi 15-20 minut. W ten sposób sterylizuje się wiele pożywek, a także przedmioty z gumy i tworzyw o sztucznych. Przy nadciśnieniu 2 Atm. temperatura pary osiąga 134 C, a czas potrzebny na wysterylizowanie materiałów wynosi od 3,5 do 7 minut. W tych warunkach jałowi się narzędzia chirurgiczne, bieliznę operacyjną, szkło i materiały opatrunkowe oraz niektóre pożywki do hodowli drobnoustrojów. W autoklawie można wyjaławiać wszystkie termostabilne materiały, do których ma szansę przeniknąć para wodna. Ma ona właściwości głęboko penetrujące i w krótkim czasie prowadzi do zabicia drobnoustrojów, w tym najbardziej opornych na temperaturę wirusów (HBV) oraz zarodników grzybów i przetrwalników bakterii. Stosowane jeszcze niekiedy (np. w gabinetach stomatologicznych czy kosmetycznych) autoklawy przepływowe (grawitacyjne), w których powietrze wypierane jest przez parę wodną, są zawodne i przestarzałe. Zastępowane są one przez małe autoklawy próżniowe. Skuteczność sterylizacji zależy w nich od całkowitego usunięcia powietrza z komory i od jakości pary wodnej (wody). Sterylizacja gorącem suchym Wyjaławianie gorącym suchym powietrzem przeprowadza się w suszarkach z wymuszonym obiegiem powietrza. Suche powietrze jest złym przewodnikiem ciepła, sterylizację należy prowadzić w wyższej niż w autoklawie temperaturze i w dłuższym czasie. Zwykle stosuje się temperaturę w granicach 160-180oC w czasie do dwóch godzin. o Najczęściej stosuje się temperaturę 170 C przez 2 godziny. W takich warunkach giną wszystkie drobnoustroje i ich przetrwalniki. Metoda ta 116 służy do wyjaławiania szkła, termostabilnych substancji sypkich oraz olejów i podstaw maściowych. Sterylizacja suchym powietrzem ma ograniczone zastosowanie i jest kosztowna. Uważana jest za przestarzałą i w wielu krajach Unii Europejskiej jest już prawie całkowicie wycofana. Może być z powodzeniem zastąpiona przez inne metody. Skutecznym sposobem sterylizacji jest spalanie w płomieniu, ale ma ono wąskie zastosowanie (np. do wyjaławiania ezy, czy niszczenia materiału zakaźnego). Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym Jest to sposób sterylizacji o zastosowaniu przemysłowym, ale konstruowane są nowe urządzenia, które pozwolą na wykorzystanie tego promieniowania w mniejszej skali. Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym o długości fali 700 nm do 1mm (ang. infrared sterilization) wykazuje bardzo dużą skuteczność w stosunku do wszystkich drobnoustrojów w tym wirusów zapalenia wątroby, najbardziej opornych przetrwalników (tężca, jadu kiełbasianego, Geobacillus stearothermophilus), grzybów i ich zarodników oraz prionów. Sterylizowane przedmioty umieszczane są w specjalnych metalowych pojemnikach. Cykl o sterylizacyjny nie przekracza kilku minut w temperaturze ok. 190 C. Sterylizowane mogą być praktycznie wszystkie materiały termostabilne. Procesy sterylizacji mogą być przeprowadzane także w niskich temperaturach (metody niskotemperaturowe). Sterylizacja gazowa W przemyśle medycznym sterylizacja gazowa jest stosowana do wyjaławiania różnego sprzętu medycznego, w tym jednorazowego użytku wykonanego z materiałów termolabilnych. Przy zastosowaniu tlenku etylenu w przeszłości stosowano mieszaninę tego gazu z nośnikiem (np. CO2). Obecnie urządzenia wykorzystują czysty (100%) tlenek etylenu, a proces zachodzi w podciśnieniu co zwiększa jego bezpieczeństwo. Wadą procesu jest bowiem toksyczność gazu i stosunkowo długi czas trwania procesu. Zaletą metody jest dobra penetracja gazu zapewniająca dużą skuteczność oraz trwałość tworzyw sztucznych w warunkach sterylizacji. 117 Sterylizację można także przeprowadzać formaldehydem. Stosuje się jego mieszaninę z parą wodną. Zwykle stosuje się 2-5% formaldehydu oraz parę wodną do wilgotności przekraczającej 70%. W urządzeniach nowej generacji proces zachodzi w temperaturze około 45oC w czasie 2-4 godzin. Metoda ta wykorzystywana jest w warunkach szpitalnych do sterylizacji giętkich endoskopów. Formaldehyd ma jednak słabe właściwości penetrujące i niszczy niektóre materiały np. gumę. Sterylizacja radiacyjna Źródłem wykorzystywanego w tej metodzie promieniowania gamma są zazwyczaj izotopy promieniotwórcze. Promieniowanie stosowane w dużych dawkach nieodwracalnie niszczy DNA i błony komórkowe drobnoustrojów. Proces zachodzi w temperaturze pokojowej, ale dla preparatów labilnych można temperaturę znacznie obniżyć. Metoda jest kosztowna, ale często stosowana w przemysłowej sterylizacji sprzętu medycznego, materiałów opatrunkowych, materiałów implantacyjnych. Sterylizacja plazmowa Wytwarzana w warunkach próżni w polu magnetycznym plazma jest zjonizowanym gazem, otrzymywanym z nadtlenku wodoru. Proces o odbywa się w temperaturze 40-60 C, co pozwala na sterylizację sprzętu medycznego wrażliwego na wysokie temperatury, a więc trudnego do wysterylizowania innymi metodami. Penetracja plazmy do wnętrza urządzeń nie jest jednak najlepsza i na przykład dla sterylizacji endoskopu trzeba wprowadzać porcje plazmy bezpośrednio do światła przewodu. Po około godzinie sprzęt jest gotowy do użycia, co jest ważną zaletą tej metody. Filtracja Filtracja to przepuszczanie płynów lub gazów przez filtry o porach na tyle małych, aby zatrzymać drobnoustroje. Metoda ta jest powszechnie stosowana, a szczególnie przydatna do wyjaławiania ciepłochwiejnych płynów. Jej zaletą jest usuwanie żywych i martwych drobnoustrojów i ich przetrwalników, a także zanieczyszczeń mechanicznych. Najczęściej wykorzystywane są sączki membranowe. Najbardziej popularne filtry 118 o średnicy porów od 0,22 μm i 0,45 μm zatrzymują tylko grzyby i bakterie, ale są i filtry o porach mniejszych (aż do 0,01 μm), które mogą także zatrzymywać wirusy dając gwarancję pełnej sterylności. Filtry membranowe znalazły zastosowanie w aptekach, zakładach farmaceutycznych, szpitalach, także do filtracji powietrza w salach operacyjnych, gabinetach zabiegowych czy boksach do pracy aseptycznej. Metody kontroli urządzeń sterylizujących Niesterylność pożywek może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów. Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych. Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym. Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych przyrządów, coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów. Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry sterylizacji. Testy te mają postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki chemiczne informują jedynie, czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują one jednak, jak długo ta temperatura się utrzymywała. Chemiczne wskaźniki wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały osiągnięte wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch) 119 parametrów sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu procesu sterylizacji. Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte, odpowiednio w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów) i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli użyte w teście przetrwalniki zostały zabite oznacza to, iż zostały zabite wszystkie bardziej wrażliwe drobnoustroje zanieczyszczające sterylizowany materiał. Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod. Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu wskaźników biologicznych. Zdania do wykonania Zadanie 1. Wpływ promieniowania UV na bakterie W tym doświadczeniu bakterie (Escherichia coli) będą eksponowane na działanie promieniowania UV przez okres 1 minuty i przez 30 minut. - Opisz dwie płytki agarowe (nazwa bakterii, czas naświetlania – 1 min., 30 min.) - Zanurz waciki w hodowli płynnej Escherichia coli, odciśnij nadmiar płynu o ścianki probówki i zasiej nimi gęsto całą powierzchnię płytek agarowych. 120 - Przykryj część posianej powierzchni płytki układając na niej jałową pęsetą papierowy szablon. - Naświetlaj pod lampą UV powierzchnię otwartych płytek: jednej przez 1 minutę, drugiej przez 30 minut. - Po naświetlaniu zdejmij jałową pęsetą szablony i wrzuć je do słoja z chloraminą. o - Umieść płytki w cieplarce (37 C na ok. 20 godzin). - Po inkubacji oceń działanie promieniowania UV na Escherichia coli po różnym czasie ekspozycji. Jaki czas naświetlania jest konieczny do zabicia bakterii? Jakie są jego zalety i wady tego promieniowania? 121 Zadanie 2 Kontrola skuteczności sterylizacji w suszarce za pomocą testu biologicznego Sporal S - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu S. o - Sprawdź temperaturę suszarki (180 C) i umieść w niej torebkę w szklanym otwartym naczyniu. Zanotuj czas. - Po 30 minutach sterylizacji wyjmij Sporal S z suszarki. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą i jałowo (przy palniku) przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (37oC, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch), czy też bulion jest klarowny. - Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia 122 Zadanie 3 Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie (lub urządzeniu o takim samym działaniu) za pomocą testu biologicznego Sporal A - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu A. - Włóż torebkę do probówki i umieść ją autoklawie. - Po zakończonym procesie sterylizacji otwórz autoklaw i wyjmij z niego Sporal A. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą jałowo przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (55oC, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch), czy bulion jest klarowny. Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia 123 124 Rozdział 10 Bakterie w lekach i żywności – kontrola czystości mikrobiologicznej Część teoretyczna Zanieczyszczenie mikrobiologiczne żywności Produkty żywnościowe i surowce są dogodnym środowiskiem do rozwoju drobnoustrojów. Ich obecność może przyczyniać się do procesów psucia, ale także stać się przyczyną zakażeń i zatruć pokarmowych. Czynniki, które wpływają na częstość zachorowań i zatruć pokarmowych ciągle się zmieniają. Należą do nich: nawyki żywieniowe, dbałość o higienę w procesie przygotowania produktów żywnościowych, światowy obrót żywnością, rozwój firm oferujących gotowe posiłki oraz nowe metody produkcji i przechowywania żywności. W procesie produkcji żywności coraz większy nacisk kładzie się na kontrolę mikrobiologiczną przetwórni i podnoszenie higieny procesów produkcji, ponieważ ten rodzaj nadzoru, sprawowany przez laboratoria przyzakładowe daje lepsze wyniki niż wyrywkowe badanie gotowych produktów. W tym celu w ciągu produkcyjnym określa się punkty wymagające szczególnej kontroli, gdzie występują warunki sprzyjające skażeniu mikrobiologicznemu (HACCP-ang. hazard analysis critical control point). Problem mikrobiologicznego skażenia żywności jest poważny, pojawiają się nowe czynniki chorobotwórcze szerzące się tą drogą, jak na przykład Escherichia coli O157:H7, ale także zwiększa się częstość zakażeń patogenami dobrze znanymi, jak np. Campylobacter jejuni. W zapobieganiu bakteryjnym zatruciom pokarmowych, wśród których w Polsce dominują salmonellozy odzwierzęce, największą rolę odgrywa wyeliminowanie źródła zakażenia i właściwe postępowanie z surowcami pochodzenia zwierzęcego przed ich wykorzystaniem. 