M. Niepokojczycka pop

Rocznik Studenckiego Ruchu Naukowego Uniwersytetu Warszawskiego
tom 8, 2010; 103-113
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów
do badań zjawiska mikrochimeryzmu in vitro1
Monika Niepokojczycka, Łukasz Bugajski,
Michał Zarzycki, Anna Kowalik i Mariusz Kulińczak
Koło Naukowe Immunologii
Wydział Biologii
Mikrochimeryzm jest stanem, w którym w organizmie znajduje się niewielka pula komórek odmiennych genetycznie. MoŜe on powstawać naturalnie podczas ciąŜy lub
sztucznie po transplantacji lub transfuzji krwi. Mechanizmy powstawania mikrochimeryzmu, a takŜe jego skutki dla organizmu nadal nie są całkowicie poznane. Wydaje się,
Ŝe zjawisko to moŜe przyczynić się do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych lub teŜ
prowadzi do wytworzenia tolerancji na przeszczepiony narząd. Doświadczenie przeprowadzone przez studentów z Koła Naukowego Immunologii miało na celu wybranie
szczepów myszy oraz ustalenie optymalnych warunków mieszanej hodowli limfocytów,
aby opracować model przydatny do badania zjawiska mikrochimeryzmu in vitro. W tym
celu załoŜono hodowle in vitro limfocytów węzłów chłonnych pochodzących od trzech
szczepów myszy, w dwóch wariantach proporcji ilościowych. Po 4 i 5 dniowej inkubacji określono odsetek limfocytów proliferujących i apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego.
Wstęp
W biologii terminem chimeryzm określa się stan, w którym organizm
składa się z komórek róŜniących się genetycznie. Pojęcie to wywodzi się
z greckiej mitologii, w której chimerą nazwane było stworzenie z głową lwa,
ciałem kozy i ogonem węŜa. U zwierząt naturalne występowanie chimeryzmu
jest wynikiem połączenia się lub wymieszania komórek dwóch zarodków we
wczesnym rozwoju embrionalnym.
1
Badania dofinansowane przez Radę Konsultacyjną ds. Studenckiego Ruchu Naukowego, projekt
o sygnaturze 25/IV/08 pt. „Mikrochimeryzm – badania w hodowlach leukocytów in vitro”
104
Monika Niepokojczycka i in.
O mikrochimeryzmie mówi się, gdy w organizmie znajduje się niewielka
pula komórek obcych genetycznie. Stan ten moŜe powstać w sposób naturalny
podczas ciąŜy, kiedy komórki płodu migrują do organizmu matki i odwrotnie.
Badania nad kobietami posiadającymi dorosłe dzieci wykazały, Ŝe nawet 6070% matek ma w swoim ciele komórki płodu przez dłuŜej niŜ 50 lat od wydania
dziecka na świat oraz podobny odsetek dzieci posiada komórki pochodzące od
matki. Jest kilka hipotez dotyczących długotrwałych konsekwencji obecności
komórek płodu w organizmie matki: 1) komórki płodu nie odgrywają Ŝadnej
roli, 2) aktywność komórek płodu kieruje się przeciwko organizmowi matki,
3) obecność komórek płodu jest pomocna, gdyŜ mogą one brać udział w naprawie zniszczonych tkanek matki. Wykazano, Ŝe komórki płodu mają zdolność do
zasiedlania uszkodzonych organów matki, jednakŜe wpływ obecności komórek
płodu nie został do tej pory jednoznacznie wyjaśniony (Fast, 2006).
Mikrochimeryzm moŜe powstać takŜe po transplantacji lub transfuzji krwi.
