Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwości

SZKOLENIE
Grzegorczyk J£,PODYPLOMOWE
Kujawiak M, K³os Z. Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwoœci
67
Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwoœci
Cells activation tests in allergy and hypersensitivity
JANINA £. GRZEGORCZYK, MAGDALENA KUJAWIAK, ZUZANNA K£OS
Zak³ad Laboratoryjnej Immunologii Medycznej, Katedra Endokrynologii i Chorób Metabolicznych Uniwersytetu
Medycznego w £odzi
Streszczenie
W ostatnich czasach obserwuje siê szybki postêp w dziedzinie nauk
biomedycznych. Dziêki nowym metodom badawczym mo¿liwe jest
dok³adniejsze poznanie procesów zachodz¹cych na poziomie komórek
uk³adu odpornoœciowego. Obok klasycznej diagnostyki chorób
alergicznych, przydatne do ustalenia pod³o¿a reakcji nadwra¿liwoœci
mog¹ byæ testy aktywacji komórek. W artykule przedstawiono ogólne
informacje na temat obecnie stosowanych testów aktywacji
granulocytów i limfocytów, jak i nowych metod wymagaj¹cych
dalszych badañ potwierdzaj¹cych ich przydatnoœæ kliniczn¹.
S³owa kluczowe: astma, alergia pokarmowa, nadwra¿liwoœæ na
leki, diagnostyka
Summary
Recently, fast advance in biomedical science can be observed. New
research methods ensure more precise knowledge about processes
occurring in the immune system. Next to conventional diagnostic tools
usually used in allergic diseases confirmation, cells activation tests
may become a new approach in estimation of hypersensitivity reaction
pathogenesis. In the paper general information about currently used
test are presented. Moreover, authors describe new methods; however
they require more studies to confirm their clinical significance.
Key words: asthma, food allergy, drug hypersensitivity, diagnostics
© Alergia Astma Immunologia 2008, 13(2): 67-72
Adres do korespondencji / Address for correspondence
www.alergia-astma-immunologia.eu
Janina £ucja Grzegorczyk
Zak³ad Laboratoryjnej Immunologii Medycznej
Katedra Endokrynologii i Chorób Metabolicznych UM w £odzi
ul. Pomorska 251, 92-215 £ódŸ
tel. (42) 675 73 93, fax (42) 678 22 92
e-mail: [email protected]
Nades³ano: 11.05.2007
Zakwalifikowano do druku: 10.01.2008
Szybki postêp w dziedzinie nauk biomedycznych, zwi¹zany z rozwojem technik badawczych, przek³ada siê tak¿e na dok³adniejsze poznanie i rozumienie zjawisk zachodz¹cych na poziomie komórki uk³adu odpornoœciowego
u ludzi. Dynamika zmian w aktywacji komórek mo¿e byæ
wyk³adnikiem tocz¹cego siê procesu chorobowego o nie
zawsze mo¿liwej do uchwycenia przez klinicystê etiologii. Dlatego te¿ laboratoryjne testy aktywacji komórek
mog¹ byæ przydatne (w pewnych okolicznoœciach) w postawieniu diagnozy, zidentyfikowaniu czynnika wywo³uj¹cego zmiany chorobowe czy zaprogramowaniu leczenia.
Uwzglêdniaj¹c zatem klasyczny podzia³ reakcji odpornoœciowych wg Gella i Coombsa (na wspó³czesnym etapie wiedzy o patomechanizmie zjawisk chorobowych s³u¿¹cy raczej celom dydaktycznym), w zale¿noœci od typu
zaburzeñ i zwi¹zanych z tym objawów klinicznych, w zale¿noœci od rodzaju g³ównych komórek efektorowych,
mo¿emy przypisaæ stosowne testy ich aktywacji. Nale¿y
jednak podkreœliæ, i¿ znaczenie diagnostyczne jest ci¹gle
jeszcze weryfikowane.
Testy aktywacji komórek w alergii oraz innych
postaciach nadwra¿liwoœci
Procesy immunologiczne le¿¹ce u pod³o¿a rozwoju
i przebiegu – ujawniaj¹cej siê klinicznie – reakcji nadwra¿liwoœci pod postaci¹ zapalenia nie tylko alergicznego zwi¹zanego z atopi¹, stanowi¹ niejednokrotnie problem diagnostyczny. Dotyczy to szczególnie chorób alergicznych,
gdzie istotnym jest ustalenie atopowego b¹dŸ nie pod³o¿a.
Faktem oczywistym jest, i¿ rozpoznanie alergii atopowej
opiera siê g³ównie na wywiadzie klinicznym, badaniu fizykalnym, testach skórnych oraz uzupe³niaj¹cych oznaczeniach swoistych przeciwcia³ klasy IgE w surowicy
pacjenta.
Jednak, w przypadku mo¿liwoœci wyst¹pienia u chorego uogólnionej reakcji anafilaktycznej zagra¿aj¹cej ¿yciu,
istnieje koniecznoœæ rozszerzenia diagnostyki o laboratoryjne testy aktywacji komórek. Jest to szczególnie istotne
u pacjentów uczulonych na lateks, pokarmy, jady owadów b³onkoskrzyd³ych, wykazuj¹cych ciê¿kie postaci
68
nadwra¿liwoœci na aspirynê czy inne niesteroidowe leki
przeciwzapalne b¹dŸ antybiotyki. W tych przypadkach
wykluczona jest mo¿liwoœæ wykonania próby prowokacyjnej czy testów skórnych. Zatem badania ex vivo przeprowadzone w laboratorium na próbce krwi chorego, mog¹
byæ jedyn¹ drog¹ rozpoznania rzeczywistego czynnika
sprawczego.
