1 Dr hab. Agnieszka Piekiełko-Witkowska Zakład Biochemii

Dr hab. Agnieszka Piekiełko-Witkowska
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej
Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
Projekt pracy doktorskiej pt.
Rola mikroRNA w regulacji ekspresji cząsteczek związanych z adhezją komórkową w raku
nerki typu jasnokomórkowego.
Projekt będzie realizowany w ramach grantu NCN nr 2012/05/B/NZ5/01541
Cel/hipoteza:
Celem projektu jest identyfikacja cząsteczek mikroRNA, które mogą regulować ekspresję cząsteczek
związanych z adhezją komórkową w raku nerki typu jasnokomórkowego, a przez to mogą wpływać na
procesy adhezji, migracji i inwazji w tym typie nowotworu.
Szczegółowe cele projektu obejmują:

wytypowanie cząsteczek mikroRNA potencjalnie regulujących ekspresję cząsteczek
adhezyjnych, których ekspresja jest zaburzona w ccRCC (dane o ekspresji cząsteczek
adhezyjnych i mikroRNA będą uzyskane w wyniku równolegle prowadzonych badań).

zbadanie wpływu cząsteczek mikroRNA na ekspresję wytypowanych cząsteczek adhezyjnych

zbadanie wiązania mikroRNA do rejonów 3'UTR wytypowanych cząsteczek adhezyjnych

Zbadanie wpływu wybranych cząsteczek mikroRNA na adhezję, migrację i inwazję komórek
ccRCC
Hipoteza projektu: zaburzenia ekspresji mikroRNA, które wpływają na ekspresję cząsteczek
związanych z adhezją, powodują zmiany we właściwościach adhezyjnych komórek w ccRCC, a także
wpływają
na
procesy
adhezji,
migracji
i
inwazji
w
tym
typie
nowotworu.
1
Obecny stan wiedzy/założenia:
1.
Rak nerki typu jasnokomórkowego.
Rak nerkowokomórkowy (RCC, ang. renal cell carcinoma) jest najczęstszym typem litych
guzów nerki. Przeważająca większość przypadków RCC (około 80%) jest klasyfikowana jako rak
nerki typu jasnokomórkowego (ang. clear cell renal cell carcinoma, ccRCC). Zgodnie z danymi
epidemiologicznymi w 2000 roku odnotowano w Polsce ponad 2000 przypadków zachorowań na raka
nerki u mężczyzn i ponad 1300 u kobiet. Z powodu raka nerki zmarło w 2000 roku 1400 mężczyzn i
ponad 800 kobiet (Krzakowski i wsp., 2004). Wśród wszystkich typów raka nerki ccRCC jest formą
najbardziej agresywną, charakteryzuje się najszybszym wzrostem i tworzeniem przerzutów
(wykrywanych u prawie 25% pacjentów w momencie diagnozy nowotworu, a u kolejnych 50%
pojawiających się w okresie obserwacji poszpitalnej). Podstawowym sposobem leczenia jest
chirurgiczne
usunięcie
guza.
U
mniej
niż
10%
pacjentów
z
rozległymi
przerzutami
immunochemioterapia paliatywna zatrzymuje rozwój choroby, dając średnią przeżycia 5-7 miesięcy.
Ponieważ możliwości skutecznego leczenia ccRCC w zaawansowanej postaci są ograniczone, główny
nacisk kładzie się na poszukiwanie sposobów wczesnego wykrywania choroby, ze szczególnym
uwzględnieniem markerów molekularnych.
2.
Cząsteczki adhezyjne w procesie nowotworzenia.
Śmiertelność w chorobach nowotworowych jest głównie związana z procesem przerzutowania.
Proces ten obejmuje kilka etapów, wśród których wyróżnia się oderwanie się komórek
nowotworowych
z
miejsc
pierwotnych
zmian
nowotworowych,
inwazję
macierzy
zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix), wnikanie do krwioobiegu, rozsiew poprzez
układ krwionośny, wnikanie do odległych narządów i tworzenie zmian wtórnych. Inicjacja procesu
przerzutowania jest ściśle związana ze zmianami we właściwościach adhezyjnych komórek
nowotworowych. Zmiany te są wynikiem zaburzeń w ekspresji i funkcjonowaniu cząsteczek
adhezyjnych (CAM, ang. cell adhesion molecules).
