Oporność bakterii

LEKOOPORNOŚĆ
molekularne mechanizmy
Wszystko jest trucizną, decyduje tylko dawka.
Phillippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim (Paracelsus)
Oporność bakterii
Oporność bakterii na antybiotyki
Oporność – zdolność drobnoustroju do przeciwstawienia
się antybiotykowi
Tolerancja na lek – bakteria nie ginie lecz trwa nie rosnąc
nie dzieli się (bakteriostaza)
wiąże się ze stanem fizjologicznym bakterii (np.
głodzenie spowalnia wzrost – większa tolerancja)
oraz miejscem infekcji (trudno dostępne tkanki jak
kość czy zastawki sercowe – bakterie rosną wolno i
tolerują β-laktamy)
Oporność bakterii
Oporność wrodzona – stała cecha gatunku, szczepu lub
grupy bakterii (np. penicylina działa na Gram +, a nie działa na
Gram -)
Oporność nabyta – początkowo wrażliwe bakterie nabywają
oporność na skutek mutacji lub nabycia genu/genów oporności
od innych bakterii; zmiana ta staje się dziedziczna
Oporność krzyżowa – rozwój jednej oporności pociąga za
sobą oporność na leki tej samej grupy
Oporność równoległa – rozwój jednej oporności pociąga za
sobą oporność na leki o podobnym schemacie działania
Oporność bakterii
EFEKTY działania chemioterapii
EFEKT TERAPII
100%
0%
Wyleczenie
Efekt paradoksalny – niskie stężenie antybiotyku zabija całą
populację a w wysokich stężeniach bakterie stają się oporne
(np. stosowanie cefalosporyn na Proteus vulgaris)
Przetrwanie części populacji bakteryjnej mimo stosowania
antybiotyku (bakterie wytwarzające glikokaliks, który utrudnia
penetrację leku oraz fakt, że bakterie na powierzchni chronię
te rezydujące głębiej)
Zależność bakterii od antybiotyku – powstaje na skutek
mutacji, np. szczepy prątków gruźlicy mające mutacje genów
kodujących białka rybosomowe S8 i S12 (antybiotyk staje się
konieczny dla składania rybosomu lub przebiegu translacji)
Oporność bakterii
Podatność bakterii na chemioterapię
test dyfuzji krążkowej
Oporność bakterii
Podatność bakterii na chemioterapię
test E
MIC
MIC - najmniejsze stężenie hamujące wzrost
Oporność bakterii
Podatność bakterii na chemioterapię
test rozcieńczeń
MIC
Oporność bakterii
Podatność bakterii na chemioterapię
metody molekularne
PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy (czy
jest obecny gen warunkujący oporność ?)
SSCP – analiza polimorfizmu konformacji
jednoniciowego DNA (mutacja w znanym
genie ?)
