Badanie mechanizmów reakcji katalizowanych przez enzymy

Wykład Monograficzny
dla Doktorantów
Badanie mechanizmów reakcji katalizowanych
przez enzymy
Część pierwsza
Ogólne informacje o enzymach
Treść I części wykładu
1. Ogólne własności enzymów.
2.
Zalety biokatalizy.
3.
Rodzaje selektywności enzymów.
4.
Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej.
5.
Klasyfikacja enzymów.
6.
Enzymatyczne syntezy związków biologicznie czynnych.
7. Kinetyka reakcji enzymatycznych.
Enzymy
Enzymy są biologicznymi polimerami katalizującymi liczne procesy, bez
których życie nie byłoby możliwe. Enzym to biokatalizator białkowy wytwarzany przez
żywe komórki organizmu. Ten biokatalizator ma zdolność do obniżania energii
aktywacji danej reakcji chemicznej, co skutkuje jej przyspieszeniem. Katalizują one
reakcje w układach biologicznych. Bez ich obecności dana reakcja nie zachodzi, lub
przebiega tak wolno, że jej rezultat jest niezauważalny. Enzymy charakteryzują się
wysoką specyficznością, zarówno pod względem katalizowanej reakcji, jak substratów
biorących w niej udział.
Enzymy są białkami prostymi i złożonymi. Enzym złożony składa się z części
białkowej i składnika niebiałkowego, zwanego kofaktorem. Część białkowa takiego
enzymu jest zwana apoenzymem, a połączenie apoenzymu z kofaktorem nosi nazwę
holoenzym.
Holoenzym = kofaktor + apoenzym
Gdy kofaktor tj. część niebiałkowa jest związana na stale z apoenzymem –
nazywamy ją inaczej grupą prostetyczną.
Gdy kofaktor jest nietrwale związany z apoenzymem – jest zwany
koenzymem.
Zalety biokatalizy
1.
Enzymy to efektywne katalizatory – zwiększają przynajmniej 106 szybkość
reakcji. W razie ich nieobecności – szybkość reakcji w układach
biologicznych jest niezauważalna.
2.
Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością.
3.
Enzymy działają w łagodnych warunkach tj.
•
przy ciśnieniu atmosferycznym;
•
W większości przypadków w przedziale temp. 20- -40oC;
•
Przy pH bliskim neutralnemu;
•
Reakcje przebiegają w środowisku wodnym.
4.
Odpady z reakcji są mało szkodliwe dla środowiska.
5.
Reakcje enzymatyczne prowadzi się w prostych aparatach.
6.
Reakcje enzymatyczne wyróżniają się wysoka wydajnością.
7.
Enzym nie katalizuje reakcji ubocznych.
Rodzaje selektywności enzymów
1.
Chemoselektywność (np. hydrolizuje estry, a nie hydrolizuje acetali lub
amidów).
2.
Regioselektywność i diastereoselektywność (np. z kilku takich samych grup
funkcyjnych w substracie – wyróżnia tylko jedną).
3.
Enancjoselektywność (np.katalizuje tylko reakcje z L-aminokwasem lub tylko z
D-sacharydem).
Zastosowanie enzymów w syntezie organicznej
1.
Rozdzielanie mieszanin racemicznych.
2.
Otrzymywanie związków optycznie czynnych.
3.
Synteza związków użytecznych biologicznie lub chemicznie.(np.alkoholi,
amidów, aminokwasów).
4.
Synteza związków niemożliwych do otrzymania na drodze klasycznej
syntezy organicznej.
5. Możliwość otrzymania związków selektywnie znakowanych izotopami
stabilnymi lub promieniotwórczymi.
a. Izotopami wodoru.
b. Promieniotwórczym izotopem 32 P.
c. Promieniotwórczym izotopem 35 S.
d. Izotopami węgla (stabilnym 13C i promieniotwórczymi 14C i 11C).
Wady przy stosowaniu enzymów
1. Mikroskala.
2. Wymagana jest wysoka czystość substratów. Niektóre
zanieczyszczenia, nawet w małej ilości powodują
inhibicję enzymów.
3.
Niektóre enzymy są bardzo drogie. Nie wszystkie
znajdują się w sprzedaży. Wydzielanie ich z materiału
biologicznego jest bardzo pracochłonne i kosztowne.
Miejsce (centrum aktywne) enzymu
W wiązaniu substratu i w przetwarzaniu go w produkt uczestniczy specyficzny
region cząsteczki białka enzymatycznego, nazywany miejscem aktywnym lub
centrum aktywnym enzymu.W jego strukturze można wyróżnić dwa elementy
funkcjonalne.
Są to: miejsce wiązania substratu i miejsce katalityczne.
Centrum aktywne cechuje się następującymi właściwościami:
A.
Zajmuje stosunkowo mały fragment cząsteczki enzymu.Tylko nieliczne reszty
amino- kwasowe białka enzymatycznego wchodzą w bezpośredni kontakt z
substratem.
B. Miejsce aktywne jest układem przestrzennym, złożonym z łańcuchów bocznych
reszt aminokwasowych, zajmujących różne odległe pozycje.
C. W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede wszystkim te reszty
aminokwasowe, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami
lub akceptorami protonów.
D. Miejsca aktywne są zagłębieniami lub szczelinami w strukturze cząsteczki białka
enzymatycznego.
Międzynarodowy kod enzymatyczny
Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech
liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d.
Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego
kodu genetycznego.
Liczba a określa numer klasy enzymu;
Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy;
Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy;
Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej
popodpodklasy.
Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny
numer identyfikacyjny.
Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC1.1.1.27.
Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc
oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1,
obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od
grupy H-C-OH. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy
1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy HC-OH na NAD+. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu
enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1
REGIOSELEKTYWNA HYDROLIZA
ESTRÓW PRZEZ PLE
1
COOH
COOMe
HO
PLE
4
COOMe
bufor
HO
COOMe
REGIOSELEKTYWNA HYDROLIZA DIESTRÓW E/Z
DIASTEREOTOPOWYCHZ UŻYCIEM PLE
R
R
COOEt
E/Z
COOEt
COOEt
PLE
bufor
R = H, Me2N, NO2
Z
COOH
ENZYMATYCZNY ROZDZIAŁ ESTRÓW
AMINOKWASOWYCH Z UŻYCIEM ESTERAZY
1
R OOC
COOH
NHR 2
R HN
R
R
esteraza lub proteaza
bufor
R = alkyl, aryl,
R1 = Me, Et,
R2 = H, acyl
L
R 1 OOC
D
R
NHR2
ROZDZIAŁ RACEMICZNYCH DIOLI W UKŁADZIE
HLADH / AlEHYDO -DH
HLADH
OH
OH
R
OH
+
NAD recykling
R
rac
OH
+
OH
D
e.e.
