wyklad_13_analiza_transkryptomu 2016

GENOMIKA FUNKCJONALNA
Jak działają geny i genomy?
Poziom I:
Analizy transkryptomu
Adnotacja – (ang. annotation)
•pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji
nukleotydyowej genomu – analiza
bioinformatyczna (in silico)
•identyfikacja genów, sekwencji
regulatorowych i przypisywanie im funkcji
(hipotetycznych)
Komputerowa analiza sekwencji nie może być
ostatecznym dowodem na istnienie genu
Analiza bioinformatyczna musi być potwierdzona
eksperymentalnie
Jednym ze sposobów stwierdzenia, że dany odcinek
DNA
jest
rzeczywiście
genem
jest
zbadanie
transkryptomu komórki, czyli sprawdzenie:
•czy w komórce znajduje się transkrypt danego
(hipotetycznego) genu, a jeśli tak to:
•ile jest jego kopii
•kiedy (tj. w jakich warunkach: czas, miejsce, czynniki
zewnętrzne), dany transkrypt się pojawia
Analiza trankryptomu komórki (globalna czy dotycząca
wybranych genów) dostarcza nam wielu cennych
informacji dotyczących sposobu działania genomu:
1. pozwala zmapować we fragmencie DNA pozycje
transkrybowane czyli mówi nam, że w konkretnym
regionie znajduje się gen (a nie np. pseudogen)
2. umożliwia lokalizację granicy
przypadku genów nieciągłych
intron-ekson
w
3. pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie
ekspresji genów
Test hybrydyzacyjny typu Northern – najprostsza
metoda ustalenia czy dany fragment zawiera
sekwencję ulegającą ekspresji
1. Ekstrakcja RNA z komórki
(Uwaga na RNAzy)
•Stosunkowo trudna w przypadku
bakterii (szybka degradacja
transkryptów mRNA, krótki okres
półtrwania)
•Łatwa w przypadku eukariontów –
obecność ogonka Poly(A)
2. Elektroforeza w warunkach
denaturujących (żel agarozowy z
formaldehydem – zapobiega tworzeniu
się struktur dsRNA)
3. Transfer na membranę
– zasada analogiczna jak
w przypadku hybrydyzacji
Southerna – różnice
dotyczą warunków
samego transferu
4. Przygotowanie
sondy- najczęściej
wyznakowany
fragment DNA, który
„podejrzewamy”, że
jest genem
5. Hybrydyzacja i detekcja
Alternatywą dla hybrydyzacji typu Northern jest RT-PCR
Real-Time PCR (qPCR)
Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie
rzeczywistym czyli bez konieczności sprawdzania obecności
produktów np. poprzez elektroforezę w żelu agarozowym
Polimeraza
(z aktywnością egzonukleazy 5’-3’)
dNTP
bufor, MgCl
Matryca - DNA
Denaturacja nici,
przyłączanie Starterów
Wydłużanie
nici
•Real-Time PCR
Dzięki użyciu sond fluorescencyjnych
reakcja ma gigantyczną czułość i można ją
zastosować do precyzyjnego oznaczania
ilości cząsteczek kwasów nukleinowych
•Wydajność amplifkacji obserwujemy poprzez pomiar fluorescencji
•Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika a
zatem ilością powstającego produktu
•to z kolei zależy od wyjściowej ilości kopii cząsteczek matrycy np. ilości kopii
mRNA danego genu
•qRT-PCR (ang. quantitative reverse transcriptase real-time PCR), pierwszym
etapem jest przepisanie RNA na cDNA przy pomocy odwrotnej transkryptazy
•W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi
fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów
cDNA (dla różnych genów)
Badanie różnicy ilości
mRNA



Różnych genów w tej
samej tkance, komórce
Tego samego genu w
różnych tkankach (np.
zdrowych i zmienionych
chorobowo)
u różnych pacjentów z tą
samą chorobą
Badanie promotorów i innych sekwencji
regulatorowych – za pomocą genów reporterowych
pozwala pokazać różnice w poziomie ekspresji genów
Stosuje dla określenia gdzie (np. w jakiej tkance), kiedy (w jakich
warunkach, w jakim okresie życia), a także na jakim poziomie (możliwość
ilościowego oznaczenia) gen ulega ekspresji.
Gen reporterowy to taki, którego ekspresję można łatwo
zaobserwować najlepiej wzrokowo.
Zasada działania:
Aby gen reporterowy mógł wiarygodnie wskazywać gdzie i kiedy
badany gen ulega ekspresji, trzeba zastąpić ORF badanego
genu, otwartą ramką odczytu genu reporterowego tworząc tzw.