Testy aktywacji bazofili
Mimo i¿ bazofile stanowi¹ najmniejsz¹ populacjê spoœród leukocytów krwi obwodowej, odgrywaj¹ zasadnicz¹
rolê w patogenezie reakcji alergicznych [1]. Komórki te
mog¹ byæ aktywowane do uwalniania mediatorów w odpowiedzi na IgE-zale¿n¹ b¹dŸ nie IgE-zale¿n¹ stymulacjê
[2,3], co pozwala na szerokie wykorzystanie w diagnostyce laboratoryjnej alergii oraz innych postaci nadwra¿liwoœci.
Testy uwalniania histaminy z bazofili – HRT
Do najbardziej poznanych mediatorów uwalnianych
podczas aktywacji bazofili nale¿y histamina (b-imidazolethylamina). Jest jednym z zasadniczych preformowanych
mediatorów procesów zapalnych o udokumentowanym
znaczeniu diagnostycznym w reakcjach alergicznych.
Powstaje w wyniku enzymatycznej dekarboksylacji histydyny. Stê¿enie histaminy w pe³nej krwi wynosi 20-200
ng/ml. Jest zmagazynowana w ziarnach bazofili (u cz³owieka oko³o 1 pg/kom). W wyniku aktywacji tych komórek dochodzi do procesu degranulacji i uwolnienia tego
mediatora o bardzo silnych w³aœciwoœciach anafilaktycznych. Dlatego te¿ okreœlenie stopnia uwalniania histaminy z bazofili pod wp³ywem swoistego antygenu/alergenu
b¹dŸ nieswoistego czynnika degranuluj¹cego in vitro,
mo¿e byæ – z jednej strony pomocnym badaniem w rozpoznaniu czynnika alergizuj¹cego, z drugiej zaœ okreœleniu podatnoœci bazofili na degranulacjê i uwalnianie tego
mediatora, co mo¿e mieæ istotne znaczenie przy stosowaniu leków anty-histaminowych. Istnieje bowiem pewna
populacja pacjentów (tzw. „non-releasers”), których bazofile nie odpowiadaj¹ na stymulacjê. Przyczyna tego zjawiska nie jest jeszcze dostatecznie wyjaœniona [4,5].
Istnieje szereg metod pomiaru uwalniania histaminy.
Opisana w 1971 roku przez Shore met. fluorymetryczna
[6] by³a wielokrotnie modyfikowana [7] w celu poprawienia swoistoœci i czu³oœci. W latach osiemdziesi¹tych próbowano wykorzystywaæ mikrometodê opracowan¹ przez
Nolte i wsp. [8,9] (HR-MM – histamine release microfibre method). Metoda ta oparta jest o zjawisko affinity of
histamine for certain glass fiber materials – powinowactwa histaminy do w³ókna szklanego. Badanie wykonuje siê z niewielkiej objêtoœci pe³nej krwi (50 µL/próbkê),
inkubowanej z alergenem oraz anty-IgE (jako pozytywna
kontrola) na p³ytkach mikrotitracyjnych. Uwolniona z komórek histamina zwi¹zana zostaje z powierzchni¹ w³ókna
szklanego mikrop³ytki, a interferuj¹ce substancje odp³uki-
Alergia Astma Immunologia 2008, 13(2): 67-72
wane s¹ wod¹ dejonizowan¹. Histamina odzyskiwana jest
z w³ókna szklanego przez dodanie 20 µL/próbkê mieszaniny HClO4/OPT. Po zalkalizowaniu œrodowiska 65 µL 0,05N
NaOH, zawartoœæ histaminy oceniana jest w spektrofluorymetrze Farranda i wyra¿ana w ng na próbkê, w oparciu
o krzyw¹ standardow¹ (inkubacja krwi ze wzrastaj¹cymi
stê¿eniami histaminy). Metoda ta znalaz³a zastosowanie
w diagnostyce alergii atopowej, w nadwra¿liwoœci polekowej i uczuleniach na pokarmy.
Najpowszechniej jednak stosowan¹ w laboratoriach
jest metoda spektrofluorymetryczna wg Siriganian [10].
Metoda jest czu³a, ale czasoch³onna i pracoch³onna oraz
wymagaj¹ca pobrania du¿ej objêtoœci krwi, poniewa¿
wykonywana jest z izolowanych na gradiencie gêstoœci
d=1,088 g/cm3 – wzbogaconych bazofilami – leukocytów.
Histamina ekstrahowana jest z komórek po zadzia³aniu
alergenem – próba w³aœciwa – lub innym degranulatorem bazofili (np. anty-IgE, ConA, polimyksyn¹ B, 48/80)
– stanowi¹cych tzw. kontrolê dodatni¹, maj¹c¹ okreœliæ
zdolnoœæ badanych komórek do uwalniania histaminy.
Nastêpnie przeprowadzana jest kondensacja z OPT (aldehydem orto-ftalowym o silnie zasadowym pH), co powoduje powstanie silnie fluoryzuj¹cego kompleksu, stabilnego w kwaœnym œrodowisku. Nasilenie fluorescencji
oceniane jest za pomoc¹ spektrofluorymetru przy d³ugoœciach fal: 350 l dla wzbudzenia i 450 l dla emisji. Badanie wymaga ka¿dorazowo przygotowania krzywej standardowej dla histaminy, stanowi¹cej wzorzec dla odczytania prób badanych. Wyniki okreœlane s¹ stopniem uwolnienia histaminy, wyra¿onym w procentach.