Cząsteczki CAM są powierzchniowymi białkami komórki, biorącymi udział w oddziaływaniach
między komórkami i między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. Do CAM zaliczane są
białka należące do grup kadheryn, integryn, selektyn i immunoglobulin. Cząsteczki te warunkują
prawidłową strukturę i działanie komórek i biorą udział w szeregu istotnych procesów, takich jak
morfogeneza, embriogeneza, organogeneza, procesy odpornościowe, procesy zapalne. Z uwagi na
rolę, jaką CAM pełnią w procesie przerzutowania, wykorzystuje się je jako markery diagnostyczne i
cele terapeutyczne w leczeniu różnego typu nowotworów.
Kadheryny są glikoproteinami pośredniczącymi w mediowanych przez wapń oddziaływaniach
między komórkami należącymi do tego samego typu. Do najintensywniej badanych cząsteczek tej
2
rodziny należą kadheryny: E (nabłonkowa, ang. epithelial), N (neuronalna, ang. neural) i P
(łożyskowa, ang. placental). Znaczenie kadheryn w regulacji procesów komórkowych wynika również
z faktu, że oddziałują one z elementami cytoszkieletu poprzez tzw. kompleks kateninowy, m.in. przez
beta-kateninę, która, oprócz oddziaływania z kadherynami, bierze udział w szeregu ważnych szlaków
sygnałowych (np. szlaku Wnt, związanego z migracją komórkową i regulacją ekspresji wielu genów,
w tym biorących udział w procesie nowotworzenia). W związku z istotną rolą kadheryn w
utrzymywaniu homeostazy komórkowej, nieprawidłowości ich ekspresji są powodem poważnych
zaburzeń. Przykładowo, utrata ekspresji E-kadheryny lub jej nieprawidłowe działanie prowadzi do
utraty polarności komórki i zaburzeń struktury tkanek. W większości nowotworów pochodzenia
nabłonkowego obserwuje się zaburzenia oddziaływań komórkowych, w których pośredniczy Ekadheryna, z czym równocześnie związane jest nabywanie przez komórki bardziej agresywnego
fenotypu. Wykazano ujemną korelację między poziomem ekspresji E-kadheryny, stopniem
zaawansowania nowotworu i przeżywalnością pacjentów. Utrata ekspresji E-kadheryny występuje też
w stanach przedrakowych, takich jak przełyk Baretta. W eksperymentach wykonanych na liniach
komórkowych wykazano, że przywrócenie ekspresji E-kadheryny powoduje odwrócenie fenotypu z
inwazyjnego do łagodnego, co sugeruje potencjalną rolę E-kadheryny jako supresora inwazyjności
nowotworowej.
Integryny są glikoproteinowymi receptorami powierzchniowymi, zbudowanymi z podjednostek
alfa i beta. 18 podjednostek alfa i 8 podjednostek beta łączy się w 24 znane kombinacje tworzące
receptory integrynowe. Domena zewnątrzkomórkowa receptorów integrynowych oddziałuje z
wieloma białkami ECM (np. fibronektyną, fibrynogenem, witronektyną, lamininą i kolagenem).
Integry oddziałują tez z ligandami, takimi jak trombospondyna, czynnik von Willebranda, czynnik X,
lub z innymi białkami CAM, takimi jak VCAM-1 (ang. vascular cell adhesion molecule) lub ICAM
(ang. intracellular adhesion molecules). Integryny inicjują komórkowe kaskady sygnałowe dzięki
oddziaływaniu ich domen cytoplazmatycznych z elementami cytoszkieletu (np. alfa-aktyną) i białkami
sygnałowymi (np. kinazami i białkami adaptorowymi: kinazami FAK (ang. focal adhesion kinase),
Src, ILK, MAPK i innymi). Dzięki tym złożonym oddziaływaniom, integryny mogą wpływać na
ekspresję wielu genów biorących udział w kluczowych procesach komórkowych, takich jak
proliferacja, migracja, różnicowanie, regulacja cyklu komórkowego.
W różnych typach nowotworów obserwuje się zaburzenia w poziomie ekspresji integryn.
Przykładowo, obniżenie ekspresji integryny alfa5beta1 obserwuje się podczas nowotworowej
transformacji fibroblastów gryzoni.