( nie określono)
O
R
L
H
e.e > 97 %
OH
Aldehydo-DH
R
COOH
L
R = -CH2OH, -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br, -CH3,
-CH2NH2, -CH=CH2, -CH2CH3
+
NAD recykling
HLADH - Horse Liver Alcohol
Dehydrogenase (hydrogenaza
alkoholowa z wątroby końskiej)
DH - Dehydrogenase
Przekształcania glukozo-6-fosforanu w zależności od enzymu
OH
CH2
O
H
H
HO
OH
H
H
OH
P
P
H
O
OH
H
H
OH
H
OH
DHG-6- P
O
HO
fruktozo-6-P
O
H
G-6-F
CH2OH
O
H
H
O
HO
OH
OH
O
H
OH
glukoza
P
PHI = fosfoheksoizomeraza
H
H
6- P -glukonolakton
PGM = fosfogluomutaza
H
PHI
P
PGM
HO
OH
OH
OH
P
H
H
CH2OH
HO
H H
O
CH2
H
O
H
glukozo-1- P
CH2
O CH2
DHG-6- P
= fosforan
= dehydrogenaza glukozo-6- P
G-6-F = glukozo-6-fosfotaza
H
OH
Mechanizm biokatalizy na przykładzie wybranych enzymów
Mechanizm biokatalizy został dość dobrze poznany dla kilku enzymów
hydrolitycznych tj.
Lizozymu, karboksypeptydazy A i chymotrypsyny.
Lizozym jest białkiem enzymatycznym o dość prostej strukturze: zawiera
129 reszt aminokwasowych. Nie ma grupy prostetycznej. Jego struktura
przestrzenna jest stabilizowana przez cztery wewnątrzcząsteczkowe mostki
disiarczkowe. Substratem lizozymu jest polisacharyd ściany bakteryjnej,
zbudowany z powtarzającego się wielokrotnie dimeru: złożonego z kwasu Nacetylomuraminowego i N-acetyloglukozoaminy. Obydwa te składniki są
połączone wiązaniem 1,4-β-glikozydowym. Wiązanie to jest rozkładane przez
lizozym.
Na powierzchni cząsteczki lizozymu znajduje się zagłębienie wiążące
polisacharyd. Decydujące znaczenie dla biokatalizy mają dwie grupy
karboksylowe.
Są to: niezjonizowana grupa γ-karboksylowa glutaminianu w pozycji 35 i
zjonizowana grupa β-karboksylowa asparaginianu w pozycji 52
Reakcja katalizowana przez lizozym
NAG
NAG
NAM
6
6
CH2OH
CH2OH
O
4
O
OH
2
3
O
4
O
O
5
1
OR
CH2OH
CH2OH
O
5
NAM
O
1
OR
OR
2
3
NH
NH
NH
NH
C O
C O
C O
C O
CH3
CH3
CH3
CH3
H2O
NAM = kwas N-acetylomuraminowy
NAG = N-acetyloglukozoamina
6
O
5
O
OH
6
CH2OH
CH2OH
4
OR
3
OH
O
5
1
NH
C O
CH3
NAG
4
2
NH
CH2OH
CH2OH
HO
1
OR
3
O
O
O
OR
2
NH
NH
C O
C O
C O
CH3
CH3
CH3
NAM
NAG
NAM
Karboksypeptydaza A
Jest enzymem proteolitycznym, odłącza od białka (peptydu)
pojedyncze aminokwasy C-końcowe, z wyjątkiem lizyny i argininy.
Wykazuje szczególnie wysoką aktywność wobec wiązań peptydowych,
powstałych z udziałem aminokwasów zawierających pierścień
aromatyczny lub długołańcuchowy. Jest białkiem jednołańcuchowym ,
zbudowanym z 307 reszt aminokwasowych i objętych w 38 procentach
strukturą α-helisy. Cząsteczka enzymu jest zwarta, ma kształt
elipsolidalny, a w miejscu aktywnym zawiera kowalencyjnie związany
jon cynku (Zn2+).Jon ten wytwarza wiązania koordynacyjne z dwoma
łańcuchami bocznymi histydyny, łańcuchem bocznym glutaminianu i
cząsteczką wody. Dzięki temu połączeniowi cząsteczka wody staje się
bardzo aktywna.Wiązanie substratu powoduje istotne zmiany centrum
aktywnego enzymu.
Chymotrypsyna
Jest ona także enzymem proteolitycznym. W odróżnieniu od
karboksypeptydazy nie odłącza aminokwasów C-końcowych tylko
hydrolizuje wiązania peptydowe położone w głębi łańcucha
białkowego, co prowadzi do fragmentacji substratu na peptydy o
różnej długości. Jest białkiem złożonym z trzech łańcuchów
polipeptydowych, połączonych mostkami disiarczkowymi.
Centrum aktywne chymotrypsyny: seryna 195, histydyna 57
i asparaginian 102.
PODZIAŁ ENZYMÓW
OXYDOREDUKTAZY
Katalizują reakcje utleniania i redukcji
TRANSFERAZY
Katalizują przenoszenie grup funkcyjnych (np. aldehydowych, ketonowych, acylowych)
HYDROLAZY
Katalizują hydrolizę np. peptydów, estrów, amidów
LIAZY
Katalizują reakcje addycji i eliminacji
IZOMERAZY
Katalizują racemizację, przenoszenie wiązań wielokrotnych, przekształcenie grup
funkcyjnych
LIGAZY ( SYNTETAZY )
Katalizują tworzenie wiązań C - C, C- heteroatom (mają zastosowanie w syntezie
organicznej )
KOENZYMY NIEZBĘDNE PODCZAS BIOTRANSFORMACJI
KOENZYM
TYP REAKCJI
NAD+ / NADH
usunięcie lub addycja wodoru
NADP+ / NADH
jak wyżej
ATP /a
fosforylacja
SAM
C1 - alkilacja
Acetyl - CoA
C2 - alkilacja
Flawiny
utlenianie
Pyridoksal-fosforan
transaminacja
Biotyna
karboksylacja
Kompleksy
utlenianie
metaloporfirynowe
peroksydacja
a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie.
G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.