Oporność bakterii
Wskaźnikiem stopnia oporności jest wzrost wartości MIC
(np. MIC dla szczepów dwoinki zapalenia płuc: szczep
niewrażliwy wymaga ponad 2,5 tys. razy większego
stężenia penicyliny benzylowej od szczepu wrażliwego)
Oporność bakterii
Oporność w testach a oporność in vivo
 hemoglobina wiąże tetracykliny i penicylinę
 niskie pH w pewnych płynach ustrojowych i moczu
zmniejsza aktywność aminoglikozydów, erytromycyny,
klindamycyny a zwiększa chlorotetracykliny
 patogeny ulegające internalizacji (Salmonella,
Mycobacterium, Chlamydia) – siła działania leku zależy
od jego zdolności do wnikania do komórek
eukariotycznych (β-laktamy i aminoglikozydy wnikają
słabo, a makrolidy i azalidy – dobrze)
Oporność bakterii
Oporność może być przekazywana pomiędzy bakteriami
transfer pionowy – na skutek podziałów w obrębie
bakterii jednego gatunku
transfer horyzontalny – pomiędzy bakteriami różnych
rodzajów
odpowiedzialne są za to plazmidy R (resistance)
na drodze: koniugacji, transdukcji (przez fagi) oraz
transformacji (pobieranie DNA z otoczenia)
Oporność bakterii
Geny oporności mogą być zlokalizowane w:
1. chromosomach
2. plazmidach
3. transpozonach
4. integronach
Oporność bakterii
Oporność chromosomowa
powstaje na skutek mutacji spontanicznych albo
indukowanych mutagenami (UV, promienie X, azotyny)
istotna dla transferu pionowego
Przykłady:
E. coli – na chromosomie wykryto geny: eryC (oporność
na erytromycynę), linB (na linkomycynę)
Gronkowiec złocisty – gen bla (na penicylinę)
Oporność bakterii
Oporność plazmidowa
 najbardziej istotna z punktu widzenia medycyny
 plazmid niekoniugacyjny może zostać ‘przemycony’
razem z koniugacyjnym lub ulec z nim rekombinacji
 pewne plazmidy nie mogą współistnieć w jednej
komórce i na tej podstawie zalicza się je do tzw. grup
niezgodności (transfer horyzontalny)
 wiele kopii jednego plazmidu w jednej komórce może
determinować stopień oporności na dany antybiotyk
Oporność bakterii
Oporność warunkowana przez transpozony – mobilne
fragmenty DNA
transpozaza
oporność - Amp
transpozaza
oporność - Tet
 zdolności mutagenne (integracja do chromosomu lub
plazmidu)
 ważne źródło zmienności i nabywania oporności w tym
oporności wielolekowej
Oporność bakterii
Integrony– mobilne fragmenty DNA
 podobnie jak transpozony są mobilne
 stanowią naturalne systemy klonowania i ekspresji
kaset genowych
 występują w chromosomach, plazmidach i
transpozonach
 super-integrony i integrony oporności wielorakiej –
zawierają kilka kaset
Oporność bakterii
Kasety genowe występujące najczęściej:
kaseta
oporność
aktywność (enzym)
blaP1, P2, P3
oxa1, oxa2 itd.
β-laktamy
β-laktamaza
aadA 1a, 1b
aadA2
aadB
aacA1
aacA4
aacC
aminoglikozydy
adenylotransferaza
aminoglikozydowa
catB2, B3, B5
clmA
chloramfenikol
acetylotransferaza
chloramfenikolowa
dfrA1, A5, A7....
dfrB1, B2, B3
trimetoprim
redukataza
dihydrofolianowa
sat
streptotrycyna
acetylotransferaza
streptotrycynowa
acetylotransferaza
aminoglikozydowa
β-laktamaza (penicylinaza) – rozkłada wiązania β-laktamowe penicylin
acetylotransferaza aminoglikozydowa (AAC) – modyfikacja grupy aminowej
adenylotransferaza aminoglikozydowa (ANT) – modyfikacja grupy hydroksylowej
fosfotransferaza aminoglikozydowa (APH) – modyfikacja grupy hydroksylowej
Oporność bakterii
PODSTAWOWE MECHANIZMY OPORNOŚCI:
1.
modyfikacja miejsca działania (uchwytu), np. zmiana w białkach rybosomalnych,
prekursorach mureiny, gyrazie)
2.
inaktywacja enzymatyczna leku, np. β-laktamaza w β-laktamowych, acetylo-,
adenylo- i fosfotransferazy w aminoglikozydach, esteraza w erytromycynie
3.
hamowanie transportu do komórki, np. zmiany w budowie błony, pogrubienie
mureiny
4.
wytwarzanie alternatywnego metabolizmu omijającego hamowany przez
antybiotyk proces
5.
zwiększenie stężenia enzymu hamowanego przez lek, np. reduktaza
dihydrofolianowa
6.
pompy aktywnie usuwające leki z komórki
7.