125 Podstawowe żywności wymogi dotyczące czystości mikrobiologicznej Przy ocenie stanu higienicznego wszystkich produktów spożywczych istotne jest oznaczenie stopnia skażenia pałeczkami z grupy coli. Ich obecność łączy się z możliwością skażenia pałeczkami chorobotwórczymi z rodziny Enterobacteriaceae, a także innymi drobnoustrojami szerzącymi się drogą fekalno-oralną. Szczególną uwagę przywiązuje się do pokarmów specjalnego przeznaczenia, jak na przykład preparaty do żywienia niemowląt. W ich przypadku wymagania mikrobiologiczne wyznaczają limity obecności drobnoustrojów tlenowych mezofilnych, bakterii z grupy coli, bakterii beztlenowych przetrwalnikujących redukujących siarczyny, Bacillus cereus, pleśni i drożdży, Salmonella oraz Staphylococcus aureus. W pracach Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO zwrócono ponadto uwagę na nowe bakterie, które mogą stanowić potencjalne zagrożenie dla zdrowia niemowląt. Należy do nich Cronobacter sakazakii (dawniej Enterobacter sakazakii), izolowany z infekcji związanych z podawaniem preparatów w proszku do początkowego żywienia niemowląt. Przyczyny zanieczyszczenia mikrobiologicznego leków Czystość mikrobiologiczna leków zależy od: zanieczyszczenia surowców, technologii produkcji, zanieczyszczenia urządzeń produkcyjnych i powietrza, higieny personelu, sposobu konfekcjonowania, czystości opakowań i warunków przechowywania gotowych preparatów. Głównym źródłem zanieczyszczenia leków produkowanych zarówno przez przemysł, jak i w aptece są surowce farmaceutyczne, substancje pomocnicze oraz woda destylowana. Stwierdzono na przykład, że podstawowym źródłem obecności Escherichia coli w tabletkach i drażetkach jest skrobia. Drobnoustrój ten znajdowano także w wielu innych surowcach pochodzenia roślinnego. Znaczne ilości bakterii 126 zawierają surowce pochodzenia zwierzęcego, na przykład te, które służą do produkcji organopreparatów. Typowymi są tu bakterie z rodzaju Clostridium, Escherichia coli, Enterococcus faecalis. Na poziom zanieczyszczenia leków drobnoustrojami duży wpływ ma także technologia ich produkcji. Przykładem mogą być leki w postaci granulatów. Temperatura 40°C w jakiej przebiega proces granulowania i duża wilgotność sprzyjają mnożeniu się drobnoustrojów, które mogą znaleźć się w łączonych składnikach. Niektóre preparaty, na przykład maści, stwarzają szczególnie dogodne warunki dla przetrwania drobnoustrojów, a inne przeszkadzają skutecznej sterylizacji. Zagrożenia ze strony drobnoustrojów obecnych w lekach Obecność drobnoustrojów w leku może być przyczyną zakażenia pierwotnego lub wtórnego. W lekach niebezpieczeństwo stanowią zarówno bakterie chorobotwórcze, jak i oportunistyczne. Do najczęściej spotykanych należą bakterie z rodzaju Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus, Klebsiella, Salmonella i Clostridium. Niebezpieczeństwo, jakie stwarza obecność tych bakterii w lekach, zależy między innymi od sposobu podania leku, a wraz z nim, drogi wprowadzenia bakterii do organizmu. W lekach doustnych szczególnie groźne są pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. W lekach do użytku zewnętrznego szczególne niebezpieczeństwo stanowią bakterie z rodzaju Pseudomonas i Staphylococcus. Drobnoustroje wytwarzają toksyny i enzymy, które są wydzielane do środowiska lub uwalniane w wyniku rozpadu komórki. Nagromadzenie lipopolisacharydu (endotoksyny) w lekach parenteralnych może prowadzić do wystąpienia groźnego dla życia pacjenta wstrząsu endotoksycznego. Pseudomonas aeruginosa namnażając się w lekach do oczu wytwarza enzymy proteolityczne, niszczące kolagen rogówki oka. Możliwość wywołania zakażenia przez lek zawierający drobnoustroje jest tylko jednym z aspektów szkodliwego ich działania. Drobnoustroje mogą również rozkładać substancje lecznicze, inaktywując je lub zmieniając ich działanie farmakologiczne. Wiele bakterii znanych jest ze zdolności przebudowywania cząsteczki sterydów, rozkładu glikozydów, a nawet 127 alkaloidów. Szereg antybiotyków, środków dezynfekujących i konserwujących ulega degradacji w wyniku działania drobnoustrojów, tracąc swą aktywność biologiczną. Obecności bakterii w leku można zatem przypisywać niepowodzenia w terapii. Leki należy zatem wytwarzać w warunkach aseptycznych. Zasada ta musi dotyczyć nie tylko leków, dla których wymagana jest jałowość (np. preparaty parenteralne i do oczu), ale także leków, dla których przepisy nie wymagają jałowości (np. leki doustne lub stosowane zewnętrznie). Postępowanie aseptyczne jest konieczne nawet w przypadku tych leków, które są następnie poddawane wyjaławianiu, z obawy przed produktami metabolizmu drobnoustrojów lub związków uwalnianych w wyniku rozpadu komórek. Normy (wymagania) czystości mikrobiologicznej leków Biorąc pod uwagę wymagania czystości mikrobiologicznej i zastosowanie oraz sposób podawania, pewne leki powinny być jałowe - całkowicie wolne od żywych drobnoustrojów, inne mikrobiologicznie czyste we wskazanym dla kategorii zakresie. Tabela 1. Kryteria akceptacji dla mikrobiologicznej jakości niejałowych produktów farmaceutycznych i substancji do celów farmaceutycznych wg FP IX Grupa preparatów Preparaty doustne nie zawierające wody Preparaty doustne zawierające wodę Preparaty doodbytnicze Preparaty: -na skórę i błony śluzowe -do nosa, uszu i gardła Wymagania 3 2 Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1mL. Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL. 2 1 3 2 2 1 Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL. Nieobecność Escherichia coli w 1g lub 1 mL. Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL. Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa w 1 g lub 1 mL. 128 Preparaty dopochwowe Systemy transdermalne Preparaty wziewne (jeżeli nie mają wymagań jałowości) Leki doustne zawierające surowce pochodzenia naturalnego (zwierzęcego, roślinnego lub mineralnego), których nie poddaje się wstępnej obróbce zmniejszającej liczbę drobnoustrojów i dla których dopuszcza się zanieczyszczenie mikrobiologiczne 3 surowców większe niż 10 drobnoustrojów w 1g lub 1mL Roślinne produkty lecznicze, zawierające substancje roślinne, z dodatkiem lub bez substancji pomocniczych, poddawane przed użyciem działaniu wrzącej wody. 2 1 2 1 2 1 4 2 Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa , Candida albicans w 1 g lub 1 mL. Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów (na jeden plaster łącznie z warstwą adhezyjną i zewnętrzną warstwą nośną). Nieobecność Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa. Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1mL. Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa w 1g lub 1 mL. Nieobecność bakterii gramujemnych tolerujących żółć w 1 g lub 1 mL. Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1g lub 1mL. 2 Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć w 1g lub 1mL. Nieobecność Salmonella w 10g lub 10 mL. Nieobecność Escherichia coli, Staphylococcus aureus w 1 mL. 7 Nie więcej niż 10 bakterii w 1g. Maksymalna dopuszczalna 7 liczba bakterii 5x10 CFU/g. 3 Nie więcej niż 10 Escherichia coli w 1 g. Nieobecność Salmonella w 25 g. 5 Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g. 5 Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU/g. 129 4 Roślinne produkty lecznicze, zawierające np. wyciągi i/lub substancje roślinne, z dodatkiem lub bez substancji pomocniczych, dla których metoda wytwarzania (np. ekstrakcja) lub wstępne postępowanie, prowadzi do obniżenia liczby drobnoustrojów Roślinne produkty lecznicze, zawierające np. wyciągi i/lub substancje roślinne, z dodatkiem lub bez substancji pomocniczych, dla których metoda wytwarzania (np. ekstrakcja) lub wstępne postępowanie, nie prowadzi do wystarczającego obniżenia liczby drobnoustrojów Substancje do celów farmaceutycznych Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL. 4 Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU w 1 g lub 1 mL. 2 Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć w 1g lub 1mL. Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL. Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL. 2 Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL. 2 Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU w 1 g lub 1 mL. 5 Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL. 5 Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU w 1 g lub 1mL. 4 Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących żółć w 1 g lub 1 mL. Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL. Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL. 4 Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL. 4 Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU w 1 g lub 1 mL. 3 Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL. 2 Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL. W mikrobiologicznej ocenie leków jałowych obowiązuje analiza jałowości określana metodami farmakopealnymi (Farmakopea Polska IX). Dla pozostałych leków stopień skażenia drobnoustrojami określa się ilościowo i przeprowadza ich identyfikację. 130 Metody Badanie skażenia żywności Próby produktów żywnościowych przeznaczonych do badań mikrobiologicznych muszą być pobierane w sposób wykluczający dodatkowe zakażenie. Produkty płynne należy przed pobraniem dokładnie wymieszać. Z produktów stałych pobiera się próbę możliwie z całego przekroju. Produkty stałe i płynne o niejednolitej konsystencji należy przed posiewem zhomogenizować, dodając uprzednio jałowy rozcieńczalnik, aby otrzymać rozcieńczenie 1:10. Z przygotowanych prób sporządza się preparaty mikroskopowe i wykonuje posiewy umożliwiające liczenie drobnoustrojów (patrz rozdział 6) i ich identyfikację. Należy stosować aktualne normy wskazywane przez odpowiednie akty prawne, a w szczególności stosować się do aktualnie obowiązującej Ustawy o warunkach zdrowotnych żywności i żywienia. Badanie jałowości leków Definicja jałowości jest trudna do weryfikacji doświadczalnej, a wyniki kontroli jałowości są względne, gdyż dają odpowiedź tylko w ścisłych granicach zastosowanych metod. Lekami, które muszą być jałowe są wszystkie leki podawane parenteralnie i leki stosowane w okulistyce. Jałowe muszą być także materiały opatrunkowe, nici chirurgiczne, igły, strzykawki, cewniki, zestawy kroplówkowe, narzędzia chirurgiczne. W badaniu jałowości można wyróżnić kilka podstawowych zasad, od których zależy uzyskanie wiarygodnych danych. Są to: aseptyczne postępowanie w czasie badania, w celu uniknięcia wprowadzenia wtórnych zakażeń do pierwotnie jałowego materiału; ustalenie odpowiedniej wielkości badanej próbki, reprezentatywnej dla całości badanego materiału; właściwy dobór pożywek wzrostowych, warunków inkubacji oraz usunięcie wszystkich czynników hamujących rozwój drobnoustrojów, gdyż podstawą badania jałowości jest obserwacja wzrostu drobnoustrojów. 131 Standardowe badanie jałowości bierze pod uwagę tylko część bakterii tlenowych, beztlenowych i grzybów i nie obejmuje wirusów ze względu na trudną i kosztowną technikę. Tabela 2 pokazuje wielkość próbek, które muszą być pobrane do kontroli jałowości. Zależy ona od objętości pojemnika i liczebności tzw. serii bakteriologicznej. Seria bakteriologiczna jest to partia pojemników określonego leku wyjaławianych podczas jednego procesu sterylizacyjnego lub zawierających lek sterylizowany drogą filtracji bakteriologicznej przez jeden sączek. Tabela 2. Minimalna ilość leku posiewana na każde podłoże wg FP IX Ilość w pojemniku Wielkość próbki Płyny: Mniej niż 1 mL Cała zawartość pojemnika Połowa zawartości każdego 1 mL-40 mL pojemnika, jednak nie mniej niż 1 mL Więcej niż 40 mL, lecz nie więcej 20 mL niż 100 mL 10% zawartości każdego pojemnika, Więcej niż 100 mL jednak nie mniej niż 20 mL Płynne preparaty antybiotyków 1 mL Nierozpuszczalne preparaty, Cała zawartość każdego pojemnika, kremy i maści, które zawiesza się nie mniej niż 200 mg lub emulguje Substancje stałe: Mniej niż 50 mg Cała zawartość każdego pojemnika 50 mg lub więcej, lecz mniej niż Połowa zawartości każdego 300 mg pojemnika, jednak nie mniej niż 50 mg Od 300 mg do 5g 150 mg Więcej niż 5g 500 mg Katgut i inne nici do użytku 3 odcinki zwoju (każdy o długości weterynaryjnego 30 cm) 132 Pożywki stosowane w kontroli jałowości muszą spełniać następujące warunki: zapewniać rozwój możliwie szerokiego zakresu bakterii i grzybów, umożliwiać rozwój bakterii tlenowych i beztlenowych, umożliwiać szybki rozwój drobnoustrojów. Używa się dwóch podstawowych pożywek płynnych: tioglikolanowej (Brewera), zapewniającej wzrost bakterii beztlenowych i tlenowych oraz kazeinowo-sojowej, odpowiedniej zarówno dla grzybów, jak i bakterii tlenowych. Kontrole, które musza towarzyszyć każdemu badaniu jałowości to: kontrola jałowości pożywek polegająca na inkubacji przez 14 dni nieposianych pożywek: tioglikolanowej w temp.30-35°C, kazeinowosojowej w temp. 20o-25°C; kontrola przydatności pożywek uzyskana przez posianie na pożywki szczepów wzorcowych w zawiesinach zawierających około 100 CFU/mL; na podłoże tioglikolanowe należy posiać: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, a na podłoże kazeinowo-sojowe: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis i Candida albicans, a następnie je inkubować nie dłużej niż 3 dni w przypadku bakterii i nie dłużej niż 5 dni w przypadku grzybów; kontrola wzrostu drobnoustrojów w obecności leku – walidacja badania, polegająca na posianiu wyżej wymienionych szczepów wzorcowych na pożywki zawierające badany lek. Kontrola ma na celu sprawdzenie, czy lek nie hamuje wzrostu bakterii lub grzybów i pozwala na wybór odpowiedniej metody badawczej. Po wykonaniu prób wszystkie pożywki należy inkubować nie dłużej niż 5 dni. Metody przeprowadzenia badania jałowości: Posiew bezpośredni polega na wprowadzeniu do podłoża hodowlanego produktu badanego tak, aby objętość produktu stanowiła nie więcej niż 10% objętości podłoża, o ile nie ma innych wymagań. Jeżeli badany produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe, należy je najpierw 133 zneutralizować odpowiednią substancją neutralizującą lub rozcieńczyć lek w wystarczająco dużej objętości podłoża. Maści, kremy i płyny olejowe należy przenieść do podłoża emulgującego, np. pożywki z Tweenem 80. Sączeniem przez filtry membranowe bada się preparaty wodne, alkoholowe i olejowe oraz preparaty rozpuszczalne w wodzie lub rozpuszczalnikach olejowych pod warunkiem, że rozpuszczalniki te nie wykazują w warunkach badania działania przeciwdrobnoustrojowego. Metoda ta zalecana jest także w przypadku badania leków, które ze względu na wielkość pojemnika, muszą być zbadane w dużej objętości – powyżej 100 mL. Próbkę leku należy przesączyć przez filtr bakteriologiczny o wielkości porów nie większej niż 0,45 μm. Jeżeli produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe, po przesączeniu leku filtr należy przepłukać co najmniej trzema porcjami (po 100 mL) jałowego rozcieńczalnika (np. obojętny roztwór peptonu). Sączek należy przenieść do jednej z pożywek lub po przecięciu na dwie równe części do dwóch różnych podłoży. Badane leki, których jałowość bada się jedną z wymienionych metod, powinny być posiane na pożywki dla bakterii i grzybów. Czas inkubacji wynosi 14 dni. Warunki hodowli próbek przedstawia Tabela 3. Tabela 3.Temperatura i czas inkubacji pożywek Pożywka Temperatura inkubacji Czas inkubacji Tioglikolanowa 30 – 35°C 14 dni (Brewera) Podłoże z hydrolizatem 20 – 25°C 14 dni kazeiny i soi O wyniku badania świadczy obecność lub brak wzrostu drobnoustrojów w pożywce. Wzrost objawia się zmętnieniem, obecnością kożucha na powierzchni pożywki lub osadu na dnie naczynia. Nie zawsze zmętnienie lub osad jest wynikiem wzrostu. Mogą one powstawać wskutek reagowania składników pożywki z lekiem. Aby uniknąć błędnej oceny, należy wykonać preparat barwiony metodą Grama oraz dokonać przesiewu z danego podłoża (przynajmniej 1 mL) na nową pożywkę. 