MIKROORGANIZMY GLEBOWE

MIKROORGANIZMY GLEBOWE
Wstęp
Organizmy glebowe można sklasyfikować pod względem wielkości na mikroorganizmy
(glony, pierwotniaki, grzyby i bakterie), mezofaunę (nicienie, skoczogonki, drobne stawonogi
i wazonkowce) oraz makrofaunę (dżdżownice, ślimaki, większe wazonkowce i stawonogi).
Mikroorganizmy żyjące w glebie wraz z innymi organizmami, szczególnie z roślinami
wyższymi należą do pięciu czynników tworzących glebę. Pozostałe to klimat, ukształtowanie
terenu, skała macierzysta i czas. Wśród mikroorganizmów glebowych najważniejsze są
bakterie i grzyby, gdyż są one związane z przepływem energii i obiegiem podstawowych
pierwiastków w ekosystemach lądowych.
Aktywność fizjologiczna mikroorganizmów jest podstawą wielu procesów glebowych takich
jak: dekompozycja (rozkład substancji organicznej), mineralizacja azotu (nitryfikacja,
amonifikacja), mineralizacja związków fosforu i przemiany siarki. Aktywność
mikroorganizmów glebowych zależy od temperatury, parametrów fizykochemicznych gleb
(np. pH) , składu i struktury gleby.
Do badania aktywności mikroorganizmów glebowych stosowane są laboratoryjne metody
wskaźnikowe np. pomiar tempa respiracji, tempa mineralizacji N, badanie aktywności
enzymów glebowych czy metody mikropłytkowe (płytki typu BIOLOG) oraz bezpośrednio
prowadzone w terenie metody pomiaru tempa dekompozycji czy tempa mineralizacji azotu.
Badaniu biomasy mikroorganizmów służą: klasyczne metody płytkowe, metoda dodatku
substratu, metoda fumigacji-ekstrakcji czy analiza kwasów tłuszczowych lub ich estrów.
Najnowsze badania dowodzą, że ważnym parametrem mikrobiologicznym jest struktura
zespołów mikroorganizmów, często decydująca o prawidłowym przebiegu procesów
glebowych. Właściwy stan zespołów mikroorganizmów glebowych, czyli ich odpowiednia
ilość, aktywność i różnorodność, jest warunkiem koniecznym dla prawidłowego
funkcjonowania ekosystemów lądowych. Do identyfikacji struktury zespołów
mikroorganizmów glebowych używa się metod mikropłytkowych, metody kwasów
tłuszczowych oraz analizy kwasów nukleinowych.
Metoda mikropłytkowa
Metoda Biolog® polega na wszczepieniu wyizolowanych z gleby mikroorganizmów (roztwór
glebowy) na 96-dołkowe płytki, zawierające w przypadku płytek typu ECO, 3 zestawy
pojedynczych substratów węgla z dodatkiem barwnika (tetrazoliny). Płytki te są następnie
inkubowane w kontrolowanych warunkach, a stopień zużycia poszczególnych substratów
węgla mierzy się jako intensywność zabarwienia, powstającego w wyniku redukcji barwnika
podczas procesów metabolicznych. Powyższa procedura umożliwia szybką ocenę zdolności
metabolicznych zespołów mikroorganizmów, a tym samym ocenę ich funkcjonalnej
różnorodności.
Wielowymiarowe analizy statystyczne pozwalają określić stopień podobieństwa zespołów
mikroorganizmów z różnych środowisk, a zróżnicowanie intensywności wybarwienia
substratów w poszczególnych dołkach w obrębie zestawu substratów na płytce pozwala
ocenić stopień różnorodności mikroorganizmów pochodzących z jednego siedliska.
Materiały:
- profil glebowy z wyraźnymi trzema poziomami genetycznymi
- płytki Biolog® EcoPlate
- zakręcane probówki o objętości 50 ml
- statywy do probówek
- pipeta automatyczna
- siteczka do przesączenia gleby
- sterylne kolbki miarowe 100 ml
- tryskawka + zlewki do płukania elektrody
- wytrząsarka laboratoryjna oraz cieplarka
- spektrofotometr do pomiaru absorbancji płytek Biolog® (µQuant) wraz z oprogramowaniem
- pH metr i bufory do kalibracji urządzenia (pH=4 i pH=7)
- własny kalkulator
Odczynniki:
- woda destylowana
- 0.9 % roztwór soli fizjologicznej NaCl
- nasycony roztwór KCl do przechowywania elektrody (pH-metr)
Procedura
Ekstrakcja mikroorganizmów
- odważyć na wadze analitycznej 3 g gleby (z każdego poziomu genetycznego gleby: A –
poziom organiczny, A - poziom wymywania i B - poziom wmywania)
- glebę umieścić w zakręcanych probówkach, zalać 30 ml roztworu soli fizjologicznej (0,9 %
NaCl) i wytrząsać intensywnie na wytrząsarce przez 0.5 h.