Interesuj¹c¹ z praktycznego punktu widzenia jest immunoenzymatyczna metoda oceny stê¿enia oraz uwalniania
histaminy z zastosowaniem zestawu ELISA. Uwolniona
z komórek lub zawarta w p³ynach ustrojowych (BAL,
surowica, osocze i inne) histamina jest acetylowana za
pomoc¹ „acetyluj¹cego czynnika”. W wyniku reakcji chemicznej, powstaje N-acetylhistamina. Próbka przenoszona jest na p³ytkê mikrotitracyjn¹, op³aszczon¹ – bezpoœrednio skierowanymi wobec zmodyfikowanej histaminy
– przeciwcia³ami monoklonalnymi. Po dodaniu substratu,
intensywnoœæ natê¿enia barwy jest odwrotnie proporcjonalna do stê¿enia uwolnionej histaminy w badanej próbce, które wyznaczane jest w oparciu o krzyw¹ standardow¹. Badanie uwalniania histaminy t¹ metod¹ mo¿e byæ
przeprowadzone na pe³nej krwi lub izolowanych komórkach. Jeszcze inn¹ metod¹ HRT jest radioenzymatyczna,
polegaj¹ca na przeniesieniu – za pomoc¹ enzymu N-metylotransferazy – grup metylowych, wyznakowanych izotopem wêgla [14C] z S-adenozylometioniny do niewyznakowanej histaminy. [C14]metylhistamina zostaje oddzielona od histaminy za pomoc¹ ekstrakcji chloroformem.
Uk³adem kontrolnym jest wprowadzenie do badanej próbki
histaminy znakowanej trytem – [3H]-histamine. WskaŸnik [14C]/[3H] jest proporcjonalny do zawartoœci histaminy w badanej próbce [11].
Grzegorczyk J£, Kujawiak M, K³os Z. Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwoœci
69
Przydatnoœæ diagnostyczna HRT by³a oceniana u chorych na atopow¹ astmê oskrzelow¹, w alergii na lateks,
w uczuleniach na pokarmy, w nadwra¿liwoœci na leki,
w uczuleniach na jady owadów b³onkoskrzyd³ych [12,13,
14,15,16,17].
¿one z RPE (fikoerytryna) i anty-gp53 sprzê¿one z FITC
(izotiocyjanian fluoresceiny). Badanie wykonywane jest
na próbce pe³nej krwi pobranej na heparynê. Po wstêpnej
inkubacji komórek z medium zawieraj¹cym IL-3 a nastêpnie stymulowanych nieswoiœcie fMLP oraz domniemanymi alergenami b¹dŸ lekami, wywo³uj¹cymi kliniczne
Test uwalniania tryptazy z bazofili – TRT (Tryptase objawy nadwra¿liwoœci, próbki analizowane s¹ w cytorelease test)
metrze przep³ywowym. Aktywowane bazofile bêd¹ wyTryptaza – serynowa endoproteaza – jest uwalniana kazywa³y ekspresjê [aIgE+CD63+]. Wyniki mog¹ byæ
równolegle z histamin¹ g³ównie z komórek tucznych i jest przedstawiane jako wskaŸnik aktywacji wynikaj¹cy z popostrzegana jako marker ich aktywacji [18,19,20]. Udo- równania próby po stymulacji z domniemanym czynnikiem
wodniono jednak tak¿e uwalnianie tego enzymu z bazofili alergizuj¹cym do spontanicznej aktywacji. Zazwyczaj
krwi obwodowej, stymulowanych in vitro alergenem. wielkoœæ wskaŸnika = >2 œwiadczy o dodatnim teœcie.
Oznaczanie tryptazy w komórkach mo¿e byæ przeprowa- Tak¿e ekspresja aIgE+CD63+ powy¿ej 15% mo¿e wskadzone metodami immunocytoenzymatycznymi, stosuj¹c zywaæ na pozytywny wynik badania, niemniej konieczprzeciwcia³a monoklonalne [21,22] oraz w nads¹czach nym jest ustawienie progu odciêcia dla ka¿dego laboratozebranych po indukcji bazofili, stosuj¹c metodê ELISA rium wykonuj¹cego te analizy. Zaznaczyæ nale¿y, i¿ ana[23]. Tak¿e wyniki naszych, wstêpnie przeprowadzonych lizy oparte o cytometriê przep³ywow¹ w danym laboratobadañ po stymulacji komórek chorych z nadwra¿liwoœci¹ rium winny byæ wykonywane przez jedn¹ i tê sam¹ osona niesteroidowe leki przeciwzapalne s¹ zachêcaj¹ce, dla- bê, co pozwala na unikniêcie du¿ego rozrzutu wyników.
tego te¿ wartoœæ diagnostyczna testu TRT bêdzie dalej
Inn¹ odmian¹ tego testu jest zastosowanie mieszaniweryfikowana w zespole Zak³adu Laboratoryjnej Immu- ny trzech przeciwcia³ monoklonalnych, sprzê¿onych z trzenologii Medycznej we wspó³pracy z Klinik¹ Immunologii ma ró¿nymi barwnikami fluoryzuj¹cymi [26].
Reumatologii i Alergii (M. Kujawiak i wsp.).
Osobiste doœwiadczenia pozwalaj¹ na refleksjê, i¿ trudGranzymy B jako nowy mediator aktywacji komórek? no jest przed³o¿yæ wy¿szoœæ metody rozpoznawania aktywowanych bazofili, stosuj¹c mieszaninê dwóch prze[24]
ciwcia³ czy trzech 1/ .
