LM PCR
advertisement
Antygeny otrzymane T. gondii w Katedrze Mikrobiologii Diagnostyka toksoplazmozy Metody diagnostyczne powinny: potwierdzić lub wykluczyć zarażenie T. gondii; określić fazę zarażenia (toksoplazmoza wczesna, przewlekła); u kobiet w ciąży z pierwotną toksoplazmozą potwierdzić lub wykluczyć zarażenie płodu lub noworodka METODY BEZPOŚREDNIE POŚREDNIE (mają na celu izolację pasożyta lub wykrycie jego antygenu) (wykorzystują właściwości immunogenne pasożyta) Testy serologiczne stosowane w diagnostyce toksoplazmozy Test barwny (antygen żywy / IgG) Immunofluorescencja pośrednia (antygen utrwalony formaliną / IgG, IgM) Aglutynacja bezpośrednia (antygen utrwalony formaliną / IgG + IgM) Test ISAGA (antygen utrwalony formaliną / IgM, IgA, IgE) Odczyn wiązania dopełniacza (antygen cytoplazmatyczny / IgG + IgM) Test hemaglutynacji (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG + IgM) Test ELIFA (antygen cytoplazmatyczny / IgG, IgM, IgA, IgE) Awidność przeciwciał (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) Test ELISA: pośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) bezpośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgM i IgA) Schemat reakcji PCR (amplifikacja DNA genu bag1) ekson 1 ekson 2 PCR 1 ex1 279 pz ex2 ekson 4 ekson 3 PCR 2 PCR 3 ex4 ex3 232 pz 243 pz PCR 4 ex3 ex4 437 pz Konstrukcja plazmidu rekombinantowego Produkt PCR 1 pUC19 EcoRI 2686 pz MCS EcoRI ex1 ex2 SmaI EcoRI / SmaI Produkt PCR 4 HindIII pUC19/ex1ex2 2943 pz ex3 SmaI / HindIII SmaI CCT CCC CCC GGG Pro Pro Pro pUC19/BAG1 3080 pz ex4 Konstrukcja plazmidu rekombinantowego pUC19/BAG1 3080 pz BglII / HindIII pUET1 2856 pz bag1 (694 pz) MCS BglII HindIII Klonowanie do wektora ekspresyjnego pUET1 w miejsca restrykcyjne BglII i HindIII DNA produktu PCR pUET1/BAG1 3465 pz Immunoidentyfikacja i oczyszczanie rekombinantowego białka BAG1 M 1 2 3 4 (A) (B) M 1 2 3 4 (C) M 1 2 3 4 5 6 Rys. (A) Wynik testu Western blotting z użyciem przeciwciał skierowanych na domenę S-Tag; (B) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach zebranych lizatów w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE); (C) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach uzyskanych podczas oczyszczania białka rekombinantowego BAG1 w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). RODZINA NAZWA FORMA ROZMOJOWA MARKER TEST Antygeny powierzchniowe (SAG) SAG1-His SAG2-His SAG4-His P35-His BSR4-His tachyzoit tachyzoit / bradyzoit bradyzoit tachyzoit bradyzoit w/p późna wczesna późna ELISA / Western b. ELISA / Western b. ELISA / Western b. ELISA / Western b. Western blotting Antygeny granul o dużej gęstości (GRA) GRA1-His GRA2-His / GRA2ex2 GRA4-His GRA5-His / GRA5-Trx GRA6-His GRA7-His GRA9-His tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit Antygeny roptrii (ROP) ROP1-His ROP9-His tachyzoit / bradyzoit tachyzoit wczesna nie badano ELISA / Western b. - Antygeny mikronem (MIC) MIC1-His MIC3-His / MIC3-Trx tachyzoit / bradyzoit tachyzoit / bradyzoit wczesna wczesna Western blotting Western blotting Enzymy LDH1-His LDH2-His tachyzoit bradyzoit nie badano nie badano - Inne MAG1-His BAG1-His bradyzoit bradyzoit wczesna późna ELISA / Western b. Western blotting wczesna ELISA / Western b. ELISA / Western b. Western blotting Western blotting ELISA / Western b. ELISA / Western b. Western blotting Test Western blotting M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – GRA5 3 – GRA9 4 – GRA4 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) M 1 2 3 4 IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła IgM +, IgG + / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła ??? M 1 2 3 4 IgM -, IgG 48 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła Test Western blotting M 1 2 3 4 M – marker wielkości M 1 2 3 4 1 – MIC3 2 – MAG1 3 – SAG4 4 – p35 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła Test Western blotting 1 PACJENT M 1 2 M 1 2 3 3 