134 Próbka powinna być inkubowana co najmniej 4 dni. Jeżeli w tym czasie nie będzie wzrostu drobnoustrojów, badany produkt spełnia wymagania jałowości. W przypadku obecności drobnoustrojów należy, w miarę możliwości przeprowadzić ich identyfikację. Jeżeli niekorzystny wynik badania budzi wątpliwości, należy przeprowadzić ponowne badanie, używając takiej samej liczby pojemników, jak w badaniu pierwotnym. Jeżeli w powtórzonym badaniu brak jest wzrostu drobnoustrojów, badany produkt jest jałowy. Badanie mikrobiologiczne leków, które muszą spełniać kryteria czystości mikrobiologicznej Podobnie, jak w badaniach jałowości, wyniki tych oznaczeń są względne, uzależnione z jednej strony od wybranych warunków hodowli, z drugiej zaś od charakteru zanieczyszczeń mikrobiologicznych znajdujących się w badanym materiale. Celem tych badań jest określenie liczby żywych bakterii i grzybów, tzn. drobnoustrojów zdolnych do wzrostu i rozmnażania w zastosowanych warunkach hodowli w niejałowych produktach farmaceutycznych (Tabela 1). Ukierunkowane badania identyfikacyjne, muszą wykluczyć obecność wskazanych dla danej grupy bakterii oportunistycznych lub wskaźnikowych dla stanu higienicznego (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp., bakterie gramujemne tolerujące żółć) oraz Candida albicans. Licząc żywe drobnoustroje wykorzystuje się fakt, że z jednej jednostki wzrostowej (jtk, CFU) powstaje na pożywce stałej jedna kolonia. Zatem liczba powstających kolonii odpowiada liczbie CFU wprowadzonych z lekiem na płytkę (patrz rozdział 6). Porównanie otrzymanego wyniku z kryterium określonym dla danej grupy leków pozwala na ocenę badanej partii leków. Podobnie, jak przy badaniu jałowości, wszystkie czynności w przebiegu określania czystości mikrobiologicznej leków powinny być wykonane w aseptycznym pomieszczeniu lub boksie z laminarnym przepływem powietrza. Jeżeli badany produkt posiada aktywność przeciwdrobnoustrojową, musi być ona zneutralizowana. W przypadku zastosowania substancji 135 neutralizującej należy sprawdzić jej skuteczność oraz brak działania toksycznego w stosunku do drobnoustrojów. Sposób pobrania i wielkość próbki są, podobnie jak w badaniu jałowości, określone pewnymi zasadami. W analizie czystości mikrobiologicznej konieczne jest pobranie 10 g lub 10 mL próbki. Próbkę należy pobrać losowo z materiału przed rozporcjowaniem lub spośród dostępnych pojemników z preparatem. Produkty rozpuszczalne w wodzie należy rozpuścić lub rozcieńczyć w jałowym rozcieńczalniku (np. w zbuforowanym roztworze chlorku sodu z peptonem o pH 7,0) przygotowując rozcieńczenie 1:10. Jeżeli to konieczne, można użyć innych rozcieńczeń. Jeżeli wiadomo, że produkt ma aktywność przeciwdrobnoustrojową, do rozcieńczalnika powinna być dodana substancja neutralizująca. W przypadku produktów nierozpuszczalnych w wodzie, do rozcieńczalnika można dodać substancję powierzchniowo czynną, np. Tween 80. Produkty zawierające tłuszcze wymagają wstępnego zhomogenizowania, np. z Tweenem 80 i dodatkowo ogrzania do temp. 40-45°C. Do badania systemów transdermalnych konieczna jest próbka licząca 10 sztuk. Po usunięciu osłonki chroniącej warstwę adhezyjną systemy transdermalne przenosi się do 500 mL zbuforowanego roztworu NaCl z peptonem o pH 7,0, zawierającego odpowiednią substancję neutralizującą, np. Tween 80 i/lub lecytynę i wytrząsa przez około 30 minut. Podłoża i warunki hodowli badanych próbek muszą być tak dobrane, aby wynik analizy dawał możliwie pełną informację o stopniu zanieczyszczenia leku drobnoustrojami rosnącymi w warunkach tlenowych (bakteriami i grzybami). Dla bakterii stosuje się agar z hydrolizatem kazeiny i soi, umożliwiający wzrost drobnoustrojów o typowych wymaganiach odżywczych. Dla grzybów jest to stałe podłoże Sabouraud z dekstrozą. Inkubację obu podłoży przeprowadza się w ciągu 3-5 dni, w temperaturze 30-35°C, a podłoża Sabouraud z dekstrozą 5-7 dni w temperaturze 20-25°C. Wybór metody badania zależy od rodzaju produktu i spodziewanej liczby drobnoustrojów. Stosuje się ogólnie przyjęte metody liczenia drobnoustrojów (patrz rozdział 6). 136 W metodzie płytkowej po odpowiednim rozcieńczeniu badanej próbki dokonuje się posiewu powierzchniowego lub głębinowego znanej objętości materiału. Należy przygotować co najmniej po dwie płytki na każde rozcieńczenie i każde podłoże. Po inkubacji zlicza się kolonie, a uwzględniając współczynnik rozcieńczenia określa się liczbę CFU w 1 mL lub 1 g leku. W metodzie filtracji używa się dwóch sączków membranowych o średnicy porów nie większej niż 0,45 μm. Wybór materiału, z którego wykonany jest sączek, zależy od rodzaju sączonej substancji (roztwory wodne, olejowe, etanolowe). Po przesączeniu próbek preparatu, każdy z dwóch sączków należy przemyć jałowym rozcieńczalnikiem (np. zbuforowanym roztworem NaCl). Jeśli to potrzebne, dodaje się Tween 80 lub związków inaktywujących działanie przeciwdrobnoustrojowe. Każdy z sączków należy następnie przenieść na powierzchnię odpowiedniego podłoża (dla bakterii i grzybów) tak, aby powierzchnia na której osadziły się drobnoustroje była zwrócona ku górze. Po inkubacji liczy się wyrosłe na sączku kolonie. Ich liczba odpowiada liczbie CFU w 1 g lub 1 mL leku. Przy badaniu systemów transdermalnych należy przesączyć dwie porcje po 50 mL przygotowanej próbki. Metodę oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL) (patrz rozdział 6) stosuje się tylko wtedy, gdy nie jest możliwe wykonanie badania innymi metodami. Należy przygotować co najmniej trzy kolejne 10-krotne rozcieńczenia produktu, a następnie z każdego z nich pobrać po trzy próbki odpowiadające 0,1 g/mL, 0,01 g/mL, 0,001 g/mL, wprowadzić do probówek zawierających bulion z hydrolizatem kazeiny i soi. Inkubować w temp. 30-35°C przez 3-5 dni. Na podstawie obliczeń statystycznych uważa się, że wzrost drobnoustrojów w pożywce, przy wprowadzeniu znanej wielkości próby jest miarą określonej liczby drobnoustrojów w jednostce wagowej lub objętościowej preparatu. Badanie czystości mikrobiologicznej obejmuje postępowanie identyfikacyjne. W badaniach identyfikacyjnych bakterii izolowanych z leków poszukuje się drobnoustrojów, których obecność nie jest dozwolona: S. aureus, P. aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp., bakterie gramujemne tolerujące żółć oraz Candida albicans. Próbki do badania przygotowuje się w taki sam sposób, jak do oznaczania liczby drobnoustrojów. Badanie wykonuje się metodą bezpośredniego posiewu 137 lub metodą filtracji. W pierwszym etapie badania próbkę leku wprowadza się do odpowiedniej płynnej pożywki namnażającej. Jeżeli korzystano z metody filtracji próbki leku, sączek przenosi się do właściwej płynnej pożywki namnażającej. Po uzyskaniu wzrostu bakterii na pożywkach namnażających dokonuje się przesiewu na pożywki diagnostycznowybiórcze. Szczegółową identyfikację przeprowadza się za pomocą testów biochemicznych i serologicznych. Wykonanie każdego badania czystości mikrobiologicznej musi poprzedzić walidacja metody oznaczania. Celem walidacji jest potwierdzenie, że badany produkt nie hamuje wzrostu drobnoustrojów, a wybrana metoda badania nie wpłynie na wynik analizy. Walidacja polega na porównaniu wzrostu szczepów testowych w obecności badanych leków i bez leków. Jako testowe wykorzystuje się trzy wzorcowe szczepy bakterii: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, posiewane na podłoże kazeinowo-sojowe i dwa wzorcowe szczepy grzybów: Candida albicans i Aspergillus brasiliensis, posiewane na podłoże Sabouraud z dekstrozą. Po wykonaniu posiewów pożywki dla bakterii inkubuje się w temp. 30-35°C, a pożywki dla grzybów w temp. 20-25°C, przez 5 dni. Metodę uznaje się za zwalidowaną, jeżeli liczba drobnoustrojów (CFU) w zawiesinach z próbkami jest najwyżej dwukrotnie większa od liczby każdego z drobnoustrojów testowych w zawiesinach w chwili ich dodania (drobnoustrój się swobodnie mnoży), a jeśli jest mniejsza, to nie mniej niż dwukrotnie (drobnoustrój przeżywa w leku, ale się nie mnoży). Zadania do wykonania Na ćwiczeniach należy dbać o warunki aseptyczne, wykonując wszystkie zadania w bezpośrednim sąsiedztwie palnika. W zadaniach metody farmakopealne zostały nieco uproszczone, tak by można je było wykonać w czasowym wymiarze ćwiczeń. 138 Zadanie 1. Kontrola jałowości wody do iniekcji - Odkaź powierzchnię ampułki (objętość 10 mL) watą zwilżoną 70% etanolem. - Pobierz jałową strzykawką 4 mL wody i wprowadź po 2 mL do dwóch kolbek; jednej, zawierającej: 20 mL pożywki tioglikolanowej Brewera i drugiej, zawierającej 20 mL pożywki kazeinowo-sojowej. - Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera w cieplarce w 35°C, a pożywkę kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny. Zadanie 2. Kontrola jałowości roztworu NaCl (objętość 21-100 mL) - Przetrzyj powierzchnię gumowego korka watą zwilżoną 70% etanolem. - Pobierz jałową strzykawką roztwór soli i wprowadź po 10 mL do pożywki tioglikolanowej Brewera i pożywki kazeinowo-sojowej (pożywki po 100 mL powinny być przygotowane w kolbkach). - Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera w cieplarce w 35°C, a pożywkę kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny. 139 Zadanie 3. Kontrola jałowości materiałów opatrunkowych (gazy) - Odetnij jałowymi nożyczkami 2 próbki gazy po około 10 cm2 (1g). Jałową pęsetą umieść kolejne próbki gazy w 50 mL pożywki tioglikolanowej Brewera i w 50 mL pożywki kazeinowo-sojowej. - Umieść pożywkę tioglikolanową Brewera w cieplarce w 35°C, a pożywkę kazeinowo-sojową w 25°C na 24 godziny. Zadanie 4. Określenie liczby drobnoustrojów w lekach (tabletki, leki płynne) metodą bezpośredniego posiewu, techniką płytkową Do badania należy pobierać taką objętość próbki, która zawiera 1 g lub 1 mL leku. Należy wykonać kilka wzrastających 10-krotnych rozcieńczeń próbki. - Z przygotowanych rozcieńczeń leku pobierz jałowo po 0,1 mL i posiej powierzchniowo na agar z hydrolizatem kazeiny i soi i pożywkę Sabouraud z dekstrozą. - Oblicz jakie rozcieńczenia leku znalazły się na płytkach. - Po inkubacji (podłoże agar z hydrolizatem kazeiny i soi – 35°C, podłoże Sabouraud z dekstrozą – 25°C, 24 godziny) policz kolonie wyrosłe na każdej płytce. - Oblicz ile bakterii i grzybów było w 1 g lub 1 mL badanego leku. - Zinterpretuj wynik. - Wpisz wyniki wykonanych przez siebie i kolegów badań do odpowiednich rubryk tabeli. 140 Nazwa leku Dopuszczalna liczba drobnoustrojów wg FP IX Liczba drobnoustrojów w badanej próbce Wynik 1............................ (leki do nosa, uszu i gardła) 2............................ (leki stosowane doustnie) 141 142 Część II Rozdział 1 Badanie wrażliwości bakterii na antybiotyki i monitorowanie leczenia Część teoretyczna Leki przeciwbakteryjne i ich stosowanie Leki przeciwbakteryjne to duża grupa antybiotyków (będących produktem naturalnym drobnoustrojów) i chemioterapeutyków (zsyntetyzowanych chemicznie). Najliczniejsze i najczęściej wykorzystywane w lecznictwie ich grupy to antybiotyki -laktamowe, aminoglikozydy, tetracykliny, makrolidy, fluorochinolony. Te, których znajomość jest niezbędna dla uczestnictwa w ćwiczeniach pokazano w Tabeli 1. Leki przeciwbakteryjne stosowane są w monoterapii (leczenie jednym lekiem) lub w terapii skojarzonej (kilkoma lekami). Zaletami terapii skojarzonej jest poszerzenie zakresu ich działania i wzmocnienie aktywności, jeśli użyte leki działają synergistycznie. Synergizm jest wzmożeniem działania leków, większym niż to, jakiego można się spodziewać jako sumy ich działań. Nie należy kojarzyć leków, które charakteryzuje antagonizm – gdy ich mechanizm działania wzajemnie się znosi lub wyklucza. Zastosowanie terapii skojarzonej często zmniejsza potrzebne dawki, a tym samym toksyczność leków, a także w dużym stopniu zmniejsza niebezpieczeństwo selekcji szczepów o nabytej oporności. Leki przeciwdrobnoustrojowe wykazują różny zakres (spektrum) działania. Wynika to z ich zdolności do interferowania z określonymi elementami budowy lub metabolizmu, charakterystycznymi dla wielu lub tylko dla nielicznych bakterii. Stąd każdy gatunek bakterii charakteryzuje oporność naturalna na niektóre z tych leków, która jest genetycznie determinowana cechami dla niego charakterystycznymi. Jej mechanizm jest związany 143 z występowaniem barier w przenikaniu antybiotyku przez osłony bakterii, brakiem systemu aktywnego transportu lub nieobecnością struktur lub/i szlaków metabolicznych będących celem działania tego antybiotyku. Ta oporność decyduje o tym czy antybiotyk lub chemioterapeutyk nazwiemy szerokowidmowym (działającym na wiele grup bakterii w tym gramdodatnie i gramujemne) czy wąskowidmowym (działającym na wąską grupę, np. na gramujemne pałeczki albo prątki). Spośród wymienionych niżej, do ważnych terapeutycznie, szerokowidmowych leków należą niektóre penicyliny półsyntetyczne (amoksycylina i ampicylina), cefalosporyny, tetracykliny i karbapenemy. Nieco węższe spektrum mają aminoglikozydy i makrolidy. Wąskowidmowe są penicyliny naturalne (penicylina G) i kloksacylina, a także monobaktamy, metronidazol i glikopeptydy. Tabela 1. Podstawowe antybiotyki i chemioterapeutyki używane w terapii Grupa Wybrane Spektrum (zakres) działania preparaty β-laktamy ANTYBIOTYKI HAMUJĄCE SYNTEZĘ ŚCIANY KOMÓRKOWEJ Penicyliny Penicylina G G(+) i nieliczne G(-) Kloksacylina Amoksycylina Ampicylina Ko-amoksiklav (amoksycylina + kwas klawulanowy) Tikarcylina Piperacylina G(+) G(+) i wiele (G-) G(+) i wiele (G-) oraz bakterie wytwarzające β-laktamazy G(-), słabiej na G(+) G(+) , G(-), tlenowe i beztlenowe 144 I generacja Cefalospooryny II generacja III generacja IV generacja V generacja Monobaktamy Karbapenemy Glikopeptydy Cefradyna Cefaklor Cefazolina Cefuroksym Cefoksytyna silniej G(+), słabiej G(-) Ceftazydym Cefotaksym Ceftriakson Cefepim G(+) i G(-) Ceftarolina Ceftobiprol Aztreonam Imipenem Meropenem Wankomycyna Teikoplanina silniej G(-), słabiej G(+) G(+) i G(-) (najszersze spektrum ) G(+) (rekomendowane dla szczepów MRSA) i G(-) G(-) G(+) i G(-) G(+) ANTYBIOTYKI HAMUJĄCE SYNTEZĘ BIAŁKA Aminoglikozydy Makrolidy Tetracykliny Linkozamidy Oksazolidynony Gentamicyna Amikacyna Netilmycyna Tobramycyna Streptomycyna Erytromycyna Klaritromycyna Azitromycyna Oksytetracyklina Doksycyklina Klindamycyna Linezolid G(-), słabiej na G(+) G(+), słabo G(-), aktywne wobec chlamydii, mikoplazm i bakterii wewnątrzkomórkowych G(+) i G(-), chlamydie, riketsje i krętki G(+) i beztlenowe G(-) G(+), niektóre beztlenowce 145 ANTYBIOTYKI HAMUJĄCE SYNTEZĘ DNA Fluorochinolony Nitroimidazole Rifamycyny Ciprofloksacyna Ofloksacyna Gatifloksacyna Moksifloksacyna Metronidazol Rifampicyna Sulfonamidy Trimetoprim Sulfametoksazol Trimetoprim G(-), aktywne wobec Chlamydia, Mycoplasma, Legionella, Mycobacterium tuberculosis beztlenowce G(+), Mycobacterium tuberculosis G(+) i G(-) G(+) i G(-) ANTYBIOTYKI HAMUJĄCE SYNTEZĘ ENZYMÓW I USZKADZAJĄCE DNA Nitrofurany Furagina G(+) i G(-) Obok oporności naturalnej bakterie fenotypowo prezentują też oporność nabytą. Powstaje ona w wyniku pozyskania przez nie genów oporności na antybiotyki – poprzez transfer odpowiednich fragmentów DNA (np. na plazmidach) z komórek innych bakterii. Ponieważ nie sposób przewidzieć tych procesów, konieczne jest wykonywanie badań mikrobiologicznych określających działanie wytypowanych grup leków na szczep izolowany od pacjenta uznany za czynnik etiologiczny jego choroby. Wybierane są leki, które ze względu na naturalną wrażliwość tych bakterii powinny być skuteczne, ale nabyta oporność mogła zmienić ten stan rzeczy. Bada się wrażliwość wyizolowanych od pacjenta bakterii uzyskanych w postaci czystej hodowli. Określanie lekowrażliwości Najczęściej stosowanym sposobem określania zakresu (profilu) wrażliwości bakterii na antybiotyki in vitro jest metoda krążkowodyfuzyjna zwana popularnie antybiogramem. 146 W metodzie tej antybiotyk dyfunduje z krążka ułożonego na powierzchni posianego badanym szczepem agaru i hamuje jego wzrost. Wielkość strefy zahamowania jest wyznacznikiem wrażliwości. Metoda wymaga bardzo starannej standaryzacji, aby wyniki były porównywalne w obrębie danej pracowni i między ośrodkami. Pełniejsze dane na temat poziomu wrażliwości badanych bakterii uzyskuje się ustalając in vitro stężenie antybiotyku, które zabija lub hamuje wzrost bakterii. Oznacza się najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii – MIC (ang. minimum inhibitory concentration) i/lub najmniejsze stężenie bakteriobójcze (zabijające 99,9% bakterii) – MBC (ang. minimum bactericidal concentration). Stężenie określa się w µg lub jednostkach leku na mL. Takie badania dają znacznie więcej informacji, które mogą przyczynić się do podjęcia właściwej terapii. Oznaczenia te wykonuje się także przy ocenie nowych leków. Zazwyczaj testuje się wtedy wrażliwość wielu rodzajów izolowanych klinicznie drobnoustrojów, a wśród nich dużej grupy szczepów każdego z gatunków, określając wartość MIC90. Wartość ta określa najmniejsze stężenie, na które było wrażliwe 90% badanych szczepów. Wykorzystując technikę oznaczania MIC można badać działanie antybiotyków w skojarzeniu. Wyniki tych oznaczeń mogą być bardzo istotne przy leczeniu zakażeń szczepami wieloopornymi. Badanie to można wykonać też metodą dyfuzyjno-krążkową, ale otrzymane tak wyniki są mniej miarodajne. Duże znaczenie kliniczne, szczególnie u pacjentów, u których cechy farmakologiczne leków są zmienione w konsekwencji chorób towarzyszących, przyjmowanych leków lub z racji wieku, w zakażeniach o ciężkim przebiegu, w przypadkach bakteriemii wywołanej przez pałeczki gramujemne, przypisuje się oznaczaniu aktywności bakteriobójczej antybiotyków w surowicy pacjentów. Aktywność ta jest bowiem wypadkową działania leków oraz aktywności ich układu immunologicznego (przeciwciał, opsonin, dopełniacza). Wykonuje się wtedy test Schlichtera (SBT ang. serum bactericidal test). Pozwala on prognozować efekty leczenia, określić czy dany lek osiąga odpowiednie (bakteriobójcze) stężenie we krwi, a także, czy zastosowanie dwóch lub więcej antybiotyków da efekt synergistyczny. W badaniu tym szczepem testowym jest drobnoustrój stanowiący czynnik etiologiczny zakażenia. 147 W badaniach antybiotykowrażliwości bakterii izolowanych z przypadków klinicznych w Polsce stosuje się procedury zawarte w wytycznych Krajowego Ośrodka Referencyjnego d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) oparte na zebranych danych z terenu Polski (np. dobór antybiotyków) oraz na normie amerykańskiej, opracowanej przez CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute), dawniej NCCLS (ang. National Committee for Clinical Laboratory Standards). Mechanizmy lekooporności bakterii Oporność bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki wynika z ekspresji genów oporności i przejawia się w czterech podstawowych mechanizmach: enzymatycznym – w którym lek jest rozkładany (inaktywowany) przez wydzielane, zazwyczaj na zewnątrz, enzymy bakteryjne; transportowym – w którym lek nie może dotrzeć do miejsca działania (uchwytu), czy to z powodu modyfikacji w obrębie ściany lub membrany komórkowej lub też w wyniku aktywnego usuwania z komórki (efflux); polegającym na modyfikacji miejsca receptorowego (punktu uchwytu) leku w komórce; zmniejszeniu lub zniesieniu powinowactwa do leku; nadprodukcji receptora; polegającym na ominięciu etapu lub szlaku metabolicznego – syntezie nowych enzymów lub szlaków metabolicznych. Mechanizmy oporności mogą dotyczyć pojedynczych antybiotyków lub ich grup (klas), a czasem nawet kilku grup o podobnym mechanizmie działania. W praktyce oznacza to, że wystarczy wykryć taki mechanizm bez potrzeby wykonywania badań poszczególnych antybiotyków, aby przewidzieć prawdopodobną reakcję na leczenie. Badanie pozwalające przewidzieć szanse skuteczności leczenia antybiotykami -laktamowymi polega na wykrywaniu zdolności wyizolowanych od pacjenta bakterii do wytwarzania -laktamaz – 148 enzymów rozbijających wiązanie -laktamowe. To duża grupa enzymów o bardzo zróżnicowanej swoistości i dlatego, znając gatunek bakterii stanowiących czynnik etiologiczny wybiera się jedną z metod oznaczania. Wśród bakterii najbardziej rozpowszechnione są (często kodowane plazmidowo) penicylinazy rozkładające penicyliny i w niewielkim stopniu tylko niektóre spośród cefalosporyn. Aktywna produkcja tych enzymów jest często, szczególnie u bakterii gramujemnych, cechą indukcyjną prowokowaną nawet niewielką ilością antybiotyku. Silnymi induktorami są: penicylina benzylowa, ampicylina, cefradyna, cefazolina i cefamycyna. Penicylinazy są wytwarzane przez wiele bakterii, w tym ponad połowę szczepów gronkowców izolowanych w szpitalach. Ich aktywność znoszą specyficzne inhibitory – penemy, co można wykryć w badaniu laboratoryjnym i wykorzystuje się w leczeniu. Wytwarzanie β-laktamaz bada się przez porównanie wrażliwości drobnoustrojów na ampicylinę i amoksycylinę z klawulanianem metodą antybiogramu lub wyznaczenia MIC. W przypadku braku takiej możliwości np. u Haemophilus influenzae można wykonać test cefinazowy (z nitrocefiną). -laktamazy nazywane ESβL – o poszerzonym spektrum substratowym (ang. extended spektrum β-lactamases) wytwarzane są tylko przez niektóre pałeczki gramujemne, najczęściej z gatunków Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae. Enzymy te mają szerokie spektrum substratowe hydrolizują wszystkie antybiotyki β-laktamowe (także cefalosporyny z wyjątkiem cefamycyn i monobaktamy), ale nie karbapenemy. Zdolność ich wytwarzania bada się metodą z zastosowaniem odpowiednich krążków. Chociaż aktywność ESL jest częściowo znoszona przez inhibitory, nie ma to znaczenia dla terapii, ale jest wykorzystywane w metodzie ich wykrywania. Ważnym mechanizmem oporności na antybiotyki β-laktamowe pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae jest wytwarzanie cefalosporynaz AmpC. Hydrolizują one penicyliny, większość cefalosporyn i monobaktamy, ale nie są hamowane przez inhibitory β-laktamaz. Oporność na cefalosporynę III generacji pałeczek gramujemnych może rozwijać się w trakcie leczenia, 149 co powoduje konieczność monitorowania mikrobiologicznego przebiegu terapii. Wytwarzanie przez pałeczki jelitowe AmpC lub ESL i jednoczesne obniżenie przepuszczalności osłon komórkowych może również prowadzić do pojawienia się oporności in vitro na karbapenemy. Ostatnio pojawiły się także szczepy wytwarzające specyficzne enzymy: karbapenemazy KPC. Najczęściej wytwarzają je pałeczki Klebsiella pneumoniae, ale również inne Enterobacteriaceae, a także Pseudomonas aeruginosa. Oporność na karbapenemy może również być związana z wytwarzaniem karbapenemaz OXA-48 czy MβL. Metalo-β-laktamazy (MβL) są produkowane najczęściej przez szczepy Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter spp., ale także niektóre Enterobacteriaceae. Aktywność tych enzymów zależna jest od obecności w środowisku jonów metali. Pałeczki wytwarzające MβL dysponują nabytą opornością na karbapenemy i różne antybiotyki -laktamowe (zależnie od szczepu). Wykrycie tego mechanizmu u badanego szczepu wyklucza zatem wykorzystywanie w terapii tych antybiotyków. Szczepy gramujemnych pałeczek wytwarzających te enzymy są z reguły wielooporne. Leczenie antybiotykami β-laktamowymi może być także niemożliwe, jeśli bakterie zyskały nowy gen, a z nim zdolność syntezy nowego membranowego białka enzymatycznego zaangażowanego w syntezę peptydoglikanu – PBP, które utraciło (lub ma bardzo niskie) naturalne powinowactwo do tych antybiotyków, a może spełniać swoje biologiczne funkcje udziału w syntezie ściany komórkowej. Oporność taką nazywa się meticylinoopornością i jest ona kodowana na chromosomie. Nowe białko wiążące powstaje w wyniku mutacji, której efekt rozprzestrzenia się klonalnie. Mutacja ta ma ogromne znaczenie kliniczne u gronkowców, których zmienione białko określa się jako PBP2a. Meticylinooporne gronkowce złociste (MRSA – ang. methicillin resistant Staphylococous aureus) i gronkowce koagulazoujemne (MRCNS – ang. methicillin resistant coagulase – negative staphylococci) są oporne na wszystkie antybiotyki -laktamowe, a także często na inne antybiotyki. Początkowo ten typ oporności badano