Oksyreduktazy
Katalizują reakcję utleniania i redukcji. Przykładem może być
dehydrogenaza mleczanowa, która przekształca mleczan w
pirogronian z udziałem NAD+ i odwrotnie z udziałem NADH
NAD
CH3
H C OH
C O O
mleczan
+
NADH + H
dehydrogenaza
mleczanowa
+
CH3
H C O
C O O
pirogronian
UTLENIANIE ALKOHOLI
ASPEKT STREOCHEMICZNY
O
D
CH3
C
OH
NH2
+
D
AD
N
D
D
CH3
C
O
H
O
NH2
+
N
R'
R'
R’-adenozyno-difosforan rybozy
UTLENIANIE ALDEHYDÓW
HCHO
ROH
H
Acc
H
C OH
OR
H
LAD
C
O
OR
Acc - grupa przyłączająca jon hydroniowy z utlenianej cząsteczki
+
H.Acc
UTLENIANIE
PIERWSZORĘDOWYCH AMIN DO ALDEHYDÓW
Eox
HR
NH2
HS
+
BSAO
Ered +
HR
HS
O
BSAO - Bovine Serum Amine Oxidase
REAKCJE ALKINÓW I CYKLOPROPANÓW
KATALIZOWANE HALOPEROKSIDAZĘ
O
CH3
O
+
Cl
CHCl2
Cl
chloroperoksidaza
Cl- , H2O2
1
O
+
:
2
:
Cl
0,3
O
O
chloroperoksidaza
Br
-
Br , H2O2
R
chloroperoksidaza
X -, H2O2
+
CHBr2
R
OH
X
R = CH3,
R = Ph,
X = Cl
X = Br
HALOGENACJA ZWIĄZKÓW AROMATYCZNYCH
NH2
NH2
Br
chloroperoksidaza
Br -, H2O2
Cl
Cl
p-chloroanalina
AcHN
S
N
N-acetylo-tiazol
2-bromo-4-chloroanilina
chloroperoksidaza
Br -, H2O2
AcHN
S
Br
N
N-acetylo-2-bromotiazol
OTRZYMYWANIE HALOHYDRYN Z ALKENÓW
chloroperoksidaza
J
J- , H2O2
OH
+
J
OH
90
10
OH
Br
bromoperoksidaza
:
Br
Br
OH
HO
OH
Br -, H2O2
90
chloroperoksidaza
:
10
O
Br -, H2O2
O
chloroperoksidaza
Br -, H2O2
rac
ślady
Br
OH
Br
O
HO
Br
rac
REAKCJA HALOGENOWANIA
L-TYROZYNY Z UDZIAŁEM
ENZYMU CHLOROPEROKSYDAZY
COOH
HO
NH2
gdzie X- = Cl -, Br -, I -
chloroperoksydaza
H2O2, X-, bufor
I
HO
COOH
NH2
Transferazy
Przenoszą grupy chemiczne z substratu (dawcy) na produkt (biorca lub
akceptor). Np. aminotransferaza alaninowa przenosi -NH2 z glutaminianu na
pirogronian w wyniku czego powstaje alanina i α-ketoglutaran. Koenzymem
jest fosforan pirodoksalu.
-
COO
CH2
CH2
+
H C NH3
COO
glutaminian
-
+
CH3
C O
COO
pirogronian
PLP
aminotransferaza
alaninowa
COO
CH2
CH2
C O
COO
α− ketoglutaran
+
CH3
+
H C NH3
COO
alanina
SYNTEZA
DIHYDROKSYACETONU ZNAKOWANEGO
FOSFOREM P- 32
CH2O32 P
CH2OH
C
32
O + AT P
Fosforokinaza
CH2OH
P
C
O + AD P + H
CH2OH
= fosforan
32
Hydrolazy
Hydrolizują wiązania np. amidowe, estrowe, itp.
Hydroliza peptydów i białek, kwasów nukleinowych
Liazy
Liazy są enzymami, które katalizują reakcje addycji lub
eliminacji.
W wyniku reakcji eliminacji powstają dwa produkty.
Jednym z nich jest najczęściej woda, amoniak, dwutlenek
węgla, czy cząsteczka aldehydu, które odrywają się od substratu
i w wyniku tej reakcji powstaje w produkcie podwójne wiązanie
lub układ cykliczny.
Liazy dzielimy:
-ze względu na rodzaj powstającego produktu;
-ze względu na rodzaj użytego kofaktora.
LIAZY
Są enzymami katalizującymi przekształcenie substratu, którym towarzyszy powstawania lub
zanik wiązania podwójnego. Przykładem jest fumaraza – enzym cyklu kwasów
trikarboksylowych, katalizujący odwracalną przemianę fumaranu w jabłczan. W tej reakcji
powstaje lub zanika wiązanie podwójne
O
O
-
O
C
+
H C
O
-
C
C H
C
O
HO C H
H2O
fumaraza
O
fumaran
H C H
-
O
C
O
jabłc za n
-
Addycja amoniaku do kwasu (E)-cynamonowego
H
Ph
COOH
PAL
T(or D)
COOH
NH2
2
[3S- H]-, or
3
[3S- H]-L-Phe
ADDYCJA WODY KATALIZOWANA PRZEZ FUMARAZĘ
HOOC
X
COOH
X = H, Cl
fumaraza
bufor
X
H
HOOC
H
COOH
OH
e.e. 100 %
Kwas (chloro)fumarowy
[trans(chloro)butanodiowy]
Kwas hydroksy(chloro)butanodiowy
Dekarboksylacja kwasów organicznych polega na rozerwaniu
wiązania C-C, a jednym z jej produktów jest CO2.
Enzymatycznej dekarboksylacji ulegają cztery typy kwasów
karboksylowych:
α-ketonokwasy
R
COOH
β-ketonokwasy
R
O
O
hydroksykwasy
R
COOH
COOH
OH
aminokwasy
R
COOH
NH2
W wyniku enzymatycznej dekarboksylacji α-aminokwasów
powstają aminy biogenne.
R
COOH
NH2
enzym
R
+
CO2
NH2
Biogenne aminy spełniają doniosła rolę w metabolizmie organizmach
żywych.
Niektóre z nich wchodzą w skład błon organelli komórkowych.
Są składnikami koenzymów, witamin, choliny.
Pełnią rolę hormonów tkankowych,
Pewne z nich są ważnymi neuroprzekaźnikami.
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
HO
COOH
CO2
HO
NH2
NH2
L-treonina
propanoloamina
Składnik witaminy B 12
HO
COOH
NH2
CO2
HO
NH2
etanoloamina
L-seryna
Składnik fosfatydów i choliny.
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
HOOC
COOH
CO2
HOOC
ΝΗ2
NH2
kwas L-glutaminowy
kwas χ-aminomasłowy
Produkt metabolizmu w mózgu.
Neuroprzekaźnik
HS
COOH
CO2
HS
NH2
NH2
L-cysteina
cystamina
Składnik koenzymu A
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
CO2
COOH
NH2
NH2
NH2
L-lizyna
NH2
kadaweryna
Stabilizator rybosomów.
Produk tmetabolizmu bakterii
przewodu pokarmowego.
