2.3 zasada metody analizy polimorfizmów – dyskryminacja alleli (snp)

Wykonywanie analizy genetycznej polimorfizmu genów
2.1 ZASADA METODY SEKWENCJONOWANIA Z ZASTOSOWANIEM APARATU
ABI PRISM 310
Znakowanie
Aby dokonać analizy sekwencji DNA przy użyciu aparatu ABI PRISM 310 stosuje się
metodę sekwencjonowania cyklicznego (terminatorowego). Zasada tej metody polega na
powielaniu (amplifikacji) w milionach kopii analizowanego fragmentu DNA (PCR) z
zastosowanie specyficznych primerów. Następnie oczyszcza się produkty amplifikacji z
primerów i przeprowadza się reakcje sekwencjonowania przy użyciu znakowanych
fluorescencyjnie trójfosforanów didezoksyrybonukleotydów: ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP. Reakcja sekwencjonowania jest to tak naprawdę zmodyfikowana reakcja
amplifikacji – PCR. Zasady przeprowadzenia reakcji PCR oraz szczegółowe instrukcje
zawiera procedura SOP5006.
Elektroforeza
Otrzymane znakowane produkty amplifikacji o różnych długościach poddaje się
procesowi elektroforezy w aparacie ABIPRISM 310 wyposażonym w kapilarę z nośnikiem
polikrylamidowym o odpowiednich parametrach elektrolitycznych.
Detekcja
Kapilara podłączona jest do laserowego detektora, który wykrywa produkty
sekwencjonowania znakowane terminalnymi nukleotydami o odpowiedniej barwie. Jest to
kolor wirtualny (niebieski, zielony, żółty i czerwony), który przyporządkowany jest
poszczególnych grup barwników:
o 5-FAM, 6-FAM,
o HEX, JOE, VIC
o TAMRA, NED
o PET, ROX
Zbieranie danych
Obserwacje rozdziału elektroforetycznego oraz zbieranie danych przeprowadza się w
programie Data Collection
2.1.1 OGRANICZENIA METODY SEKWENCJONOWANIA

ryzyko fałszywie odczytanych (oznaczonych) nukleotydów wynikające z:
o kontaminacja primerami pochodzącymi z amplifikacji poprzedzającej reakcję
sekwencjo-nowania
o kontaminacją DNA pochodzącym z innych amplifikacji
o wrażliwości na substancje mające pływ na rozdział produktów sekwencjonowania
w kapilarze i na odczyt sygnału fluorescencji.
o zbyt duże stężenia nukleotydów użytych do reakcji sekwencjonowania
o niewłaściwą korekcję matrycy - nakładanie się fluorescencji rożnych barwników
pochodzących od różnych nukleotydów.

ryzyko negatywnych wyników powodowane może być:
o zanieczyszczeniem próbek inhibitorami amplifikacji
o użyciem niewłaściwych primerów i innych odczynników do amplifikacji
1
Wykonywanie analizy genetycznej polimorfizmu genów
2.1.2 ZALETY
 Czułość – pozwala na sekwencjonowanie niewielkich ilości materiału genetycznego
 Uniwersalność  poszukuje się nowych, nieopisanych mutacji w znanych genach.
2.2 ZASADA METODY ANALIZY POLIMORFIZMÓW Z ZASTOSOWANIEM
TRAWIENIA ENZYMAMI RESTYKCYJNYMI - RLFP
Amplifikacja
Powielanie w milionowych kopiach znanego fragmentu DNA z zastosowaniem primerów
(krótkie fragmenty DNA – oligonukleotydy) komplementarnych do jednej z nici badanego
DNA. Enzym polimeraza DNA może dobudować drugi komplemetarny do badanego
fragment DNA tylko w obecności primerów. Sekwencje rozpoznawane przez pimery znajdują
się zazwyczaj w odległości kilkuset par zasad, zatem powstający produkt ma taką długość,
jaka odległość dzieli od siebie primery. Mieszanina w której zachodzi proces amplifikacji
musi zawierać trójfosforany dezoksyrybonukleotydów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP, które
służą polimerazie za ‘cegiełki’ do budowy DNA. W mieszaninie reakcyjnej muszą znajdować
się także jony metali K i Mg niezbędne dla pracy enzymu.
Elektroforeza kontrolna
Produkty amplifikacji poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym ZAŁACZNIK
5006.2.9 aby sprawdzić poprawność reakcji PCR.
Trawienie enzymami restrykcyjnymi
Obecność mutacji lub analizowanego polimorfizmu genowego sprawdza się za
pomocą trawienia
enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne rozpoznają
odpowiednie miejsce restrykcyjne odpowiadające szukanej mutacji. Trawienie
przeprowadza się w inkubatorze lub w łaźni wodnej, najczęściej przez noc.
Elektroforeza diagnostyczna
Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi przeprowadza się kolejna elektroforeze w celu
stwierdzenia produktów trawienia enzymami.
2.2.1 OGRANICZENIA METODY RLFP

