Embrionalne komórki macierzyste Gastrulacja Ektoderma
advertisement
Transplantacje komórek i tkanek – rola układu odpornościowego 1 Rozwój strategii wytwarzania substytutów tkanek in vitro kryterium – sposób działania implantu typ tkanki rola substytutu przykład fizyczny biomechaniczna kość naczynia krwionośne fizjologiczny fizjologiczna wątroba, nerka chemiczny produkcja rozpuszczalnych, dyfundujących substancji wysepki Langerhansa kombinacja złożona skóra 2 Sposób działania implantu fizyczne - biomechanika zależy od składu macierzy i zdolności żywych komórek w obrębie tego implantu do utrzymania takiej struktury- naczynia - „wypełniacze” tkankowe - mastektomia fizjologiczne i chemiczne - hepatocyty złożone - skóra 3 Rola gospodarza w implantacji Odrzucanie przeszczepu – reakcja niespecyficzna, wrodzona Korzystny wpływ odpowiedzi immunologicznej – integracja z tkanką gospodarza Niekontrolowany stan zapalny- zwłóknienie, uszkodzenie architektury konstruktu (enkapsulacja implantu) 4 Źródła komórek Kryteria wyboru: - łatwość pozyskiwania - funkcjonalność - przeżywalność w implancie 5 Źródła komórek Komórki autologiczne proliferacja in vitro – krytyczny czas oczekiwania na kmórki biopsja tkanki pacjenta, namnożenie poza organizmem, reimplantacja - aktywowanie zasiedlania nośnika in vivo manipulacja in vivo czynnikami mobilizującymi właściwe komórki do migracji w obszar implantu - 6 Źródła komórek Komórki allogeniczne – bankowanie komórek wystandaryzowanie źródło komórek - unieśmiertelnione linie komórkowe możliwość modyfikacji genetycznych, często utrata zdolności do różnicowania, niektóre cechy komórek nowotworowych – bezpieczeństwo stosowania 7 Źródła komórek Komórki ksenogeniczne 8 Komórki macierzyste embrionalne izolowane z dojrzałego organizmu izolowane z krwi pępowinowej 9 Komórka macierzysta zdolność do nieograniczonych podziałów daje początek co najmniej jednemu typowi zróżnicowanych komórek 10 Ektoderma Gastrulacja Mezoderma Endoderma Embrionalne komórki macierzyste Tkanka nerwowa / NSCs Skóra / SSCs HSCs, MSCs Szpik kostny i krew / tkankoweSCs Mięśnie i kości/ narządowo-specyficzneSCs Płuca, wątroba, trzustka / jelitoweSCs Przełyk, żołądek, jelito/ Pierwotne komórki rozrodcze Mezoderma Tkanka nerwowa Skóra Szpik kostny i krew Mięśnie i kości Endoderma Płuca,wątroba, trzustka Przełyk, żołądek, jelito Ektoderma Gastrulacja Embrionalne komórki macierzyste Pierwotne komórki rozrodcze NSCs/ SSCs Multipotencjalne komórki macierzyste HSCs/MSCs/tkankoweSCs NarządoweSCs/jelitoweSCs 11 totipotencjalne komórki zygoty pluripotencjalne komórki zarodkowe pluripotencjalne zarodkowe komórki rozrodcze gonady multipotencjalne komórki macierzyste multipotencjalne komórki macierzyste tkankowo-specyficzne organy i tkanki komórki macierzyste układu krwiotwórczego komórki macierzyste centralnego układu nerwowego komórki macierzyste mięśni komórki macierzyste skóry 12 13 Pluripotencjalne komórki wewnętrznej masy komórkowej ludzkiej blastocysty -zdolne do różnicowania w komórki z 3 warstw germinalnych - różnicują in vitro pod nieobecność czynników wzrostu warunkujących samoodnawianie komórek macierzystych - niski poziom spontanicznego różnicowania podczas pasaży - aktywność alkalicznej fosfatazy - markery powierzchniowe: SSEA-3(stage specyfic embryonic antigen) SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2 - ekspresja telomerazy - ekspresja czynnika transkrypcyjnego Oct4 regulującego ekspresję genów 14 Charakterystyka embrionalnych komórek macierzystych niezdefiniowany potencjał proliferacyjny stabilny diploidalny kariotyp zdolność do wzrostu klonalnego formowanie potworniaków wielokierunkowe różnicowanie in vitro możliwość manipulacji genetycznych 15 16 James A. Thomson, Univ. Wisconsin John D. Gearhart, Roger Pedersen, John Hopkins Univ. Gerard Bain i David I Gottlieb, Washington Univ. School of Medicine Meri Firpo, Gordon Keller’s Laboratory Loren J. Field, Indiana Univ. Terrence Deacon, Harvard Medical School 17 Embrionalne komórki macierzyste - sektor komercyjny GERON PLURION INFIGEN Advanced Cell Technology Origen Therapeutics Stem Cell Sciences MIDAS AVIGENICS Biotechnology Rsrch&Development Melno Park, Calif. White Plains, New York DeForest, Wisc. Worcester, Mass. San Francisco, Calif. Monash, Australia North Grafton, Mass. Athens, Georgia Peoria, III. ludzkie, małpie ludzkie bydlęce bydlęce, świńskie, ludzkie kurze, bydlęce świńskie, szczurze świńskie kurze świńskie 18 Days Embryonic stem (ESC) cells cultivated on feeder layer d0 Cultivation of ESC in Formation of hanging drops embryoid bodies d3 Transfer of plates d5 Plating embryoid bodies and cultivation to bacteriological in suspension of embryoid bodies day 5 and 7) into endo ( between - , ecto - and mesodermal