Mikrochimeryzm po przeszczepie został po raz pierwszy opisany w 1969 roku
u pacjentów, którzy otrzymali wątrobę od dawcy przeciwnej płci. Hepatocyty
i komórki wyściełające naczynia krwionośne posiadały materiał genetyczny
dawcy, natomiast makrofagi pochodziły od biorcy narządu. Wykazano, Ŝe
w przeszczepionym narządzie znajdowały się komórki hematopoetyczne, które
następnie zasiedliły organizm biorcy. Kolejne badania, tym razem na szczurach
wykazały, Ŝe komórki pochodzące z wątroby dawcy zasiedlają zarówno narządy
limfoidalne jak i nielimfoidalne biorcy. Przypuszczano, Ŝe zjawisko to moŜe
leŜeć u podstaw tworzenia i utrzymywania tolerancji na przeszczepioną wątrobę, jak i inne przeszczepione narządy pochodzące od tego samego dawcy. Sądzono, Ŝe wątroba jest pod tym względem wyjątkowym narządem, aŜ do 1991
roku kiedy komórki układu odpornościowego dawcy wykryto w narządach limfoidalnych po przeszczepie jelita (u człowieka, szczura i świni). Pomimo występującego mikrochimeryzmu nie zaobserwowano objawów choroby – przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. graft versus host disease – GVHD). Obserwowany stan moŜna wytłumaczyć faktem, Ŝe współistnienie obok siebie
populacji komórek biorcy i dawcy, powoduje w kaŜdej z tych populacji klonalną ekspansję (proliferację) limfocytów zdolnych do niszczenia drugiej populacji
i równocześnie klonalną delecję (apoptoza) komórek drugiej populacji, co zapewnia stan dynamicznej równowagi pomiędzy odpowiedzią typu GVHD oraz
odrzuceniem przeszczepu (Starzl i in., 1992). Jak dotąd nie ustalono czy mikrochimeryzm jest niezbędny do osiągnięcia stanu tolerancji, czy jest jedynie
wskaźnikiem wykształcenia się stanu tolerancji na przeszczep (Fast, 2006).
Mikrochimeryzm jest przedmiotem zainteresowania wielu badaczy jako:
1) moŜliwa przyczyna chorób autoimmunizacyjnych 2) sposób na indukcję
tolerancji immunologicznej 3) wskaźnik ryzyka rozwinięcia się GVHD
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów…
105
4) sposób na poprawę stanu pacjenta lub wyleczenie chorób genetycznych lub
nabytych 5) sposób diagnozowania zaburzeń genetycznych płodu 6) metoda
monitorowania potencjalnie nadchodzącego odrzucenia przeszczepu (Utter
i in., 2007). Niektórzy badacze uwaŜają, Ŝe poziom zgodności MHC (ang. Major Histocompatibility Complex, geny głównego układu zgodności tkankowej)
ma związek z powstaniem i utrzymaniem się mikrochimeryzmu oraz jest decydującym czynnikiem ryzyka w powstaniu chorób autoimmunizacyjnych (Nikbin
i in., 2007).
Ludzkie antygeny MHC, znane pod nazwą HLA (ang. Human Leukocyte
Antigen), są glikoproteinami obecnymi na powierzchni błony komórkowej
i charakteryzują się bardzo wysokim polimorfizmem w populacji ludzkiej
(Tiercy i in., 2002). Ten wysoki polimorfizm czyni kaŜdy organizm (z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych) unikalnym pod względem MHC i umoŜliwia rozpoznawanie swoich komórek od obcych, co z kolei umoŜliwia walkę z patogenami (Caballero i in., 2006). Cząsteczki MHC biorą udział w prezentacji peptydów pochodzących z degradacji białek patogenów 1/ limfocytom T cytotoksycznym o fenotypie CD8+ 2/ limfocytom T pomocniczym o fenotypie CD4+.
Kompleksy MHC-peptyd są rozpoznawane przez róŜnorodne TCR (ang. T Cell
Receptor). TCR moŜe takŜe rozpoznać allogeniczne MHC jako cząsteczkę obcą. Szacuje się Ŝe 1-10% limfocytów w krwi obwodowej człowieka jest w stanie rozpoznać podany allo-HLA, co jest znaczącą barierą w przeszczepach narządów oraz szpiku kostnego (Tiercy i in., 2002). Po przeszczepie narządu,
MHC obecne na komórkach dawcy są rozpoznawane jako obce przez komórki
układu odpornościowego biorcy, co wywołuje reakcję allogeniczną i powoduje
odrzucenie przeszczepu, jeśli nie zostanie wytworzona immunosupresja (Caballero i in., 2006). W przypadku przeszczepu szpiku kostnego nowo powstałe
komórki układu odpornościowego mogą rozpoznać HLA biorcy jako obce
i wtedy rozwija się GVHD (Tiercy i in., 2002).
