wniosek: 293558

Cel prowadzonych badań
Nowotwory tarczycy stanowią najczęstszą grupę nowotworów gruczołów endokrynnych a ich liczba w Polsce stale wzrasta.
Podobne tendencje obserwuje się we wszystkich rozwiniętych krajach świata. Największa grupa nowotworów tarczycy rozwija się
ze specyficznych dla tego narządu komórek pęcherzykowych. Dzielimy je na raki wysokozróżnicowane, a wśród nich
brodawkowaty i pęcherzykowy, oraz niskozróżnicowane i raka anaplastycznego. Podstawą leczenia zróżnicowanych raków
tarczycy, w tym raka brodawkowatego (PTC), stanowiącego 85% ogółu przypadków raka tarczycy, jest chirurgiczne usunięcie
tarczycy wraz z węzłami chłonnymi oraz terapia uzupełniająca polegająca na podaniu promieniotwórczego jodu I131. Jod jest
wychwytywany przez tkankę tarczycową, która wykorzystuje go do syntezy hormonów, a także przez zróżnicowane nowotwory z
niej pochodzące. O ile u większości pacjentów z rakiem tarczycy prognoza jest dobra i nowotwór ten uważany jest za niezwykle
łagodny, u części z nich obserwuje się pierwotną lub wtórną oporność na terapię jodem radioaktywnym. Wobec ograniczonej
skuteczności innych form leczenia, takich jak teleradioterapia, chemieterapia czy próby stosowania kinaz tyrozynowych, chorzy ci
umierają z powodu zaawansowania miejscowego choroby lub przerzutów odległych. Stąd też konieczne jest poszukiwanie
nowych terapii.
Produkt białkowy genu SLC5A8 pełni w tarczycy podwójnie istotną rolę. Został pierwotnie zidentyfikowany jako transporter
jodkowy obecny w błonie szczytowej, czyli sąsiadującej ze światłem pęcherzyka, komórek tarczycy. Z tego powodu został
nazwany AIT (ang. Apical Iodide Transporter). Jak już wspomniano, komórki tarczycy mają zdolność wychwytywania jodu,
który następnie jest wbudowywany w hormony produkowane w gruczole tarczowym – tyroksynę i trijodotyroninę. Transport jodu
przez błonę szczytową jest złożonym i nie do końca zbadanym procesem, w który najprawdopodobniej zaangażowanych jest
wiele białek, a jego utrzymanie jest niezbędne dla prawidłowej syntezy hormonów tarczycy. Ponadto AIT jest supresorem
nowotworzenia, czyli genem, którego produkt czuwa nad prawidłowymi podziałami komórki, a jego ekspresja jest obniżona nie
tylko w nowotworach tarczycy, ale także wielu innych, np. raku jelita grubego, żołądka, trzustki, płuca, prostaty, glejakach. Jego
wyciszenie jest na tyle wczesnym i charakterystycznym zdarzeniem w kancerogenezie, że określanie jego metylacji –
powszechnie występującego sposobu wyciszania poszczególnych genów – zostało nawet zaproponowane jako składowa panelu
diagnostycznego PTC. Poza tym jednak jego rola w tarczycy pozostaje stosunkowo niejasna, co implikuje potrzebę dalszych
badań.
Najwięcej prac dotyczących jego funkcji supresorowej SLC5A8 odnosi się do jelita grubego i koncentruje na zdolności białka do
transportu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, w tym będących inhibitorami deacetylazy histonów 1 i 3 (HDAC1 i 3).
Enzymy te, przez odłączanie reszt acetylowych od histonów, czyli białek stanowiących „rusztowanie” dla DNA, utrudniają odczyt
informacji z pewnej puli genów. Tym samym takie zmiany acetylacji histonów w sposób bezpośredni skutkują obniżeniem
ekspresji licznych białek.
Pomimo że SLC5A8 wydaje się pełnić niezwykle istotną rolę w zachowaniu prawidłowej fizjologii komórki, zwłaszcza
tarczycowej – zarówno poprzez swoją rolę supresorową, jak i transport krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i jodu – tylko
kilka badań marginalnie wspomina o roli AIT w regulacji ekspresji innych genów zaangażowanych w proces nowotworzenia,
m.in TP53. Biorą one udział w regulacji namnażania oraz eliminacji komórek, a właśnie zaburzenie równowagi tych procesów
uważa się za przyczynę powstawania nowotworów. O istotnej roli SLC5A8 świadczy też fakt, że wymuszenie jego ekspresji w
liniach komórkowych wyprowadzonych z raka jelita grubego hamuje ich proliferację. Zaskakujące jest zatem, że nikt nie
przeprowadził analizy zmian wywoływanych przez nadekspresję SLC5A8 na poziomie całego transkryptomu. Taka analiza
umożliwi identyfikację wszystkich szlaków, które są w komórce regulowane przez AIT.
