Sposób radioimmunologicznego oznaczania hormonów i leków.

POLSKA
121950
OPIS PATENTOWY
RZECZPOSPOLITA
LUDOWA
Patent dodatkowy
do patentu nr
Zgłoszono: 27.04.78 (P. 206415)
Int. Cl8
G01N 33/48
PierwsizeńBtwo: 11.05.77 Republika Federalna
Niemiec
URZĄD
PATENTOWT
PRL
Zgłoszenie ogłoszono: 17.11.80
Opis patentowy opublikowano: 20.02.1984
Twórca wynalazku: Hans A. Thoma
Uprawniony z patentu: Cihandon Investment Plannikig Ltd. West Wind
Bldg, Wielki Kajman, Kajmany (Brytyjskie In¬
die Zachodnie)
Sposób radioimmunologicznego oznaczania hormonów i leków
2
do różnych nośników takich jak np. agar, celuloza,
cząsteczki szkła, poliamidy i podiaikryioamidy. Ko¬
rzyści z zamknięcia przeciwciała w nośniku pole¬
gają na wykluczeniu zakłóceń spowodowanych
cząsteczkami o dużym ciężarze cząsteczkowym, oraz
Przedmiotem wynalazku jest sposób radiotimmunologicznego oznaczania hormonów i leków.
Przy oznaczaniu hormonów i leków metodą radioimmunoiogiczną, hormony i leki reagują z prze¬
ciwciałem. Specyficzność reakcji zależy od immu¬
nologicznej komplementarności tzn. może występo¬
wać krzyżowa reaktywność z substancjami, które
wykazują podobną konfigurację chemiczną. W po¬
łączeniu estriol-węgiel Ce, estriol występuje w kon¬
figuracji immunodeterminantowej, w której prawie
wszystkie grupy funkcyjne estrolu są umiejscowio¬
usunięciu
w estrogenach surowicy ciężarnych.
10
15
121 950
i
ciała, gdy zostało ono unieruchomione w nośniku
w znany sposób; nie spełnia stawianych wyma¬
Celem wynalazku było opracowanie sposobu ra¬
dioimmunologicznego oznaczania hormonów i le¬
ków przez immobilizowanie przeciwciała na noś¬
niku z polimeru o podwyższonej specyficzności wią¬
zania zamkniętego przeciwciała i uniknięcia zda¬
rzającej się uprzednio krzyżowej reaktywności.
20
przeprowadzoną przed próbą radioim-
munologiczną. Ekstrakcje rozpuszczalnikami stoją
jednakże na przeszkodzie do seryjnego i zautomaty¬
zowanego prowadzenia badań.
W badaniach prowadzonych w celu ułatwienia
metod immunologicznych w technikach fazy sta¬
łej, przeciwciała zostają związane kowalencyjnie
odwirowywania
gań.
Z powyższych powodów były dotychczas głów¬
nie stosowane takie metody, w których specyficz¬
ność była zapewniona przez ekstrakcję rozpuszczaiLniikiem
pipetowania,
rze pokojowej.
Okazało się, że specyficzność wiązania przeciw¬
ne w zasięgu wiążącego je przeciwciała.
Pomimo to, połączenia estrolu z resztą siarcza¬
nową lub glukuronidową zajmujące pozycję przy
fenolowym węglu C3, są związane w znacznym
stopniu przez przeciwciało. Jest to niekorzystne
przy oznaczaniu wolnych sterydów, zwłaszcza gdy
stężenie związanego sterydu w próbce przewyższa
stężenie sterydu o dziesiąte potęgi, co ma miejsce
etapu
długotrwałej stabilizacji przeciwciał w temperatu¬
25
Nieoczekiwanie okazało się, że kopolimery akryioamidu stanowią odmianę nośnika, dzięki której
uzyskuje się podwyższenie specyficzności wiązania
przeciwciała przez nośnik z polimeru.
Przedmioten^ wynalazku jest więc sposób ozna¬
czania hormonów i leków metodą radioimmunalogiczną polegającą na unieruchamianiu przeciwciał
na nośniku z kopolimeru akryloamidu.