Przebieg doświadczenia
Celem doświadczenia przeprowadzonego przez studentów było znalezienie
optymalnych warunków hodowli limfocytów wyizolowanych z węzłów chłonnych myszy róŜniących się w zakresie MHC, tak aby zaobserwować powstanie
stanu mikrochimeryzmu in vitro.
Do doświadczenia wybrano trzy szczepy myszy róŜniące się pod względem MHC: C3H, CBA oraz F1 pochodzący ze skrzyŜowania szczepu CBA
z C57BL/6, a więc częściowo zgodny pod względem MHC z szczepem CBA.
Zakładano hodowle komórek pochodzących z dwóch szczepów, tak aby proporcje pomiędzy limfocytami kaŜdego ze szczepów myszy wynosiły odpowiednio:
1:1 i 1:9. Limfocyty pochodzące z jednego ze szczepów znajdującego się
106
Monika Niepokojczycka i in.
w mniejszości w hodowli (oznaczonego na wykresach ryc. 1-6 literą „z”) wyznakowano uprzednio CFSE (ang. 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate
N-succinimidyl ester, Sigma). Związek ten po wniknięciu do Ŝywej komórki
powoduje emisję zielonej fluorescencji, a podczas podziałów komórki intensywność fluorescencji zmniejsza się – barwnik jest dzielony między dwie potomne komórki. Zastosowano następujące warunki hodowli: 1) hodowle kontrolne w podłoŜu hodowlanym bez stymulatorów – RPMI 1640 z glutamax-I (Gibco), uzupełnione HEPES (Invitrogen), FBS (Gibco), 2-merkaptoetanol i penicyliną/streptomycyną (Invitrogen) – umoŜliwiające pomiar spontanicznej proliferacji; 2) hodowle umoŜliwiające długotrwałe przeŜycie limfocytów T in vitro,
w podłoŜu hodowlanym z dodatkiem IL-2 (interleukina 2, 20 U/ml, PeproTech).
IL-2 zapobiega apoptozie limfocytów, równocześnie w zastosowanym stęŜeniu,
nie powoduje ich proliferacji; 3) hodowle w podłoŜu z dodatkiem IL-2
(20 U/ml) oraz przeciwciał anty-CD3 (1 µg/ml, BD Pharmingen). Takie warunki hodowli limfocytów imitują warunki aktywacji antygenowej przez receptor
TCR i umoŜliwiają określenie maksymalnej zdolności do proliferacji obu populacji hodowanych limfocytów. Po 4 i 5 dniach hodowli część komórek wyznakowano aneksyną V (BD Pharmingen), aby określić odsetek komórek apoptotycznych. Kinetykę proliferacji i apoptozy komórek mierzono za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences), do analizy wyników
uŜyto programu CellQuest. Na wykresach przedstawione są średnie wyniki dla
poszczególnych pomiarów wraz z odchyleniem standardowym. Doświadczenia
przeprowadzono zgodnie z zezwoleniem LKE nr 844/2008.
Wyniki
Obserwowano intensywność reakcji allogenicznej zachodzącej pomiędzy
limfocytami pozyskanymi z róŜniących się pod względem MHC szczepów myszy, jej miarą jest zarówno proliferacja jak i apoptoza (ryc. 1-6).
Wnioski
1. Wśród wybranych do badań szczepów myszy najsłabszą odpowiedź allogeniczną obserwowano w hodowlach komórek szczepów myszy CBA i F1
oraz CBA i C3H, reakcja była niezaleŜna od proporcji ilościowej pomiędzy
komórkami pochodzącymi z obu szczepów myszy.
2. Hodowle limfocytów pozyskanych z myszy CBA i F1 oraz CBA i C3H
z dodatkiem IL-2 (20 U/ml) mogą zostać uŜyte w przyszłości do badań nad
zjawiskiem mikrochimeryzmu in vitro.
3. Po upływie 4 dni hodowle limfocytów pozyskanych z myszy CBA i F1
oraz CBA i C3H i stymulowanych IL-2 naleŜy przenosić do nowego
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów…
107
podłoŜa równocześnie zwiększając objętość hodowli, tak aby utrzymać optymalną gęstość komórek.
A
80
70
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
% komórek proliferujących
60
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn F1z+F1n
B
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
90
80
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
% komórek proliferujących
70
60
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn F1z+F1n
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
Ryc. 1. Proliferacja limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych
CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami
obu szczepów 1:1; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
108
Monika Niepokojczycka i in.
