Eliza Pawlik-Pachucka „Wpływ modyfikacji epigenetycznych
advertisement
Eliza Pawlik-Pachucka „Wpływ modyfikacji epigenetycznych na zależne od wieku zmiany ekspresji genu THRB kodującego jądrowe receptory trijodotyroniny”. Starzenie jest naturalnym, wieloczynnikowo uwarunkowanym procesem rozpoczynającym się na poziomie molekularnym, którego skutkiem jest zmniejszenie zdolności do utrzymania homeostazy i związany z tym wzrost ryzyka zachorowania na tzw. choroby związane z wiekiem, na przykład choroby układu krążenia, cukrzycę 2 typu, nowotwory i choroby neurodegeneracyjne. Głównym mechanizmem molekularnym prowadzącym do starzenia, jest narastająca z wiekiem niestabilność genomu, do której dochodzi wskutek różnych przyczyn. Jedną z nich jest akumulacja fizyko-chemicznych uszkodzeń DNA, które powstają pod wpływem działania czynników środowiskowych oraz czynników endogennych – produktów ubocznych oddychania komórkowego oraz metabolizmu komórkowego, przede wszystkim reaktywnych form tlenu (ROS). Ponadto, środowisko modyfikuje tempo i przebieg procesu starzenia poprzez wpływ na epigenom – zespół niezmieniających sekwencji modyfikacji (metylacji genomowego DNA, modyfikacji kowalencyjnych białek histonowych i mikroRNA), które wpływają na stopień aktywności genów. Starzeniu towarzyszy tzw. dryft epigenetyczny – związana z wiekiem zmiana epigenomu. Jednym z głównych hormonów kontrolujących metabolizm komórkowy, a więc i produkcję ubocznych produktów łańcucha oddechowego, ROS, jest trijodotyronina (T3), która za pośrednictwem swoistych jądrowych receptorów (TR) reguluje ekspresję docelowych genów znajdujących się nie tylko w genomowym, ale i w mitochondrialnym DNA. T3 za pośrednictwem TR reguluje również, w mechanizmie pozagenomowym, liczne procesy biologiczne przebiegające w cytoplazmie komórki. Receptory dla T3 obecne są w każdej tkance ludzkiego organizmu, w tym również w komórkach jądrzastych krwi, gdzie za ich pośrednictwem T3 bierze udział w regulowaniu swoistej i nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. Prawidłowemu starzeniu towarzyszy niewielkie obniżenie funkcji tarczycy, przy czym stężenia hormonów tarczycy pozostają blisko dolnej granicy normy lub dochodzi do subklinicznej (bezobjawowej) niewydolności tarczycy. Niższa aktywność osi tarczycowej sprzyja długowieczności, co może mieć związek ze zmniejszeniem tempa metabolizmu, spowolnioną produkcją ROS i wolniejszą akumulacją uszkodzeń materiału genetycznego. Z wiekiem dochodzi do istotnych zmian w funkcjonowaniu układu odpornościowego (immunostarzenia). Możliwe jest, że jednym z czynników nasilających proces immunostarzenia jest zaburzenie metabolizmu oraz deregulacja immunologicznej funkcji komórek odpornościowych wskutek nieprawidłowej funkcji TR i T3. W niniejszej pracy zbadałam, jak z wiekiem zmienia się aktywność genu kodującego receptor trijodotyroniny β w komórkach jednojądrzastych krwi (PBMC) osób młodych oraz pomyślnie (zdrowo) się starzejących. Zaobserwowałam, iż zbadana metodą PCR czasu rzeczywistego ekspresja genu THRB na poziomie mRNA w tychże komórkach jest znamiennie niższa u osób w starszym wieku w porównaniu z osobami młodymi. Jednocześnie zaobserwowałam, iż osoby starsze miały niższe stężenia T3. Wyniki te sugerują, że zmniejszone stężenie T3 w połączeniu z obniżoną ekspresją THRB w PBMC mogą sprzyjać wolniejszej produkcji ROS i spowolnieniu akumulacji uszkodzeń materiału genetycznego. Z drugiej strony, zmiany te mogą pogłębiać skutki immunostarzenia, przyczyniając się m.in. do słabszej odpowiedzi limfocytów T na antygen, obniżeniu liczby i aktywności monocytów, zmniejszeniu liczby limfocytów NK oraz osłabieniu ich funkcji cytotoksycznej, wpływając także na wzrost wydzielania przez te komórki cytokin zapalnych. Ponadto, mogą sprzyjać nasileniu odpowiedzi immunologicznej ze strony limfocytów B przyczyniającej się do autoagresji. W pracy badałam również, czy zmiany ekspresji THRB mogą być, przynajmniej częściowo, skutkiem dryftu epigenetycznego. Wykorzystując dwie różne metody badawcze, sekwencjonowania DNA zmodyfikowanego wodorosiarczynem sodu i restrykcji enzymami wrażliwymi na metylację/PCR czasu rzeczywistego, uzyskałam wyniki wskazujące, że stopień metylacji wyspy CpG w promotorze tego genu znamiennie zwiększa się z wiekiem, a zjawisko to jest możliwe do zaobserwowania już u osób 60-70-letnich. Tak więc związany z wiekiem spadek ekspresji THRB w PBMC może częściowo być skutkiem zwiększonej metylacji jego promotora. Badałam ponadto, czy na obniżenie ekspresji THRB mają wpływ wybrane mikroRNA, wykazujące w analizie in silico największe prawdopodobieństwo interakcji z 3’UTR mRNA TRβ1 (głównej transkrypcyjnie czynnej izoformy receptora) i wskazywane wcześniej jako mogące brać udział w regulacji procesu starzenia. Badania funkcjonalne potwierdziły istnienie oddziaływań pomiędzy wytypowanymi mikroRNA i miejscami ich wiązania z tym mRNA. Jednocześnie stwierdziłam, że ekspresja żadnego z tych mikroRNA nie zwiększa się z wiekiem w PBMC co oznacza, że nie są one współodpowiedzialne za związany z wiekiem spadek ekspresji THRB w tych komórkach. Podsumowując, wykazałam, iż ekspresja genu THRB na poziomie mRNA w komórkach jednojądrzastych krwi osób pomyślnie się starzejących obniża się z wiekiem i jest to najprawdopodobniej częściowo związane z hipermetylacją promotora tego genu. Spadek ekspresji THRB może mieć wpływ na przebieg procesu starzenia komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, z jednej strony wpływając na zmniejszoną akumulację uszkodzeń materiału genetycznego i pozostałych molekuł na skutek zmniejszonej produkcji reaktywnych form tlenu, z drugiej strony zmienia funkcjonowanie układu immunologicznego przyczyniając się do pogorszenia jego funkcji nasilającej się z wiekiem.
