Wp³yw swoistej i nieswoistej aktywacji na ekspresję

167
Alergia Astma Immunologia, 1998, 3(3), 167-170
Wp³yw swoistej i nieswoistej aktywacji na ekspresjê
receptorów histaminowych na limfocytach i neutrofilach
TERESA ¯AK-NEJMARK, MARIA KRAUS-FILARSKA, JÓZEF MA£OLEPSZY, RENATA JANKOWSKA,
IWONA ANNA NOWAK, GRA¯YNA NADOBNA
Katedra i Klinika Chorób Wewnêtrznych i Alergologii Akademii Medycznej, ul. Traugutta 57/59, 50-417 Wroc³aw
Z licznych badañ wynika, ¿e histamina jest nie tylko mediatorem reakcji alergicznych, ale tak¿e czynnikiem reguluj¹cym
odpowiedŸ immunologiczn¹. Poprzez receptory histaminowe (powierzchniowe i wewn¹trzcytoplazmatyczne) histamina
wywiera wp³yw na biologiczn¹ aktywnoœæ komórki.
Celem prezentowanej pracy by³a ocena ekspresji receptorów histaminowych na limfocytach i neutrofilach,
niestymulowanych i stymulowanych swoiœcie alergenami (¿ycicy trwa³ej i mieszanin¹ py³ków traw B2) oraz nieswoiœcie
(fMLP) u osób atopowych i w grupie kontrolnej. Komórki inkubowano z alergenami w szerokim zakresie stê¿eñ (1pg-1µg/ml),
nastêpnie dodawano znakowanej fluorescein¹ histaminy i po inkubacji liczono procent wyznakowanych komórek.
Stwierdzono, ¿e w grupie kontrolnej odsetek wyznakowanych komórek nie zmienia siê pod wp³ywem badanych alergenów.
Natomiast w grupie osób uczulonych, pod wp³ywem swoistego alergenu, obserwowano znamienny wzrost odsetka komórek
wyznakowanych (p<0,01). Maksymalny wp³yw u poszczególnych osób atopowych waha³ siê w zale¿noœci od stê¿enia alergenu,
jednak¿e wzrost odsetka wyznakowanych komórek wystêpowa³ u wszystkich badanych. Równolegle do badanego wp³ywu
swoistego alergenu w obu grupach oceniano wp³yw fMLP (10-8M) na ekspresjê receptorów histaminowych. W obu badanych
grupach obserwowano znamienny wzrost odsetka wyznakowanych komórek po preinkubacji z fMLP (p<0,001).
Na tej podstawie mo¿na wnioskowaæ, ¿e jednym z przejawów aktywacji komórek, swoistej (alergen) i nieswoistej (fMLP),
jest zwiêkszona ekspresja receptorów histaminowych.
WSTÊP
Histamina jest powszechnie wystêpuj¹cym,
zarówno w œwiecie roœlinnym jak i zwierzêcym,
mediatorem ró¿norakich reakcji biologicznych.