konieczność znania sekwencji badanego genu i analizowanej mutacji

ryzyko fałszywie pozytywnych wyników – jak w metodzie PCR

czasochłonność

ryzyko zdiagnozowania fałszywych heterozygot – złe warunki trawienia

ryzyko negatywnych wyników powodowane może być:
o zanieczyszczeniem próbek inhibitorami amplifikacji
o użyciem niewłaściwych primerów i innych odczynników do amplifikacji
2.2.2 ZALETY
 cena – niższa w porównaniu do ceny sekwencjonowania
2.3 ZASADA METODY ANALIZY POLIMORFIZMÓW – DYSKRYMINACJA
ALLELI (SNP)
Definicja
Analiza dyskryminacji alleli służy do wykrywania w znanym genie, znanej mutacji
(polimorfizmu) polegającej na zamianie (lub delecji) jednej zasady (nukleotydu), tak
2
Wykonywanie analizy genetycznej polimorfizmu genów
zwanego SNP (single nucleotide polymorphism). Do analizy dyskryminacji stosuje się
metodę PCR w czasie rzeczywistym (RealTime PCR) polega na jednoczesnej amplifikacji
fragmentu genu przy użyciu primerów/sond znakowanych znacznikami fluorescencyjnymi
(najczęściej FAM i VIC). Sonda jest tak skonstruowana, ze rozpoznaje tylko fragment
zawierający określony SNP. Podczas reakcji PCR w próbce amplifikują się tylko te fragmenty
DNA, które są komplementarne do sondy. W wyniku amplifikacji powstają znakowane
fluorescencyjnie produkty.
Zbieranie danych
Reakcje przeprowadza się w analizatorze RT-PCR (7900HT Fast Real Time System).
Wyniki uzyskuje się danych uzyskanych w końcowym punkcie amplifikacji. W analizatorze
przeprowadza się jednoczesna amplifikację wielu próbek ( płytka wielodołkowa), co pozwala
na uzyskanie odczytu z wielu powtórzeń.
Wyniki
W wyniku analizy dyskryminacji alleli uzyskuje się rozkłady alleli w formie wykresów,
na których próbki zawierające allel 1 (FAM), allel 2 (VIC) i zawijające oba allele (FAM i
VIC) tworzą populację o określonych parametrach. Jest to odczyt sygnału fluorescencji o
określonym natężeniu i długości fali emisji.
2.3.1 OGRANICZENIA METODY SNP
 konieczność znania sekwencji badanego genu i analizowanej mutacji
 konieczność analizy wielu próbek jednocześnie
 cena – wysoki koszt aparatury i odczynników
2.3.1 ZALETY METODY SNP
 szybkość – możliwość jednoczesnej analizy wielu próbek w krótkim czasie
2.4
SPEKTRUM DIAGNOSTYCZNE
ZASTOSOWANIE
PRZYKŁADY
KORZYŚCI
BADANIE
PREDYSPOZYCJI
GENETYCZNYCH
TROMBOFILI
Polimorfizm G1691A genu czynnika V
Leiden, G20210A genu czynnika II
układu krzepnięcia,
Wykrywanie zaburzeń w układzie
krzepnięcia
 Oporność na leczenie lekami:
 przeciwkrzepliwymi (pochodne
warfaryny) - polimorfizm genu
VKORC1 oksydazy-reduktazy
FARMAKOGENOM
witaminy K i cytochromu CYP2C9
 przeciwpłytkowymi (pochodne
IKA
tienopirydyny) – polimorfizm
cytochromu CYP2C19
 polimorfizm glikoproteiny płytkowej
GPIIb/IIIa
Personalizacja leczenia, zmniejszenie
ryzyka powikłań zakrzepowych i
krwotocznych podczas leczenia
TRANSPLANTOLO
Przeszczepy narządów
GIA
Typowanie HLA, szybsze i
pewniejsze niż metody serologiczne
Analiza chimeryzmu
CHOROBY
NOWOTWOROWE
3
Szybkość, większa czułość niż
Białaczki, dziedziczna forma raka sutka i
metody cytogenetyczne, badanie
jajnika
mutacji genu BRCA1/BRCA2