Granzymy B (GzmB) s¹ – de novo syntetyzowanymi
Porównywalnym z CD63 lecz bardziej czu³ym mari uwalnianymi z bazofili przez egzocytozê – serynowymi
kerem jest nowo odkryty CD203c (ecto-nucleotide pyroproteazami (c. cz. 28kD) podczas IgE-zale¿nej i IgE-niephosphatase/phosphodiesterase 3=phosphodiesterasezale¿nej aktywacji. W badaniach in vitro wykazano œcis³¹
NPP3) [27]. Rozpoznawalny jest przez przeciwcia³a mozale¿noœæ pomiêdzy uwalnianiem GzmB, a interleukin¹noklonalne 97A6 specyficzne dla CD203c [28]. Jak do13 oraz wytwarzaniem LTC4. In vivo granzymy B s¹
t¹d metoda oceny markera CD203c stosowana by³a w
uwalniane 18 godz. po prowokacji alergenem u chorych
identyfikacji uczulenia na jady owadów b³onkoskrzyd³ych
na astmê oskrzelow¹. Obserwacje te wyznaczaj¹ nowy
[29], nadwra¿liwoœci polekowej oraz badaniu rekombinokierunek badañ tak¿e nad znaczeniem diagnostycznym
wanych alergoidów [30,31,32].
GzmB, szczególnie w odniesieniu do póŸnej fazy reakcji
alergicznej.
Test CAST-ELISA
Ocena markerów aktywacji bazofili technik¹ cytometrii
przep³ywowej
Cytometria przep³ywowa jest nowoczesn¹ technik¹
badawcz¹ w obszarze laboratoryjnej immunologii medycznej o coraz szerszym zastosowaniu w diagnostyce tak¿e
chorób zwi¹zanych z reakcjami nadwra¿liwoœci. W 1991
r. Knol EF i wsp. opublikowali po raz pierwszy mierzenie
aktywacji bazofili poprzez ocenê ekspresji CD63 [25].
Wprowadzony w 1997 roku BASOTEST pozwala na
okreœlenie odsetka aktywowanych, ulegaj¹cych degranulacji bazofili poprzez ocenê ekspresji cz¹steczki CD63
rozpoznaj¹cej glikoproteinê gp53, której obecnoœæ charakteryzuje aktywowane – przez swoisty alergen lub nieswoisty degranulator – komórki. Dostêpny na rynku zestaw
zawiera fMLP (jako pozytywna kontrola dla aktywacji
komórek) oraz przeciwcia³a monoklonalne: anty-IgE sprzê-
Wa¿nymi mediatorami uwalnianymi podczas aktywacji komórek s¹ leukotrieny. Powstaj¹ w komórkach tucznych i bazofilach oraz innych leukocytach przy udziale
5-lipooksygenazy – enzymu luŸno zwi¹zanego z b³on¹ komórkow¹ lub wystêpuj¹cego w wolnej formie w cytozolu. W wyniku dzia³ania tego enzymu na kwas arachidonowy (kwas ten uwalniany jest z fosfolipidów b³ony komórkowej w wyniku rozbicia wi¹zañ estrowych tego kwasu
z wêglem C2 glicerolu fosfolipidów na skutek zadzia³ania
fosfolipazy A2), powstaje zwi¹zek 5-HPETE (kwas 5-Shydroksy-6,8-trans-11,14-cis-eikozatetraenowy) ulegaj¹cy konwersji do leukotrienu A4 (LTA4). Pod wp³ywem
hydrolazy LTA4 – mo¿e powstawaæ LTB4 lub pod wp³ywem syntetazy LTC4, przenosz¹cej zredukowany glutation
1/
1 BD FastImmune CD63 FITC/CD123 PE/Anti-HLA-DR PerCP
70
na wêgiel C6 – leukotrien C4 (LTC4). Dalej – z LTC4
powstaje LTD4, ulegaj¹cy przekszta³ceniu w LTE4. Poniewa¿ w cysteinie przy³¹czonego glutationu znajduje siê
atom siarki, leukotrieny C4,D4,E4 zosta³y nazwane leukotrienami siarczkowymi – sulfidoleukotriens-SLTs.
Uwalnianie SLTs mo¿na oceniæ po indukcji leukocytów swoistym alergenem lub innym domniemanym czynnikiem wywo³uj¹cym reakcjê nadwra¿liwoœci.
W obecnoœci niewielkiego stê¿enia IL-3, Il-5 b¹dŸ
GM-CSF, wyizolowane komórki – stymulowane in vitro
– uwalniaj¹ SLTs, stê¿enie których oceniæ mo¿emy stosuj¹c test CAST-ELISA. Stê¿enie leukotrienów wyra¿ane jest w ng/ml i odnoszone do arbitralnie ustalonych klas.
Odmian¹ powy¿szego jest BasoCAST pozwalaj¹cy
– z jednej strony na ocenê aktywacji bazofili, poprzez ekspresjê CD63, z drugiej zaœ – w nads¹czach – stê¿enie
SLTs – met. ELISA.
Metabolitem, który jest œciœle zwi¹zany z kaskad¹
kwasu arachidonowego jest 15-HETE (15-hydroxyicosatetrenic acid) uwalniany z leukocytów krwi obwodowej.
Przydatnoœæ oceny tego mediatora wykaza³y badania
przeprowadzone na grupie pacjentów nadwra¿liwych na
aspirynê (ASPITest) [33].