Opis zastosowanej metodyki
Otrzymane wyniki wstępne, stanowiące podstawę badania
Dotychczasowe badania wykazały, że obniżona ekspresja SLC5A8 w raku tarczycy jest bez wątpienia wynikiem zadziałania
wielu czynników. Skierowało to naszą uwagę na rolę mikroRNA w regulacji ekspresji tego genu. MikroRNA (miRNA, miR)
stanowią około 22 nukleotydowe niekodujące cząsteczki RNA, które hamują ekspresję genów poprzez wiązanie ze specyficzną
sekwencją w ich transkryptach. Nasze badania na materiale tkankowym uzyskanym od pacjentów operowanych z powodu PTC
potwierdziły, że spadkowi ekspresji genu towarzyszy wzrost ekspresji niektórych mikroRNA. W wykonanych przez nas
badaniach potwierdziliśmy wiązanie miR-181a-5p, miR-182-5p oraz miR-494-3p z 3’UTR SLC5A8. miR-181a-5p i -182-5p
ulegają ponadto znacznej nadekspresji w raku tarczycy. Również ekspresja miR-494-3p jest podwyższona. Wszystkie 3
mikroRNA zmniejszają ekspresję SLC5A8 na poziomie mRNA, a miR-182 obniża także zdolność transportu jodu. Zmiany w
ekspresji mikroRNA można modulować poprzez specyficzne inhibitory, dlatego też potwierdziliśmy, że wprowadzenie do
komórek syntetycznego inhibitora miR-181a-5p zwiększa poziom mRNA SLC5A8.
W odróżnieniu od zmian genetycznych, zmiany związane z mikroRNA są odwracalne. Ponieważ pojedyncze mikroRNA mogą
regulować wiele genów docelowych, spodziewamy się, że efekty ich wyciszenia będą odbiegały od tych spowodowanych
nadekspresją genu SLC5A8. Przegląd piśmiennictwa ujawnia, że powyższe mikroRNA ulegają nadekspresji także w innych
nowotworach, wyciszając specyficzne dla nich szlaki. Możemy zatem, przez analogię do onkogenów, nazywać je onkomiRami.
Tym bardziej interesujące i uzasadnione wydaje się zbadanie wpływu inhibicji miR-181a-5p, -182-5p i -494-3p na zmiany
zachodzące na poziomie całego transkryptomu.
Opis planowanych badań
Kolejnym krokiem będzie porównanie zmian w ekspresji genów wywołanych nadekspresją SLC5A8 oraz inhibicją mikroRNA.
Podczas realizacji projektu stworzymy plazmid wyrażający gen SLC5A8 (czyli sklonujemy go) oraz stworzymy specyficzny
konstrukt do wyciszenia funkcji wszystkich trzech badanych mikroRNA. Taki konstrukt nazywa się „sponge-miR”, ponieważ
jego działanie polega na „wysysaniu” z komórki cząsteczek, na które jest skierowany. Tym samym ich poziom ulega znaczącemu
obniżeniu.
Otrzymany w ten sposób materiał poddamy analizie sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Jest to bardzo nowoczesna
metoda, umożliwiająca całościową analizę ekspresji wszystkich genów w komórce. W ten sposób otrzymamy listy genów o
ekspresji zmienionej pod wpływem nadekspresji SLC5A8 oraz (osobno) wyciszenia mikroRNA. Następnie porównamy ze sobą te
listy, celem określenia zmian wywołanych nadekspresją genu, zmian wywołanych przez wyciszenie wybranych mikroRNA, a w
konsekwencji – określimy potencjalną użyteczności inhibitorów mikroRNA w przywracaniu ekspresji SLC5A8 w raku
brodawkowatym tarczycy.
Nie tylko dostarczy to listy genów regulowanych przez SLC5A8 i mikroRNA, ale także przybliży nas do odpowiedzi na pytanie,
czy tkankowospecyficzna inhibicja badanych mikroRNA mogłaby w przyszłości znaleźć zastosowanie terapeutyczne.
Podsumowując, cele niniejszego projektu to:
określenie puli genów, których ekspresja w komórkach tarczycy jest zależna od SLC5A8,
równoczesne wyciszenie mikroRNA miR-181a-5p, -182-5p i -494-3p w celu podniesienia ekspresji SLC5A8,
zbadanie dokładnego wpływu wyciszenia mikroRNA na cały transkryptom, czyli na ekspresję wszystkich genów w
komórce.
Uzasadnienie podjęcia badań
Będzie to pierwszy projekt w ramach którego zostanie scharakteryzowany wpływ SLC5A8 na ekspresję innych genów na
poziomie całego transkryptomu.
Gen ten jest dla nas szczególnie interesujący, gdyż po pierwsze jako transporter jodu odgrywa rolę w produkcji hormonów przez
tarczycę i terapii jodem radioaktywnym, a po drugie – spadek jego ekspresji jest typowy dla wielu nowotworów. W przypadku
PTC jest nawet uważany za wczesne wydarzenie i z tego powodu jego oznaczenie zostało zaproponowane jako składowa panelu
diagnostycznego. Wobec powyższego, wywołując jego nadekspresję spodziewamy się wykazać jego szerokie działanie, w tym na
liczne geny zaangażowane w procesy rozmnażania komórek (proliferacji) i ich planowej śmierci (apoptozy).
Określimy także możliwości przywrócenia ekspresji SLC5A8 za pomocą inhibitorów mikroRNA. Co istotne, dzięki zastosowaniu
techniki NGS wskażemy użyteczne z terapeutycznego punktu widzenia inne geny docelowe dla tych mikroRNA. Każde ze
wskazanych przez nas mikroRNA, prócz SLC5A8, reguluje też wiele innych genów, a ich ekspresja jest zwiększona również w
innych nowotworach. Tylko dane pochodzące z NGS są w stanie dostarczyć nam informacji o wpływie ich wyciszenia na cały
transkryptom. Nie są nam znane próby badania całych transkryptomów po wyciszeniu kilku mikroRNA, co dodatkowo wpływa na
nowatorstwo niniejszego projektu.
Na koniec porównamy zmiany wywołane nadekspresją genu SLC5A8 z powodowanymi przez wyciszenie wybranych przez nas
mikroRNA, dzięki czemu określimy potencjalną użyteczność wyciszania wybranych mikroRNA u pacjentów cierpiących na raka
brodawkowatego tarczycy.