Kopolimery te są uzyskiwane przez polimeryza¬
cję akryloamidu z jednym lub więcej związkami
30
takimi jak kwas akrylowy, metakryiowy, metakry-
121 950
3
4
loamid, ich pochodnymi i solami kwasu akrylowego
lub metakrylowego.
i/lub ziem alkalicznych. Szczególnie korzystne są
sole sodowe lub potasowe.
związka¬
Jako pochodne kwasu akrylowego i metakrylo¬
mi dającymi się kopolimeryzować można wpływać
na miikrośirodowisko nośnika z polimeru. Działanie
polega głównie na efektach hydrofiłowych, hydro¬
fobowych i elektrostatycznych wewnątrz nośnika
z polimeru.
Przez kopoiimeryzację akryloamidu ze
wego stosuje się zwłaszcza estry, np. ester metyIowy i etylowy.
Odpowiednimi pochodnymi metakryloamidów są
np. związki podstawione przy azocie, jak N-hydroksymetylometakryloamid.
Przykładami innych odpowiednich związków kopolimeryzacyjnych z akryloamidem są zwłaszcza
związki podstawione przy azocie jak N-hydroksymetydoakryloaimid.
Przykładem innych związków kopoMmeryzujących z akryloamidem jest N,N-dwualkilotartaro-
5
Przez zmianę nośnika z polimeru za pomocą kopolimeryzacji możliwe, jest znaczne podwyższenie
specyficzności wiązania przeciwciała i powstrzy¬
manie niepożądanej krzyżowej reaktywności. Noś¬
nik z polimeru za pomocą odpowiedniej kopalinie-
ryzacjij £W$kfe*żJZń*mopy tak, aby z jednej strony
zapjfewnić specyficzną reakcję haptenu z unierucho¬
mionym przeciwciałem, a
haptenu.
utrwalenie.
specyficznego
nośnika
aby
dwuamid.
Uinienuiohiaimiianie przeciwciała następuje poraez
zamknięcie w nośniku polimeru Mlub kowalencyjne
zastosowaniu
strony
15
powstrzymać •> niepożądaną reaktywność krzyżową
Dzięki
z drugiej
w
sposobie według wynalazku, możliwe są pomiary
bezpośrednio w nieekstrahowanej surowicy.
Ze względu na podwyższoną specyficzność nośni¬
Dokładny opis badań radioimmunologicznych po¬
20
sprowadzone do
30
tiolan lub salicylan w celu przemieszczenia hormo¬
nu z jego wiązania z różnymi związanymi w suro¬
wicy proteinami.
29
40
czne podniesienie stężenia substancji kompetycyjnych tj. o współczynnik 100 bez osłabienia wiąza¬
45
ciwciała pmzeprowadiza się w ten sposób, że roz¬
twór przeciwciała dodaje się do mieszaniny mo¬
wych, a zwłaszcza 20—80°/o molowych.
nomerów. Początkową mieszaninę poddaje się poli¬
50
przy wielu oznaczeniach.
Jako korzystne sole kwasu akrylowego lub me¬
takrylowego stosuje się sole metali alkalicznych
meryzacji np. wolnorodniikowej, a otrzymany po¬
limer rozdrabnia się, przemywa i suszy.
55
cza możliwość niespecyficznego wiązania w sub¬
stancjach badanych.
W sposobie według wynalazku dzięki zastosowa¬
niu kopolimerów zawierających kwas akrylowy
lub metakrylowy lub ich sole można uzyskać efekt
zobojętniania lub działanie buforowe dla roztworów
kwaśnych lub alkalicznych. Jest to znaczną zaletą
146).
Sposób według wynalazku unieruchamiania prze¬
Zawiarfość akii^oamidu w kopolimerze może wy¬
nosić 1—99°/o molowych, korzystnie 5—9t3°/o molo¬
prowadzi do efektu naładowania, przez co wyklu¬
uśmierzające ból) i salicylany.
