MIKROORGANIZMY GLEBOWE

MIKROORGANIZMY GLEBOWE
Wstęp
Organizmy glebowe można sklasyfikować pod względem wielkości na mikroorganizmy
(glony, pierwotniaki, grzyby i bakterie), mezofaunę (nicienie, skoczogonki, drobne stawonogi
i wazonkowce) oraz makrofaunę (dżdżownice, ślimaki, większe wazonkowce i stawonogi).
Mikroorganizmy glebowe wraz z innymi organizmami, szczególnie z roślinami wyższymi
należą do pięciu czynników tworzących glebę. Pozostałe to klimat, ukształtowanie terenu,
skała macierzysta i czas. Wśród mikroorganizmów glebowych najważniejsze są bakterie i
grzyby, gdyż są one związane z przepływem energii i obiegiem podstawowych pierwiastków
w ekosystemach lądowych.
Aktywność fizjologiczna mikroorganizmów jest podstawą wielu procesów glebowych takich
jak: dekompozycja (rozkład substancji organicznej), mineralizacja azotu (nitryfikacja,
amonifikacja), mineralizacja związków fosforu i przemiany siarki. Aktywność ta zależy od
temperatury, parametrów fizykochemicznych gleb (np. pH, obecności zanieczyszczeń),
składu i struktury gleby.
Do badania aktywności mikroorganizmów glebowych stosowane są laboratoryjne metody
wskaźnikowe np. pomiar tempa respiracji, tempa mineralizacji N, badanie aktywności
enzymów glebowych czy metody mikropłytkowe (płytki typu BIOLOG) oraz bezpośrednio
prowadzone w terenie metody pomiaru tempa dekompozycji czy tempa mineralizacji azotu.
Badaniu biomasy mikroorganizmów służą: klasyczne metody płytkowe, metoda dodatku
substratu, metoda fumigacji-ekstrakcji czy analiza kwasów tłuszczowych lub ich estrów.
Najnowsze badania dowodzą, że ważnym parametrem mikrobiologicznym jest struktura
zespołów mikroorganizmów, często decydująca o prawidłowym przebiegu procesów
glebowych. Właściwy stan zespołów mikroorganizmów glebowych, czyli ich odpowiednia
ilość, aktywność i różnorodność jest warunkiem koniecznym dla prawidłowego
funkcjonowania ekosystemów lądowych. Do identyfikacji struktury zespołów
mikroorganizmów glebowych używa się metod mikropłytkowych, metody kwasów
tłuszczowych oraz analizy kwasów nukleinowych.
Metoda mikropłytkowa
Metoda mikropłytkowa Biolog® polega na zaszczepieniu wyizolowanych z gleby
mikroorganizmów (roztwór glebowy) na 96-dołkowe płytki, zawierające w przypadku płytek
typu ECO, 3 zestawy pojedynczych substratów węgla (3*31 substratów) z dodatkiem
barwnika (tetrazoliny) a w przypadku płytek GN2 95 różnych związków organicznych, które
są metabolizowane przez bakterie glebowe. Płytki te są następnie inkubowane w
kontrolowanych warunkach, a stopień zużycia poszczególnych substratów węgla mierzy się
jako intensywność zabarwienia, powstającego w wyniku redukcji barwnika podczas
procesów metabolicznych. Powyższa procedura umożliwia szybką ocenę zdolności
metabolicznych zespołów mikroorganizmów, a tym samym ocenę ich funkcjonalnej
różnorodności.
Wielowymiarowe analizy statystyczne pozwalają określić stopień podobieństwa zespołów
mikroorganizmów z różnych środowisk, a zróżnicowanie intensywności wybarwienia
substratów w poszczególnych dołkach w obrębie zestawu substratów na płytce pozwala
ocenić stopień różnorodności mikroorganizmów pochodzących z jednego siedliska.
