STRESZCZENIE Badanie mechanizmów utrzymania stabilności genomu ma zasadnicze znaczenie w poznawaniu etiologii nowotworów. Destabilizacja genomu, obserwowana w nowotworach, jest wynikiem defektów mechanizmów naprawy DNA oraz mechanizmów kontroli cyklu komórkowego. Przedmiotem pracy jest funkcjonalna analiza substytucji nukleotydowych w genach wybranych białek bezpośrednio uczestniczących w naprawie DNA lub biorących udział w utrzymaniu stabilności genomu pośrednio poprzez regulację cyklu komórkowego. Metylotransferaza MGMT, będąca białkiem naprawy bezpośredniej, jest podstawowym elementem obrony przed kancerogennymi efektami czynników alkilujących, a zarazem głównym elementem oporności na metylujące chemoterapeutyki. Glikozylaza TDG, uczestnicząca w systemie naprawy poprzez wycinanie zasady, jest białkiem, które łączy naprawę DNA, kontrolę epigenetycznych modyfikacji DNA i regulację ekspresji genów. Opiekuńcze białko HSPA8 jest istotne dla podstawowego metabolizmu wszystkich typów komórek i tkanek. Zaangażowane jest m.in. w apoptozę, modulację konformacji białek i transdukcję sygnałów. Plejotropowe białko p53 pełni centralną rolę w koordynowaniu komórkowej odpowiedzi na szeroki zakres czynników stresu. Jego aktywność prowadzi do stymulacji procesów naprawy i innych mechanizmów obronnych, bądź do zaprzestania podziałów komórkowych i indukcji apoptozy. Utrata funkcji p53 spowodowana mutacjami genu TP53, bądź inną inaktywacją tego białka, obserwowana jest w większości nowotworów. Mutacje germinalne TP53 są odpowiedzialne za zespół Li-Fraumeni, czyli dziedzicznie zwiększoną predyspozycję do zachorowania na różne nowotwory. Helikazy WRN i RECQL należące do rodziny RecQ, biorą udział w utrzymaniu stabilności genomu poprzez rozplatanie struktur przejściowych, powstających podczas replikacji i rekombinacji DNA. Głównym celem pracy była analiza funkcjonalna zmian w sekwencjach regulujących ekspresję genów MGMT, TDG i HSPA8, a także scharakteryzowanie substytucji w sekwencjach kodujących genów TP53, RECQL i WRN. Testy funkcjonalne pomagają w rozstrzygnięciu, czy wykryta w populacji zmiana sekwencji jest rzadko występującym, neutralnym wariantem, czy mutacją inaktywującą białko. Pomagają również w określeniu charakteru polimorfizmu (neutralny versus funkcjonalny). Funkcjonalne polimorfizmy typu SNP mogą modulować ryzyko zachorowania na różne choroby, w tym choroby nowotworowe. 1 Badania przeprowadzono głównie metodą reporterowych testów z udziałem lucyferazy. Do określania wewnątrzkomórkowej lokalizacji zmutowanych helikaz stosowana była metoda barwienia fluorescencyjnego z udziałem białka mRFP1. Zaobserwowano, że często występujący polimorfizm 1099C>T (rs16906252) regionu „promotorowo-enhancerowego” genu MGMT nie jest funkcjonalnie neutralny. Analiza alternatywnego transkryptu TDG pozbawionego eksonu 2 zasugerowała, że prawdopodobnie jest on skutkiem nieprawidłowego procesu wycinania intronów. Zidentyfikowany promotor TDG okazał się bardzo silnym aktywatorem transkrypcji, natomiast wykryty w nim polimorfizm nie wykazał funkcjonalnego znaczenia. Został opracowany oryginalny test reporterowy umożliwiający badanie znaczenia polimorfizmów i mutacji występujących w intronach. Bazując na nim wykazano, że polimorfizm 1541-1542delGT w intronie 2 genu HSPA8 wpływa na aktywność genu reporterowego. Heterozygotyczny genotyp związany z tym polimorfizmem obniża ryzyko raka płuca. W genie TP53 została wykryta mutacja germinalna, która całkowicie pozbawia białko p53 zdolności aktywacji transkrypcji. Nie uzyskano potwierdzenia, że transkrypcja genów jest promowana przez helikazową aktywność białka WRN, natomiast wykazano, że zdolność aktywacji transkrypcji posiada białko RECQL. Okazało się ponadto, że jąderkowa lokalizacja helikazy WRN oraz tworzenie przez nią toroidalnych ciałek jądrowych ulegają zakłóceniu przez zniekształcenie poprawnej struktury trzeciorzędowej domeny HRDC tego białka. Testy reporterowe z udziałem lucyferazy wykazały funkcjonalne znaczenie niektórych badanych zmian sekwencji nukleotydowych, występujących w odcinkach regulujących ekspresję genów lub w odcinkach kodujących sekwencję białka. Porównanie otrzymanych wyników z wynikami opublikowanymi przez innych badaczy wskazuje na konieczność testowania znaczenia substytucji w odcinkach regulatorowych w oparciu o możliwie jak najdłuższe fragmenty DNA, uwzględniające wpływ na badane odcinki sekwencji sąsiadujących. 2