HOOC
COOH
CO2
HOOC
ΝΗ2
NH2
kwas L-asparginowy
β −alanina
Składnik koenzymu A
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
COOH
N
CO2
N
NH
NH2
NH
NH2
histamina
L-histydyna
Hormon tkankowy
obniżający ciśnienie
COOH
HO
NH2
L-tyrozyna
CO2
HO
NH2
tyramina
Hormon tkankowy
powoduje skurcze macicy
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
COOH
CO2
NH2
NH
NH2
NH
tryptamina
L-tryptofan
Hormon tkankowy
HO
COOH
NH
NH2
5'-hydroksy-L-tryptofan
CO2
HO
NH
NH2
serotonina
Hormon tkankowy
podwyższający ciśnienie krwi,
neuroprzekaźnik
Ważniejsze biogenne aminy w organizmie ludzkim
HO
COOH
NH2
HO
CO2
HO
NH2
HO
L-DOPA
(3',5'-dihydroxyphenylalanine)
dopamina
Prekursor w syntezie melanin
(naturalnych pigmentów zwierzęcych)
oraz katecholoamin takich jak:
noradrenaliny i adrenaliny
tj. jednych z najważniejszych neuroprzekażników
Stereospecyficzność enzymatycznej dekarboksylacji
L-aminokwasów
T(S)
T(S)
COOH
R
dekarboksylaza
R
H2O
NH2
NH2
3
3
[1S- H]-α− amina
[2S- H]-α−L-aminokwas
H(S)
H(S)
COOH
R
NH2
dekarboksylaza
R
T(R)
THO
NH2
3
α−L-aminokwas
[1R- H]-α− amina
T(S)
T(S)
COOH
R
NH2
3
H(R)
[2S- H]-α−L-aminokwas
dekarboksylaza
R
D(R)
D2O
NH2
3
2
[1S- H, 1R- H]-α− amina
IZOMERAZY
Są enzymami katalizującymi reakcje izomeryzacji. Przykładem może być jeden z enzymów
glikolizy tj. izomeraza fosfotriozowa. Przekształca ona odwracalnie aldehyd 3-fosfoglicerolowy
w fosfodihydroksyaceton.
O
H
H
C
H C OH
H C OH
H C O
H
alde hyd
3-fos foglic e rynowy
izo me raza
P
fos fotriozo w a
H C O
H C O
P
H
fos fodihydroks yac e ton
SYNTETAZY czyli LIGAZY
Są enzymami katalizującymi reakcje syntezy kosztem energii pochodzącej od ATP (lub innego
nukleotydu trifosforanowego). Np.. Enzym syntetaza glutaminy wiąże amoniak z grupą γ-karboksylową kwasu glutaminowego, tworzac glutaminę. W reakcji zużuwa się jedna cząsteczka
ATP.
O
C
O
ATP
ADP +
Pi
O
CH2
CH2
CH2
H C NH3
O
C
O
C
NH2
-
glutaminian
+
s y nte taza g lutaminy
CH2
H C NH3
O
C
O
glutamina
-
+
KOENZYMY NIEZBĘDNE PODCZAS BIOTRANSFORMACJI
KOENZYM
TYP REAKCJI
NAD+ / NADH
usunięcie lub addycja wodoru
NADP+ / NADH
jak wyżej
ATP /a
fosforylacja
SAM
C1 - alkilacja
Acetyl - CoA
C2 - alkilacja
Flawiny
utlenianie
Pyridoksal-fosforan
transaminacja
Biotyna
karboksylacja
Kompleksy
utlenianie
metaloporfirynowe
peroksydacja
a) Inne trójfosforany takie jak: GTP, CTP i UTP działaja podobnie.
G - guanidyna; C - cytozyna; U - uracyl.
Koenzymy mogą być klasyfikowane zależnie od grupy,
przeniesienie której ułatwiają
Koenzymy przenoszące wodór H:
NAD+, NADP+
FMN, FAD
Kwas liponowy
Koenzym Q
Koenzymy przenoszące inne grupy niż H
CoA-SH
Pirofosforan tiaminy
Fosforan pirodoksalu
Koenzymy folianowe
Biotyna
Koenzymy kobamidowe
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy - NAD+
amid kwasu
nikotynowego
O
NH2
NH2
N
N
O
-
O
-
CH2 O P O P O
OH HO
O
O
N
CH2
N
N
O
P
O
OH
ryboza
OH
ryboza
Przez przyłączenie fosforanu
adenina
P
poprzez wiązanie estrowe
w miejscu wskazanym strzałką, powstaje
+
fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP )
Flawinomononukleotyd (FMN) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)
dimetyloizoalloksazyna
H3C
N
H3C
N
dimetyloizoalloksazyna
NH
O
N
H3C
N
H3C
N
CH2
rybitol
H C
H
NH2
H C
H C
H C O
O
N
CH2
H C
rybitol
NH
P
N
N
H C
N
H C
H C O
H
P
P
adenina
N
CH2
O
ryboza
FMN
OH
FAD
OH
Koenzym A (CoA)
Jest przenośnikiem grup acylowych (reszt kwasowych). W jego
strukturze można wyróżnić trzy elementy składowe.
- Nukleotyd difosforanowy – adenozynodifosforan (ADP)
- Kwas pantotenowy (witaminaB5), będący połączeniem β-alaniny i kwasu
pantoinowego
- Cysteamina.
Cysteamina zawiera grupę –SH, która wytwarza wiązania
tioestrowe z różnymi kwasami organicznymi. Na tej drodze powstają
acylowe pochodne CoA, określane w skrócie jako acylo∼S-CoA.Ta forma
zapisu acylowych pochodnych CoA ma na celu wskazanie, że miejscem
wiązania grupy acylowej jest atom siarki, a połączenie pomiędzy siarką
CoA a grupą acylową (przedstawione falista kreską „∼”) jest wiązaniem
bogatym w energię.Tą droga reszty kwasowe zostają aktywowane. W tej
postaci mogą być substratami w syntezie różnych estrów np. acetocholiny,
acylogliceroli, bądź włączać się do szlaków katabolicznych, takich jak:
β-oksydacja kwasów tłuszczowych lub cykl kwasów trikarboksylowych.
Koenzym A
NH2
kwas pantotenowy
O
HS
CH2
CH2
N
N
cysteamina
C
N
CH2
CH2
N
H
H
O
CH3
C
C CH2
CH CH3
OH
N
O
P
P
CH2
O
O
β− alanina
P
kwas pantoinowy
Zaznaczono składniki koenzymu A oraz grupę –SH
będącą miejscem wiązania reszt acylowych
N
OH
S-Adenozylometionina (SAM)
Koenzym SAM jest przenościkiem –CH3 na różne akceptory. Po odłączeniu
–CH3 powstaje S-adenozylohomocysteina zdolna do przyłączenia grupy metylowej i odtworzenia cząsteczki SAM
NH2
N
N
N
S
H3C
N
CH2
CH2
O
CH2
metionina
+
H3N CH
C
O
O
OH
-
SAM
OH
Biotyna
Koenzym biotyna wiąże CO2 tworząc karboksybiotynę – substrat w reakcjach
karboksylacji. Jest to reakcja odwracalna.