wykazując ich oporność na niewrażliwą na β-laktamazy 150 penicylinę półsyntetyczną – meticylinę, stąd pochodzi nazwa tego mechanizmu oporności. Antybiotykami, na które szczepy meticylinooporne zachowały wrażliwość są glikopeptydy (np. wankomycynę). Coraz jednak liczniejsze są doniesienia ze świata o pojawianiu się szczepów opornych i na ten antybiotyk. Wrażliwość szczepów izolowanych w Polsce jest jeszcze zadowalająca (0.5-2 µg/mL), ale wymagane jest monitorowanie poziomu wankomycynooporności w celu wykrycia zagrożenia ze strony szczepów VISA (ang. vancomycin intermediateresistant S. aureus) i VRSA (ang vancomycin resistant S. aureus), aby zapobiec rozprzestrzenieniu się ich klonów. Wszystkie szczepy S. aureus wartościach MIC wankomycyny ≥ 2 μg/mL należy badać w kierunku obniżonej wrażliwości na glikopeptydy (metodyka wg KORLD) i przesłać do ośrodka w celu potwierdzenia. Innym mechanizmem wykrywanym w jednym badaniu jest oporność gronkowców na makrolidy i linkozamidy - oporność typu MLSB. Obejmuje ona makrolidy, linkosamidy i streptograminę B, antybiotyki o zbliżonym mechanizmie działania. Jest ona związana ze zmianą struktury miejsca wiązania antybiotyku na rybosomie przez przyłączenie dwóch grup metylowych do adeniny. Metylacja zachodzi przy udziale metylazy kodowanej przez gen erm. Oporność może mieć charakter konstytutywny i wtedy jest autentyczną opornością MLSB i odnosi się krzyżowo do wymienionych grup antybiotyków, których nie należy stosować w terapii. Gdy oporność ma charakter indukowany wtedy w ocenie klinicznej należy uznać oporność na makrolidy, ale należy wziąć pod uwagę że podawanie linkozamidów i streptograminy B może spowodować selekcję mutantów o fenotypie oporności konstytutywnej. Mechanizmem oporności wykrywanym specjalną metodą jest też oporność szczepów enterokoków o fenotypie HLAR (ang. high level aminoglycoside resistance). Paciorkowce z rodzaju Enterococcus charakteryzują się naturalną opornością na niskie stężenia (32-512 µg/mL) antybiotyków aminoglikozydowych, co jest wynikiem ich słabego transportu do komórek. W powodowanych przez nie infekcjach zwykle skuteczne jest jednak stosowanie tych leków w dużych stężeniach. Niektóre szczepy enterokoków mogą jednak mieć nabytą cechę tzw. wysokiej oporności na aminoglikozydy wynikającej z wytwarzania 151 enzymów modyfikujących cząsteczkę antybiotyku. Infekcje wywołane przez szczepy HLAR nie mogą być skutecznie leczone antybiotykami aminoglikozydowymi. Poszukiwanie nowych antybiotyków i chemioterapeutyków Szerokie stosowanie leków przeciwbakteryjnych powoduje powstawanie i narastanie zjawiska oporności. Dlatego też, mimo, że w lecznictwie ma obecnie zastosowanie około 100 preparatów, stale poszukuje się nowych, o lepszym spektrum, działających na szczepy wielooporne czy mających korzystne właściwości farmakologiczne. Nowe leki przeciwbakteryjne są najczęściej modyfikacją chemiczną znanych produktów naturalnych, bowiem poszukiwanie nowych aktywnych substancji z bakterii glebowych i grzybów wymaga ogromnych nakładów finansowych. Prowadzone są również badania substancji wytwarzanych przez glony, porosty, rośliny wyższe (alkaloidy, diterpenoidy), a nawet organizmy zwierzęce (polipeptydy wytwarzane przez bezkręgowce, płazy i ssaki). Procedury badania leków opisane są w bieżących wydaniach Farmakopei. Aktywność nowych leków przeciwdrobnoustrojowych określa się opisaną wyżej metodą wyznaczania wartości MIC. W tym wypadku jednak badanie przeprowadza się w stosunku do zestawu szczepów wzorcowych o znanej wrażliwości. Szczepy te mają cechy ich oporności naturalnej, ale nie mają genów oporności nabytej. Są one ściśle oznakowane i przechowywane w specjalnych kolekcjach w warunkach gwarantujących zachowanie ich genotypu i fenotypu. Jeśli nowy lek wykaże obiecujące cechy w postaci niskich wartości MIC i/lub MBC wobec jednego (wąskowidmowy) czy wielu (szerokowidmowy) szczepów wzorcowych, w następnym etapie prowadzi się badania ze szczepami klinicznymi tych gatunków, wyznaczając wartości MIC50 i MIC90. Aktywność nowych preparatów określa się zawsze równolegle z oznaczaniem wzorca – zwykle dobrze znanego, najlepszego antybiotyku z tej samej grupy. 152 Metody Antybiogram Oznaczenie wykonuje się w ściśle standaryzowanych warunkach używając atestowanych krążków bibułowych nasączonych antybiotykami pamiętając, że na wynik antybiogramu, obok wrażliwości bakterii, ma wpływ szereg czynników związanych z jego wykonaniem. Wykonanie: należy zebrać 1-3 takie same kolonie z płytki ze świeżą czystą hodowlą wcześniej zidentyfikowanego szczepu i przygotować zawiesinę w fizjologicznym roztworze NaCl o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali Mc Farlanda; posiać ją wacikiem na powierzchnię płytki z podłożem MuelleraHinton; wybrać odpowiednie krążki z lekami (korzystając z instrukcji Ośrodka Referencyjnego) i ułożyć je na płytce używając jałowej pęsety lub dyspensera (na płytce 90 mm nie wiecej niż 5-6); płytki umieścić w ciągu 15 minut w cieplarce 35oC i inkubować przez 20 godzin; zmierzyć przezroczystą linijką strefy zahamowania wzrostu wokół krążków (mm); sprawdzić w tabeli stopień wrażliwości korzystając z odpowiednich tabel. Oznaczanie MIC i MBC metodą rozcieńczeniową Oznaczenie to można przeprowadzić na podłożu płynnym lub stałym. Ta pierwsza metoda ma szersze zastosowanie i została tu opisana. Jako inokulum przygotowuje się zawiesinę badanego szczepu bakterii w roztworze NaCl o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali Mac Farlanda i rozcieńcza w pożywce 102 raza. Wykonanie Przygotować szereg kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń antybiotyku w pożywce płynnej. 153 Dodać stałą objętość inokulum bakterii (zależną od przyjętej skali) do probówek z kolejnymi rozcieńczeniami antybiotyku i probówki kontrolnej (bez antybiotyku). Inkubować w cieplarce 37oC 20 godzin. Po tym czasie ocenić makroskopowo wzrost. Stężenie antybiotyku w ostatniej probówce w szeregu, w której brak wzrostu bakterii określa wartość MIC. Oznaczenie MBC jest kontynuacją oznaczenia MIC. Po jego odczytaniu, z probówek, w których brak widocznego wzrostu oraz probówki kontrolnej odsiewa się standaryzowaną ezą próbki punktowo na pożywkę stałą, odpowiednią dla badanych bakterii (np. podłoże MacConkeya dla pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae). Po inkubacji ocenia się wzrost na płytkach. Wzrost będzie niewidoczny tylko przy subkulturze z probówki z takim rozcieńczeniem antybiotyku, które jest bójcze dla tych bakterii. Jest ono wartością MBC. Oznaczenie MIC metodą E-testu E-test jest paskiem nasączonym antybiotykiem. W pasku tym utworzono gradient stężeń; ich wartości opisane są liczbowo na jego powierzchni (wartości MIC). Paski układa się na odpowiednim podłożu zasianym standaryzowaną zawiesiną badanego szczepu podobnie jak krążki w antybiogramie. Podczas inkubacji w cieplarce (37oC 20 godzin) antybiotyk dyfundując z paska do podłoża spowoduje zahamowanie wzrostu bakterii. Strefa zahamowania wzrostu maleje wraz ze zmniejszaniem się stężenia antybiotyku. Wartość najmniejszego stężenia hamującego – MIC wskazuje dotykająca paska krawędź strefy zahamowania. Badanie działania antybiotyków w skojarzeniu Badanie działania antybiotyków w skojarzeniu można przeprowadzić stosując metodę krążkowo-dyfuzyjną na podłożu stałym przez porównanie wielkości stref zahamowania wzrostu badanego szczepu wokół krążków z pojedynczymi antybiotykami i krążka zawierającego oba leki lub ocenę powiększenia (synergizm) lub zmniejszenia (antagonizm) tej strefy 154 we wspólnym obszarze dyfuzji antybiotyków z dwóch położonych w odległości 20 mm krążków (mierząc od środka krążka). Bardziej miarodajna jest jednak metoda rozcieńczeniowa. W stosunku do badanego, izolowanego od pacjenta szczepu wyznacza się MIC antybiotyków działających pojedynczo i w mieszaninie. Następnie oblicza się indeks FIC (ang. fractional inhibitory concentration) dla poszczególnych antybiotyków (np. A i B). Indeks FIC antybiotyku A jest równy ilorazowi wartości MIC antybiotyków w mieszaninie (A+B) i wartości antybiotyku A pojedynczo. Indeks FIC antybiotyku B jest równy ilorazowi wartości MIC w mieszaninie (A+B) i wartości MIC (B). Jeżeli suma wartości indeksów FIC (A) i FIC (B) jest >1 oznacza to, że badane antybiotyki w skojarzeniu działają antagonistycznie. Działanie synergistyczne skojarzonych antybiotyków obserwuje się wtedy, gdy suma wartości indeksów FIC (A) i FIC (B) jest <1. Oznaczanie aktywności bakteriobójczej antybiotyków w surowicy pacjenta - test Schlichtera (SBT) Badanie wykonuje się podobnie jak oznaczanie MIC i MBC antybiotyku techniką rozcieńczeń. Przygotowuje się serię dwukrotnych rozcieńczeń badanej surowicy w pożywce płynnej, a następnie każdą z probówek zakaża się wystandaryzowaną zawiesiną (0,5 wg McFarlanda) szczepu wyizolowanego od pacjenta. Po około 20-godzinnej inkubacji odczytuje się miano bakteriostatyczne surowicy, a następnie materiał z probówek, w których nie zaobserwowano wzrostu bakterii odsiewa się na odpowiednie podłoża różnicujące. Następnego dnia odczytuje się miano bakteriobójcze surowicy (SBT). SBT oznacza się w czasie „0” – przed podaniem antybiotyku i w czasie: 30-60 minut po podaniu dożylnym (i.v.) 60 minut po podaniu domięśniowym (i.m.) 90 minut po podaniu doustnym (p.o.) Empirycznie ustalono kryteria dla pomyślnego rokowania efektów leczenia: miano SBT w czasie „0” minimum 1:32 miano SBT po podaniu antybiotyku minimum 1:64 155 Określanie mechanizmów lekooporności Wykrywanie szczepów wytwarzających β-laktamazy typu ESβL Powszechnie stosuje się tzw. test dwóch krążków (ang. double-disk synergy test – DDST), w którym, na płytce z posianą zawiesiną bakterii (przygotowaną jak do antybiogramu) układa się krążki zawierające amoksycylinę z klawulanianem (w centrum płytki) i w odległości 20 mm od środka tego krążka koncentrycznie krążki zawierające: ceftazydym, cefotaksym i aztreonam. O wytwarzaniu ESβL świadczy poszerzenie lub powstanie stref zahamowania wzrostu szczepu między cefalosporynami i monobaktamem, a krążkiem zawierającym klawulanian. Wykrywanie szczepów wytwarzających karbapenemazy Szczepy o małej wrażliwości na karbapenemy powinny zostać zbadane w kierunku wytwarzania KPC, OXA-48 lub MβL. Wykrywanie KPC Do wykrywania KPC wykorzystuje się kwas boronowy jako inhibitor tych βlaktamaz oraz meropenem i/lub imipenem. Badanie wykonuje się metodą krążkowo-dyfuzyjną. Na posianej szczepem badanym płytce układa się krążek z meropenem oraz krążek z meropenemem i kwasem boronowym (można równocześnie zastosować imipenem). Różnice stref zahamowania wzrostu ≥4mm świadczy o fenotypie KPC. Wykrywanie OXA-48 Badanie wykonuje się za pomocą testu z temocyliną 30 µg metodą krążkowo-dyfuzujną. Strefa zahamowania wzrostu poniżej 10 mm kwalifikuje szczep jako podejrzany o wytwarzanie OXA-48. Wykrywanie MβL Do wykrywania oporności typu MβL używa się EDTA i 2-MPA (kwas 2-merkaptopropionowy), które są inhibitorami metalo-β-laktamaz. Są to związki chelatujące, wiążące jony cynku z podłoża. Oporność typu MβL wykrywa się metodą krążkowo-dyfuzyjną. 156 Na podłożu Muellera-Hinton z posianym szczepem (postępowanie jak w przypadku przygotowywania antybiogramu) układa się zestaw krążków: centralnie krążek z 10 μL 0,5 M EDTA po jego obu stronach, w odległości 20 mm, krążki z ceftazydymem 30 μg i imipenemem 10 μg. O produkcji metalo-β-laktamaz świadczy pojawienie się lub wyraźne powiększenie strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z ceftazydymem lub/i imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor. Dostępne są również E-testy do wykrywanie MβL, które jednak nie są zalecane dla Enterobacteriaceae ze względu na większą ich wrażliwość in vitro na imipenem i zlewanie się stref zahamowania wzrostu. Wszystkie szczepy z pozytywną interpretacją testów wytwarzania karbapenemaz muszą zostać niezwłocznie przesłane do Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) w celu potwierdzenia wyniku. Wykrywanie meticylinooporności Dla wykrywanie metycylinooporności stosuje się różne metody: metodę krążkowo-dyfuzyjną (krążek z cefoksytyną 30), metodę przeglądową na podłożu stałym (tylko dla S. aureus), wykrywanie białka PBP2a przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, wykrywanie genu mec A technikami genetyki molekularnej, test komercyjny BBLCrystal MRSA ID System (wzrost bakterii w obecności antybiotyku powoduje redukcję substancji, która świeci pod lampą UV). Metoda przeglądowa polega na zasianiu powierzchni podłoża MuelleraHintona zawierającego 4% NaCl oraz 6 mg/L oksacyliny zawiesiną badanego szczepu gronkowca złocistego o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali McFarlanda. Po inkubacji 24 godziny w temperaturze 35o C stwierdza się obecność wzrostu (MRSA) lub jego brak - szczep wrażliwy (MSSA). 