W organizmie ludzkim, podobnie jak u innych ssaków,
amina ta jest stale produkowana i magazynowana,
g³ównie w ziarnistoœciach komórek tucznych, bazofilach
oraz w p³ytkach krwi. Dzia³anie biologiczne histaminy
obejmuje funkcje fizjologiczne oraz patologiczne
i dokonuje siê ono za poœrednictwem czterech typów
receptorów. Receptory typu H1, H2 i H3 znajduj¹ siê na
powierzchni b³on komórkowych, natomiast Hic jest
receptorem wewn¹trzkomórkowym [1,2,3]. Uwalniana
podczas reakcji alergicznych histamina wywiera
dzia³anie prozapalne poprzez receptor H1. Klinicznie
dzia³anie to manifestuje siê przede wszystkim skurczem
miêœni g³adkich oskrzeli i jelit, rozszerzeniem naczyñ
obwodowych, zwiêkszon¹ przepuszczalnoœci¹ naczyñ
i œwi¹dem [4,5]. Zainteresowanie histamin¹, jako
modulatorem reakcji immunologicznych, pojawi³o siê
w wyniku licznych obserwacji, mówi¹cych o hamowaniu
przez histaminê niektórych procesów, za poœrednictwem
receptora typu H 2 [3,6,7]. Stwierdzono równie¿,
-5
¿e histamina w stê¿eniach wy¿szych ni¿ 10 M wywiera
wp³yw supresyjny na odpowiedŸ immunologiczn¹,
zarówno komórkow¹ jak i humoraln¹, natomiast
w stê¿eniach ni¿szych zwiêksza oba typy
odpowiedzi [6,8]. Receptory histaminowe stanowi¹
heterogenn¹ grupê bia³ek, przy³¹czaj¹cych ró¿ne
elementy strukturalne cz¹steczki histaminy. Zjawisko to
jest szeroko wykorzystywane w terapii poprzez
stosowanie zwi¹zków blokuj¹cych odpowiedni receptor
i tym samym ograniczaj¹cym oddzia³ywanie histaminy
za jego poœrednictwem. Kierunek i efektywnoœæ dzia³ania
histaminy zale¿y od aktualnej liczby (w chwili dzia³ania
bodŸca), stopnia powinowactwa i typu receptorów
znajduj¹cych siê na komórkach.
Celem pracy by³o zbadanie czy ekspresja
receptorów dla histaminy na komórkach bior¹cych udzia³
w procesach alergiczno-zapalnych podlega dynamicznym
zmianom pod wp³ywem bodŸców œrodowiskowych oraz
czy aktywacji komórek (nieswoistej i swoistej) towarzyszy
zmiana w ekspresji tych receptorów. Badania zosta³y
wykonane z u¿yciem zsyntetyzowanego ostatnio
bezpoœredniego po³¹czenia histaminy z fluorescein¹. Taki
zwi¹zek znacz¹co ró¿ni siê od poprzednio stosowanych
do badañ po³¹czeñ histaminy, w których to po³¹czone by³y
oddzielnie cz¹stki histaminy i fluoresesceiny do noœnika
bia³kowego. Po³¹czenia takie wi¹za³y siê równie¿
niespecyficznie do komórek [9].
Alergia Astma Immunologia, 1998, 3(3), 167-170
grupa
% komórek wyznakowanych
limfocyty
neutrofile
medium
fMLP
medium
fMLP
zdrowi
chorzy
10,7±2,2
13,0±4,1
27,0±5,3*
19,6±5,7*
19,1±5,6 31,0±9,5*
25,5±17,8 44,8±14,2*
* p<0,05
chory
5pg
100pg
1ng
± 7,8
± 4,3
± 3,8
± 6,0
50pg
± 2,3
0
± 2,4
0
± 2,7
5
± 2,1
10
± 3,2
± 4,6
± 4,1
15
± 6,3
*
± 2,0
zdrowy
20
± 10.8
25
100ng 1000ng
stê¿enie alergenów / ml
Ryc. 1. Wp³yw alergenów mieszaniny py³ków traw B2
(Biomed, Kraków) na ekspresjê receptorów histaminowych
limfocytów osób zdrowych i chorych na py³kowicê
*p<0,05
Rycina 1 ilustruje wp³yw alergenów mieszaniny
py³ków traw (B2) na wi¹zanie znakowanej histaminy
przez limfocyty osób zdrowych i uczulonych na py³ki traw.
W grupie osób zdrowych liczba wyznakowanych
fluorescein¹ limfocytów, inkubowanych z alergenami, nie
ró¿ni³a siê znamiennie w porównaniu do liczby
wyznakowanych komórek inkubowanych jedynie
w medium. U osób uczulonych widoczny jest wzrost
odsetka komórek wi¹¿¹cych znakowan¹ histaminê
w ca³ym badanym zakresie stê¿eñ (5pg-1000ng/ml), a przy
stê¿eniu 1000pg/ml jest on znamienny statystycznie.