CO2
O
N
N
BIOTYNA
O
S
CH2
CH2
CH2
CH2
kwas walerianowy
C
OH
Liponian/lipoamid
Ten tiokwas występuje w dwóch postaciach. W formie zredukowanej ma
dwie grupy –SH przy C6 i C8, a w formie utlenionej zawiera mostek disiarczkowy.
GrupaCOO- jest połączona z enzymem przez wiązanie amidowe ε-NH2 reszty Lys,
dlate-go koenzym jest zwany lipoamidem. Liponian jest przejściowym akceptorem grup acylowych w procesie oksydacyjnej dekarboksylacji α-aminokwasów.
CH2
CH2
S
CH CH2 CH2
CH2 CH2 C
O
O
+2H
-
S
liponian
-2H
CH2
SH
CH2
CH CH2 CH2
CH2 CH2 C
SH
dihydroliponian
O
O
-
Zastosowanie enzymów w praktyce medycznej
Enzymy znajdują liczne praktyczne zastosowania w diagnostyce laboratoryjnej
wielu chorób; są odczynnikami laboratoryjnymi lub lekami.
Zastosowanie enzymów do naprawy materiału genetycznego komórki stwarza
nowe możliwości leczenia wrodzonych wad metabolicznych i chorób nowotworowych.
Enzymy jako markery chorób.
Aktywność niektórych enzymów w tkankach i płynach ustrojowych zmienia się w
przebiegu różnych chorób.
Na przykład aktywność aminotransferaz w osoczu krwi rośnie w przebiegu zawału mięśnia
sercowego lub uszkodzenia wątroby.
Aktywność amylazy – enzymu rozkładającego skrobię – wzrasta u chorych na zapalenie
trzustki.
Znaczenie diagnostyczne maja tez wzajemne relacje pomiędzy aktywnościami
określonych izoenzymów np.
-u ludzi zdrowych aktywność LDH-1 w osoczu krwi jest niższa niż LDH-2.
-u chorych z zawałem serca aktywność LDH-1 przewyższa aktywność LDH-2
Enzymy jako leki i odczynniki
Niektóre enzymy służą jako leki np.
- Lipaza – enzym hydrolizujący tłuszcze – jest użyteczna w leczeniu niedomogi
wydzielniczej trzustki.
- Asparaginaza – enzym rozkładający asparaginę – jest przydatna w leczeniu
białaczek.
Pewne enzymy służą jako odczynniki w praktyce laboratoryjnej np.
- Ureaza może być zastosowana do oznaczania mocznika,
- Dehydrogenaza mleczanowa - do oznaczania mleczanu.
Enzymy w biotechnologii i terapii genowej
Za pomocą nukleaz można wycinać wadliwe skonstruowane odcinki DNA,
a powstałe ubytki wypełniać odpowiednimi fragmentami pochodzących z komórek
zdrowych tego samego gatunku.
Zespalanie fragmentów DNA jest możliwe dzięki ligazom DNA.
Stwarza to możliwość naprawy uszkodzonego genu i otwiera perspektywę rozwoju
nowej dziedziny medycyny, określanej mianem terapii genowej.
Międzynarodowy kod enzymatyczny
Międzynarodowy kod enzymatyczny składa się z dwu liter i czterech
liczb oddzielonych kropkami. Jego schemat wygląda następująco: EC a.b.c.d.
Symbol EC (enzyme code) oznacza, że liczby po nim dotyczą międzynarodowego
kodu genetycznego.
Liczba a określa numer klasy enzymu;
Liczba b- numer podklasy w obrębie tej klasy;
Liczba c- oznacza numer podpodklasy w obrębie podpodklasy;
Liczba d -oznacza numer enzymu w obrębie wymienionej wcześniej
popodpodklasy.
Każdemu dobrze poznanemu enzymowi, przypisano jego niepowtarzalny
numer identyfikacyjny.
Na przykład dehydrogenaza mleczanowa ma numer kodowy EC1.1.1.27.
Pierwsza liczba (1) oznacza, że enzym należy do klasy 1, jest więc
oksydoreduktazą. Druga liczba (1) oznacza, że enzym należy do podklasy 1,
obejmującej wszystkie oksydoreduktazy, które odłączają parę atomów wodoru od
grupy H-C-OH. Trzecia liczba (1) oznacza, że enzym ten należy do podpodklasy
1, obejmującej wszystkie enzymy, które przekazuja wodory odłączone z grupy HC-OH na NAD+. Czwarta liczba (27), to numer przyporządkowany temu
enzymowi w obrębie podpodklasy EC.1.1.1
ENZYMY
KINETYKA
FORMALNA
Część II
Procesy metaboliczne
Katabolizm
Anabolizm
Procesy kataboliczne przekształcają składniki tkanek do mniejszych, prostszych
cząsteczek. Końcowymi produktami katabolizmu są bardzo proste substancje jak woda, dwutlenek
węgla, amoniak, mocznik czy kwas moczowy.
Procesom katabolicznym (np.reakcje utleniania) towarzyszy uwalnianie energii i jest ona
przetwarzana w formę użyteczną dla komórki. Jest magazynowana w postaci związków bogato
energetycznych.
Procesy anaboliczne polegają na syntezie składników złożonych ze składników
prostych wykorzystując energię uzyskaną z procesów katabolicznych. Synteza zachodząca w
układzie biologicznym często nazywa się biosyntezą. W wyniku biosyntezy powstają z prostych
związków wielkocząsteczkowe tj. białka, polisacharydy czy kwasy nukleinowe.
Większość energii zmagazynowanej w wiązaniach chemicznych składników odżywczych ulega
rozproszeniu w postaci ciepła, dlatego masa pożywienia potrzebna organizmowi jest zdecydowanie
większa niż łączna masa produktów, które mogą być wytworzone w procesach anabolicznych.
Entropia
Entropia, funkcja termodynamiczna, jest miarą uporządkowania układu.
Im większy jest stan nie uporządkowania (chaos), tym większa jest entropia układu.
Procesy anaboliczne prowadzą do wzrostu uporządkowania materii
biologicznej.W tym przypadku entropia maleje
Procesy kataboliczne zmniejszają stopień uporządkowanie materii. W tym
przypadku entropia wzrasta.
Energia swobodna
`
Zawartość energii swobodnej w produktach reakcji jest niższa lub wyższa od jej zawartości
w substratach reakcji. Różnica ta nosi nazwę zmiany energii swobodnej (∆G).
Wartość ta mierzona w standardowych warunkach (standardowych warunkach tj. wtedy gdy stężenie
substratów wynosi 1M, pH 7,0) nosi nazwę standardowej zmiany energii swobodnej i jest
określana symbolem ∆G0.