157 Wykrywanie szczepów enterokoków z mechanizmem HLAR Metoda przeglądowa (preferowana przez CLSI) Wykonując badanie antybiotykowrażliwości enterokoków należy nanieść badany szczep w postaci kropli zawiesiny o gęstości 0,5 McFarlanda na agar BHI z gentamicyną (500 μg/mL) lub ze streptomycyną (2000 g/mL). Jeśli po 24 godzinnej inkubacji w temp. 35oC w miejscu posiewu pojawi się więcej niż jedna kolonia – wynik jest dodatni, badane enterokoki są oporne na duże stężenia aminoglikozydów. W przypadku wyniku ujemnego, dla pewności hodowlę należy przedłużyć do 48 godzin. Metoda dyfuzyjno-krążkowa Badanie można też wykonać posługując się specjalnymi krążkami zawierającymi większą ilość antybiotyku aminoglikozydowego (gentamicyna – 120 μg, streptomycyna – 300 μg). Strefa zahamowania wzrostu szczepu wokół tych krążków mniejsza od 10 mm świadczy o obecności mechanizmu oporności HLAR. Wykrywanie oporności typu MLSB gronkowców Oznaczanie oporności indukowanej gronkowców na makrolidy i linkozamidy wykonuje się metodą krążkowo-dyfuzyjną. Badany szczep przygotowany jak do antybiogramu, posiewa się na podłoże MuelleraHinton. Na płytce umieszcza się krążki z erytromycyną 15 μg i klindamycyną 2 μg w odległości 15-26 mm (mierząc od środka krążka). Po o 16-18 godzinnej inkubacji w temperaturze 33-35 C odczytuje się wynik. O indukcyjnej oporności typu MLSB świadczy brak zahamowania wzrostu wokół krążka z erytromycyną lub strefa zahamowania świadcząca o oporności badanego szczepu na erytromycynę i wyraźne spłaszczenie strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną. Techniki biologii molekularnej stosowane w poszukiwaniu genów oporności na antybiotyki Oporność nabyta na antybiotyki jest wynikiem mutacji w genach lub pojawieniem się w wyniku przekazania od innych bakterii nowego genu. Geny oporności mogą być zlokalizowane w chromosomie lub na ruchomych elementach genetycznych (np. na plazmidach, transpozonach) 158 i mogą być przenoszone pomiędzy komórkami bakterii w wyniku horyzontalnego transferu genów (HTG). Do bezpośredniego wykrywania obecności w badanym szczepie bakterii (np. izolowanym z materiału klinicznego) genów oporności na substancje przeciwdrobnoustrojowe można wykorzystywać techniki molekularne. Przykładem może być wykrywanie u gronkowców genu mecA kodującego oporność na meticylinę czy genów z grupy erm odpowiedzialnych za mechanizm oporności krzyżowej na makrolidy, linkozamidy i streptograminę B (MLSB). Najczęściej wykorzystywaną metodą w poszukiwaniu genów oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki u bakterii jest łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR – ang. Polymerase Chain Reaction) oraz jej odmiany (np. Multiplex-PCR). Zadania do wykonania Zadanie 1. Wykonanie antybiogramu krążkowego dla bakterii wyhodowanych z materiału klinicznego - Otrzymujesz czystą hodowlę bakterii na płytce. - Pobierz wacikiem materiał z kilku kolonii i przygotuj zawiesinę o gęstości odpowiadającej wzorcowi nr 0,5 wg skali Mc Farlanda. - Posiej bakterie na płytkę z podłożem Muellera-Hinton zasiewając wacikiem całą powierzchnię - Ułóż przy pomocy pęsety krążki antybiotykowe odpowiednie dla badanego rodzaju bakterii, dobrane wg zaleceń Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów. Jeżeli układasz krążki z erytromycyną i klindamycyną, ułóż je w odległości 15-26 mm (mierząc od środka krążka) co pozwoli jednocześnie wykryć mechanizm MLSB. 159 - Po inkubacji w cieplarce odczytaj i zapisz wynik antybiogramu. Zadanie 2. Oznaczanie MIC antybiotyków - Przygotuj rozcieńczenia antybiotyku: ustaw w statywie 10 probówek. Do każdej z nich wlej 1 mL pożywki. - Do pierwszej probówki nalej 1 mL roztworu antybiotyku; dokonaj szeregu dwukrotnych rozcieńczeń przenosząc 1 mL pożywki z antybiotykiem do kolejnej probówki. - Z przedostatniej probówki (9) wylej 1 mL otrzymanego podłoża z antybiotykiem; dziesiąta probówka będzie stanowić kontrolę wzrostu badanego szczepu. 160 - Przygotuj inokulum: pobierz z hodowli na płytce materiał z kilku kolonii i zawieś w kilku mL 0,9% roztworu NaCl do uzyskania gęstości zawiesiny 0,5 wg skali McFarlanda. - Rozcieńcz tę zawiesinę 102 w pożywce (1,8 mL pożywki i 0,2 mL zawiesiny bakterii – 101, a następnie 1,8 mL pożywki i 0,2 mL otrzymanej zawiesiny – 102). - Do wszystkich probówek z antybiotykiem i probówki kontrolnej dodaj po 0,1 rozcieńczonej zawiesiny badanych bakterii. - Inkubuj 18-20 godzin w cieplarce. - Oblicz MIC Zadanie 3. Oznaczanie MBC antybiotyków - Z probówek, w których oznaczane było MIC, w których brak widocznego wzrostu i probówki kontrolnej pobierz po 1 oczku ezy i przesiej pasmowo na oznaczone sektory płytki z podłożem: MacConkeya dla E. coli krwawym dla S. aureus. - Inkubuj w cieplarce 37oC przez ok. 20 godzin. 161 - Oblicz wartość MBC i zinterpretuj wynik Zadanie 4. Odczytanie wyniku oznaczenia aktywności bakteriobójczej antybiotyku w surowicy pacjenta – SBT (test Schlichtera) Otrzymujesz płytkę titracyjną 96-dołkową, na której w dwóch rzędach znajdują się kolejne dwukrotne rozcieńczenia surowicy: I rząd przed podaniem pacjentowi antybiotyku – czas „0” II rząd po upływie 60 minut od dożylnego podania antybiotyku – czas „60” Wszystkie dołki zakażono odpowiednim inokulum szczepu wyizolowanego od pacjenta i inkubowano w cieplarce 37oC przez 20 godzin. Po upływie tego czasu z dołków, w których nie zaobserwowano wzrostu dokonano subkultur (przesiewów) na odpowiednie podłoże różnicujące. - Odczytaj miano bakteriostatyczne surowicy z szeregu probówek: przed podaniem antybiotyku – czas „0” 162 60 minut po dożylnym podaniu antybiotyku – czas „60” - Odczytaj miano bakteriobójcze surowicy z płytek z subkulturami - Zinterpretuj wynik badania: Zadanie 5. Badanie działania antybiotyków w skojarzeniu metodą rozcieńczeniową Odczytaj wyniki badania, wpisz do tabeli i zinterpretuj. MICA= MICB= FICA= MICA w mieszaninie A+B / MICA= FICB= MICB w mieszaninie A+B / MICB= 163 Interpretacja wyników: FICA +FICB>1 Antagonizm FICA +FICB=1 Addycja FICA +FICB<1 Synergizm Zadanie 6. Wykrywanie meticylinooporności metoda dyfuzyjno-krążkową z cefoksytyną - Otrzymujesz czystą hodowlę gronkowców koagulazoujemnych (nie S.lugdunensis) na płytce. - Przygotuj zawiesinę badanego szczepu o gęstości odpowiadającej nr 0,5 wg skali Mc Farlanda. - Posiej wacikiem na podłoże Muellera-Hinton. - Ułóż krążek cefoksytyną – FOX30. - Inkubuj w cieplarce 35oC przez ok. 20 godzin. - Po inkubacji w cieplarce odczytaj wynik. Kryteria dla CNS: ≤24 mm – oporny ; ≥25 mm – wrażliwy. 164 Wynik: Zadanie 7. Badanie oporności typu MLSB z wykorzystaniem reakcji PCR przez wykrywanie genu ermX - Otrzymujesz wyizolowane DNA z badanego szczepu Corynebacterium spp. Do probówek Eppendorfa dodaj: 2+ - 10µL MasterMix (mieszanina nukleotydów, Taq polimerazy DNA, Mg ) - po 0.25 µL starterów specyficznych dla genu ermX, - 1 µL startera matrycy, - uzupełnij do 20 µL wodą wolną od nukleaz. Wykonaj analogiczne próby kontrolne dla ermX+ (DNA szczepu wzorcowego) i ermX. Próbki umieść w termocyklerze. Przygotuj żel do elektroforezy: - odważ 0.70 g agarozy, dodaj 70 mL buforue TAE i rozgrzej do rozpuszczenia agarozy; - po przestudzeniu dodaj 2 µL barwnika Midori Green i uformuj żel z dołkami na próbki; - po jego stężeniu (15-20 minut) przenieś żel do komory do elektroforezy. Do kolejnych dołków nanieś po 10 µL produktów amplifikacji i 3 µL markera wielkości DNA - rozdzielaj przez 45 minut przy napięciu 70V, - odczytaj wynik na kamerze w świetle UV i zinterpretuj wynik. 165 166 Rozdział 2 Podstawy diagnostyki wirusologicznej Część teoretyczna Cechy wirusów zwierzęcych Wirusy są bezwzględnymi (obligatoryjnymi) pasożytami wewnątrzkomórkowymi, odtwarzają się wyłącznie wewnątrz żywych komórek gospodarza. Ich kompletne, zdolne do zakażania cząstki nazywamy wirionami. Struktura cząstek wirusowych jest złożona i zróżnicowana u różnych gatunków. Rodzaj kwasu nukleinowego (RNA lub DNA) oraz specyfika jego cząsteczki (jedno- czy dwuniciowa), a także liczba zawartych w wirionach jego segmentów determinują sposób mnożenia w komórce gospodarza oraz zmienność genetyczną – cechy istotne dla przebiegu zakażenia. Wrażliwość na warunki środowiskowe i specyfika zakażania wrażliwych komórek zależą od tego czy wirion okryty jest glikoproteinową osłonką. Wrażliwość wirusów na czynniki chemiczne i fizyczne Wrażliwość wirusów na środki dezynfekcyjne zależy od szeregu czynników, w dużej mierze od obecności osłonki. Aktywność środków dezynfekcyjnych wobec wirusów można podzielić na trzy grupy: silne działanie bójcze w stosunku do wszystkich wirusów wykazują aldehydy glutarowy, mrówkowy, ortoftalowy oraz kwas nadoctowy; umiarkowane działanie przeciwwirusowe ma chlor i jego pochodne, alkohol etylowy w stężeniu 75%, fenol i jego pochodne (chlorokrezol, chloroksylenol, dwufenol – triklosan, 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol, p-amylofenol) oraz jodyna; słabe działanie bójcze, ograniczone tylko do wirusów osłonkowych mają chlorek i bromek benzalkoniowy i cetrimid, dichlorowodorek oktenidyny, chlorheksydyna i aleksydyna i jodofory. 167 o Większość wirusów traci zakaźność w temperaturze 60 C po 30 minutach. Obecność w środowisku kationów dwuwartościowych działa ochronnie na wirusy i ogranicza wpływ wyższych temperatur. Niektóre wirusy są szczególnie oporne na wysokie temperatury. Należą do nich wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), a także HCV, HPV. Wirusy dobrze tolerują niskie temperatury. W temperaturze 4oC wirusy mogą zachować swoją aktywność nawet przez wiele miesięcy, a w stanie zamrożenia przez wiele lat. Dlatego próbki do badań wirusologicznych transportuje się w chłodzie. Można je także zamrażać. Większość wirionów jest stabilna w środowisku o pH w granicach od 5 do 8. Promienie UV o długości fali 260 nm, w zależności od dawki i czasu ekspozycji, mogą działać na genom wirusa letalnie lub mutagennie. Promieniowanie jonizujące powoduje nieodwracalne uszkodzenie ich genomu. Bakteriofagi Bakteriofagi (fagi) są wirusami pasożytującymi na bakteriach. Odgrywają znaczącą rolę w zmienności bakterii. Ze sposobem zakażania i replikowania tych wirusów wewnątrz bakterii związane są zjawiska transdukcji ogólnej i specyficznej – nabywania przez bakterie nowych cech genetycznych przeniesionych od innych bakterii. Cykl rozwojowy bakteriofagów może być lityczny, prowadzący do zniszczenia zakażonej komórki i uwolnienia wirusów potomnych. Niekiedy jednak fag włącza swój genom w nukleoid bakterii i pozostaje w nim w formie profaga przez wiele pokoleń. Razem z jego powielaniem w komórce bakterii mogą się wtedy powielać przyniesione przez niego nowe cechy zagarnięte od innych bakterii, np. gen kodujący wytwarzanie toksyny. W sprzyjających warunkach może dojść do ich ekspresji. Bakteriofagi wykazują dużą specyficzność w atakowaniu określonych komórek, na których powierzchni znajdują się odpowiednie dla nich receptory. Ten fakt jest wykorzystywany w diagnostyce bakterii, a także w eksperymentalnym leczeniu zakażeń bakteryjnych. Bakteriofagi charakteryzują się wysoką swoistością wobec gospodarza. 168 W diagnostyce typowanie bakteriofagowe wykorzystywane jest do wewnątrzgatunkowej identyfikacji bakterii w dochodzeniach epidemiologicznych. W badaniach nad wykorzystaniem fagów do leczenia zakażeń (terapia fagowa) obserwuje się ostatnio znaczny postęp Bakteriofagi już znajdują zastosowanie w eksperymentalnym leczeniu zakażeń bakteryjnych wywołanych szczepami wieloopornymi, stanowiąc istotną alternatywę dla kurczących się zasobów leków przeciwbakteryjnych. Wykorzystywana jest ich zdolność do infekowania określonych komórek bakteryjnych prowadząca do ich lizy. Mają zatem działanie bakteriobójcze. Bakteriofagi mogą być stosowane zarówno w zakażeniach bakteriami gramdodatnimi, jak i gramujemnymi. Wobec bardzo dużej specyficzności fagów w łączeniu się z komórkami bakterii niezwykle istotna jest identyfikacja czynnika etiologicznego danego zakażenia oraz dobór szczepu bakteriofaga wykazującego najwyższy potencjał lityczny wobec tego patogenu. W przeciwieństwie do antybiotyków, bakteriofagi nie niszczą mikrobiota zakażonego organizmu. Dodatkowo atakują bakterie także w postaci biofilmów, są nietoksyczne dla gospodarza, gdyż nie replikują w komórkach eukariotycznych, a po eradykacji bakterii patogennych są całkowicie usuwane z ustroju. Ich liczba wzrasta w miejscu toczącej się infekcji, co ma szczególne znaczenie w przypadku gorzej ukrwionych tkanek. Leczenie bakteriofagami wymaga jednak starannych badań i uwzględnienia wszystkich jego potencjalnych, słabszych stron. Ta terapia wciąż pozostaje w fazie doświadczalnej, choć jest już stosowana, także w Polsce, względem uporczywych zakażeń, jednak tylko u ochotników. Oprócz terapii infekcji bakteryjnych w medycynie, bakteriofagi stosowane są również do oczyszczania aparatury medycznej. Obecnie prowadzone są także badania nad ich zastosowaniem w terapii przeciwnowotworowej. Bakteriofagi są również wykorzystywane w przemyśle, np. w procesie odkażania surowego mięsa, owoców i warzyw, do dezynfekcji sprzętu i powierzchni użytkowych przy produkcji żywności, a także jako naturalny środek konserwujący. 