Selektyny są transbłonowymi białkami i zalicza się do nich selektynę E (śródbłonkowa, ang.
endothelial), L (leukocytarna, ang. leukocyte) i P (płytkowa, ang. platelet). Pośredniczą one w
oddziaływaniach między komórkami śródbłonka, leukocytami i trombocytami. Zaburzenia ekspresji
selektyn są spotykane w wielu nowotworach, np. w inwazyjnym raku piersi i przerzutach raka jelita
3
grubego, gdzie stwierdzono zwiększoną ekspresję selektyny E. Zwiększoną ekspresję selektyny P
stwierdzono w raku piersi i żołądka, podczas gdy obniżona ekspresja tego białka jest związana z
progresją czerniaka i raka jelita grubego.
Cząsteczki CAM, należące do rodziny immunoglobulin (IgCAM), stanowią dużą grupę
powierzchniownych glikoprotein. Kilka cząsteczek tej grupy jest związanych z procesem
nowotworzenia (np. NCAM, VCAM, ICAM, PECAM, Mad CAM i CEA). Cząsteczki te pośredniczą
w oddziaływaniach pomiędzy komórkami tego samego typu, jak i komórkami różnych typów.
Zaburzenia ekspresji cząsteczek NCAM są związane z progresją nowotworową i złym
prognozowaniem. Zmiany w ekspresji NCAM obserwowano m.in. w nowotworach mózgu, jelita
grubego, trzustki, tarczycy, drobnokomórkowego raka płuca.
3.
Cząsteczki adhezyjne w raku nerki typu jasnokomórkowego.
W nerce opisano ekspresję kilku kadheryn, m. in kadheryny E, N, kadheryny 6, 8 i 16. Ogólnie
uważa się, że kadheryna E działa jako supresor inwazji nowotworowej i że jej ekspresja koreluje z
przeżywalnością pacjentów w wielu różnych typach nowotworów, m.in. w raku pęcherza moczowego,
prostaty, piersi, jelita grubego i żołądka. Również w RCC stwierdzono statystycznie istotną korelację
między prawidłową ekspresją E-kadheryny i lepszym prognozowaniem (Katagiri i wsp. 1995).
Langner i wsp (2004) wykazali, że ekspresja cząsteczki MUC1 i kadheryny E może stanowić marker
diagnostyczny i prognozujący RCC.
Stosunek ekspresji genu kodującego metaloproteinazę 9 (MMP9) do kadheryny E stanowi
marker prognozujący przerzutowanie w ccRCC (Slaton i wsp., 2001). Jednak w większości
przypadków RCC kadheryna E nie ulega ekspresji (wykrywa się ją w zaledwie około 20%
analizowanych próbek), co częściowo wynika z faktu, że kanaliki proksymalne, z których wywodzi się
RCC, nie wykazują ekspresji kadheryny E. Wydaje się, że lepszym markerem w tym typie nowotworu
jest kadheryna 6. Zaburzona ekspresja tej cząsteczki koreluje ze złym prognozowaniem RCC (Paul i
wsp., 1997, Shimazui i wsp., 1998). W RCC obserwuje się również zwiększoną ekspresję kadheryny
8, która w prawidłowych kanalikach proksymalnych nie występuje (Blaschke i wsp., 2002). Z kolei
kadheryna Ksp wykazuje obniżoną ekspresję w RCC w porównaniu z tkanką prawidłową (Thedieck i
wsp., 2005).
Ekspresja czasteczki VCAM-1 jest podwyższona w ccRCC i koreluje z lepszym
prognozowaniem (Shioi i wsp., 2006). W prawidłowych kanalikach proksymalnych ekspresja tej
cząsteczki jest prawie niewykrywalna. Podwyższona ekspresja cząsteczki adhezyjnej L1 (L1-CAM)
koreluje z przerzutowaniem w ccRCC (Allory i wsp., 2005), a także z krótszym prognozowanym
czasem życia i opornością na chemioterapię (Doberstein i wsp., 2011).