fuzję tranksrypcyjną
Teraz gen reporterowy będzie miał taki sam wzór
ekspresji jak gen badany
PstI
XbaI
KpnI
EcoRI
XhoI
badania promotorów (głównie bakterie)
BglII
lacZ –-galaktozydaza
detekcja test histochemiczny
MCS
o riT
o riV
la c Z
pM P220
(1 0 40 0 0 p z )
tr fA
Te t
uidA – glukuronidaza (GUS) – oznaczenia enzymatyczne szczególnie w
komórkach i ekstraktach roślinnych (brak naturalnego tła GUS w roślinach)
detekcja test histochemiczny
Lux: enzymatyczne utlenianie lucyferyny katalizowane
lucyferazą: chemiluminescencja
świetliki Phausis splendidula
Photobacterium phosphoreum
lux – badanie aktywności promotorów zarówno bakteryjnych jak i
eukariotycznych
GFP (green fluorescent protein) detekcja fluorescencja
GFP - meduza występująca w Pacyfiku Aequoria victoria
Globalne (czyli dotyczące dużej liczby genów) analizy
transkryptomu – macierze DNA
Macierz DNA - gęsto ułożone cząsteczki DNA, umieszczone na
stałym podłożu (nośniku: np. szkle, plastiku, membranie
nylonowej) reprezentujące
a) cały genomu
b)
kodujące odcinki genomu, czyli geny (najczęściej wszystkie,
albo dużą ich część) badanego organizmu
Tego typu układy przeznaczone są
do równoległych analiz
hybrydyzacyjnych, za pomocą
których możemy pokazać np.:
wyrażanie się genów w komórce
oraz różnice w poziomie ich
ekspresji (transkrypcji)
Nazewnictwo inne niż w tradycyjnych technikach
hybrydyzacyjnych:
„probe” - sonda - kwas nukleinowy o znanej sekwencji,
unieruchomiony na nośniku
„target” - wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany,
który poddajemy badaniu, jest to cała populacja cząsteczek
np. całkowite mRNA komórkowe – czyli transkrypty
wszystkich genów
Macierze są opisywane w wersji makro i mikro.
Różnica dotyczy pojemności macierzy tj. liczby
unieruchomionych na stałej powierzchni odcinków DNA
Makromacierze –
mała gęstość sond na dużej powierzchni, mała pojemność jeśli
chodzi o reprezentację genów z danego genomu
Mikromacierze –
duża gęstość sond, łatwo zmieścić wszystkie geny
genomu
Istnieją dwa podstawowe warianty mikromacierzy DNA które
różnią się:
•rodzajem sondy - rodzajem kwasu nukleinowego umieszczonego
na stałej powierzchni
•przeznaczeniem (zastosowaniem)
Format I: mikromacierz oligonukleotydowa – chip genowy, chip DNA
sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej
powierzchni w postaci bardzo krótkich odcinków DNA długości
20~80 nt (oligonukleotydów)
Ten typ mikromacirzy z syntezą in situ został opracowany przez firmę
Affymetrix, Inc.
Format II: mikromacierz cDNA
sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej
powierzchni w postaci odcinków cDNA długości 500~5,000 pz
Zasadnicze zastosowanie macierzy oligonukleotydowych (Format I) :
(1) Oznaczenie ilości mRNA genów w pojedynczej (tej
samej) próbce
Macierz oligonukleotydowa ma ogromną specyficzność wiązania i
wykrywania „targetu” (na chipie jest kilkanaście kopii sond danego genu)
co czyni ją bardziej użyteczną przy monitorowaniu ekspresji genów w
genomach, w których mRNA ulega dojrzewaniu
Ważne: W
eksperymentach z
chipami
oligonukloetydowymi
do jednego chipa
hybrydyzowana jest
tylko jedna próbka
„target”.
Etapy przygotowania targetu
1.
Ekstrakcja mRNA
2.
Odwrotna transkrypcja
do cDNA
3.
Znakowanie (np.
biotyną) z transkrypcją
cDNA do cRNA
Po wyznakowaniu cRNAs
hybrydyzuje się z
chipem, a następnie
wybarwia w celu
uwidocznienia
hybrydyzacji i określenia
intensywności wiązania
do sondy
Mikromacierze cDNA (Format II)
Podstawowe zastosowanie macierzy cDNA to porównywanie
poziomu ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami
Eksperyment z macierzą cDNA obejmuje najczęściej przygotowanie dwóch
próbek „targetów”: kontrolnej i badanej (np. tkanki zdrowej i zmienionej
nowotworowo).
Przygotowanie dwóch „targetów”
Z dwóch różnych próbek izoluje się mRNA poddaje się je odwrotnej transkrypcji
do cDNA w czasie której próbki znakuje się fluorescencyjnym barwnikiem np.
próbkę kontrolną barwnikiem zielonym (Cy3), a badaną czerwonym (Cy5).
Dzięki temu można je użyć równocześnie do hybrydyzacji do tej samej
macierzy.
Co się wtedy stanie?
Dwie próbki kompetycyjnie wiążą się do macierzy a próbka, która zawiera więcej
specyficznego cDNA (tzn. wyjściowo zawierała więcej mRNA – czyli poziom
ekspresji określonych genów był wyższy) wygra to współzawodnictwo.
Jeśli np. w tzw. próbce kontrolnej jest więcej mRNA dla danego genu w
porównaniu z tzw. próbką badaną (czyli ekspresja danego genu w próbce
badanej jest zmniejszona) więcej DNA wyznakowanego Cy3 (zielony
barwnik) zwiąże się z sondą i plamka będzie świecić na zielono. Jeśli
będzie odwrotnie – plamka będzie świecić na czerwono.
Macierz cDNA jest bardzo przydatna przy globalnych analizach
ekspresji całego genomu polegających na równoczesnym
porównywaniu ekspresji genów komórek rosnących w dwu różnych
warunkach (stanach fizjologicznych)
Zastosowania technologii macierzy (poza badaniem profili
ekspresji genów):
1. Wykrywanie rearanżacji w genomach – duplikacja jakiegoś genu
spowoduje zwiększoną hybrydyzację do określonej sondy
2. Wykrywanie mutacji
3. Wykrywanie polimorfizmu SNP
4. Analiza wzorów metalacyjnych w DNA
Globalny (całościowy, kompleksowy) sposób analizy genomu