Ocena aktywacji eozynofili
Komórk¹ istotn¹ w rozwoju przewlek³ego zapalenia
– w tym alergicznego – jest eozynofil. Aktywacja tych
komórek prowadzi do uwolnienia mediatorów b³onowych
– LTC4, PAF, PGE, TXB2; z ziarnistoœci – bia³ek cytotoksycznych: EPC, MBP, EDN, EPO czy wreszcie cytokin i chemokin. Pomiar stê¿enia ECP – eozynofilowego
bia³ka kationowego – odzwierciedla stopieñ aktywacji tych
komórek w aktywnej astmie oskrzelowej i zaostrzeniach
innych chorób atopowych. Rutynowe pomiary ECP w surowicy i innych p³ynach ustrojowych, mo¿liwe s¹ przy
wykorzystaniu systemu UniCap.
Ocena aktywacji limfocytów
Limfocyty stanowi¹ populacjê komórek warunkuj¹cych zachowanie homeostazy w uk³adzie odpornoœciowym. Badanie funkcji i aktywacji tych komórek mo¿e byæ
wyk³adnikiem reaktywnoœci uk³adu immunologicznego
tak¿e w przypadku reakcji nadwra¿liwoœci. Historycznie
ujmuj¹c – metod¹ oceny aktywacji limfocytów by³ test
transformacji blastycznej oraz test hamowania migracji
leukocytów [34,35]. D³ugo funkcjonowa³ tak¿e test proliferacji, którego zasad¹ by³ pomiar j¹drowego DNA poprzez w³¹czanie znakowanego izotopem nukleotydu – tymidyny. Szczególnie przydatnym jest w ocenie nadwra¿liwoœci na beryl i inne metale, co mo¿e wspomagaæ diagnostykê np. chorób zawodowych [36] czy nadwra¿liwo-
Alergia Astma Immunologia 2008, 13(2): 67-72
œci na leki [37]. Dobrym markerem aktywacji tych komórek po hodowli z antygenem/alergenem, jest ocena antygenu PCNA (proliferating cells nuclear antigen) w komórkach (met. immunocytoenzymatyczne) czy nads¹czach (met. ELISA). Tak¿e badanie antygenu proliferacyjnego Ki-67 po hodowli limfocytów z alergenem, jest
markerem aktywacji swoistej [38,39]. Podejmowane by³y
tak¿e badania cyklu komórkowego pod wp³ywem swoistego alergenu [40] oraz w nadwra¿liwoœci na leki [41].
Wysoki stopieñ alergizacji spo³eczeñstwa nakazuje
obowi¹zek poszukiwania szybkich, a jednoczeœnie czu³ych, swoistych metod oceny aktywacji komórek. Nasilaj¹cy siê problem nadwra¿liwoœci na leki czy pokarmy, stanowi niejednokrotnie powa¿ny problem diagnostyczny.
Wydaje siê, ¿e ocena ekspresji antygenu CD69 – markera wczesnej aktywacji – mo¿e spe³niaæ kryteria wiarygodnego testu [42]. Badanie mo¿e byæ przeprowadzone
z niewielkiej objêtoœci krwi pobranej na antykoagulant [43]
b¹dŸ z wyizolowanych z komórek jednoj¹drowych. Po
stymulacji swoistym antygenem/alergenem wprowadzane s¹ przeciwcia³a monoklonalne sprzê¿one z barwnikami fluoryzuj¹cymi np. anty-CD69 FITC (marker wczesnej aktywacji) oraz inne ró¿nicuj¹ce komórki np. antyCD3 RPE. Analiza przeprowadzana jest w cytometrze
przep³ywowym. Komórki wykazuj¹ce podwójn¹ ekspresjê tzn. [ CD3(+)CD69(+)], bêd¹ stanowi³y populacjê
aktywowanych limfocytów T [44,45].
Ostatnio wiele uwagi badacze poœwiêcaj¹ oznaczeniom granzymów B nie tylko w aspekcie potencjalnego
mediatora zapalenia alergicznego, uwalnianego z bazofili,
ale tak¿e pochodz¹cego z aktywowanych limfocytów.
Grupa badaczy niemieckich wykaza³a wzrost ekspresji
granzymów B (grB) w limfocytach CD3+, CD8+, CD16/
56+ pochodz¹cych z BAL po 42 godz. SAP (segmental
alergen provocation) u chorych na alergiczn¹ astmê
oskrzelow¹ w porównaniu do grupy kontrolnej (prowokacja sol¹ fizjologiczn¹). Jednoczeœnie wykonano oznaczenie stê¿enia grB w pop³uczynach, które tak¿e by³o wy¿sze u chorych po prowokacji alergenowej. Autorzy sugeruj¹ istotn¹ rolê granzymów B – pochodz¹cych z limfocytów – w alergicznej astmie oskrzelowej [46].
Nadmieniæ nale¿y, ¿e pomocnym badaniem mo¿e byæ
okreœlenie – w nads¹czach po hodowli limfocytów – stê¿enia IL-5 – szczególnie w in vitro detekcji uczulenia na
leki [47].
Powy¿ej przedstawiony przegl¹d testów aktywacji
komórek wskazuje na szerokie mo¿liwoœci ich wykorzystania tak¿e w diagnostyce immunologicznej chorób alergicznych oraz innych postaci nadwra¿liwoœci. Niew¹tpliwie wymagaj¹ one badañ potwierdzaj¹cych przydatnoœæ
kliniczn¹.