45
*
*
± 1 8,6
35
± 6,8
± 8,2
± 6,5
± 6,5
± 5 ,0
10
± 5 ,6
15
± 5 ,5
20
± 1 2 ,7
25
± 9,6
30
*
± 1 3 ,2
c hory
± 2 3 ,0
z d r ow y
± 8,2
40
± 7,6
WYNIKI
W tabeli I przedstawiono wi¹zanie znakowanej
histaminy przez spoczynkowe i stymulowane przez
fMLP limfocyty i neutrofile osób zdrowych i chorych
na py³kowicê. Stwierdzono, ¿e fMLP znamiennie
zwiêksza odsetek limfocytów i neutrofilów wi¹¿¹cych
znakowan¹ histaminê, zarówno w grupie osób zdrowych
jak i chorych na py³kowicê (p<0,05).
Tabela I. Wp³yw fMLP w stê¿eniu 10 -8M na wi¹zanie
znakowanej fluorescein¹ histaminy przez limfocyty
i neutrofile osób zdrowych i chorych na py³kowicê
% komórek w yznakow anych
MATERIA£ I METODY
Badania przeprowadzono u 24 chorych na
py³kowicê (12 kobiet i 12 mê¿czyzn) o œredniej wieku
32 lata; œredni czas trwania choroby wynosi³ 12 lat.
U osób tych test skórny (prick) z alergenami B2
mieszaniny py³ków traw (mietlicy bia³awej, miot³y
zbo¿owej, grzebienicy pospolitej, kostrzewy ³¹kowej,
k³osówki we³nistej, ¿ycicy trwa³ej i tymotki ³¹kowej)
oraz trawy ¿ycicy trwa³ej (Lolium perenne), firmy
Biomed (Kraków) by³ dodatni. W trakcie badania
pacjenci przez minimum 120 godzin nie otrzymywali
antagonistów receptorów histaminowych (H1). Grupê
kontroln¹ stanowi³o 12 osób zdrowych (6 kobiet
i 6 mê¿czyzn), nie obci¹¿onych w wywiadzie chorobami
alergicznymi, o œredniej wieku 28 lat. Test skórny (prick)
z badanymi alergenami u tych osób by³ ujemny.
Izolacja limfocytów i neutrofilów: Komórki
izolowano wg metody Zemana, z krwi pobranej z ¿y³y
³okciowej do probówki zawieraj¹cej heparynê
(10jedn./ml) [10]. Z frakcji mononuklearów usuwano
monocyty, pos³uguj¹c siê metod¹ p³ytkow¹ [11]. Po
izolacji sprawdzano ¿ywotnoœæ komórek b³êkitem
trypanu, która zazwyczaj wynosi³a powy¿ej 97%.
Wi¹zanie znakowanej histaminy przez komórki:
6
200µl zawiesiny komórek (2x10 komórek/ml) w PBS
preinkubowano z badanymi alergenami w zakresie stê¿eñ
1pg – 1000ng i fMLP (N-formylo-metionylo-leucyno-8
fenyloalanina) w stê¿eniu 10 M, przez 15 min.
w temperaturze pokojowej. Kontrolê stanowi³y komórki
inkubowane wy³¹cznie w medium. Po odwirowaniu,
komórki zawieszano w 200 µl PBS i dodawano 20 µl
histaminy znakowanej fluorescein¹, (Histamine
fluorescein, firmy Molecular Probes, USA), do
-5
koñcowego stê¿enia 10 M. Zawiesinê komórek
inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min.
Po inkubacji liczono w mikroskopie fluorescencyjnym
(Olympus BX-50) procent komórek wyznakowanych
fluorescein¹, przy powiêkszeniu 40x10.
Analiza statystyczna: Uzyskane wyniki poddano
analizie statystycznej obliczaj¹c œrednie arytmetyczne
i odchylenie standardowe (SD). Istotnoœæ ró¿nic miêdzy
œrednimi arytmetycznymi badano testem t-Studenta
przyjmuj¹c za poziom istotnoœci p<0,05.