A
20
18
16
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
% komórek proliferujących
14
12
10
8
6
4
2
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn F1z+F1n
B
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
35
30
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
% komórek proliferujących
25
20
15
10
5
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn F1z+F1n
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
Ryc. 2. Proliferacja limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych
CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami
obu szczepów 1:9; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów…
A 50
% komórek apoptotycznych znakowanych CFSE
45
109
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
40
35
30
25
20
15
10
5
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
% komórek apoptotycznych znakowanych CFSE
B 70
60
F1z+F1n
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
F1z+F1n
F1z+CBAn
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
Ryc. 3. Apoptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych
CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami
obu szczepów 1:1; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
110
Monika Niepokojczycka i in.
% komórek apoptotycznych znakowanych CFSE
A 70
60
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
F1z+F1n
F1z+CBAn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
% komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE
B 70
60
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
F1z+F1n
F1z+CBAn F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
Ryc. 4. Apoptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych nieznakowanych
CFSE (n) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami
obu szczepów 1:1; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów…
A
10
% komórek apoptotycznych znakowanych CFSE
9
111
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
% komórek apoptotycznych znakowanych CFSE
B
F1z+F1n
F1z+CBAn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
F1z+F1n
F1z+CBAn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
30
25
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
20
15
10
5
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
Ryc. 5. Apoptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych znakowanych
CFSE (z) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami
obu szczepów 1:9; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
112
Monika Niepokojczycka i in.
A 90
% komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE
80
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
70
60
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
% komórek apoptotycznych nieznakowanych CFSE
B 80
70
F1z+F1n
F1z+CBAn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
F1z+F1n
F1z+CBAn
F1z+C3Hn C3Hz+C3Hn C3Hz+CBAn C3Hz+F1n
niestymulowane
stymulowane IL-2
stymulowane IL-2 i αCD3
60
50
40
30
20
10
0
CBAz+CBAn CBAz+F1n CBAz+C3Hn
Ryc. 6. Apoptoza limfocytów obwodowych węzłów chłonnych nieznakowanych CFSE
(n) w mieszanej hodowli limfocytów, proporcja pomiędzy komórkami obu
szczepów 1:9; A – 4 dni hodowli; B – 5 dni hodowli
Opracowanie warunków mieszanej hodowli limfocytów…
113
Podziękowania
Autorzy serdecznie dziękują dr Ewie Kozłowskiej za pomoc w przygotowaniu i przeprowadzeniu doświadczeń oraz opracowaniu artykułu.
Literatura:
CABALLERO A., FERNANDEZ N., LAVADO R., BRAVO M. J., MIRANDA J. M., ALONSO A.
2006. Tolerogenic response: allorecognition pathways. Transplant Immunology,
17 (1). 3-6.
FAST L. D. 2006. Microchimerism: a lasting legacy of transfusion? Transfusion, 46 (11).
1856-1858.
NIKBIN B., TALEBIAN F., MOHYEDDIN M. 2007. Chimerism: a new look. Urology
Journal, 4 (1). 1-9.
STARZL T.E., DEMETRIS A. J., MURASE N., ILDSTAD S., RICORDI C., TRUCCO M. 1992.
Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet, 27; 339 (8809). 15791582.
TIERCY J. M., inni 2002, Molecular basis of HLA polymorphism: implications in clinical
transplantation. Transplant Immunology, 9 (2-4). 173-180.
UTTER G. H., REED W. F., LEE T.H., BUSCH M. P. 2007. Transfusion-associated
microchimerism. Vox Sanguinis, 93 (3). 188-195.
Summary
Microchimerism is a state when a small population of non-self cells is present in the
body of an individual. This phenomenon could occur naturally during pregnancy or
artificially after transplantation and blood transfusion. The origin and effects of the
microchimerism are still unknown. Some researchers consider that it could take part in
development of autoimmunity, while others think it may be crucial for tolerance after
organ transplantation. Experiments performed by Students' Society for Immunology
were focused on assessing optimal conditions of culture of 3 different mouse strains to
develop an in vitro model of microchimerism phenomenon. In experiments three mouse
strains, three culture conditions and two cell to cell ratios were used. After incubation
percentage of proliferating and apoptotic cells were measured using flow cytometry.