Synteza antygenu, otrzymywanie antyserum np.
przez uodpornianie królików i izolowanie jak rów¬
nież unieruchamianie przeciwciał są znane (por.
np. dinical Chemistry t. 19, nr 2, 1973r str.
wzajemnego oddziaływania elektrostatycznego, zna¬
Szczególnie odpowiednimi są kopolimery akry¬
loamidu z kwasem metakrylowym, zwłaszcza takie
w których zawartość kwasu metakrylowego wy¬
nosi 20—60tyo molowych. Kwas metakrylowy z jed¬
nej strony hydrofobu je nośnik, a z drugiej strony
ficznych lub niespecyficznych wiązań proteino¬
wych.
Hormony mogą być hormonami tarczycy, zwła¬
szcza tyroksyma i trójjodotyiroinina, hormonami
steroidowymi jak kortizon, testosteron, progeste¬
ron, estron, estradiol i estriol i glikozydami nasercowymi, jak digitoksyna i digoksyna.
Ponadto można również oznaczać witaminy, zwła¬
szenie wiązania pomiędzy hormonem i przeciwcia¬
nia hormon—przeciwciało.
Sposób według wynalazku przy zastosowaniu
nośnika z polimeru nadaje się do oznaczania róż¬
nych hormonów i leków, które znajdują się w su¬
szcza witaminę Bi2 i kwas foliowy, jak też środki
lecznicze silnie wiążące białko jak np. środki antykoagulacyjne dwukumarol, analgetiika (środki
Jednakże wiadomo, że w przypadku dużego stę¬
żenia substancji kompetylcyjnych następuje naru¬
łem. Przy zastosowaniu nośnika z polimeru w spo¬
sobie, według wynalazku możliwe jest na podstawie
nr 2,
rowicy lub plazmie, związane częściowo do specy¬
minimum.
Przy różnych oznaczeniach, takich jak np. hor¬
monów tarczycy, tyroksyny i trojjodotyroniny sto¬
suje się substancje kompetycyjne (współzawodni¬
czące) jak kwas anilinonaftalenosulfonowy, mer-
19,
ruchomienie przeciwciał.
29
wiązań pomiędzy cząsteczkami sterydów, a nośni¬
kiem dzięki kopolimeryzacji są
Chemistry, t.
1973, str. 145; ibid. t. 19 nr 12, 1973 str. 1339, i
ibid. t. 21, nr 7,. 1975, str. 829, opisane są techniki
radioimmunoiogiczne, w których stosuje się unie¬
ka z polimeru według wynalazku możliwe jest ra-
dioimmunologiczne oznaczanie hormonów i leków
z bardzo dużą dokładnością, ponieważ wahania
oznaczanych wartości na podstawie niespecyficznych
dany jest np. w Glinical
Wybór i stosunek ilościowy kopolimeru dodane¬
go do akryloamidu określają właściwości nośnika
jakie pragnie się uzyskać w odniesieniu do swoi¬
stości. Na swoistość można wpływać w szerokich
granicach poprzez zmianę hydrofobowości i ładun¬
ku nośnika. Dodatek inetakryloamidu podwyższa
własności
hydrofobowe
nośnika.
Dodatek
kwasu
aikrylowego lub metbakiryiliowego albo ich soli zmie¬
60
nia ładunek nośnika.
Istnieje również możliwość dodania bezpośred¬
nio do mieszaniny monomerów soli kwasu akry¬
lowego lub metakrylowego lub alternatywnie mo¬
żna spolimeryzować kwasy i następnie utworzyć
sole w nośniku za pomocą wymieniaczy jonowych.
121990
5
6
W celu uzyskania w nośnilku por o odpowiedniej
wielkości zmienia się stężenia monomerów. Stę¬
żenie monomerów w zakresie od około 20*/* pro¬
szej tablicy. Podane wartości są wartościami reak¬
wadzi do uzyskania por o wielkości 7—'10 A.