% ko m ó r e k wyzn ako wa n ych
168
5
0
0
5pg
5 0 pg
1 0 0p g
1ng
1 0 0n g
1 0 00 n g
s tê ¿e n ie a le r g e n ów / m l
Ryc. 2. Wp³yw alergenów mieszaniny py³ków traw B2
(Biomed, Kraków) na ekspresjê receptorów histaminowych
neutrofilów osób zdrowych i chorych na py³kowicê
*p<0,05
¯ak-Nejmark T. i wsp. Wp³yw swoistej i nieswoistej aktywacji na ekspresjê receptorów histaminowych ...
Na ryc.2 przedstawiono, w obu badanych
grupach, wp³yw alergenów mieszaniny py³ków traw na
neutrofile. Jedynie u osób uczulonych inkubacja komórek
z alergenami (w stê¿eniach 1-1000ng/ml alergenu)
powodowa³a statystycznie znamienny wzrost liczby
wyznakowanych neutrofilów.
W badanych grupach oceniano równoczeœnie
wp³yw alergenów trawy ¿ycicy trwa³ej (Lolium perenne),
na ekspresjê receptorów histaminowych.
169
±
± 20 ,0
± 11 ,6
± 6,5
± 5,9
± 5,6
± 8,2
± 5,5
± 7,6
± 19 ,3
± 17 ,1
± 3 ,3
± 2 ,6
± 2 ,7
± 4 ,3
±3 ,7
± 2 ,2
%
% k o m ór e k w y z na k o w a n y c h
± 5 ,0
± 4 ,7
ko m ó r e k w y z n a k o w a n y c h
5 ,1
± 6 ,0
DYSKUSJA
W przedstawionej pracy wykonywaliœmy
równolegle ocenê wp³ywu swoistego (alergen)
i nieswoistego (fMLP) bodŸca na limfocyty i neutrofile,
zarówno osób uczulonych na dany alergen, jak
i nieuczulonych. Stwierdziliœmy, ¿e nieswoista
aktywacja prowadzi do znamiennego wzrostu odsetka
komórek wi¹¿¹cych histaminê w obu badanych grupach.
Natomiast bodziec swoisty (alergen) jedynie u osób
uczulonych powodowa³ istotny statystycznie wzrost
25
*
odsetka komórek wi¹¿¹cych histaminê. Mo¿na zatem
*
z d ro w y
c h ory
20
s¹dziæ, ¿e aktywacja komórek, niezale¿nie czy w wyniku
*
dzia³ania bodŸca swoistego, czy nieswoistego, przejawia
15
siê miêdzy innymi wzrostem liczby komórek wi¹¿¹cych
histaminê.
10
Do czynników powoduj¹cych nieswoist¹
aktywacjê komórek nale¿¹ N-formylowane polipeptydy,
5
których syntetycznym przedstawicielem jest fMLP.
0
W licznych badaniach wykazano, ¿e fMLP w stê¿eniu
0
1pg
1 0 pg
1 0 0p g
1 0 00 p g
-8
10 M jest nie tylko czynnikiem chemotaktycznym
s t • • e n ie a le r g e n ó w / m l
i zwiêkszaj¹cym metabolizm komórkowy, lecz równie¿
Ryc. 3. Wp³yw alergenów trawy Lolium perenne na ekspresjê powoduje liczne zmiany procesów komórkowych m.in.
receptorów histaminowych na limfocytach osób zdrowych
wzrost sekrecji, degranulacjê, uwalnianie metabolitów
i chorych na py³kowicê
komórkowych, wytwarzanie rodników ponadtlen*p<0,05
kowych, ponadto zwiêksza agregacjê i adhezjê komórek
Ryc.3 przedstawia wp³yw alergenów ¿ycicy do œródb³onka. Wykazano tak¿e, ¿e aktywowane komórki
trwa³ej na wi¹zanie znakowanej histaminy przez charakteryzuj¹ siê zwiêkszon¹ ekspresj¹ receptorów
limfocyty. W grupie osób zdrowych, odsetek komórek b³onowych [12].