A+ B ↔ C + D
[C][D]
[A][B]
[C ][ D]
∆G0 = − RT ln
[ A][ B]
K=
∆G0 =- RTlnK = -2,303 RTlogK
Z powyższego równania wynika, że przy stałej temperaturze ∆G0 zależy wyłącznie od od K.
Jeżeli K = 1, to ∆G0 = 0. Nie zachodzi żadna reakcja lub przebiega ona w obu kierunkach z taką samą
szybkością.
Energia swobodna cd.
Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów jest większy niż iloczyn stężeń
substratów, to stała równowagi K jest wyższa od 1, a ∆G0 ma wartość ujemną. Oznacza to, że
reakcja jest egzoergiczna. Reakcja jest spontaniczna i zachodzi tak długo, aż ∆G0 osiągnie wartość
zerową. Ustala się wtedy stan równowagi.
Jeżeli w stanie równowagi iloczyn stężeń produktów C i D jest niższy od iloczynu stężeń
substratów to stała równowagi K jest niższa od 1, a ∆G0 ma wartość dodatnią. Oznacza to ze reakcja
przebiega z pobieraniem energii, jest endoergiczna i nie zachodzi spontanicznie w kierunku A + B →
C + D.
W odwracalnej reakcji wartość bezwzględna a ∆G0 w obydwu kierunkach jest jednakowa
tylko różni się znakiem.
Jeżeli ∆G0 ma wartość ujemną , nosi nazwę termodynamicznie korzystnej. Może ona
zachodzić samorzutnie.
Jeżeli dla reakcji wartość ∆G0 jest dodatnia, to ta reakcja jest termodynamicznie
niekorzystna. Nie może zajść spontanicznie. W organizmie zachodzą reakcje obydwu rodzajów.
Reakcje termodynamicznie niekorzystne są „napędzane” reakcjami termodynamicznie korzystnymi.
Efekt termodynamiczny reakcji
A (substrat)
---→
B (produkt)
C (substrat)
G
---→
D (produkt)
G
D
A
Stan
końcowy
Stan
początkowy
∆G > 0
∆G < 0
B
Stan
końcowy
Przebieg reakcji
Reakcja termodynamicznie
korzystna
Stan
początkowy
C
Przebieg reakcji
Reakcja termodynamicznie
niekorzystna
Addytywność zmian energii swobodnej
Zmiany wolnej energii, towarzyszące następującym po sobie reakcjom, sumują
się. Określa się to mianem addytywności zmian wolnej energii.
W organizmie funkcjonują ciągi reakcji enzymatycznych, których celem jest
wieloetapowe przekształcenie substratów w określone produkty.
Substrat A, pod działaniem enzymu a przechodzi w produkt B, a ten staje się
substratem do enzymu b, który przekształca go w produkt C itd.
Dzięki addytywnej właściwości wolnej energii szlak metaboliczny może
funkcjonować w kierunku: A→B →C→D→ dopóki suma ∆G0 wszystkich reakcji
składowych jest ujemna. Może to występować także wtedy, gdy niektóre reakcje z reakcji
cząstkowych wykazują ∆G0 dodatnie.
Przykładem takiego szlaku metabolicznego jest glikoliza.
Reakcja przebiegająca z enzymem i bez udziału enzymu
G
Ga ← bez enzymu
Ga ← z enzymem
Stan
początkowy
Stan
końcowy
Przebieg reakcji
FORMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ
ENZYMY (1)
E +
S
k +1
k
k +2
ES
produkty
1.1
-1
v(szybkość) = k +2 [ ES ]
1.2
Jeżeli oznaczymy Ks jako stałą równowagi dysocjacji kompleksu ES na E i S, i
jeżeli przez [E'] oznaczymy początkowe stężenie enzymu; wtedy stężenie wolnego
enzymu wynosi ([E'] - [ES]). Wówczas:
Ks =
[E] [S] ([E] - [ES])[S]
=
[ ES]
[ES]
1.3
Z równania 1.2 otrzymujemy:
([E][S] - [ES] [S])
Ks =
[ES]
v =
k [E ]
K
1+
[S ]
+2
s
1.4
1.5
FORMALNA KINETYKA REAKCJI KATALIZOWANYCH PRZEZ
ENZYMY (2)
Kiedy stężenie substratu jest bardzo duże, wtedy równanie (1.5) określa
maksymalną szybkość reakcji V i zbliża się do wyrażenia
V = k +2 [E']
Wstawiając to wyrażenie na V do równania (1.5) otrzymujemy
V
v =
1.6
Ks
1 +
[S]
Jest to równanie Michaelisa - Menten'a
Stałą Michaelisa , Km, definiuje się jako takie stężenie [S], przy którym osiąga się połowę
szybkości maksymalnej V. Wartość Km można otrzymać eksperymentalnie z (1.6) Chociaż jest
możliwe wyznaczyć Km z wykresu, lecz dokładność jest mała, ze względu na asymptotyczny
charakter zależności.
W praktyce preferuje się stosowanie równania (1.7) otrzymanego
przez przekształcenie (1.6):
1
1 Km
1
=
+
1.7
v
[S] V
V
WYKRES MICHAELISA- MENTEN’A
V/2
Km
stężenie substratu [ S ]
Zależność szybkości reakcji v od stężenia substratu [S] w warunkach stałego stężenia enzymu.
Przy wysokich stężeniach substratu szybkość reakcji v osiąga wartość maksymalną V. Km
równa się stężeniu substratu przy wartości v = 0.5 V.
WYKRES LINEWEAVERA - BURK’A
( podwójne odwrotności)
1/v
nachylenie = Km / V
odcięta = -1 / Km
odcięta = 1 / V
1 / [ S]
Zależność 1/v od 1/[S] dla reakcji katalizowanej enzymatycznie opisanej równaniem
Michaelis-Menten’a
Zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten’a, Km = Ks. Wobec tego Km jest bezpośrednią miarą
siły wiązania między enzymem a substratem.
Powyższy wykres jest też bardzo użyteczny do badania inhibicji w reakcjach
enzymatycznych.
Zależność prędkości reakcji enzymatycznej (V) od temperatury
V
10
20
30
40
Temperatura [oC]
50
Zależność prędkości reakcji katalizowanych przez niektóre enzymy od pH
V
amylaza
pepsyna
2
4
6
trypsyna
8
10
pH
Przykładowe wartości stałej Michaelisa
Enzym
Fumaraza
Penicylinaza
Esteraza acetylocholinowa
β-Galaktozydaza
Anhydraza węglanowa
Ureaza
Substrat
KM [mol/L]
fumaran
5,0 × 10-6
benzylopenicylina
5,0 × 10-5
acetylocholina
9,5 × 10-5
laktoza
4,0 × 10-3
CO2
1,2 × 10-2
mocznik
2,5 × 10-2
Efektory allosteryczne
Efektory allosteryczne są drobno cząsteczkowymi metabolitami, które łącząc
się z białkiem enzymatycznym modyfikują jego strukturę czwartorzędową, a
niekiedy strukturę trzeciorzędową. Efektem tego jest zmiana powinowactwa
enzymu do substratu, co skutkuje zmianą wartości Km .
