Starzenie jest naturalnym procesem biologicznym

Starzenie jest naturalnym procesem biologicznym, charakteryzującym się stopniowym
pogarszaniem funkcji fizjologicznych, co skutkuje wzrostem ryzyka zachorowania na „choroby
związane z wiekiem” i w ostateczności śmiercią. Obecnie przyjmuje się, że starzenie nie jest
zaprogramowane genetycznie, ale jako proces wieloczynnikowy, nie jest też całkowicie od czynników
genetycznych niezależne. Na tempo i przebieg starzenia człowieka, oprócz czynników genetycznych,
wpływają również czynniki środowiskowe oraz „przypadkowe”. Nieodłącznym elementem starzenia
jest dryft epigenetyczny. Modyfikacje epigenetyczne, czyli metylacja genomowego DNA, modyfikacje
białek histonowych oraz działanie krótkich niekodujących RNA (miRNA) wpływają na aktywność
genów bez zmiany ich sekwencji i pośredniczą pomiędzy środowiskiem i funkcją genomu. Subtelne,
akumulujące się z wiekiem zmiany epigenomu zwane są właśnie dryftem epigenetycznym.
Wśród genów i szlaków metabolicznych, których rola w regulacji tempa procesu starzenia jest
dość dobrze udokumentowana, najlepiej scharakteryzowano szlak insuliny i insulinopodobnego
czynnika wzrostu-1 (IGF-1). Szlak ten został zachowany w toku ewolucji. U człowieka jego
komponentami są m.in. receptor insuliny (IR) i receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF1R), które szlak ten zapoczątkowują oraz czynniki transkrypcyjne FOXO, znajdujące się na jego końcu.
W badaniach na organizmach modelowych stwierdzono, że zmniejszenie aktywności tego szlaku
prowadzi do wydłużenia życia m.in. drożdży, nicieni, muszki owocowej oraz myszy. Natomiast u
człowieka wykazano związek niektórych odmian polimorficznych genów kodujących komponenty
tego szlaku z długowiecznością. Szlak ten odgrywa również ważną rolę w utrzymaniu plastyczności
układu immunologicznego, zapewniając tym samym natychmiastowe i adekwatne reagowanie na
antygeny.
W oparciu o dane literaturowe stworzyłam hipotezę, że starzeniu może towarzyszyć zmiana
ekspresji genów IGF-1R, FOXO1 i FOXO3a w komórkach odpornościowych, za co częściowo może być
odpowiedzialny dryft epigenetyczny, a to może nasilać proces immunostarzenia.
Aby tę hipotezę zweryfikować, jako model badawczy w niniejszym projekcie zastosowano
komórki jednojądrzaste krwi człowieka (PBMC). Posługując się metodą półilościowego PCR czasu
rzeczywistego zbadałam ekspresję genów IGF-1R, FOXO1 i FOXO3a w PBMC osób z trzech grup
wiekowych: osób młodych (Y, N=59, przedział wiekowy 18-34 lata), starszych (E, N=52, 60-75 lat)
oraz osób długowiecznych (L, N=51, 90-102 lata). Otrzymane wyniki odnosiłam do ekspresji genu
referencyjnego ACTB. Wykazałam, że mediana ekspresji genów IGF-1R oraz FOXO1 na poziomie
mRNA była znamiennie niższa w grupach E i L w porównaniu do osób z grupy Y (IGF-1R: odpowiednio
p=0,000003
i
p<0,000001;
FOXO1:
odpowiednio
p=0,001
i
p<0,000001).
Jednocześnie
zaobserwowałam, że ekspresja genu FOXO3a była podobna we wszystkich grupach wiekowych.
Posługując się analizą bioinformatyczną (programy TargetScanHuman, PicTar i miRanda) oraz
danymi literaturowymi sugerującymi udział w regulacji funkcji układu odpornościowego lub/i w
procesie starzenia, poszukiwałam takich miRNA, które potencjalnie wiążą się z 3’UTR mRNA IGF-1R
lub FOXO1; na tym etapie ze względu na brak związanej z wiekiem zmiany ekspresji, z badań
wyłączyłam FOXO3a. Do dalszych doświadczeń wytypowałam miR-96, miR-99a, miR-145 i miR-182
dla 3’UTR mRNA IGF-1R oraz miR-9, miR-96, miR-132, miR-145 i miR-182 dla 3’UTR mRNA FOXO1. By
sprawdzić, czy wybrane in silico miRNA faktycznie wiążą się z rejonem 3’UTR mRNA IGF-1R lub
FOXO1, w hodowli komórek HEK 293 przeprowadziłam badania funkcjonalne tych miRNA, które nie
były badane wcześniej w odniesieniu do ww. mRNA. Przeprowadzone przeze mnie w systemie
lucyferazowym badania funkcjonalne potwierdziły, że wybrane in silico miR-96 i miR-182 faktycznie
oddziałują z 3’UTR mRNA IGF-1R, jak również miR-145 oraz miR-132 odziałują z 3’UTR mRNA FOXO1.
Następnie sprawdziłam, czy ekspresja wytypowanych miRNA zmienia się z wiekiem. Badanie
przeprowadziłam metodą półilościowego PCR czasu rzeczywistego. Analizowany materiał pochodził z
PBMC tych samych osób, u których zbadałam ekspresję IGF-1R i FOXO. Otrzymane wartości
odnosiłam do ekspresji genu referencyjnego U6 snRNA. Wykazałam obecność znamiennych różnic w
ekspresji miR-96, miR-99a oraz miR-145. Zaobserwowałam, że w porównaniu do osób z grupy Y
mediana ekspresji miR-96 była znamiennie wyższa u osób z grupy E i L (odpowiednio p=0,014 i
p=0,006), mediana ekspresji miR-145 była wyższa u osób z grupy L w porównaniu do osób z grupy E
(p=0,033), natomiast mediana ekspresji miR-99a była znamiennie niższa u osób z grupy E niż u osób
młodych grupy Y (p=0,024). Mediana ekspresji miR-9 również rosła z wiekiem, ale różnice nie
osiągnęły założonego progu znamienności statystycznej. W przypadku miR-132 i miR-182 nie
wykazałam zależnych od wieku zmian ich ekspresji w PBMC.
Podsumowując, wykazany przez mnie na poziomie mRNA spadek ekspresji IGF-1R w
komórkach jednojądrzastych krwi osób pomyślnie się starzejących może częściowo być skutkiem
wzrostu ekspresji miR-96 oraz miR-145, zaś spadek ekspresji FOXO1 w tych komórkach może być
częściowo skutkiem nadekspresji tych samych miRNA oraz, prawdopodobnie, miR-9. Jak wykazuje
dostępna literatura tematu, zaobserwowane przeze mnie towarzyszące starzeniu obniżenie ekspresji
tych genów oraz zmiany ekspresji miRNA najprawdopodobniej modulują tempo i przebiegstarzenia
komórek odpornościowych.