wirusy - mikrobiologia - wenda1209

wirusy.doc
(6074 KB) Pobierz
Wirusologia- dział mikrobiologii zajmujący się badaniem wirusów ich
systematyką, budową, właściwościami antygenowymi i chorobotwórczymi.
Wirusologia opracowuje także metody izolacji, oczyszczania, namnażania i
zwalczania wirusów.
Pobieranie prób do badań wirusologicznych.
Najważniejsze jest jak najszybsze pobranie materiału, najlepiej za życia
zwierzęcia, gdy tkanki, w których namnaża się wirus są dostępne ( skóra,
błona śluzowa), dogodnym materiałem jest krew zwierzęcia w okresie
wiremii, a także jego wydaliny i wydzieliny.
W miarę trwania, a nawet pogłębiania się procesu chorobowego ilość
wirusa może się zmniejszać na skutek równocześnie działających
procesów obronnych organizmu. Po śmierci zwierzęcia szczególnie ważny
jest pośpiech w pobraniu wycinków narządów. Przy wielu chorobach
wirusowych następuje zjawisko pośmiertnej autosterylizacji, na skutek
czego pomimo daleko posuniętych zmian chorobowych, wirusa może nie
być w badanym materiale, bądź ilość jego jest zbyt mała aby wykazać ją w
rutynowym badaniu.
Drugi powód nakazujący pośpiech to ten, aby uniknąć pośmiertnego
rozkładu tkanek.
Wskazane jest umieszczenie pobranego materiału w warunkach
zapewniających możliwie wolny przebieg procesów inaktywacji wirusa.
Wirusy są na ogół wrażliwe na duże wahania pH, temperaturę ponad 37C ,
wysychanie i światło.
Próbki umieszcza się w odpowiednich płynach konserwujących,
zapewniających minimalne straty wirusa w czasie transportu do
laboratorium. Przykłady:
buforowy roztwór Hanksa- zawierający odpowiednią ilość antybiotyków (
penicylina, streptomycyna, nystatyna oraz stabilizator białkowy np. 0,5%
żelatyna lub 0,5-1% albuminy surowicy bydła.
Glicerol- ma działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, nie uszkadza
wirusa.
Tok postępowania rozpoznawczego
Badanie próbek wysłanych do laboratorium powinno być podjęte jak
najszybciej.
Jeśli to możliwe należy zastosować metody szybkiej diagnostyki, czyli
pozwalające bezpośrednio wykazać wirusa lub jego antygeny w
nadesłanym materiale.
W przypadku największych wirusów -np. wirus ospy- jest to możliwe nawet
w badaniu w mikroskopie optycznym przy odpowiednich metodach
przygotowania preparatu.
Mikroskopia elektronowa dysponuje szybkimi i dokładnymi metodami, co
pozwala wskazać kierunek poszukiwań, a czasem nawet rozpoznanie.
Mikroskop elektronowy — mikroskop wykorzystujący do obrazowania
wiązkę elektronów, pozwala badać strukturę materii na poziomie atomowym. Im
większa energia elektronów tym krótsza ich fala i większa rozdzielczość
mikroskopu.
Próbka znajduje się w próżni i najczęściej jest pokrywana warstewką metalu.
Wiązka elektronów przemiata badany obiekt i trafia do detektorów.
Urządzenia elektroniczne odtwarzają na podstawie zmierzonych sygnałów
obraz badanej próbki. Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruował w
1931 r. Ernst Ruska razem z Maksem Knollem w Berlinie.
Największą wartość mają metody oparte na reakcjach antygenprzeciwciało przy użyciu swoistych wysokowartościowych surowic
znakowanych odpowiednimi substancjami, łatwymi do wykazania.
Serodiagnostyka- oparta na stwierdzeniu jakościowych i ilościowych zmian
swoistych przeciwciał we krwi chorego zwierzęcia.
Badanie histologiczne- np. Ciałka wtrętowe ( Negriego) przy wściekliźnie.
Jeżeli pracownia nie dysponuje metodami szybkiej diagnostyki lub gdy ich
użycie nie dało pozytywnego wyniku zachodzi potrzeba izolacji wirusa po
jego namnożeniu.
Gdy w laboratorium brak możliwości natychmiastowego podjęcia badań
rozpoznawczych ( brak zwierząt, zarodków, surowic) materiał można
zamrozić w zamrażarce w temperaturze około -70C dla wirusów dużych
optymalna temperatura wynosi -20C
zasada jest taka aby szybko zamrozić materiał. Suchy lód z alkoholemzamraża w kilkanaście sekund.
Aby namnożyć wirusa używamy wrażliwych obiektów biologicznych (
zwierzęta doświadczalne, zarodki kurze, ( też innych ptaków) hodowle
tkanek, hodowle komórek różnych typów)
Jeśli wynik wyjdzie ujemny nie można wykluczyć obecności wirusa.
Wykonuje się dwa ślepe pasaże- polegają one na zakażeniu następnych
obiektów biologicznych tego samego rodzaju co poprzednio materiałem
pobranym przyżyciowo lub pośmiertnie – materiałem tym np. będzie
wycinek ośrodkowego układu nerwowego wtedy gdy poszukujemy wirusa
neurotropowego.
W przypadku ujemnego wyniku ślepych pasaży badanie uważa się za
zakończone.
Jeśli podłoża biologiczne zareagowały(w 1 lub 2 próbie) mamy wynik
dodatni.
Potrzebna jest szczegółowa identyfikacja – określenie jaki to wirus.
Najczęściej reakcje – antygen- przeciwciało.
Interpretacja wyników:

Fałszywie dodatnie
izolowano wirus trwałego zakażenia lub reaktywowano wirus z
uprzedniego zakażenia

wirus stanowi zanieczyszczenie hodowli komórkowej

materiał miał dwa zarazki

wzrost miana po szczepieniu

Fałszywie ujemne
zbyt późne lub zbyt wczesne pobranie materiału

złe miejsce pobrania

zły transport i przechowywanie

zły dobór zwierząt laboratoryjnych
Diagnostyka wirusologiczna
1. Metody izolacji i namnażania wirusów.
Wirusy nie replikują poza komórką żywą, zatem hodowla wirusów odbywa
się in vivo w komórkach organizmów żywych lub in vitro poprzez
namnażanie cząstek wirusa w hodowlach komórkowych albo tkankowych.
Metoda namnażania wirusa w zarodkach kurzych. Rozwijające się
zarodki ptasie zakażane są w różnych fazach rozwojowych. Dokonuje się
zakażenia błony kosmówkowo-omoczniowej, jamy owodni, omoczni lub
woreczka żółtkowego. Po określonym czasie inkubacji w odpowiednich
warunkach z zakażonego jaja pobiera się płyn lub tkankę i bada na
obecność wirusów.
Metoda namnażania w hodowlach tkankowych, komórkowychhodowle mogą pochodzić z tkanek ludzkich lub zwierzęcych świeżo
pobranych (hodowle pierwotne), lub z tzw. heteroploidalnych,
ustabilizowanych linii komórkowych- pasażowane in vitro wielokrotnie.
Komórki zmienione są nowotworowo i namnażają się nieograniczenie.
Wykonywanie posiewów i izolowanie wirusów na zarodkach jaj
kurzych
Materiał przeznaczony do zakażania zwierząt doświadczalnych, zarodków
kurzych oraz hodowli musi być uprzednio odpowiednio przygotowany. Ma
to na celu przede wszystkim rozdrobnienie go i uzyskanie zawiesiny
dającej się wprowadzić za pomocą igły.
Zwykle wystarcza roztarcie próbki z małą ilością płynu i jałowym piaskiem
lub rozbicie za pomocą specjalnych młynków elektrycznych. Do pełnego
uwolnienia wirusa z komórek konieczne jest czasem bardziej dokładne ich
rozbicie co uzyskuje się przez kilkakrotne zamrażanie i rozmnażanie
materiału, lub ultradźwięki.
Ważne – temperatura zbliżona do 0C , chronić przed światłem.