169 Metody Większość infekcji wirusowych cechuje się charakterystycznymi objawami klinicznymi, z kolei ich leczenie jest często mało specyficzne. Dlatego laboratoryjna diagnostyka wirusologiczna miała do niedawna mniejsze znaczenie niż bakteriologiczna, a badania takie były trudno dostępne. Wraz z postępem metod diagnostycznych i możliwością ich wykonywania w wielu placówkach ich znaczenie wyraźnie wzrosło. Badania wirusologiczne pozwalają na określenie czynnika etiologicznego w przypadku niektórych chorób wirusowych (np. AIDS, zapalenie wątroby, różyczka, gorączki krwotoczne), niezwykle istotnego ze względu na znaczenie rokownicze dla pacjenta. Mają one także znaczenie dla monitorowania stanu epidemicznego oraz dla ustalania typów szczepionkowych czy konstrukcji nowych szczepionek. Współczesna diagnostyka wirusologiczna obejmuje: 1) wykazanie obecności wirusa w pochodzącym od pacjenta materiale klinicznym osiągane poprzez: - metody mikroskopowe, - metody hodowlane, - wykrywanie materiału genetycznego wirusa; 2) metody serologiczne pozwalające na: - wykrywanie antygenów wirusowych w materiale klinicznym, - oznaczanie w surowicy pacjenta przeciwciał przeciwwirusowych. Obecnie największe znaczenie mają metody oparte na wykrywaniu w próbkach klinicznych materiału genetycznego wirusów oraz ich antygenów lub przeciwciał przeciwko nim skierowanych (metody serologiczne). Te ostatnie obejmują wiele wspólnych technik, w których trzeba dysponować wzorcowymi surowicami odpornościowymi lub antygenami wirusowymi. Metody mikroskopowe Mikroskopia elektronowa jest jedyną techniką umożliwiającą bezpośrednią obserwację wirusów, nawet w próbkach materiału klinicznego, ale nie pozwala ona na rozpoznawanie poszczególnych 170 gatunków. Metoda ta cechuje się dosyć wysoką specyficznością, ale stosunkowo niską czułością w porównaniu z innymi metodami. Liczba wirionów w próbce musi być bardzo duża (ponad 100 mln w 1 mL), aby były one widoczne w polu widzenia. Możliwe jest wykorzystywanie mikroskopii elektronowej do oceny próbek kału w zakażeniach wirusowych np. rotawirusami, kaliciwirusami czy adenowirusami. Czas uzyskania wyniku w przypadku tej metody jest bardzo krótki, jednak wymaga ona specjalistycznego sprzętu, zaś procedura obróbki materiału jest skomplikowana. Automatyzacja procesu detekcji wirusów przy użyciu tej metody do celów diagnostycznych nie jest możliwa. Znajduje ona jednak zastosowanie w przypadku wirusów nowo odkrytych lub niedających się namnażać w warunkach doświadczalnych. Mikroskopia świetlna może okazać się przydatna w diagnostyce tych zakażeń wirusowych, które pociągają za sobą zmiany histopatologiczne w dostępnych do badania tkankach pacjenta. Metody polegają na ocenie w mikroskopie świetlnym preparatów cytologicznych czy wycinków tkankowych (np. system Bethesda, test Tzancka) i poszukiwanie charakterystycznych zmian w morfologii zainfekowanych komórek. W takich, odpowiednio barwionych, preparatach mikroskopowych można zaobserwować na przykład: koilocyty – nieprawidłowe komórki widoczne w wymazach z szyjki macicy świadczące o infekcji wirusem HPV; komórki Tzancka – komórki akantolityczne obecne w preparatach z treści pęcherzyka w przebiegu infekcji HSV; komórki o obrazie "sowich oczu” – kwasochłonne, jądrowe i cytoplazmatyczne ciała inkluzyjne charakterystyczne dla infekcji CMV; ciałka mięczakowate – występujące w cytoplazmie komórek w górnych warstwach naskórka w infekcji wirusem mięczaka zakaźnego MCV; syncytia komórkowe – obecne wewnątrz olbrzymich, wielojądrzastych komórek w przebiegu infekcji wirusem paragrypyy, paramyksowirusami, niektórymi herpeswirusami i retrowirusami; ciałka Guarnieriego typu B – kwasochłonne, cytoplazmatyczne ciałka inkluzyjne obecne w przypadku infekcji pokswirusami; 171 ciałka Negriego – wtręty cytoplazmatyczne w tkance mózgowej typowe dla wścieklizny. Metody mikroskopowe obejmują także opisaną w następnym rozdziale immunofluorescencję bezpośrednią, w której do barwienia preparatów z materiału klinicznego stosuje się swoiste, wyznakowane przeciwciała reagujące z określonymi antygenami wirusowymi. Metody hodowlane Wprawdzie metody hodowlane ciągle jeszcze uznawane są za „złoty standard” niezbędny w procesie identyfikacji wirusów oraz dla oceny ich lekowrażliwości, jednakże wymagają one specjalnie wyposażonych pracowni wirusologicznych, co sprawia, że są mało dostępne. Czas oczekiwania na wynik jest często zbyt długi, aby mógł on mieć znaczenie dla pacjenta. W związku z tym zastosowanie ich w praktyce klinicznej jest ograniczone, szczególnie wobec znaczącego postępu innych metod. Hodowle wirusów są prowadzone w nielicznych pracowniach, przeważnie o charakterze naukowym. Wirusy jako obligatoryjne pasożyty wewnątrzkomórkowe nie mogą być hodowane na sztucznych pożywkach. Do ich namnażania stosuje się żywe komórki uwzględniając powinowactwo wirusów do określonych tkanek (tropizm). Hodowle wirusów zwierzęcych prowadzone są z użyciem linii komórek eukariotycznych lub w zarodkach ptasich (najczęściej kurzych). Hodowle komórek eukariotycznych (tkankowe) są najczęściej stosowaną metodą namnażania wirusów. Hodowle tych komórek in vitro prowadzone są w specjalnych naczyniach hodowlanych, w których tworzą zwykle jednolitą warstwę (ang. monolayer) lub zawiesinę w płynie odżywczym. Hodowle te zakażane są takimi wirusami, dla których ich komórki są permisywne. Przygotowuje się hodowle tkanek: pierwotne - przygotowywane ze świeżo pobranych tkanek; nie można ich pasażować; 172 półciągłe - przygotowywane z komórek diploidalnych wywodzących się najczęściej z różnych tkanek płodowych; można je pasażować 30-50 razy; ciągłe - sporządzane z ustabilizowanych linii heteroploidalnych pochodzących głównie z tkanek nowotworowych (np. HeLa); mogą być pasażowane nieskończoną ilość razy. Hodowle ciągłe są wykorzystywane w celach diagnostycznych lub naukowych, natomiast hodowle pierwotne i półciągłe także przy produkcji szczepionek. Bakteriofagi hodowane są z użyciem hodowli bakteryjnych na podłożach płynnych lub stałych. W hodowlach płynnych obserwuje się zanik zmętnienia wskutek lizy bakterii. Ich supernatant zawiera wtedy liczne bakteriofagi. W przypadku hodowli na podłożu stałym obecność bakteriofagów objawia się w postaci przejaśnień (tzw. „łysinek”) we wzroście powierzchniowym bakterii spowodowanym rozprzestrzeniającą się lizą komórek zapoczątkowaną działaniem pojedynczego wirionu. Wykrywanie obecności wirusów w hodowlach Obecność wirusów w hodowlach ocenia się na podstawie zmian degeneracyjnych komórek w mikroskopie świetlnym, których charakter może sugerować zakażenie komórek wirusem z określonej rodziny. Określenie gatunku wirusa w ten sposób jest jednak zazwyczaj niemożliwe. Zmiany te określane są jako efekt cytopatyczny (CPE). Obraz zainfekowanych komórek może obejmować: zmianę kształtu, zaokrąglenie, obkurczenie, tworzenie wielojądrzastych form (syncytia) czy obecność ciałek wtrętowych. Czasami jednak efekt cytopatyczny może nie wystąpić, może być niedostatecznie wyraźny lub nietypowy, dlatego do identyfikacji namnożonego w hodowli wirusa niezbędne jest przeprowadzenie dalszej diagnostyki (np. metodami serologicznymi). Jeżeli badany wirus nie ma zdolności do wywoływania efektu cytopatycznego, jego obecność w hodowli tkankowej można ujawnić dzięki zjawisku interferencji wirusowej. Wynika ono z faktu, że komórki już zakażone nie mogą być zakażone innym, odmiennym wirusem. Do hodowli komórkowej zakażanej materiałem podejrzanym o obecność 173 poszukiwanego wirusa, o którym wiadomo, że nie wywołuje efektu cytopatycznego wprowadzany jest wirus wskaźnikowy, który posiada tę zdolność. Jeżeli po inkubacji w hodowli komórkowej nie zaobserwujemy efektów cytopatycznych, można wnioskować, że poszukiwany wirus nie dopuścił do zakażenia komórek wirusem wskaźnikowym, a zatem jest obecny w badanym materiale. Tak może być wykrywany na przykład wirus różyczki czy wirus ECHO. Wirusy, których osłonki posiadają hemaglutyniny, mogą być pośrednio wykrywane metodą hemadsorbcji. W czasie replikacji, przed uwolnieniem, wirusy wbudowują swe hemaglutyniny w błonę zakażonej komórki. Gdy po kilku dniach od momentu zakażenia hodowli komórkowej wirusami doda się do niej zawiesinę erytrocytów, przylegają one do komórek zakażonych wirusami za pośrednictwem tych hemaglutynin. Zjawisko to można obserwować gołym okiem. Następuje ono zanim pojawi się efekt cytopatyczny, co znacznie przyspiesza diagnostykę. Gdy wirusy, które mają w swojej osłonce hemaglutyniny, jak np. wirus grypy, zostaną uwolnione z zakażonych komórek do podłoża płynnego, po dodaniu do niego zawiesiny erytrocytów nastąpi hemaglutynacja. Metoda ta pozwala nie tylko na wykrycie obecności wirusa w badanym materiale, ale także umożliwia określenie jego ilości przez wyznaczenie umownej wartości na nią wskazującej (tzw. miana). Jest to odwrotność największego rozcieńczenia badanego płynu, w którym widoczne będzie gołym okiem zlepienie krwinek. Wykrywanie materiału genetycznego wirusa Nowoczesne techniki biologii molekularnej pozwalają na dokładną identyfikację poprzez wykrywanie i analizę genomów wirusów izolowanych z zakażonych tkanek i płynów ustrojowych pacjenta. Wprowadzenie tych technik do rutynowej diagnostyki wirusologicznej stanowi przełom ze względu na możliwość wykrywania wirusów, których identyfikacja nastręczała wcześniej trudności. Pozwalają one na wykrywanie bardzo małych ilości wirusów oraz detekcję ich w próbkach o bardzo małej objętości. Najpowszechniej wykorzystuje się metodę amplifikacji odpowiednich sekwencji genomu wirusowego z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji 174 polimerazy (PCR; ang. polimerase chain reaction) i jej odmian: RT-PCR (ang. reverse transcription PCR) umożliwiającej identyfikację wirusów RNA oraz Real-Time PCR pozwalającej dodatkowo na określenie liczby kopii wirusa w badanej próbce. W porównaniu z metodami hodowlanymi łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest szybsza i mniej pracochłonna. Technika ta cechuje się dużą czułością, swoistością oraz uniwersalnością dając możliwość badania różnych materiałów biologicznych. Umożliwia wykrywanie wirusów znajdujących się w próbkach w niewielkiej ilości, a także diagnostykę wirusów o krótkim okresie wydalania poza zakażone komórki. Jej zaletą jest możliwość różnicowania wirusów do celów epidemiologicznych i identyfikacji szczepów wysoce patogennych. Należy jednak pamiętać, że metody molekularne wymagają bardzo dużej precyzji wykonania. Technika RT-PCR (PCR z odwrotną transkryptazą) jest wykorzystywana zwłaszcza w diagnostyce infekcji wirusowych dróg oddechowych, gdyż większość wirusów je wywołujących to wirusy RNA. Klasyczna PCR jest coraz częściej wypierana przez jej odmianę Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym), która jest obecnie jedną z technik najczęściej stosowanych do szybkiego wykrywania wirusów. Umożliwia ona oznaczanie miana (ilości) wirusów w próbce, co ma szczególne znaczenie w różnicowaniu etapów zakażenia, monitorowaniu leczenia czy badaniach rokowniczych. Real-Time PCR cechuje się krótszym czasem uzyskania wyniku, większą czułością i swoistością w porównaniu z klasyczną PCR. Metoda jest stosowana powszechnie w diagnostyce chorób spowodowanych przez wirusy HCV, HBV, HSV, wirus grypy, CMV, wirus Norwalk, RSV i inne. W diagnostyce wirusologicznej rotawirusów grupy A, HCV czy CMV znajduje też zastosowanie nested PCR (gniazdowy PCR) polegający na dwuetapowej amplifikacji z użyciem różnych par starterów, gdzie amplikon pierwszej reakcji stanowi matrycę drugiej, co zwiększa czułość bez obniżenia specyficzności i zmniejsza ryzyko powstawania niespecyficznych produktów reakcji. 