Korzystny kopolimer zawiera np. afcryloamid
i 20—60% molowych kwasu akrylowego i/lub me¬
5
takrylowego, otrzymany z około 20%-owego roz¬
tworu monomeru, przy czym co najmniej część
gnap kwasowych przeprowadza się w odpowiednie
sole metali alkalicznych lub ziem alkalicznych.
Bardziej szczegółowo objaśniają wynalazek na¬
dach.
Bnzez odpowiedni dobór kopolimeru można uzy-
10
skać podwyższenie specyficzności o wskaźnik 15
w stosunku do układu wodnego i o wskaźnik 7
w stosunku do homopolimerów akryloamidu. Wska¬
zuje na to porównanie wartości układu wodnego
i homopolimerów akryloamidu z 40/60 kopolimerem
15
kwasu metakrylowego i akryloamidu.
stępujące przykłady.
Przykład I. Wpływ nośnika z polimeru na
reaktywność krzyżową estriol-3-glukuronid i estrioi-3-siarczan.
tywności krzyżowej uprzednio określonej.
Wyniki wskazują, że sposobem według wynalaz¬
ku przy zastosowaniu kopolimeru uzyskuje się
znaczny wzrost specyficzności wiązania w porów¬
naniu do układu wodnego i homopolimerów akry¬
loamidu stosowanych w dotychczasowych meto¬
Reaktywność krzyżowa K jest obliczona na pod¬
Przykład II. Oznaczanie całkowitej zawarto¬
stawie setnych-(krotności masy odpowiedniego haptenu dla y = 50 podzielonej przez zużytą masę
reaktywnego krzyżowo hapitenu dla y = 50. War¬
tości obliczone są na podstawie JD50.
Wybrane przeciwciało antyestriolu wykazywało
wysoką reaktywność krzyżową wiązania 3-glukuronidu względnie 3-siarczanu.
20
Dla każdej mieszaniny polimeru, tak dobiera
się stężenie żeby całkowite stężenie monomeru
25
wynosiło 2,9 m/l.
Dla jednej
mieszaniny
ści tyroksyny na
1 ml
ła stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molo¬
ny z 20%-owego roztworu monomeru.
10 1 surowicy zawierającej 18 |mg/100 ml tyro¬
rozpu¬
ksyny rozcieńcza się 160|d roztworu enzymu za¬
wierającego 2 mg/ml pepsyny rozpuszczonej w
0,1 n kwasie solnym.
Reakcję z enzymem przeprowadza się w tempe¬
raturze pokojowej w ciągu 30 minut. Do tych
170 jml dodaje się następnie 150 \nl roztworu wskaź¬
nika izotopowego zawierającego 5,2 mg/ml ozna¬
buforu fosforanowego,
reakcję zapoczątkowuje się przez dodanie 0,15 g
czonej izotopowo tyroksyny.
ryboflawiny i 0,10 ml N,N,N',N'-czterometyloetylenodwuaminy i naświetla światłem ultrafioletowym.
Żótły blok następnie rozdrabnia się, przemywa
wodą destylowaną i suszy.
22 mg suchego żelu przeciwciała antyestriolu
odważa się do małych kolumienek i miesza z
0,150 ml płynu inkubacyjnego. Roztwór inkubacyjny zawiera 3H-estriol i nieoznaczony hapten (estriol, estriol-3-glukuronid lub estrioi-3-siarczan).
Otrzymany roztwór następnie umieszcza się na
60 mg żelu przeciwciała. Okres inkubacji wynosi
35 30 minut, temperatura 22°C.
Ocena wykazuje nadzwyczaj wysoki procent od¬
zyskiwania wynoszący 98%.
Przykład III.
tości kortizonu.
40
Utrzymuje się stałą temperaturę reakcji 0°C. Po
30
min.
sów.
Oznaczanie całkowitej zawar¬
Nośnik z polimeru zawierający żel przeciwciała
stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molowych
mieszaniny soli sodowej i wapniowej kwasu meta¬
inkubacji następuje rozdzielenie wolnych
od związanych przeciwciał hapitenu przez elucję
buforem fosforanowym zawierającym albuminy.