Grzegorczyk J£, Kujawiak M, K³os Z. Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwoœci
71
Piœmiennictwo
1. Schroeder JT, Kagey-Sobotka A, Lichtenstein LM. The role of
basophil in allergic reaction. Allergy 1995; 50: 463-72.
2. Ka³³a M, Rozniecki J, Grzegorczyk J. Ocena zale¿noœci miedzy
uwalnianiem histaminy z bazofili pod wp³ywem alergenu
py³kowego i wra¿liwoœci¹ oskrzeli na wziewn¹ polimyksynê B
polimyksynê stanem klinicznym chorych na astmê py³kow¹
odczulanych pollineksem. Pneumonol Pol 1984; 52: 279-86.
3. Kuna P, Reddigari SR, Schall TJ, Ruciñski D, Sadick M, Kaplan
AP. Characterization of the human basophil response to
cytokines, growth factors, and histamine releasing factors of the
intercrine/chemokine family. J Immunol 1993; 150: 1932-43.
4. Mac Glashan DW. Releasability of human Basophil: Cellular
sensitivity and maximal histamin release are independent variables.
J Clin Immunol 1993; 91: 605-15.
5. Radermecker MF, Leclercque MD, Mariz SD, Louis RE. Basophil
releasability in patients with hymenoptera venom allergy. Int
Arch Allergy Immunol 1993; 101: 283-87.
6. Shore PA. The chemical determination of histamine. (w) Analysis
of biogenic amines and their related enzymes. Glick D (red.).
Interscience Publishers, Inc. N.Y. 1971; 89-97.
7. Skov PS, Norn S, Weeke B.A new method for detecting histamine
release. Agents Actions 1984; 14: 414-16.
8. Nolte H, Schiotz O, Skov SP. A new glass microfibre – based
histamine analysis for allergy testing in children. Allergy 1987;
83: 366-73.
9. Nolte H, Storm K, Schiøtz O. Diagnostic value of a glass fibrebased histamine analysis for testing in children. Allergy 1990;
45: 1-11.
10. Siriganian PS, Hook Wa. Histamine release and assay methods
for the study of human allergy. (w) Manual of Clinical Laboratory
Immunology 1992: 709-22.
11. van Toorenebergen AW, Vermeulen AM. Histamine release from
human peripheral blood leukocytes analyzed by histamine
radioimmunoassay. Agents Actions 1990; 30: 278-80.
12. Ostergaard PA, Ebbsen F, Nolte H, Skov PS. Basophil histamine
release in the diagnosis of house dust mite and dander allergy of
asthmatic children. Comparison between prick test, RAST,
basophil histamine release and bronchial provocation. Allergy
1990; 45: 231-35.
13. Crockard AD, Ennis M. Basophil histamine release test in the
diagnosis of allergy and asthma. Clin Exp Allergy 2001; 31:
345-50.
14. Norgaard A, Skov PS, Bindslev-Jensen C. Egg and milk allergy in
adults: comparison between fresh foods and commercial allergen
extracts in skin prick test and histamine release from basophiles.
Clin Exp Allergy 1992; 22: 940-47.
15. Hansen TK, Bindslev-Jensen C, Skov PS, Poulsen LK. Codfish
allergy in adults. Specific tests for IgE and histamine release vs
double – blind, placebo – controlled challenges. Clin ExpAllergy
1996; 26: 1276-85.
16. Demony P, Lebel B, Messaad D, Sahla H, Rongier M, Daures JP,
Godard P, Bosquet J. Predictive capacity of histamine release for
the diagnosis of drug allergy. Allergy 1999; 54: 500-6.
17. Eberlein-Kõnig B, Kolsouzidou S, Przybiela B. Changes of
histamine release and leukotriene release during specific vespid
venom hyposensitization. Allergo J 1997; (suppl. 1): S42-S43.
18. van der Linden P-WG, Hack CE, Poortman J, Vivié-Kipp YC,
Struyvenberg A, Van der Zwan JK. Insect challenge in 138
patients: relation between clinical severity of anaphylaxis and
mast cell activation. J Allergy Clin Immunol 1992; 90: 110-8.
19. Schwartz LB, Matcalfe DD, Miller JS, Earl H, Sullivan T.
Tryptase levels as an indicator of mast-cell activation in systemic
anaphylaxis and mastocytosis. N Engl J Med 1987; 316: 1622-6.
20. Komericki P, Arbab E, Grims R, Kränke B, Aberer W. Tryptase
as severity marker in drug provocation tests. Intern Archiv of
Allergy and Immunol 2006; 140(2): 164-69.
21. Jogie-Brahim S, Hae-Ki M, Fukuoka Y, Xia H-Z, Schwartz LB.
Expression of a-tryptase and b-tryptase by human basophils.
J Allergy Clin Immunol 2004; 113: 1086-92.
22. Foster B, Schwartz LB, Devouassoux G, Matcalf DD, Prussin
C. Characterization of mast-cell tryptase-expressing peripheral
blood cells as basophils. J Allergy Clin Immunol 2002; 109:
287-93.
23. Rossi RE, Monasterolo G, Operti D. A comparative study of
tryptase release test and the cellular antigen stimulation test
(CAST) in mite sensitive patients. Clin Exper Allergy 1998; 28:
752-57.
24. Tschopp C M, Spiegi N, Luymann W, Julis P, Virchow JC, Hack
CE, Dahinden CA. Granzyme B, a novel mediator of allergic
inflammation and release in blood basophils and human asthma.
Immunobiology 2006; 108: 2290-99.
25. Knol EF, Mul FPJ, Jansen H, Calafat J, Roos D. Monitoring
human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435.