175 W celu przyspieszenia badania, a jednocześnie dla minimalizacji jego kosztów, często sięga się po technikę Multiplex PCR (MPCR, multipleksowy PCR). W metodzie tej w jednej reakcji PCR stosuje się zestawy starterów dla kilku wirusów odpowiedzialnych za infekcje o podobnym obrazie klinicznym. Otrzymany wynik wskazuje, który z nich jest czynnikiem etiologicznym choroby. Sekwencjonowanie jest szczególnie ważną techniką w czasie dochodzeń epidemiologicznych i monitorowania zmienności wirusów, szczególnie związanej z nabywaniem oporności oraz patogennością. W rutynowej diagnostyce laboratoryjnej wirusów wywołujących infekcje dróg oddechowych stosowana jest też technika NASBA (ang. nucleic acid sequenced based amplification) stosowana do amplifikacji wirusowego jednoniciowego RNA. Reakcja naśladująca replikację wirusa przebiega w stałej temperaturze 42°C z udziałem odwrotnej transkryptazy, RNazy H i polimerazy RNA z faga T7 oraz dwóch rodzajów starterów. Oprócz diagnostyki wirusów układu oddechowego znajduje ona także zastosowanie w wykrywaniu innych wirusów RNA takich jak HIV-1, HCV czy wirus pryszczycy. Metody serologiczne Metody serologiczne pozwalają przeprowadzić dokładną identyfikację wirusów. Stosuje się znane wzorcowe surowice zawierające przeciwciała przeciwko antygenom określonych gatunków wirusów. Przeciwciała te mogą znosić ich zdolności zakaźne obserwowane w innych metodach (np. hodowlanych) lub wiązać się z antygenami wirusa zawartymi w badanych próbkach, pozwalając dzięki odpowiednim metodom na ich wykrycie. Wiele z tych technik dzięki zastosowaniu mianowanych preparatów zawierających antygeny wirusowe pozwala także na oznaczenie poziomu przeciwciał wytworzonych w organizmie pacjenta w wyniku świeżej lub obecnych po przebytej infekcji lub szczepieniu. 176 Poszukiwanie w materiale klinicznym wirusów lub przeciwciał przeciwwirusowych w surowicy pacjenta w reakcji antygen wirusowy – przeciwciało jako uzupełnienie technik hodowlanych Odczyn neutralizacji (zobojętniania) NT polega na połączeniu przeciwciał (np. z surowicy pacjenta) z zawiesiną wirusów namnożonych w hodowli tkankowej. Po inkubacji mieszaniny zakaża się nią nową wrażliwą hodowlę. Brak efektu cytopatycznego wskutek utraty właściwości zakaźnych uznaje się za wynik dodatni. Odczyn ten jest najczulszym testem wykrywającym odpowiedź immunologiczną na zakażenie wirusowe, ale jest on pracochłonny, a czas oczekiwania na wynik jest stosunkowo długi. Znajduje jednak zastosowanie w diagnostyce enterowirusów. Odczyn zahamowania hemadsorpcji wykonuje się podobnie jak odczyn neutralizacji. Łączy się odpowiednią surowicę odpornościową (lub surowicę badaną) z zawiesiną wirusów wykazujących właściwości hemadsorpcyjne (np. paramyksowirusów). Mieszaniną tą zakaża się hodowlę komórkową. O wyniku dodatnim (obecności w próbce wirusów lub przeciwciał w badanej surowicy) świadczy brak przylegania krwinek do komórek w tej hodowli. Odczyn ten pojawia się przed wystąpieniem efektu cytopatycznego, co zwiększa jego przydatność. W odczynie zahamowania hemaglutynacji (OZHA) po dodaniu przeciwciał do zawiesiny wirusów nie obserwuje się zjawiska aglutynacji erytrocytów. Odczyn ten jest stosowany w diagnostyce wirusów produkujących hemaglutyninę zdolną do aglutynacji erytrocytów, np. wirusa grypy, różyczki, paramyksowirusów. Wykrywanie antygenów wirusowych w materiałach lub swoistych przeciwciał w surowicy pacjenta klinicznych W odczynie immunofluorescencji bezpośredniej DIF (ang. direct immunofluorescence) obecność w badanym materiale wirusów stwierdza się na podstawie obserwacji emitujących światło kompleksów antygenprzeciwciało widocznych w polu widzenia mikroskopu fluorescencyjnego. 177 Badany materiał (wymaz, bioptat) umieszczany na szkiełku podstawowym inkubuje się ze znaną, wyznakowaną surowicą. Wykorzystywane są surowice zawierające przeciwciała skoniugowane z fluorochromem. Po odpłukaniu nadmiaru surowicy preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym. Obraz ten jest jednak bardzo nietrwały i zależny od typu mikroskopu. Duże znaczenie w tej technice odgrywa sposób transportu i przechowywania próbek oraz czas dostarczenia ich do laboratorium. Technika ta jest szybka, umożliwia nie tylko wykrycie patogenu, ale także określenie jego typu, co ma znaczenie epidemiologiczne oraz terapeutyczne. Metoda ta jest powszechnie stosowana w diagnostyce (to tzw. szybkie metody diagnostyczne) zakażeń dróg oddechowych czy wirusów ospy wietrznej i półpaśca. Odczyn immunofluorescencji pośredniej IIF (ang. indirect immunofluorescence) to także technika mikroskopowa. Przebiega dwuetapowo. W pierwszym etapie antygen wirusowy jest wiązany ze swoistymi przeciwciałami, a następnie do niego przyłączane są przeciwciała antyglobulinowe skoniugowane z fluorochromem. Powstałe kompleksy antygen-przeciwciało(I)-przeciwciało(II) wykrywa się obserwując emitowaną przez nie fluorescencję w mikroskopie fluorescencyjnym. Odczyn ten jest bardziej pracochłonny niż DIF, ale pozwala na poszukiwanie zarówno antygenów jak i przeciwciał, a także przeprowadzenie badania w przypadku, gdy przygotowanie swoistych znakowanych przeciwciał jest niemożliwe lub zbyt kosztowne. Metoda ta jest wykorzystywana w diagnostyce wirusa różyczki i CMV. Metodą wykrywania białek wirusowych (np. rdzenia HCV, HIV, wirusa SARS) jest też technika Western-Blot polegająca na ich rozdziale w żelu poliakrylamidowym i po przeniesieniu na membranę nitrocelulozową lub PVDF wykrywanie przy użyciu odpowiednich przeciwciał w systemie bezpośrednim (przeciwciała znakowane) lub pośrednim (znakowane przeciwciała antyglobulinowe). Metoda ta pozwala także na wykrywanie przeciwciał w surowicy pacjenta. W odczynach lateksowych swoiste przeciwciała przeciwwirusowe osadzone sa na cząsteczkach lateksu. Dodanie do zawiesiny tych 178 cząsteczek kropli badanego materiału, w której znajduje się poszukiwany wirus, powoduje związanie wirionów z przeciwciałami, co można ocenić gołym okiem obserwując aglutynację cząstek lateksu. Odczyn ten znalazł powszechne zastosowanie do diagnostyki rotawirusów i adenowirusów. Coraz częściej w badaniach wirusologicznych wykorzystuje się też testy immunochromatograficzne (zwane kasetkowymi). Wynik uzyskiwany jest w prosty sposób, a koszt takiego badania jest bardzo niski. Dodatkową ich zaletą jest krótki czas oczekiwania na uzyskanie wyników. Badany materiał (krew, surowica, zawiesina kału, mocz, płyn mózgowo- rdzeniowy - PMR) nakrapla się do okienka testu na membranę nitrozocelulozową na której, w postaci paska, umieszczone są znakowane koloidalnym złotem przeciwciała specyficzne dla poszukiwanego antygenu wirusowego. Powstający kompleks wędrując wraz z płynną próbką jest następnie wyłapywany przez swoiste dla niego przeciwciała immobilizowane w regionie T dając barwny pasek świadczący o reakcji dodatniej. W czasie dalszej „wędrówki” znakowane przeciwciała antyglobulinowe immobilizowane w regionie C wychwytują specyficzne przeciwciała nie związane we wcześniejszych etapach dając barwną linię C. Obecność antygenu wirusowego w próbce uwidoczniana jest zatem jako dwie linie T i C, a jego brak jako pojedyńcza linia C. Testy immunochromatograficzne są mniej czułe niż inne metody, ale niektóre z nich mogą być wykonywane samodzielnie przez pacjentów. Osobną grupą są szeroko stosowane w rutynowej diagnostyce zakażeń wirusowych odczyny immunoenzymatyczne EIA (ang. enzyme immunoassay). Mogą one być wykorzystywane do wykrywania w materiale badanym zarówno antygenów wirusowych, jak i, w surowicy pacjenta, swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko danemu wirusowi. Odczyn ELISA (ang. enzyme linked immunosorbent assay) wykorzystuje wiązanie osadzonych na stałym nośniku znanych antygenów lub przeciwciał do wykrywania odpowiednio przeciwciał lub antygenów w materiałach klinicznych od pacjenta. Powstały kompleks wykrywa się przeciwciałami antyglobulinowymi sprzężonymi z enzymem (np. peroksydazą chrzanową, fosfatazą alkaliczną), który daje barwną, 179 łatwą do wykrycia reakcję z odpowiednim substratem. Produkty oznaczane są spektrofotometrycznie. Konieczne jest wykonanie odpowiedniej kalibracji pozwalającej na ilościową ocenę poziomu przeciwciał lub ilości wirusów w próbce. Metody immunoenzymatyczne cechują się szybkością wykonania, łatwością odczytu oraz są w pełni zautomatyzowane. Są powszechnie wykorzystywane w diagnostyce zakażeń wirusami hepatotropowymi czy herpeswirusami. Czas oraz warunki transportu i przechowywania próbek do badań immunoenzymatycznych mają tu mniejszy wpływ na wynik niż w przypadku metod immunofluorescencyjnych. W oznaczaniu poziomu (miana) przeciwciał przeciwwirusowych należy pamiętać o tym, że kształtowana przez lata swoista odporność pacjenta uzyskana czy to w wyniku szczepień czy też kontaktu z wirusami (i to nie tylko w wyniku odnotowanego zachorowania) prowadzi do seropozytywności, która może nie mieć związku z aktualnym zakażeniem. Diagnostyka wirusologiczna oparta na oznaczeniu poziomu przeciwciał w surowicy chorego musi więc polegać na wykazaniu wzrostu miana przeciwciał klasy IgG między dwoma próbkami surowicy pobranymi w odstępie 10-14 dni (tzw. para surowic). Z uwagi na ten okres, taki wynik ma niewielki wpływ na sposób leczenia. Bardziej pomocne jest wykazanie obecności w surowicy przeciwciał klasy IgM świadczących o „świeżym” zakażeniu lub określenie awidności przeciwciał. Ta ostatnia metoda jest miarą funkcjonalnej siły wiązania przeciwciał, która we wczesnym okresie infekcji jest niska i rośnie wraz z jej rozwojem. Dzięki temu możliwe jest wykrywanie zakażenia pierwotnego. Określanie awidności stosowane jest na przykład w diagnostyce różyczki, zakażeń CMV i EBV. Techniką coraz rzadziej stosowaną do wykrywania przeciwciał przeciwwirusowych lub antygenów wirusów jest odczyn wiązania dopełniacza (OWD). Jest on wykonywany dwuetapowo: w pierwszym etapie inkubuje się mieszaninę reakcyjną badanej, wstępnie ogrzanej do 56oC, surowicy, antygenu i dopełniacza. W drugim etapie dodaje się układ wskaźnikowy, którym są erytrocyty barana i przeciwciała dla tych erytrocytów. Brak hemolizy układu wskaźnikowego świadczy o obecności poszukiwanych przeciwciał w surowicy pacjenta. Odczyn ten może być 180 wykorzystywany w diagnostyce wirusa grypy. Obecnie jednak, ze względu na znaczne ograniczenia takie jak złożoność procedury, pracoi czasochłonność, jest wypierany przez techniki EIA. Do klasycznych metod serologicznych służących wykrywaniu przeciwciał przeciwwirusowych zalicza się także omówione wyżej odczyny: neutralizacji, zahamowania hemaglutynacji, zahamowania hemadsorpcji. Tabela 1. Metody stosowane w diagnostyce wybranych zakażeń wirusowych Wirus wirus grypy (FLUV) Materiał do badania materiał z nosa i gardła (aspirat, popłuczyny, wymaz) surowica wirus odry wirus nagminnego zapalenia przyusznic wirus różyczki (RUBV) parvowirus B19 (B19V) Metody badania testy immunochromatograficzne; DIF; Hodowla; RT-PCR poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) wymaz z gardła, mocz, krew pełna pobrana na heparynę hodowla surowica surowica odczyn neutralizacji poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) krew, ślina, mocz, PMR surowica hodowla; RT-PCR poszukiwanie IgM, IgG (ELISA, IIF); awidność przeciwciał wymaz z gardła, popłuczyny (nosogardziel), mocz, krew, PMR surowica hodowla; RT-PCR krew pełna, surowica, osocze, płyn owodniowy, tkanki poszukiwanie IgM, IgG (ELISA, Western Blot) Real-Time PCR 181 wirus ospy wietrznej i półpaśca (VZV) płyn z pęcherzyka a) b) hodowla; PCR zeskrobiny z dna pęcherzyka IIF surowica poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) testy immunochromatograficzne; testy lateksowe; poszukiwanie antygenów (szybkie testy ELISA) testy immunochromatograficzne; poszukiwanie IgM, IgG (ELISA, IIF); RT-PCR; Real-Time PCR rotawirus; adenowirus kał pneumowirus (RSV) próbki z układu oddechowego, surowica płyn z pęcherzyków, wymaz z szyjki macicy, wydzielina pochwy wirus opryszczki (HSV-1 i HSV-2) płyn z pęcherzyków, wymaz z szyjki macicy, wydzielina pochwy, PMR hodowla PCR poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) surowica wirus zapalenia wątroby typu A (HAV) wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) surowica surowica poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) testy immunochromatograficzne; poszukiwanie w zależności od fazy choroby antygenów (HBsAg, HBeAg) i przeciwciał (anty-HBc IgM i IgG, anty-HBe, anty-HBs) (ELISA); PCR wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) surowica poszukiwanie przeciwciał anty-HCV; PCR (wykrywanie i oznaczanie genotypu) wirus zapalenia wątroby typu D (HDV) surowica poszukiwanie HDVAg, IgM anty-HDV 182 wirus zespołu nabytego upośledzenia odporności (HIV) surowica testy immunochromatograficzne; poszukiwanie przeciwciał anty-HIV (screening – ELISA/EIA; test potwierdzenia wyników (+) lub wątpliwych – Western Blot) RT-PCR wirus kleszczowego zapalenia mózgu (TBEV) surowica, PMR wirus EbsteinaBarr (EBV) surowica cytomegalowirus (CMV) surowica wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) wymaz z szyjki macicy poszukiwanie IgM, IgG (ELISA) testy lateksowe (przeciwciała heterofilne związane z mononukleozą); testy immunochromatograficzne; poszukiwanie IgM i IgG (ELISA); awidność przeciwciał poszukiwanie IgM, IgG (ELISA); awidność przeciwciał; Real-Time PCR badanie cytologiczne (koilocyty); Real-Time PCR (wykrywanie i ocena onkogenności) 183 184