4. Cząsteczki mikroRNA i ich rola w procesie nowotworzenia.
4
Cząsteczki mikroRNA są małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA, które regulują ekspresję
genów wiążąc się do rejonów UTR (ang. UnTranslated Region) docelowych transkryptów i
hamując translację bądź indukując degradację mRNA. Ekspresja mikroRNA jest bardzo często
zaburzona w nowotworach, a cząsteczki te są często proponowane jako molekularne markery
diagnostyczne. Z drugiej strony, z uwagi na to, że celem działania mikroRNA są geny
bezpośrednio związane z neogenezą i progresją nowotworową, mikroRNA są obiektem badań
klinicznych testujących je jako cząsteczki terapeutyczne (Wahid et al., 2010). W ccRCC
zaobserwowano zaburzenia mikroRNA związane z przerzutowaniem. Przykładowo, wykazano, że
wzór ekspresji miR-451, miR-221, miR-30a, miR-10b i miR-29a różni się między chorymi z
rozsianą postacią choroby a chorymi bez przerzutów (Heinzelmann i wsp., 2011). Cząsteczki
mikroRNA mogą też wpływać na procesy inwazji i migracji w ccRCC (Slaby i wsp., 2011). W
ccRCC zaobserwowano więc zarówno zaburzenia genów związanych z adhezją komórkową jak i
mikroRNA. Brakuje jednak badań, który wykazywałyby, że cząsteczki mikroRNA, których
ekspresja zmienia się w zależności od stopnia inwazyjności nowotworu, wpływają na procesy
przerzutowania za pośrednictwem cząsteczek adhezyjnych. Dlatego właśnie celem projektu jest
identyfikacja mikroRNA wpływających na cząsteczki adhezyjne i elementy ECM w ccRCC.
Identyfikacja mikroRNA, które hamując ekspresję genów adhezyjnych modulują właściwości
adherentne komórek nowotworowych, pozwoli na uzyskanie potencjalnych cząsteczek
terapeutycznych wpływających na proces przerzutowania w ccRCC.
Metodyka:
Ogólny schemat badawczy będzie wyglądał następująco:
Na podstawie analizy danych uzyskanych z RT²Profiler™ PCR Arrays i Real-time Custom Panels
zostanie wybranych 3 cząsteczek adhezyjnych, których ekspresja różni się w ccRCC w zależności od
stopnia zaawansowania i inwazyjności nowotworu. Na podstawie analizy danych uzyskanych z Pick&-Mix microRNA PCR Panels oraz analizy bioinformatycznej (programy TargetScan, miRANDA,
miRbase i Diana) zostaną wybrane cząsteczki mikroRNA potencjalnie wiążące się do rejonów UTR
wybranych cząsteczek adhezyjnych. Cząsteczki mikroRNA o najwyższym prawdopodobieństwie
wiązania zostaną wybrane do weryfikacji: a) ich wiązania z rejonem UTR wytypowanych cząsteczek
adhezyjnych (testy w systemie lucyferazowym); b) ich wpływu na ekspresję wytypowanych
cząsteczek adhezyjnych (analiza real-time PCR, Western-blot); c) ich wpływu na adhezję, migrację i
inwazję komórkową ccRCC (testy na liniach komórkowych)
1. Materiał.
Materiał do badań będą stanowiły: a) pobrane za zgoda Komisji Bioetycznej wycinki guzów
ccRCC (n=30), scharakteryzowane pod względem histopatologicznym oraz odpowiadające im
5
wycinki kontrolne, pobrane z przeciwległego bieguna nerki, nienacieczone nowotworowo; b)
nerkowe linie komórkowe (prawidłowe kanaliki proksymalne oraz linie wyprowadzone z
ccRCC).
2. Izolacja RNA .
Izolacja RNA będzie wykonywana za pomocą zestawów miRCURY RNA Isolation Kit –
Tissue (Exiqon), zgodnie z instrukcją producenta.
3. Izolacja białka będzie wykonywana zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (PiekiełkoWitkowska i wsp., 2010) lub za pomocą zestawów do frakcjonowania białek (ProteoExtract®
Subcellular Proteome Extraction Kit, Merck-Chemicals).
4. Analiza poziomu ekspresji na poziomie RNA/mikroRNA będzie wykonywana za pomocą
odpowiednich sond i gotowych zestawów odczynnikowych zawierających polimerazę hot
start. Wyniki analizy będą normalizowane względem ekspresji genów referencyjnych
wybranych za pomocą NormFinder.