cells d5 + 16 19 Perspektywy badań komórek macierzystych Badanie rozwoju, kontroli genów Badanie leków, testy cytotoksyczności Pluripotencjalne komórki macierzyste w hodowli in vitro Komórki/tkanki dla celów terapeutycznych szpik kostny komórki nerwowe komórki mięśnia serca komórki trzustki 20 w dojrzałym organizmie tkankowo swoiste komórki macierzyste posiadają zdolność do różnicowania w komórki tego narządu lub tkanki, dla której stanowią tzw. pulę komórek rezerwowych komórki macierzyste obecne w różnych narządach mogą różnicować w komórki innych tkanek – wykazywać tzw. plastyczność alternatywna teoria tłumacząca plastyczność współzawodnictwo o wspólne nisze w tkankach 21 Źródła somatycznych komórek macierzystych Szpik kostny – hematopoetyczne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste Skóra– epidermalne komórki macierzyste, komórki macierzyste mieszka włosowego Mięśnie szkieletowe – komórki satelitarne, komórki macierzyste mięśnia Żołądek – komórki macierzyste nabłonka Serce– komórki macierzyste kardiomiocytów Mózg – neuronalne komórki macierzyste Wątroba- komórki owalne 22 Schofield 1978 – zaproponował hipotezę występowania „niszy” jako fizjologicznie ograniczonego mikrośrodowiska (komórki, macierz, sygnały) regulujące i chroniącego komórki macierzyste 23 Nisze warunkują właściwości komórek macierzystych i przejściowo namnażających się skóra nabłonek jelita zarodek tkankowo-specyficzne komórki macierzyste embrionalne komórki macierzyste szpik kostny przejściowo namnażające się komórki Kontrola transdukcji sygnału w niszy proliferacja terminalnie zróżnicowane komórki różnicowanie 24 Figure 1. Stem cell hierarchy Rizvi, A. Z. et al. Stem Cells 2005;23:150-165 25 Copyright ©2005 AlphaMed Press Figure 2. Rapidly renewing stem cell niches Rizvi, A. Z. et al. Stem Cells 2005;23:150-165 26 Copyright ©2005 AlphaMed Press Standaryzacja hodowli komórek do przeszczepów 1. Liczenie wyizolowanych komórek, testy żywotności, wydajność tworzenia kolonii (liczba kolonii utworzonychx100/liczba wysianych komórek)- %CFE 2. Identyfikacja komórek- analiza morfologiczna (mikroskopia elektronowa), antygeny markerowe – metoda immunologiczna, kariotypowanie 3. Monitorowanie kontaminacji: Sprawdzenie materiału do izolacji Monitoring w trakcie hodowli Źródła zakażeń: tkanka Niewłaściwa izolacja W trakcie hodowli Z materiałów stosowanych do hodowli Ze środowiska Niewłaściwy układ hodowlany 27 Immunologia nie autologicznych komórek Profesjonalne i nieprofesjonalne komórki prezentujące antygeny MHCII i białka kostymulujące B7 i CD40 Bezpieczeństwo stosowania komórek nie autologicznych : Badanie komórek donorowych na obecność: wirusa HIV, żółtaczki, adenowirusy, badania kariotypu, tumorogenność, zmiany fenotypowe 28 IMMUNOMODULACJA Projektowanie tkanek i organów - eliminacja komórek limfoidalnych dawcy - maskowanie lub eliminacja antygenów odpowiadających za reakcję immunologiczną 29 IMMUNOMODULACJA Projektowanie tkanek i organów /modyfikacja antygenów komórek donorowych/ Źródła koncepcji projektowania tkanek 30 31 Indukcja tolerancji transplantacyjnej 32 Badania nad projektowaniem tkanek Maskowanie przeciwciałami - cukrzyca - choroby neurodegeneracyjne 33 Usunięcie lub maskowanie MHC I - mechanizmy przetrwania przeszczepu delecja β2-mikroglobuliny Odtwarzanie na powierzchni komórek dawcy antygenów MHC I z wykorzystaniem b2-mikroglobuliny biorcy- ochrona przed komórkami NK, powodującymi lizę komórek bez MHC I 34 Badania nad projektowaniem tkanek Maskowanie przeciwciałami Dodawanie genów Usuwanie RNA 35 IMMUNOIZOLACJA – terapia biohybrydowa enkapsulacja technologia - rodzaje kapsuł (mikro-, makro-) - komórki stosowane do enkapsulacji 36 Próby kliniczne Cukrzyca - 37 Próby kliniczne Cukrzyca Chroniczny ból ALS (amyotrophic lateral sclerosis) – stwardnienie zanikowe boczne 38 Wyzwania inżynierii w rozwoju narzędzia immunoizolacji Dostarczenie tkanek z z hodowli pierwotnej bądź komórkowej Ochrona przed immunologicznym odrzutem przeszczepu Utrzymanie żywotności komórek i ich funkcji gradient O2 Wyspy komórek Langerhansa błona immunoizolacyjna O2 tkanka komórki białka insulina metabolity: Kwas mlekowy CO2 H+ 39 Utrzymanie żywotności komórek i ich funkcji dostarczanie składników odżywczych i tlenu Preferowane miejsca implantacji wysp trzustkowych: jama otrzewnej jama opłucnej wątroba 40 Ochrona przed immunologicznym odrzutem przeszczepu martwa komórka żywa komórka Wydzielane białka półprzepuszczalna bariera immunoizolacyjna Antygeny powierzchniowe Białka cytoplazmatyczne Cytokiny, wolne rodniki Reaktywne formy tlenu limfokiny Składniki komplementu Makrofag przeciwciała Limfocyt T Komórka cytotoksyczna Odpowiedź komórkowa Limfocyt B Komórka produkująca przeciwciała Odpowiedź humoralna 41