J Allergy Clin Immunol 1991; 88: 328-38.
26. Monneret G, Gutowski MC, Bienvenu J. Detection of allergeninduced basophil activation by expression of CD63 antigen using
tricolour flow cytometric method. Clin Exp Immunol 1999; 115:
393-96.
27. Bumiza R, Monneret G, Forissier MF, Savoye J, Gutowski MC,
Powell WS, Bienvenu J. Marked improvement of the basophil
activation test by detecting CD203c instead of CD63. Clin Exp
Allergy 2003; 33: 259-65.
28. Bühring HJ, Simmons PJ, Pudney M i wsp. The Monoclonal
antibody 97A6 defines a novel surface antigen expressed on
human basophil and Ther multipotent and unipotent progenitors.
Blood 1999; 94: 2343-56.
29. Platz IJ, Binder M, Marxer A, Lischka G, Valent P, Bühring HJ.
Hymenoptera-venom-induced upregulation of the basophil
activation marker ecto-nucleotide pyrophosphatase/
phosphodiesterase 3 in sensitized individuals. Int Arch Allerg
Immunol 2001; 126: 335-42.
30. Kahlert H, Cromwell O, Fiebig H. Measurement of basophilactivating capacity of grass pollen allergens, allergoids and
hypoallergenic recombinant derivatives by flow cytometry using
anti-CD203c. Clin Exp Allergy 2003; 33 (9): 1266-72.
31. Bühring HJ, Streble A, Valent P. The basophil-specific
ectoenzyme E-NPP3 (CD203c) as a marker for cell activation
and allergy diagnosis. Int Arch Allergy Immunol 2004; 133(4):
317-29.
32. Boumiza R, Debard AL., Monneret G. The basophil activation
test by flow cytometry: recent developments in clinical studies,
standarization and emerging perspectives. Clin Mol Allerg 2005;
3: 9-17.
33. Kowalski ML, Ptasiñska Ptasiñska, Jêdrzejczak M, Bienkiewicz
B, Cieœlak M, Grzegorczyk J, Pawliczak Pawliczak, DuBuske
L. Aspirin-tiggered 15-HETE generation in peripheral blood
leukocytes is a specific and sensitive patients identification test
(ASPITest). Allergy 2005; 1-7.
34. Szkudliñska B, Grzegorczyk J. Metody oceny komórkowych
mechanizmów odpowiedzi immunologicznej. (w Immunologia
kliniczna. ML. Kowalski (red.) 2000: 765-86.
72
35. Grzegorczyk J, Ro¿niecki J, Ka³³a M. Test hamowania migracji
leukocytów (THML) u chorych na astmê py³kow¹
z uwzglêdnieniem leczenia odczulaj¹cego preparatem
„POLLINEX”. Pneum Pol 1984; LII, 3: 123-30.
36. Klein R, Schwenk M, Heinrich-Ramm R, Templeton DM.
Diagnostic relevance of the lymphocyte transformation test for
sensitization to berylium and other metals. Pure Appl Chem
2004; 6: 1269-81.
37. Nyfeler B, Pichler WJ. The lymphocyte transformation test for
the diagnosis 0f drug allergy: sensitivity and specificity. Cli Exper
Allergy 1997; 27(2): 175.
38. Grzegorczyk J. Badanie wybranych czynników aktywacji oraz
prze¿ywalnosci komórek uczestnicz¹cych w zapaleniu
alergicznym IgE-zale¿nym. Folia Medica Lodziensia 2005; 32
s.1. (Rozprawa habilitacyjna).
39. Cordone I, Matutes E, Catovsky D. Characterisation of normal
peripheral blood cells in cykle identified by monoclonal antibody
Ki-67. J Clin Pathol 1992; 45: 201-205.
40. Grzegorczyk J, Cha³ubiñski M, Kowalski ML: Apoptoza
komórek jednoj¹drowych krwi obwodowej (PBMC)
w odniesieniu do cyklu komórkowego u chorych z alergi¹ IgEzale¿n¹. Alergia Astma Immunologia 2004; 9, (supl.2): 108.
41. Sabbah A, Bruchmann C, Drouet M, Vitale L, Laureat MG. Study
of the cell cycle using Flow cytometry in drug allergy. Allerg
Immunol 1993; 25(3): 91-7.
Alergia Astma Immunologia 2008, 13(2): 67-72
42. Caruso A, Licenziati S, Corulli M, De Francesco MA,
Florentini S, Peroni L, Fallacara F, Dima F, Balsari A, Turano A.
Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T
cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry 1997;
27: 71-6.
43. Lim LCL, Fiordalisi MN, Mantel JL, Schmitz JL, Folds JD.
A whole-blood assay for qualitative and semiquantitative
measurements of CD69 surface expression on CD4 and Cd8
T lymphocytes using Flow Cytometry. Clin Diag Lab Immunol
1998: 392-98.
44. Gibbons DC, Evans TG. CD69 expression after antigenic
stimulation. Cytometry 1996; 23: 260-61.
45. Simms PA Ellis T. Utility of Flow cytometric detection of CD69
expression as a rapie method for determining Poly- and Oligoclonal
lymphocyte activation. Clin Diag Lab Immunol 1996; 3: 301-304.
46. Bratke K, Bõttcher B, Leeder K, Schmidt S, Küpper M,
Virchow JC. Increase in granzyme B+ lymphocytes and souble
granzyme B in bronchoalveolar lavage of allergen challenged
patients with atopic asthma. Clin Exp Immunol 2004; 136:
542-48.