Enzymy podatne na działanie tych efektorów noszą nazwę efektorów
allosterycznych.
Powoduje to zmianę wykresu Michaelisa- Mentena.
Efektory allosteryczne dzielą się na dodatnie (aktywatory allosteryczne) i
ujemne (inhibitory allosteryczne).
Aktywator allosteryczny sprawia,że prędkość maksymalna reakcji zostaje
osiągnięta przy niższym pH. Wartość Km maleje. Inhibitor allosteryczny
powoduje efekt odwrotny. Wartość Km wzrasta.
Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji
z udziałem inhibitora kompetycyjnego
(-) inhibitor
Vmax
(+)inhibitor
(-) inhibitor
Vmax
2
(+)inhibitor
1/Vmax = 1/Vmax(i)
KM
KM(i)
A
[S]
-1/KM
[S]
1/KM(i)
B
Wykresy Michaelisa- Mentena (A)i Lineweavera--Burka (B) dla reakcji
z udziałem inhibitora niekompetycyjnego
1/V
V
(+) inhibitor
Vmax
1/Vmax(i)
(-) inhibitor
Vmax(i)
(+) inhibitor
Vmax/2
(-) inhibitor
1/Vmax
Vma(i)
2
KM=KM(i)
A
[S]
[S]
1/KM = 1/KM(i)
B
Różnice między inhibitorami kompetycyjnymi
i niekompetycyjnymi
Inhibitor
kompetycyjny
Inhibitor
niekompetycyjny
Budowa
Podobny do substratu
Niepodobny do substratu
Miejsce wiązania
Miejsce aktywne
Odwracalność
inhibicji
Inhibicja odwracalna
przez wzrost stężenia
substratu
Inhibicja nieodwracalna
przez wzrost stężenia
substratu
Bez zmian
maleje
wzrasta
Bez zmian
Vmax
KM
Poza miejscem
aktywnym
Wykres Michaelisa-Menten zależności V od [S] glukozy
dla heksokinazy (H) i glukokinazy (G)
V
heksokinaza
Vmax(H)/2
Vmax(G)/2
glukokinaza
KM(H)
KM(G)
glukoza
[S]
Część III
BADANIA MECHANIZMÓW
REAKCJI
Mechanizm reakcji
Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej.
Mówi on o tym:
a) które wiązania ulegają pęknięciu,
b) jakie wiązania się się tworzą,
c) jaka jest kolejność tych zjawisk,
d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces,
e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów
Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem.
Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymatycznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy
katalityczne.
Metody wyznaczania mechanizmów reakcji
1. Badanie produktów produktów reakcji:
• identyfikacja,
• dowody stereochemiczne.
2. Badanie produktów pośrednich:
• izolacja produktów pośrednich,
• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),
• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować
z danym reagentem dając ściśle określony produkt),
• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.
3. Badania kinetyczne:
• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),
• badania katalizy (również inhibicji),
• efekty izotopowe.
4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi
technikami, jak MS, NMR itp.).
Kinetyczny efekt izotopowy
A +
A +
1B
2B
k1
------------→
k2
------------→
k1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (1B)
k2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (2B)
k1
= 1
k2
k1
φ 1
k2
k1
π 1
k2
nie ma KIE
jest KIE
odwrotny KIE
A1 B
A2 B
Kinetyczny efekt izotopowy
Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda
kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania
mechanizmów reakcji enzymatycznych.
Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i
trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie
sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku
biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości
reakcji.
Różna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem
izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości:
kiz. lżejszego / kiz. cięższego
Różnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym
możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od
masy zredukowanej:
µ=
m1 m 2
m1 + m 2
υ ≈
1
2
zgodnie z prawem Hook’a:
k
µ
(k- stała siłowa niezależna od masy).
Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię
oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii.
Obrazowo przedstawiono to na poniższym schemacie:
Energia dysocjacji wiązań C-H i C-D
Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości
procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas,
gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na
szybkość całego procesu.
Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału.
1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku
k is.lighter
k is.heavier
• efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem
lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym
k is.lighter
k is.heavier
>1
• brak efektu izotopowego
k is.lighter
k is.heavier
=1
• efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy:
k is .lighter
k is.heavier
<1
2. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku do
miejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji:
a) pierwszorzędowe,
b) α−drugorzędowe
c) β−drugorzędowe
Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty.
Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy
atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap
będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12C1
izotopem 14C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszorzędowym. Analogicznie dla wodoru H2 wystąpi efekt α−drugorzędowy, a dla wodoru H3
wystąpi efekt β−drugorzędowy.
3
H H
2
3
H C C1 X
wolno
H H
+
H C C1
H H
3
H H
2
H H
2
+
H C C1
s zybko
H H
Mechanizm E1
H
3
H
C C1
H
H
2
3. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe
• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu
powoduje zmianę szybkości reakcji,
• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np.
• z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.
4. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w
zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
/Km
4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe
• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu
powoduje zmianę szybkości reakcji,
• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np.
• z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.
5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w
zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
kinetyczne efekty izotopowe na Vmax
/Km
METODY WYZNACZANIA KINETYCZNYCH
EFEKTÓW IZOTOPOWYCH
1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektów
izotopowych.
2. Metoda zaburzeń równowagi.
3. Metody z użyciem spektrometrii mas.
Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga
R0 + 1
R
)
ln(1 − f ∗ 0 )
Rp + 1
Rp
≈
α=
R p ∗ f ∗ ( R0 + 1)
ln(1 − f )
ln[1 −
]
R0 ∗ ( R p + 1)
ln(1 − f ∗
(1 − f ) ∗ R0
(1 − f ) ∗ ( R0 + 1)
ln
Rs + 1
Rs
α=
≈
R ∗ (1 − f ) ∗ ( R0 + 1)
ln(1 − f )
ln s
R0 ∗ ( Rs + 1)
ln
f ∗ ( R p − Rs )
f ∗ ( R p − Rs )
1
1
−
−
ln[
]
ln[
]
1 − f (1 − f ) ∗ ( R p + 1)
1− f
(1 − f ) ∗ R p
α=
≈
f ∗ ( R p − Rs )
f ∗ ( R p − Rs )
1
1
−
ln[
] ln[
−
]
1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ ( R p + 1)
1 − f (1 − f ) ∗ Rs ∗ R p
ln
α=
ln
R p − Rs
( R p − R0 ) ∗ Rs
( R p − Rs ) ∗ R0
- R0 - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego
w substracie przed rozpoczęciem reakcji,
- Rp - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu
cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f,
- Rs - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego
do izotopu cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f,
- f - stopień przereagowania.