zmniejszenie aktywności enzymu przeprowadzającego aktywację leku
Oporność bakterii
MECHANIZMY OPORNOŚCI:
Antybiotyki działające na kwasy nukleinowe
Chinolony i fluorochinolony
 mutacje w genach kodujących topoizomerazę II (gyrazę) i IV – zmniejszenie
powinowactwa kompleksu Topo-DNA do tych leków
 pompy MDR (oporność wielolekowa)
 mutacje genu kodującego porynę OmpF – zmniejszenie wnikania
Pochodne kumarynowe (nowobiocyna, kumermycyna)
 substytucje lub mutacje genu gyrazy
 pompy - usuwanie
Ansamycyny (rifamycyny, streptowarycyny)
 mutacje genu podjednostki  polimerazy RNA (rpoB) – hamowanie wiązania
leku do polimerazy
Oporność bakterii
Antybiotyki hamujące syntezę białek
Aminoglikozydy i aminocyklitole
 enzymatyczna inaktywacja lub modyfikacja leku
 metylacja 16S rRNA (metylazy)
 mutacja genu 16S rRNA
 zmiana przepuszczalności osłon bakteryjnych
Tetracykliny



enzymatyczna inaktywacja antybiotyku – znany tylko 1 gen (rzadki)
aktywne usuwanie – pompy protonomotoryczne
ochrona rybosomu – przez białko inaktywujące Tet przed jego reakcją z
rybosomem
Makrolidy, linkozamidy i streptograminy
 metylacja 23S rRNA (metylazy)
 mutacje w białkach budujących jednostkę 50S rybosomu
 inaktywacja enzymatyczna - esterazy (rozszczepienie), transferazy,

fosoforylazy i hydrolazy (modyfikacja struktury)
aktywne usuwanie:
 transportery ABC (ATP-binding cassette) – zależne od hydrolizy ATP
 transportery MFS – napędzane siłą protonomotoryczną
Oporność bakterii
Oporności te mogą być razem przenoszone w jednym
plazmidzie: fosofotransferaza, metylaza i pompa ABC
Chloramfenikol
 oporność enzymatyczna (CAT – acetylotransferaza)
 mutacje modyfikujące podjednostkę 50S rybosomu
 pompa zależna od energii
Oporność bakterii
Inhibitory syntezy mureiny
Wankomycyna – synteza zmienionych prekursorów mureiny, które mają
mniejsze powinowactwo do wankomycyny
Antybiotyki β-laktamowe
 β-laktamazy – inaktywują antybiotyk przez hydrolizę pierścienia βlaktamowego, gen - w chromosomalnym (np. Ampr) lub plazmidowym (np.
Ap) DNA; 4 klasy molekularne: A, B, C, D na podstawie sekwencji genów,
kryteriów biochemicznych i genetycznych; najpowszechniejszy gen blaTEM-1
kodujący TEM-1; występują w przestrzeni periplazmatycznej (Gram-) i
uwalniane lub związane z powierzchnią komórki (Gram+)
 modyfikacje poryn błony zewn. – ich brak lub zmniejszenie światła kanału
 zmianę powinowactwa białek wiążących penicylinę (PBP) do penicyliny,
funkcja białka w syntezie mureiny pozostaje niezmieniona
Oporność bakterii
Antymetabolity – sulfonamidy i trimetoprim
Sulfonamidy



wytwarzanie zmodyfikowanego enzymu (celu działania leku) – syntazy
dihydropterynianowej (DHPS); oporny enzym – kodowany przez plazmidowe
DNA, a naturalny – wrażliwy – przez chromosomalne
nadprodukcja kwasu p-aminobenzoesowego (PABA) współzawodniczącego o
dostęp do centrum aktywnego DHPS
nadprodukcja DHPS
Trimetoprim
 nadprodukcja reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) na skutek mutacji
promotora genu chromosomalnego
 enzym DHFR o mniejszym powinowactwie do trimetoprimu
Oporność wirusów
Oporność wirusów
 wysoka częstość mutacji wirusowego genomu jest
związana z ‘omylnością’ wirusowej polimerazy (dla
HIV i grypy)
 wysoki wskaźnik proliferacji tych wirusów sprawia, że
nawet u nieleczonych osób liczba odmian wirusa jest
duża
 oporne szczepy ujawniają się w trakcie selekcji
Oporność wirusów
HIV
oporność na wszystkie chemioterapeutyki tj.