47. Sachs B, Erdman S, Malte Baron J, Neis M, al. MasaoudiT,
Merk HF. Determination of interleukin-5 secretion from drugspecific activated ex vivo peripheral blood mononuclear cells as
a system for the in vitro detection of drug sensitization. Clinical
Experimental Allergy 2002; 32(5): 736-744.
Grzegorczyk J£, Kujawiak M, K³os Z. Testy aktywacji komórek w alergii i nadwra¿liwoœci
73
Szanowni Czytelnicy,
Mi³o nam poinformowaæ, i¿ na ³amach czasopisma „Alergia Astma Immunologia – przegl¹d kliniczny” prowadzimy Testowy
Program Edukacyjny (TPE) w dziedzinie alergologii. Maj¹cy akredytacjê Polskiego Towarzystwa Alergologicznego Program
Testowy ma umo¿liwiæ lekarzom uzyskiwanie punktów edukacyjnych zgodnie z zarz¹dzeniem Ministra Zdrowia w sprawie
sposobów dope³nienia obowi¹zku doskonalenia zawodowego lekarzy i lekarzy dentystów z dnia 6 paŸdziernika 2004 r. Program
ten stanowi równoczeœnie element realizowanego przez PTA Programu Edukacyjnego, którego jednym z zadañ jest dotarcie do
lekarzy ró¿nych specjalnoœci z aktualn¹ wiedz¹ z zakresu alergologii.
W kolejnych numerach czasopisma „Alergia Astma Immunologia – przegl¹d kliniczny” ukazuj¹ siê artyku³y pogl¹dowe
publikowane dla celów szkolenia podyplomowego. Do ka¿dego artyku³u za³¹czone bêdzie 10 pytañ testowych. Po wype³nieniu
i odes³aniu karty odpowiedzi, znajduj¹cej siê na koñcu czasopisma, ka¿dy lekarz bêdzie mia³ odnotowan¹ liczbê punktów
edukacyjnych na swoim indywidualnym koncie prowadzonym w redakcji czasopisma. Raz w roku lekarz bêdzie otrzymywa³
certyfikat potwierdzaj¹cy uzyskanie okreœlonej liczby punktów edukacyjnych.
Prawid³owe odpowiedzi bêd¹ publikowane w kolejnych numerach kwartalnika.
Wype³nion¹ KARTÊ ODPOWIEDZI nale¿y przes³aæ do dnia 30 listopada 2008 r. na adres:
MEDITON
ul. Sienkiewicza 101-109/115
90-301 £ódŸ
Pytania
1. Ryzyko wyst¹pienia reakcji anafilaktycznej wystêpuje
szczególnie u pacjentów:
a. uczulonych na lateks, truskawki oraz jad mrówek,
b. pokarmy, jad owadów b³onkoskrzyd³ych i loratadynê,
c. pokarmy, jad owadów b³onkoskrzyd³ych, lateks,
d. z ciê¿k¹ postaci¹ nadwra¿liwoœci na aspirynê, inne
niesteroidowe leki przeciwzapalne oraz antybiotyki,
e. odpowiedŸ c i d jest prawid³owa.
2. Do mediatorów zapalenia uwalnianych przez bazofile nie
nale¿¹:
a. histamina, granzym B,
b. tryptaza, chymaza,
c. odpowiedzi a i b s¹ prawid³owe,
d. IL-3, RANTES,
e. leukotrieny cysteinylowe.
3. Tryptaza jest:
a. modelowym markerem aktywacji komórek tucznych,
b. uwalniana z p³ytek krwi,
c. uwalniana z bazofili w iloœciach porównywalnych
jak z mastocytów,
d. odpowiedzi a i b s¹ prawid³owe,
e. odpowiedzi a i c s¹ prawid³owe.
4. Testem wykorzystywanym do oceny aktywacji eozynofili
jest:
a. test immunoenzymatyczny oceniaj¹cy poziom bia³ka ECP,
b. test HRT,
c. test TRT,
d. badanie Ag proliferacyjnego Ki-67,
e. odpowiedzi b i c s¹ prawid³owe.
5. Które zdanie jest prawdziwe:
a. powszechnie stosowanym testem aktywacji limfocytów jest test hamowania migracji,
b. obecnie do oceny aktywacji limfocytów stosuje siê
cytometryczn¹ metodê oznaczania markera Ki-67,
c. obecnie do oceny aktywacji limfocytów stosuje siê
immunoenzymatyczn¹ metodê oznaczania markera Ki-67,
d. test transformacji blastycznej jest powszechnie stosowanym testem wspomagaj¹cym diagnostykê nadwra¿liwoœci na leki,
e. odpowiedzi b i c s¹ prawid³owe.
6. Wybierz stwierdzenie prawdziwe:
a. stê¿enie histaminy w pe³nej krwi wynosi 20-200
ng/ml,
b. stê¿enie histaminy w pe³nej krwi wynosi 1-30 ng/ml,
c. w granulach jednej komórki bazofilowej cz³owieka
znajduje siê ok. 1pg histaminy,
d. w granulach jednej komórki bazofilowej cz³owieka
znajduje siê ok. 1ng histaminy,
e. odpowiedzi a i c s¹ prawid³owe.
7. Rozpoznanie alergii opiera siê g³ównie na:
a. wywiadzie klinicznym,
b. badaniu fizykalnym,
c. testach skórnych,
d. oznaczaniu swoistych przeciwcia³ klasy IgE w surowicy pacjentów,
e. wszystkie odpowiedzi s¹ prawid³owe.