- po wytrząśnięciu zawiesinę znad gleby zdekantować do sterylnej kolbki, rozcieńczając
roztwór 100 krotnie (1 ml roztworu glebowego uzupełnić roztworem NaCl do 100 ml).
Pomiar pH gleby
- przygotować trzy 50 ml plastikowe zakręcane próbówki do wytrząsania gleby dla
oznaczenia odczynu gleb z trzech badanych poziomów
- odważyć 2 g gleby z poziomu organicznego (O) oraz po 5 g gleby z obu niższych poziomów
(ozn. A i B) oddzielnie do każdej probówki
- dodać do każdej odważonej próby gleby 20 ml wody dejonizowanej
- zakręconą próbówkę umieścić w wytrząsarce i wytrząsać próby przez 0.5 h
- zdjąć próby i ustawić w statywie (pionowo) na 15 minut do zdekantowania
- zmierzyć wartości pH zawiesiny za pomocą pH-metru skalibrowanego uprzednio
odpowiednimi buforami (pH =4 i pH=7), zanotować wyniki
- każdorazowo płukać elektrodę wodą dejonizowaną pomiędzy pomiarami pH w kolejnych
próbach gleby
Inokulacja mikroorganizmów na 96 dołkowych płytkach BIOLOG Ecoplate
- opisać odpowiednim kodem płytkę i jej części (na przykład: grupa 1, poziom O, A, B,)
- roztwór wymieszać i aplikować po 100 μl na płytkę typu ECO, używając 1/3 płytki (32
dołki) dla każdego poziomu gleby
- wypełnioną płytkę umieścić ostrożnie w cieplarce (22ºC) (UWAGA, należy kontrolować
wilgotność)
Pomiar zawartości materii organicznej
- przygotować sześć 50 ml zlewek szklanych z odpowiednimi kodami, po dwie zlewki
(powtórzenia) dla poziomu np.
grupa 1, poziom O: 1O1, 1O2, potem 1A1, 1A2……
- zważyć każdą zlewkę i zanotować jej masę (g)
- odważyć po 2 próby (5g) gleby z każdego poziomu do 50 ml zlewki, zanotować masę (g) i
wstawić do suszarki na 24 godziny (105ºC), następnie do pieca sylitowego (550ºC)
Analiza wyników
1. Zmierzyć absorbancję każdego dołka (rozłożonego substratu) dla płytki BIOLOG.
Wyliczyć średnią absorbancję AWCD (ang. Average Well Colour Development) dla każdego
poziomu gleby, używając absorbancji dla 31 dołków, pomniejszonych o wartość absorbancji
w dołku A1 odpowiednio dla poziomu O, w dołku A5 dla poziomu A, i dołku A9 dla
poziomu B, które to dołki stanowią próbę kontrolną (H2O).
Wyliczona wartość AWCD jest miarą aktywności bakterii glebowych.
Policzyć i porównać liczbę zużytych (gdy WCD>0.2) substratów RS (ang. Substrate
Richness) dla poszczególnych poziomów genetycznych gleby.
Porównać otrzymane wyniki i zinterpretować je (można także ocenić udział bakterii w
rozkładzie poszczególnych grup substratów: węglowodanów, kwasów karboksylowych, amin,
etc.)
2. Zważyć pozostały po spaleniu w zlewkach popiół i wyliczyć % zawartości materii
organicznej w suchej masie w badanych próbach. Porównać procentową zawartość materii
organicznej w 3 badanych poziomach genetycznych gleb.
3. Oznaczyć pH gleb z badanych poziomów
3. Oszacować zależność różnorodności i aktywności mikrobiologicznej (bakterii i grzybów)
od zawartości materii organicznej w glebie i od odczynu gleby.