Materiały:
- gleby z różną zawartością materii organicznej (np. gleba leśna i gleba orna)
- płytki Biolog® GN2 lub Ecoplate
- zakręcane probówki o objętości 50 ml
- statywy do probówek szerokie
- pipeta automatyczna (1 ml, 5 ml, 100 ul mogą być nastawne )
- siteczka do przesączenia gleby
- sterylne kolbki miarowe 100 ml
- zlewki małe (50-100 ml) do przelania roztworów z kolbek przed pipetowaniem
- tryskawka + zlewki do płukania elektrody
- wytrząsarka laboratoryjna oraz cieplarka
- spektrofotometr do pomiaru absorbancji płytek Biolog® (µQuant) wraz z oprogramowaniem
- pH metr i bufory do kalibracji urządzenia (pH=4 i pH=7)
- własny kalkulator
Odczynniki:
- woda destylowana
- 0.9 % roztwór soli fizjologicznej NaCl
- 1 M roztwór KCl do wyznaczenia pH gleby
- nasycony roztwór KCl do przechowywania elektrody (pH-metr)
Procedura
Ekstrakcja mikroorganizmów
- odważyć na wadze analitycznej 3 g gleby
- glebę umieścić w zakręcanych probówkach, zalać 30 ml roztworu soli fizjologicznej (0,9 %
NaCl) i wytrząsać intensywnie na wytrząsarce przez 0.5 h.
- po wytrząśnięciu zawiesinę znad gleby zdekantować do sterylnej kolbki, rozcieńczając
roztwór 100 krotnie (1 ml roztworu glebowego uzupełnić roztworem NaCl do 100 ml).
Pomiar pH gleby
- przygotować 50 ml plastikowe zakręcane próbówki do wytrząsania gleby dla oznaczenia
odczynu gleby
- odważyć 2 g gleby leśnej lub 5 g gleby ornej do plastikowych probówek
- dodać do każdej odważonej próby gleby 20 ml wody dejonizowanej lub 20 ml 1M KCl
- zakręconą próbówkę umieścić w wytrząsarce i wytrząsać próby przez 0.5 h
- zdjąć próby i ustawić w statywie (pionowo) na 15 minut do zdekantowania
- zmierzyć wartości pH zawiesiny za pomocą pH-metru skalibrowanego uprzednio
odpowiednimi buforami (pH =4 i pH=7), zanotować wyniki pH(H2O) i pH(KCl)
- każdorazowo płukać elektrodę wodą dejonizowaną pomiędzy pomiarami pH w kolejnych
próbach gleby
Inokulacja mikroorganizmów na 96 dołkowych płytkach BIOLOG Ecoplate
- opisać odpowiednim kodem płytkę i jej części (na przykład: grupa 1, gleba lesna(L) lub orna
(O)
- roztwór wymieszać i aplikować po 100 μl na płytkę typu ECO lub GN2 - wypełnioną płytkę
umieścić ostrożnie w cieplarce (22ºC) (UWAGA, należy kontrolować wilgotność)
Pomiar zawartości materii organicznej
- przygotować sześć 50 ml zlewek szklanych z odpowiednimi kodami, po dwie zlewki
(powtórzenia) dla poziomu np.
grupa 1, gleba O:
- zważyć każdą zlewkę i zanotować jej masę (g)
- odważyć po 2 próby (5g) gleby do 50 ml zlewki, zanotować masę (g) i wstawić do suszarki
na 24 godziny (105ºC), następnie do pieca sylitowego (550ºC)
Analiza wyników
1. Zmierzyć absorbancję każdego dołka (rozłożonego substratu) dla płytki BIOLOG.
Wyliczyć średnią absorbancję AWCD (ang. Average Well Colour Development) dla każdego
poziomu gleby, używając absorbancji dla 31 dołków dla plytki ECO lub dla 95 dołków dla
płytko GN2 , pomniejszonych o wartość absorbancji w dołku A1, A5 lub A9 dla płytki ECO
lub A1 dla płytki GN2, absorbancja w dołkach A1, A5, A9 stanowi próbę kontrolną (H2O).
Wyliczona wartość AWCD jest miarą aktywności bakterii glebowych.
Policzyć i porównać liczbę zużytych (gdy WCD>0.2) substratów RS (ang. Substrate
Richness) dla poszczególnych gleb.
Porównać otrzymane wyniki i zinterpretować je. Dodatkowe punkty uzyskuje się za ocenę
udziału bakterii w rozkładzie poszczególnych grup substratów: węglowodanów, kwasów
karboksylowych, amin, etc.
2. Zważyć pozostały po spaleniu w zlewkach popiół i wyliczyć % zawartości materii
organicznej w suchej masie badanych prób. Porównać procentową zawartość materii
organicznej w badanych glebach.
3. Oznaczyć pH gleb 4. Oszacować zależność różnorodności i aktywności mikrobiologicznej
(bakterii) od zawartości materii organicznej w glebie i od odczynu gleby.