wyznakowanych nie zmieni³ siê istotnie statystycznie
Podstawow¹ rolê w ujawnianiu i rozwoju reakcji
w wyniku inkubacji z alergenem w przeciwieñstwie do
alergicznych odgrywa rozpoznawanie alergenu przez
osób uczulonych, u których obserwowano znamienny
komórki regulatorowe i docelowe. Rozpoznawanie to
statystycznie wzrost liczby wyznakowanych komórek po
dokonuje siê albo z udzia³em receptora dla antygenu TCR
ich inkubacji z alergenami w stê¿eniach 10pg-1ng/ml,
(T cell receptor) na limfocytach T, albo na innych
p<0,05.
komórkach za poœrednictwem cytofilnych immuno45
globulin. Przy³¹czenie alergenu do receptora prowadziæ
*
*
z dro w y
c ho ry
40
mo¿e do aktywacji komórek. Wzrost liczby receptorów
dla histaminy – g³ównego mediatora reakcji alergicznych,
35
pod wp³ywem swoistego alergenu, ma niew¹tpliwe
30
nastêpstwa kliniczne. W leczeniu chorób alergicznych
25
powszechnie stosowane s¹, jako leki objawowe, zwi¹zki
20
konkurencyjnie w stosunku do histaminy, ³¹cz¹ce siê
15
z receptorami typu H1. Skutecznoœæ tych leków warunkuje
10
ich selektywnoϾ, powinowactwo do receptora,
5
dystrybucja narz¹dowa i aktualna liczba receptorów.
0
Wiadomo jednak, ¿e miejscowo uwalniana histamina
0
1 pg
1 0p g
1 00 p g
1 00 0 p g
-4
podczas reakcji alergicznych osi¹ga stê¿enie rzêdu 10 M,
s t • • e n ie a le r g e n ó w / m l
natomiast przy stosowaniu zalecanych dawek leków,
Ryc. 4. Wp³yw alergenów trawy Lolium perenne na ekspresjê tkankowe jej stê¿enie ocenia siê na 10-7M [9].
receptorów histaminowych na neutrofilach osób zdrowych
Z badañ innych autorów wynika, ¿e ekspresja
i chorych na py³kowicê
receptorów
histaminowych jest modulowana przez ró¿ne
*p<0,05
czynniki. Shibata i wsp. [13] wykazali, ¿e aktywacja
W frakcjach neutrofilów osób zdrowych supresorowych limfocytów T konkawalin¹ A (Con A)
i uczulonych, po inkubacji z alergenami ¿ycicy trwa³ej, i interleukin¹ 2 prowadzi do znamiennego wzrostu
tylko w grupie osób uczulonych widoczny jest znamienny ekspresji receptorów H 2 w porównaniu do
wzrost odsetka wyznakowanych komórek, p<0,05
nieaktywowanych limfocytów T. Zwiêkszon¹ znamiennie
170
Alergia Astma Immunologia, 1998, 3(3), 167-170
ekspresjê mRNA dla receptora histaminowego typu H1,
u pacjentów z objawami uczulenia na roztocze kurzu
domowego, w komórkach œluzówki nosa w porównaniu
do grupy kontrolnej wykazali Iriyoshi i wsp. [14].
Na podstawie przedstawionych danych mo¿na
s¹dziæ, ¿e jednym z przejawów aktywacji komórek jest
zwiêkszona ekspresja receptorów dla histaminy.
Podziêkowania: Autorzy dziêkuj¹ Pani Krystynie Baranieckiej za
pomoc w wykonaniu doœwiadczeñ.
Piœmiennictwo
1. Brandes L.J., La Bella F.S.: Identification of intracellular
histamine receptor (Hic) that regulates cell proliferation. Adv.