5. Praca z liniami komórkowymi.
Linie komórkowe wywodzące się z ccRCC (Caki-2, UOK-171, KIJ-256T, KIJ-308T) będą
hodowane
zgodnie
z
zaleceniami
dostawcy
linii.
Wybór
konkretnych
linii
do
wyciszania/nadekspresji będzie poprzedzony analizą poziomu ekspresji wybranych genów,
celem wyboru linii, których profil natywnej ekspresji pozwoli na uzyskanie najlepszych
wyników zmian ekspresji indukowanych transfekcją. Celem indukowania zmian ekspresji
wytypowanych mikroRNA wykorzystane zostaną mirVana® miRNA mimic 5nm, mirVana®
miRNA inhibitors, mirVana™ miRNA Inhibitor Negative Control (Life Technologies) i
miRNA Mimic Negative Control. Transfekcja będzie przeprowadzana za pomocą
Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Testy adhezji, migracji i inwazji będą
przeprowadzane za pomocą ECM Cell Adhesion Array Kit (Millipore), Radius 24 well cell
migration assay (Cell Biolabs) i (QCM ECMatrix Cell Invasion Assay (Millipore) na liniach
komórkowych transfekowanych z indukowaną zmianą ekspresji wybranych miRNA lub
kontrolnych prekursorów (tzw. miRNA mimic negative controls).
6. Klonowanie wybranych rejonów 3'UTR cząsteczek adhezyjnych będzie prowadzone z
wykorzystaniem PCR, wektorów pGEMT-easy i pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target
Expression Vector (Promega). Uzyskane konstrukty zostaną wykorzystane w testach wpływu
mikroRNA na poziom ekspresji w systemie lucyferazowym.
7. Analiza statystyczna:
Analiza statystyczna będzie wykonywana z pomocą programu GraphPad Prism 5. Rozkład
normalny będzie sprawdzany za pomocą testu D’Agostino i Pearsona. W zależności od
wyników testu badającego rozkład normalny, będą wykonywane analizy za pomocą testu t
bądź testu U Mann-Whitney’a. W przypadku analizy par wiązanych będzie wykorzystywany
6
test t dla par wiązanych lub test par Wilcoxona (dla danych nieparametrycznych). Analiza
korelacji będzie określana za pomocą współczynnika korelacji Pearsona (dla danych z
rozkładu normalnego) lub współczynnika korelacji rang Spearmana (dla danych
nieparametrycznych). Obserwacje odstające będą identyfikowane za pomocą testu Grubbsa.
Wyniki testów lucyferazowych będą analizowane za pomocą testu ANOVA w powiązaniu z
testem Dunnetta. p<0.05 będzie uznawane za statystycznie istotne.
Spodziewane wyniki i znaczenie projektu:
Oczekujemy, że zidentyfikowane zostaną cząsteczki mikroRNA:
a) wpływające na ekspresję genów związanych z adhezją komórkową, których ekspresja jest
zmieniona w ccRCC
b) wpływające na adhezję, migrację i inwazję ccRCC
Biorąc pod uwagę rolę cząsteczek CAM i ECM w inwazji nowotworowej oraz rolę mikroRNA jako
potencjalnych cząsteczek terapeutycznych, wyniki projektu będą mogły stanowić podstawę dalszych
badań, już o charakterze aplikacyjnym. Wyniki projektu będą też stanowiły podstawę do badań nad
rolą zidentyfikowanych cząsteczek mikroRNA w innych typach nowotworów.
Wyniki projektu będą prezentowane w postaci abstraktów konferencyjnych w Polsce i zagranicą, oraz
w formie artykułów naukowych publikowanych w pismach o możliwie najwyższych współczynniku
IF.
Piśmiennictwo:
Allory Y, Matsuoka Y, Bazille C, Christensen EI, Ronco P, Debiec H. Clin Cancer Res. 2005 Feb 1;11(3):11907. The L1 cell adhesion molecule is induced in renal cancer cells and correlates with metastasis in clear
cell carcinomas.
Blaschke S, Mueller CA, Markovic-Lipkovski J, Puch S, Miosge N, Becker V, Mueller GA, Klein G. Int J
Cancer. 2002 Oct 1;101(4):327-34. Expression of cadherin-8 in renal cell carcinoma and fetal kidney.