Zarodki kurze

najczęściej używamy zarodków kurzych, ale np. Wirus zakaźnego
zapalenia wątroby kacząt namnaża się znacznie lepiej w zarodkach
kaczych
jaja zakupywać w fermach objętych nadzorem weterynaryjnym, wolnych
od wirusów
trzeba przewidzieć ubytki np.: jaja wybrakowane przed nałożeniem-3%,
jaja niezapłodnione-0-2,5%, zarodki zamarłe 1-6 dnia inkubacji 4-6,5%,
7-17dnia- 0,6-1,5%, 18-20dnia- 4,7-7,0%.

należy uwzględnić czynniki genetyczne( rasę, linię kur)

ważne żeby kury nie były zapobiegawczo szczepione przeciw chorobie
od której czynnika etiologicznego się poszukuje

w jajach mogą znajdować się różne zarazki nawet od kur klinicznie
zdrowych.
Ich obecność może z jednej strony prowadzić do omyłek
diagnostycznych a z drugiej mogą hamować namnażanie się wirusa
obecnego w próbie.
Jaja nakładane do inkubatorów powinny być możliwie świeże ( można je
trzymać przed inkubowaniem 5-10 dni w chłodnym miejscu 10-12C. Pełne
wstrzymanie jego rozwoju następuje przy temperaturze 15,9C
Jaja powinny być średnich rozmiarów i o czystej skorupce. Mycie jaj jest
nie wskazane gdyż usuwa się przez to warstwę ochronną uszczelniającą
pory skorupki i zapobiegającą wysychaniu jaja. Można ewentualnie
dezynfekować przy użyciu roztworu 3% formaliny, zanurzyć na 5 min, nie
wycierać wilgotne wkładać do inkubatora
Dla zapewnienia rozwoju zarodków w zalężonych jajach należy je umieścić
w odpowiedniej temperaturze i wilgotności. Temp 37,5-38,5C, wilgotność
50-70%.
musi być swobodny dostęp powietrza- każde jajo zużywa dziennie 1 L
tlenu!!!
okres wylęgowy trwa 21dni.
Po 3-5 dniach jaja prześwietla się za pomocą specjalnej lampy stołowej lub
ręcznej i określa czy są zapłodnione. Niezapłodnione lub obumarłe usuwa
się.
Drugie prześwietlenie wykonuje się w dniu zakażenia.
Zależy od wirusa i drogi wprowadzenia inokulum.
Budowa jaja
Błona kosmówkowo- omoczniowa jest narządem oddechowym, jama
omoczniowa stanowi miejsce gromadzenia się wydalin. Woreczek żółtkowy
jest narządem odżywczym zarodka, a woreczek owodniowy -jama z
płynem- amortyzuje ciśnienie i wstrząsy oraz podtrzymuje zarodek.
Zakażanie zarodków
zalety tej metody:
tanio
nie trzeba klatek, pomieszczeń dla zwierząt laboratoryjnych
prosta w wykonaniu
brak niebezpieczeństwa zakażenia personelu
dzięki skorupce jaja z różnymi wirusami mogą stać obok siebie
drogi wprowadzenia materiału zakaźnego
zależy od potrzeb danego wirusa, ich tropizmu, cel namnożenie
po odkażeniu skorupki wykonuje się otwór i ponownie odkaża to miejsce.
Oznacza się (opisuje)krótko jajo zwykłym ołówkiem
Inokulowane zarodki inkubuje się w zależności od wirusa albo w tej samej
temperaturze albo w niższej.
Zakażenie na błonę kosmówkowo- omoczniową (BKO)
zarodki muszą mieć 7-8 dni, po prześwietleniu oznaczamy sobie komorę
powietrzna i rysujemy trójkąt,
1.odkazić alkoholem,a następnie jodyna trójkąt i komorę powietrzną
2. zrobić otwór igłą preparacyjna w środku nad komorą powietrzną
3. wiertlem tarczowym delikatnie napiłować skorupkę wzdłuż boków
trójkąta, nie uszkadzając błony podskorupkowej
4. usunąć skorupkę- trójkąt
5. nanieść kroplę płynu fizjologicznego i delikatnie igłą z zagiętym
ostrzem lekko przeciągnąć po błonie tak żeby zadrasnąć błonę
skorupkową a nie uszkodzić kosmówkowo- omoczniowej, która
odpada i powstaje sztuczna komora powietrzna na skutek
przemieszczenia zarodka w stronę naturalnej komory powietrznej.