- α - kinetyczny efekt izotopowy,
R p − R0
Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie
miejsca aktywnego
O
O
O
N
NR
Enzym
a)
Enzym
N
N
b)
NH2
+
+
NH2
CO 2 -
NR
Enzym
NR
+
CO 2 -
CO 2 -
+
NH3
c)
a ) Addycja Micha e la
b) β−e limina cja
c) odtworze nie de hydroa la niny prze z
O
β-e limina cję
N
Enzym
NR
+ NH3
Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany
przez Havir’a i Hanson’a
+
B
B:
H
B:
O
H2N
N
H
Ph HRe
H Si
OH
Ph HRe
H Si
N
H
B:-
N
H
H
COO-
H2N
Ph
N
H
H2N
N H H
H
H
COO-
N H H
H
B:
OH
+
B:
HB
-
+
H
COO-
HRe
HB
Ph
OH
N
H
H2N
N H H
H
COO-
Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany
przez Schuster’a i Retey’a
OH
+
H
N
OH
H
N
N
H
H ReHSi
N
H
H ReHSi
COO
+
COO
+
H3N H
+
H3N H
H
N
:B
+
OH
+
HB
N
H
COO
H
N
OH
N
H
+
HB
COO
+
H3N H
NH3
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny
Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny, co
pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego efektu
izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja eliminacji z
udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu. Potwierdzeniem takiej
tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe, czyli na przykład brak
efektu lub duży efekt.
T
14
HO
C OOH
NH2
14
P AL
pH = 8,7, 30 o C
C OOH
+ NH2T
HO
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji orto pierścienia
aromatycznego L-fenyloalaniny
O
T
14
C
T
T
PAL
OH
O
14
C
pH = 8,7
NH2
OH
+
NH3
T
Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego H/T w pozycji 2 i 6 pierścienia
aromatycznego L-fenyloalaniny.
Nr eksperymentu –
Stopień
nr frakcji
przereagowania [%]
KEI
1-1
5,89
0,8595
1-2
9,32
0,9664
1-3
12,09
1,0254
1-4
13,86
1,0870
1-5
16,22
1,0991
2-1
9,95
1,0143
2-2
12,34
1,0354
2-3
19,70
1,1559
2-4
21,82
1,1591
2-5
24,12
1,1598
Kinetyczny efekt izotopowy
12C/14C
w pozycji 2 L-Phe
O
O
H*
C
OH
NH2
*
C
H
P AL
pH = 8,7
OH
Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-fenyloalaniny
Nr eksp.*
R0, Rp, f
R0, Rr, f
Rp, Rr, f
R0, Rr, Rp
Średnia
1
0.9957
1.0262
1.0003
0.9981
1.0051
2
0.9955
0.9918
0.9955
0.9955
0.9946
3
1.0095
0.9696
1.0020
1.0050
0.9965
4
1.0085
1.0044
1.0075
1.0078
1.0070
średnia
1.0023
0.9980
1.0013
1.0016
1.0008
±0.0062
±0.0019
Procedura wyznaczenie KEI H/T w pozycji 3-pro-R
Mieszanina reakcyjna:
enzym, L-Phe [1-14C, 3R-3H]
bufor boranowy 0,2M pH = 8,7
Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej
Mierzę aktywność (A 0 ) 14 C oraz
stosunek aktywności
t1
t2
3 H/14 C
(R 0 )
t5
t3 t4
Pobieram 5 frakcji (każda V1)
o różnym stopniu przereagowania
w zakresie od 10% do 20%
Procedura postępowania dla każdej frakcji
Mieszanina reakcyjna pH=8,7
O
T
14
C
T
O
14
O
C
+
O
NH3
H+
Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1
O
T
14
C
T
OH
O
14
C
+
OH
NH3
Ekstrakcja
(Et2 O)
Warstwa eterowa
T
Warstwa wodna
T
O
14
C
O
14
OH
C
OH
+
NH3
14 C
Pomiar aktywnosci
oraz stosunku aktywności
(A i)
3 H/14 C
Rp
Po wydzieleniu L-Phe zastosowana
do następnego eksperymentu
Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-R L-Phe
Nr Eksp.
KEI
1
1,0594
Odchylenie
stand.
0,0215
1,0535
0,0187
3
1,0566
0,0151
4
1,0480
0,0167
5
1,0585
0,0193
Średnia
1,0552
0,0046
2
Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe
Mieszanina reakcyjna:
enzym, L-Phe [1-14C, 3S-3H]
bufor boranowy 0,2M pH = 8,7
Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej
Mierzę aktywność (A 0 ) 14 C oraz
stosunek aktywności
t1
t2
t3 t4
3 H/14 C
(R 0 )
t5
Pobieram 5 frakcji (każda V1)
o różnym stopniu przereagowania
w zakresie od 10% do 20%
Procedura postępowania dla każdej frakcji
Mieszanina reakcyjna pH=8,7
NH2T
O
T
14
C
O
14
O
C
+
H+
O
Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1
+
NH3T
O
T
O
14
14
C
C
OH
OH
+
NH3
NH3
Ekstrakcja
(Et 2 O)
elucja H 2 O
Kolumna jonowymienna
Amberlit IR 120 (H+)
0,3 M NH3
Warstwa wodna
T
+
NH3T
Warstwa eterowa
O
14
C
O
14
OH
C
OH
+
NH3
O
T
14
C
OH
+
NH3
HT O
O
T
14
C
+
NH3
OH
Odparowanie pod
zmniejszonym
ciśnieniem
Pomiar stosunku
aktywności 3 H/14 C (R ri)
Pomiar aktywnosci
14 C
(Ai)
Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe
Nr Eksp.
KEI
Odchylenie
Stand.
1
1,0750
0,0186
1,0953
0,0187
3
1,0899
0,0151
4
1,0734
0,0167
Średnia
1,0834
0,0109
(1,01%)
2
Zależność Swain’a-Schaad’a
α=
k 
kH
=  H
kT
 kD 
Gdzie:
1, 44
α=
 kD 
 
 kT 
3, 26
k 
k 
=  H ⟨  H
 k T  obl  k T  obs
kH/kT - KIE dla 1H/3H.
kH/kD - KIE dla 1H/2H.
kD/kT - KIE dla 2H/3H.
Jeśli efekt 1H/3H, obliczony z efektów 1H/2H lub 2H/3H przy pomocy
wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy
prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu.
Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do
czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu
decyduje o szybkości reakcji.