 analogi nukleozydów hamujące aktywność odwrotnej transkryptazy
 inhibitory odwrotnej transkryptazy (nienukleozydowe)
 inhibitory proteaz
Oporność wiąże się z mutacjami genów: transkryptazy i proteazy
Dla pojedynczo stosowanych leków jak zydowudyna, lamiwudyna
oporność rozwija się w przeciągu tygodni lub miesięcy
Obecnie stosuje się kilka substancji jednocześnie – większa
efektywność
wirusy Herpes
 oporność ogranicza się do pacjentów z obniżoną odpornością
 acyklowir i famcyklowir wymagają obecności kinazy tymidynowej wirusa do
swojej aktywacji (inhibicja polimerazy wirusa)
 większość opornych mutantów posiada zmienioną lub jest pozbawiona tej
kinazy
lekooporność nowotworów
Lekooporność a chemoterapia nowotworów
Szlaki molekularne powodujące rozwój oporności na leki:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
hamowanie przedostawania się leków do wnętrza komórki
zwiększenie usuwania leków z wnętrza komórki
aktywacja systemów detoksykacyjnych
zmiany białek, z którymi wiąże się lek
zaburzenia procesów, związanych ze zmianami struktury DNA
aktywacja procesów reperacji DNA
blokowanie apoptozy
lekooporność nowotworów
Aktywne usuwanie leków z komórki
rodzina białek transporterów ABC (ATP-binding cassette) –
białka błonowe z domeną wiążącą ATP; energia hydrolizy
ATP wykorzystywana do transportu; transportują wiele
substancji
posiadają funkcje fizjologiczną – oczyszczanie organizmu z
substancji toksycznych (nerki – podczas wytwarzania moczu,
także są w jelicie grubym, wątrobie i nadnerczach)
najczęściej występują:
mdr1 – koduje glikoproteinę P
mrp2, 3 i 6 – białka powiązane z opornością wielolekową –
ich obecność wiąże się z opornością na winblastynę,
winkrystynę, antracykliny, aktynomycynę-D i cisplatynę
lekooporność nowotworów
Detoksykacja leków
Dwufazowa:
I.
hydroksylacja przy udziale cytochromu P450
II.
przekształcenie hydroksylowanych związków do
polarnych przez sprzęganie z glutationem – koniugaty
glutationowe usuwane przez MRP
Istnieje pozytywna korelacja pomiędzy poziomem glutationu a
opornością na cisplatynę i doksorubicynę
lekooporność nowotworów
Modyfikacje topoizomerazy IIα
Topoizomeraza IIα tworzy kompleksy rozszczepialne które są
stabilizowane np. przez etopozyd i antracykliny
Komórki oporne obniżają poziom ekspresji topoizomerazy IIα
lekooporność nowotworów
Modyfikacje receptorów błonowych
nowotwory piersi i prostaty (zależne od hormonów płciowych)
leczone tamoksifenem i flutamidem mogą:



zwiększyć ilość receptorów błonowych
zmniejszyć próg aktywacji receptorów
na skutek mutacji ulegać aktywacji agonistamiinhibitorami (TAM i FLU)
1. „Bakterie antybiotyki lekooporność” Z.
Markiewicz, Z. Kwiatkowski PWN 2001
2. Molekularne mechanizmy chemooporności
w raku nerki J. Szenajch, A. Cieślak (2005)
Współczesna Onkologia 9: 123-8