6. Do powstałej komory wprowadzamy 0,1-0,2ml materiału
7. otwory zalepić taśmą przylepca
8. inkubować w pozycji poziomej i nie przewracać
zakażenie do jamy omoczniowej
zarodki w wieku 9-12dni, stosowana w produkcji materiału wirusowego- do
namnażania
jaja prześwietla się, wyznacza komorę powietrzną oraz punkt położony w
odległości 5mm poniżej tej linii miedzy naczyniami.
Zakażenia do jamy owodniowej
6-11dni
stosowana do wyizolowania wirusów pneumotropowych np. Grypy. Wirus
jest przez zarodek aspirowany do płuc i jego namnażanie tam ułatwia
identyfikacje.
Po usunięciu skorupki nad komorą powietrzną i częściowo usunięciu błony
skorupkowej przekłuwa sie błonę k-o pensetą i chwyta się bardzo delikatnie
worek owodniowy. Wprowadza się materiał 0,2ml, następnie odkryte jajo
nakrywa się jałowym kołpakiem i okleja, uszczelnia parafiną. Inkubuje się w
pozycji pionowej
zakażenie do woreczka żółtkowego do 10 dnia inkubacji. Wtedy kiedy
woreczek jest jeszcze duży, jedna metoda przez otwór nad komorą
powietrzną i druga przez otwór w połowie jaja po stronie żółtka- nawet 1 ml
płynu
domózgowe zakażenie zarodków
do wirusów namnażających się w tkance nerwowej, skorupkę nad komorą
powietrzną odpiłowuje się , nanosi się na błonę podskorupkową 1 krople
oliwy jałowej, i przez przechylenie uzyskuje się prześwietlenie błony i
uwidocznienie zarodka. Materiał wprowadza się domózgowo. Następnie
obracamy jajo równomiernym ruchem otworem w dół, kładziemy na pół
sztywny papier i uszczelniamy parafiną.
Obserwacja inokulowanych zarodków
trwa różnie w zależności od wirusa i od jego dawki
prześwietlając 2 razy dziennie na początku i przy końcu pracy. Obumarłe
wyjmuje się i bada.
Ujemny wynik zakażenia zarodków nie wyklucza obecności wirusa. Może
było za mało zarazka albo zarodek jest niewrażliwy na wirusa.
Reakcja zarodków na zakażenia wirusowe:
zazwyczaj obumarcie przed upływem 24h uznajemy za następstwo urazusą wirusy które powodują tak wczesną śmierć.
Rodzaj, umiejscowienie i intensywność zmian zależą od rodzaju wirusa,
jego dawki, drogi wprowadzenia, stopnia adaptacji do zarodka
zmiany:
1. śmierć zarodka
2. wybroczyny w tkance podskórnej, potylica, brodawki piór
3. przekrwienie naczyń na skrzydłach nogach, cały zarodek
4. zahamowanie wzrostu zarodka
5. skręcenie zarodka
6. zmniejszenie płynu owodniowego
7. wzrost omoczniowego
8. zgrubienie i obrzęk b k-o
9. ogniska nekrotyczne
10.
zmiany histopatologiczne
Metody bezpośredniego wykazywania wirusa lub jego
antygenów i kwasów nukleinowych.
Są to metody wykrywania i identyfikacji czynnika zakaźnego w badanym
materiale za pomocą znanych, odpowiednio przygotowanych swoistych
surowic odpornościowych.
Często wystarcza niewielka ilość wirusa aby go wykryć, wiec nie trzeba już
namnażać
Odczyn immunofluorescencji (IF)
Istotą tej metody jest użycie przeciwciał połączonych z substancjami
fluoryzującymi....
Plik z chomika:
wenda1209
Inne pliki z tego folderu:



wirusy.doc (6074 KB)
podłoża.doc (1658 KB)
bakterie1.doc (620 KB)
Inne foldery tego chomika:


anatomia
choroby
 chów
 diagnostyka
 egzamin
Zgłoś jeśli naruszono regulamin







Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dla Mediów
Dział Pomocy
Opinie
Program partnerski




Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Ochrona praw autorskich
Platforma wydawców
Copyright © 2012 Chomikuj.pl