Boguslawska J, Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A. PLoS One. 2011;6(9):e24541.
MiR-224 targets the 3'UTR of type 1 5'-iodothyronine deiodinase possibly contributing to tissue
hypothyroidism in renal cancer.
Doberstein K, Wieland A, Lee SB, Blaheta RA, Wedel S, Moch H, Schraml P, Pfeilschifter J, Kristiansen G,
Gutwein P. Carcinogenesis. 2011 Mar;32(3):262-70. Epub 2010 Nov 19. L1-CAM expression in ccRCC
correlates with shorter patients survival times and confers chemoresistance in renal cell carcinoma cells.
Heinzelmann J, Henning B, Sanjmyatav J, Posorski N, Steiner T, Wunderlich H, Gajda MR, Junker K.
World J Urol. 2011 29(3):367-73.
7
Katagiri A, Watanabe R, Tomita Y. Br J Cancer. 1995 Feb;71(2):376-9. E-cadherin expression in renal cell
cancer and its significance in metastasis and survival.
Krzakowski M (ed.). Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złożliwych u
dorosłych, rozdział "Nowotwory układu moczowo-płciowego", Polska Unia Onkologii, 2004
Langner C, Ratschek M, Rehak P, Schips L, Zigeuner R. Mod Pathol. 2004 Feb;17(2):180-8. Expression of
MUC1 (EMA) and E-cadherin in renal cell carcinoma: a systematic immunohistochemical analysis of 188
cases.
McSherry EA, Brennan K, Hudson L, Hill AD, Hopkins AM. Breast Cancer Res. 2011 Mar 23;13(2):R31.Breast
cancer cell migration is regulated through junctional adhesion molecule-A-mediated activation of Rap1
GTPase.
Okegawa T, Li Y, Pong RC, Hsieh JT. J Urol. 2002 Apr;167(4):1836-43. Cell adhesion proteins as tumor
suppressors.
Paul R, Ewing CM, Robinson JC, Marshall FF, Johnson KR, Wheelock MJ, Isaacs WB. Cancer Res. 1997 Jul
1;57(13):2741-8. Cadherin-6, a cell adhesion molecule specifically expressed in the proximal renal tubule
and renal cell carcinoma.
Piekielko-Witkowska A, Wiszomirska H, Wojcicka A, Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, Nauman A.
Disturbed expression of splicing factors in renal cancer affects alternative splicing of apoptosis regulators,
oncogenes, and tumor suppressors. PLoS One. 2010 Oct 27;5(10):e13690.
Shimazui T, Oosterwijk E, Akaza H, Bringuier P, Ruijter E, van Berkel H, Wakka JO, van Bokhoven A,
Debruyne FM, Schalken JA. Clin Cancer Res. 1998 Oct;4(10):2419-24. Expression of cadherin-6 as a
novel diagnostic tool to predict prognosis of patients with E-cadherin-absent renal cell carcinoma.
Shioi K, Komiya A, Hattori K, Huang Y, Sano F, Murakami T, Nakaigawa N, Kishida T, Kubota Y, Nagashima
Y, Yao M. Vascular cell adhesion molecule 1 predicts cancer-free survival in clear cell renal carcinoma
patients. Clin Cancer Res. 2006 Dec 15;12(24):7339-46.
Slaby O, Redova M, Poprach A, Nekvindova J, Iliev R, Radova L, Lakomy R, Svoboda M, Vyzula R. Genes
Chromosomes Cancer. 2012 51(7):707-16.
Slaton JW, Inoue K, Perrotte P, El-Naggar AK, Swanson DA, Fidler IJ, Dinney CP. Am J Pathol. 2001
Feb;158(2):735-43. Expression levels of genes that regulate metastasis and angiogenesis correlate with
advanced pathological stage of renal cell carcinoma.
Thedieck C, Kuczyk M, Klingel K, Steiert I, Müller CA, Klein G. Expression of Ksp-cadherin during kidney
development and in renal cell carcinoma. Br J Cancer. 2005 Jun 6;92(11):2010-7.
Wahid F, Shehzad A, Khan T, Kim YY. MicroRNAs: synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.
Biochim Biophys Acta. 2010; 1803(11):1231-43.
8