Biosci. 1993; 89: 31-41.
2. Haaksma E.E.J., Leurs R., Timmerman H.: Histamine
receptors: subclasses and specific ligands. Pharmac. Ther. 1990;
47: 73-104.
3. Pearce F.L.: Biological effects of histamine: An overview.
Agents and Actions 1991; 33: 4-7.
4. Falus A., Meretey K.: Histamine: an early messenger in
inflammatory and immunology reactions. Immunol. Tod. 1992;
13: 154-156.
5. Whithe M.V.: The role of histamine in allergic diseases. J.
Allergy Clin. Immunol. 1990; 86: 599-605.
6. Beer D.J., Rocklin R.E.: Histamine-induced suppressor – cell
activity. J. Allergy Clin. Immunol. 1984; 73: 439-452.
7. Beer D.J., Rocklin R.E.: Histamine modulation of lymphocyte
biology: membrane receptors, signal transduction, and
functions. CRC Critical Rev. Immunol. 1987; 7: 55-91.
8. Plaut M., Lichtenstein L.M.: Histamine and immune responses.
W: Pharmacology of histamine receptors. (ed.) Ganellin C.R.,
Parsons M.G. Wright, London, 1982: 392-435.
9. Harris J.N., Hutchinson J.V.: A novel fluorescein-histamine
reagent to quantitate histamine receptor expression on
leukocytes. Int. J. Immunopharmac. 1994; 16: 633-640.
10. Zeman K. i wsp.: Prosta i szybka metoda równoczesnej izolacji
z krwi obwodowej wysoce oczyszczonych limfocytów
i granulocytów obojêtnoch³onnych. Immunol. Pol. 1988; 23:
217-224.
11. Hunt S.V.: Preparation of lymphocytes and accessory cells.
(ed.) Klaus Cr.B.: Lymphocytes a practical approach. IRL
Press, Oxford Washington DC 1982: 1-34.
12. Fletcher M.P., Seligmann B.E., Gallin J.I.: Correlation of
human neutrophil secretion, chemoattractant receptor
mobilization, and enhanced functional capacity. J. Immunol.
1982; 128: 941-948.
13. Shibata M. i wsp.: Modulation of histamine type II receptors
on CD8+T cells by interleukin-2 and cimetidine. Int. Arch.
Allergy Immunol. 1992; 97: 8-16.
14. Iriyoshi K. i wsp.: Increased expression of histamine H1
receptor mRNA in allergic rhinitis. Clin. Exp. Allergy 1996;
26: 379-385.
An increased histamine receptor expression on lymphocytes and
neutrophils is induced by both specific and nonspecific activation
TERESA ¯AK-NEJMARK, MARIA K RAUS-FILARSKA , JÓZEF MA£OLEPSZY, RENATA JANKOWSKA,
IWONA ANNA NOWAK, GRA¯YNA NADOBNA
Summary
Numerous studies provide evidence that histamine is not only the main mediator of anaphylactic reactions
but also a potent regulator of cellular and humoral components of the immune response. Intracellular
and surface receptors on the effector cells mediate biological actions of histamine. The aim of our study
was to investigate changes in histamine receptor expression to stimulation with both specific (grass
pollen) and non-specific (fMLP) stimuli. The cells were obtained from healthy and allergic subjects.
Lymphocytes and neutrophils were preincubated with various concentration of mixed grass pollen, Lolium
perenne (1pg-1mg) and fMLP (10-8 M). Histamine fluorescein (Molecular Probes) was added and the
number of cell binding histamine was determined after incubation in fluorescens microscope. Stimulation
with allergens increased histamine binding significantly (p<0,01) only in allergic subjects. Stimulation
with fMLP resulted in significantly (p<0,001) increased histamine binding in all subjects. We conclude
that increased histamine receptor expression to both specific and unspecific stimulation appears to be
associated with lymphocytes and neutrophils activation.