Metody identyfikacji wirusów kręgowców

Metody diagnostyki
zakażeń wirusowych
i techniki badań
wirusologicznych
1. Bezpośrednie wykrywanie
zakażeń wirusowych przez:




Stwierdzenie obecności (izolacja) i
identyfikacja wirusa
Stwierdzenie obecności wirusowego
antygenu
Stwierdzenie obecności wirusowego kwasu
nukleinowego
Wykazanie swoistej funkcji - zakaźności
2.Pośrednie wykrywanie zakażeń
wirusowych
wykrycie i badanie poziomu
specyficznych przeciwciał
antywirusowych
badanie aktywności mechanizmów
odpornosci komórkowej
Izolacja i namnażanie
Identyfikacja
Wirusa izolowanego in
vitro
W materiale bezpośrednim
Izolacja i namnażanie
wirusów kręgowców
Izolacja i namnażanie wirusów
kręgowców
1.Materiał używany do izolacji wirusów:
 płyny ustrojowe
 wydaliny i wydzieliny
 zeskrobiny
 płyny ze zmian pęcherzowych
 skrawki śródoperacyjne i bioptaty
 próbki tkanek pobierane post mortem
2. Sposoby namnażania wirusów:



w zwierzętach laboratoryjnych (próba
biologiczna)
w zarodkach ptaków
w hodowlach komórkowych
Namnażanie wirusów w zwierzętach
laboratoryjnych
1. Zwierzęta używane do
eksperymentów:



małe gryzonie (myszy, szczury, chomiki)
króliki
naczelne (rhesusy i szympansy)
Namnażanie wirusów w zwierzętach
laboratoryjnych
2. Drogi podawania materiału
zakaźnego:





domózgowo
dootrzewnowo
donosowo
dożylnie
domięśniowo
Namnażanie wirusów w zarodkach
ptaków
1. Zarodki używane do zakażeń:
 najczęściej stosowane są 7-11
dniowe zarodki kurze
2. Drogi podawania materiału
zakaźnego:
 na błonę kosmówkowo-omoczniową
 do jamy owodni
 do woreczka żółtkowego
 do ciała zarodka (dożylnie,
domózgowo)
Objawy wirusowego zakażenia
zarodka kury:
 zmiany w wyglądzie ciała zarodka
(przekrwienia, wybroczyny, deformacje)
 często śmierć zarodka
 wirusowe ogniska na błonach zarodka
 zmiany właściwości płynów w jaju (np. mogą
nabierać właściwości hemaglutynujących)
Wirusowa hemaglutynacja
czyli
zlepianie czerwonych
krwinek za pośrednictwem
wirusa w widoczne gołym
okiem agregaty
Namnażanie wirusów w hodowlach
komórkowych
1. Rodzaje hodowli stosowanych do
namnażania wirusów:



pierwotne
półciągłe
ciągłe
2. Źródła komórek używanych do
hodowli komórkowych:



tkanki embrionalne
tkanki nowotworowe
tkanki dojrzałe
Normalna hodowla fibroblastów
zarodka kury
Przejawy zakażenia hodowli
komórkowej – efekt cytopatyczny
CPE
rozsiany
syncytialny
miejscowy
(łysinka)
Identyfikacja wirusa
 W materiale bezpośrednim
 Izolowanego in vitro
Badanie mikroskopowe
 mikroskop świetlny – ciałka
wtrętowe cytoplazmatyczne i
wewnątrzjądrowe
 mikroskop elektronowy - wiriony
c. w. cytoplazmatyczne
c. w. wewnątrzjądrowe
S
Wewnątrzjądrowe ciałka wtrętowe w komórkach linii ED (skóry
konia) podczas zakażenia herpeswirusem typu 2 (EHV-2)
Filo
Corona
Pox
Rhabdo
Hepadna
Papilloma
Orthomyxo
Immunofluorescencja
W skrawkach mrożeniowych
Immunofluorescencja
W zakażonych hodowlach komórkowych
Techniki immunoenzymatyczne
Wykrywanie i analiza kwasów
nukleinowych
 PCR
 hybrydyzacja
 analiza restrykcyjna
Nested PCR
Hybrydyzacja
In situ w skrawku
histopatologicznym
Hybrydyzacja
In situ w hodowli
komórkowej
Hybrydyzacja
Na membranie
Analiza restrykcyjna