Eluat zbiera się w szkiełkach scyntylacyjnych, za¬
daje 15 ml cieczy scyntylacyjnej i mierzy radioak¬
tywność w płynie scyntylatora. Stężenie wolnego
3H-estriołu (wskaźnik hapten) wyliczano z impul¬
hydrolizy
wych soli sodowej kwasu metakrylowego otrzyma¬
szcza się np. 5 g akryloamidu i 1,25 g N,N'-metyleriobisafkryloamidu w naczyniu Bechera w 24 ml
buforu fosforanowego o wartości pH 7,2. Po do¬
daniu przeciwciał w
drodze enzymatycznej
pepsyną przy zastosowaniu nośnika z polimeru.
Nośnik z polimeru zawierający żel przeciwcia-
krylowego otrzymany z 20%-owego roztworu mo¬
nomeru.
45
Przygotowuje się 10 ul surowicy lub plazmy za¬
wierającej 15 fig kortizonu na 100 ml. Do tego
dodaje się 500 |jlL roztworu wskaźnika izotopowego
zawierającego ^J-kortizon w wodnym buforze cy¬
50
try nianowyim o pH 3,5.
Otrzymany roztwór następnie umieszcza się na
100 mg żelu przeciwciała. Okres inkubacji wyno¬
Wyniki oznaczenia w układzie wodnym i przy
zastosowaniu nośnika z polimeru akryloamidu i
kopolimeru akryloamidu są przedstawione w poniż-
si 20 minut, temperatura 25°C.
Tablica
Akrylo¬
Układ
amid
Sól sodowa kwasu akrylowego/akryioamidu
Sól sodowa kwasu meta-
krylowego/akryloamidu
wodny
100
10:90
30 : 70
50:50
2t):80
40:60
60:40
Estriol-3-glukuronid
61
29
19
10
14
14
4
21
Estriol-3-siarczan
47
33
30
12
24
27
6
23
121 950
Ocena wykazuje nadzwyczaj wysoki 98% wyno¬
szący procent odzyskiwania.
Przykład IV. Oznaczanie
tyroksyny
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób radioiimmunologicznego oznaczania hor¬
przy
użyciu substancji kompetycyjnych.
Nośnik z polimeru zawierający żel przeciwciała
stanowi kopolimer akryloamidu i 40% molowych
soli mieszanej wapniowo sodowej kwasu metakry¬
lowego otrzymany z 20%-owego roztworu monome¬
5
limer akryloamidu.
ru.
500 [ii roztworu wskaźnika izotopowego zawie¬
io
rającego ^J-tyroksynę w buforze fosforanowym
o pH 9,6 umieszcza się na 80 mg żelu przeciwcia¬
Następnie 500 \»1 takiego samego roztworu wskaź¬
zawierającego 6 mg/ml kwasu
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym,
że przeciwciała immobilizuje się na nośniku z ko¬
polimeru akryloamidu i kwasu akrylowego, albo
metakrylowego lub metakryloamidu, ich pochod¬
nych, soli kwasu akrylowego lub metakrylowego
i ich
ła.
nika izotopowego
monów i leków, znamienny tym, że przeciwciała
immobilizuje się na nośniku stanowiącym kopo¬
is
mieszanin.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym,
że przeciwciała immobilizuje się na nośniku z kopolimeru akryloamidu i 30—60% kwasu metakry¬
anilinonaftalenosulfonowego umieszcza się na 80 mg
lowego.
żelu przeciwciała.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym,
że przeciwciała immobilizuje się na nośniku z ko¬
Obie próby były inkuibowane w temperaturze
22°C w ciągu 20 minut.
polimeru akryloamidu
Ocena nie wykazuje żadnego nakładania się wią¬
zań
tyroksyny
stężenia
z przeciwciałem
substancji
mimo
kompetycyjnych,
wysokiego
takich
20
i soli
metali
alkalicznych
lub ziem alkalicznych kwasu akrylowego lub me¬
takrylowego.
jak
kwas andłinonaftolenósulfonowy.
Drukarnia Narodowa, Zakład Nr 6,
Cena 100 zł