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – p35 3 – SAG4 1 pobranie surowicy TOKSOPLAZMOZA WCZESNA 2 pobranie surowicy (8 miesięcy później) TOKSOPLAZMOZA PÓŹNA DNA szczepionki DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek Ściśle zdefiniowany skład • zawierają geny kodujące określone antygeny białkowe lub sekwencje kodujące determinanty antygenowe Bezpieczeństwo • brak możliwości wywołania infekcji • możliwość wywołania choroby autoimmunologicznej indukcja produkcji autoprzeciwciał skierowanych przeciwko komórkom, w których następuje biosynteza obcego antygenu • możliwość integracji DNA plazmidowego z ludzkim DNA Skuteczność • wywołują zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź immunologiczną • uzależniona od rodzaju kodowanego antygenu • uzależniona od poziomu ekspresji antygenu w komórce docelowej DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek • możliwość stosowania tylko jednej dawki szczepionki długotrwała prezentacja antygenu systemowi immunologicznemu – biosynteza antygenu in vivo • możliwość stosowania jako szczepionki profilaktyczne lub terapeutyczne ochrona przed infekcją stymulacja układu immunologicznego u osobników zainfekowanych • możliwość stosowania u niemowląt posiadających jeszcze matczyne przeciwciała DNA plazmidowe nie jest rozpoznawane i neutralizowane przez przeciwciała długotrwała prezentacja antygenu umożliwia rozwój prawidłowej odpowiedzi immunologicznej • możliwość wywoływania odporności na różne szczepy tego samego wirusa lub bakterii możliwość wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko zakonserwowanym antygenom niż antygeny powierzchniowe bardziej DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek Możliwość stosowania jako szczepionki skojarzone lub poliwalentne • • kilka plazmidów kodujących różne antygeny jeden plazmid kodujący kilka antygenów Możliwość dostarczania DNA do organizmu różnymi sposobami Łatwa formulacja szczepionek • brak konieczności stosowania adiuwantów, substancji konserwujących i stabilizujących Stabilność termiczna • liofilizowane lub sprecypitowane DNA można bardzo długo przechowywać w temperaturze pokojowej Niski koszt produkcji • • możliwość produkcji dużych ilości plazmidowego DNA w komórkach bakteryjnych łatwa i tania procedura oczyszczania plazmidowego DNA - liza alkaliczna DNA szczepionki Sposoby formulacji i podawania szczepionek DNA domięśniowo (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) • wydajność dostarczania regenerujących się mięśni DNA wzrasta, jeżeli jest podawane do śródskórnie (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) dożylnie (iniekcja, DNA wewnątrz liposomów) przez błony śluzowe • • donosowo; DNA w roztworze soli fizjologicznej, w postaci aerozolu doustnie; mikrokapsułki z biodegradowalnych polimerów zawierające DNA przez skórę • • skaryfikacja; DNA w roztworze soli fizjologicznej dostarczanie za pomocą pistoletu genowego, cząsteczki złota opłaszczone DNA (DNA dostarczane bezpośrednio do wnętrza komórek) DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) bakteryjne ori replikacji • zapewnia dużą liczbę kopii plazmidowego DNA w komórce bakteryjnej prokariotyczny marker selekcyjny • umożliwia łatwą identyfikację komórek bakteryjnych transformowanych DNA plazmidowym miejsce (MCS) • wielokrotnego klonowania umożliwia łatwe wprowadzenie kodującego antygen w obręb plazmidowego genu DNA DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) elementy regulujące transkrypcję organizmach eukariotycznych • • w silne promotory pochodzenia eukariotycznego lub wirusowego promotor CMV ludzkiego wirusa cytomegalii promotor SV40 małpiego wirusa S40 promotor CKM mięśniowo-specyficznej kinazy kreatyny eukariotyczne lub wirusowe terminatory transkrypcji zapewniające poliadenylację mRNA sygnał poliadenylacji wirusa S40 sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) Odpowiedź immunologiczna indukowana przez szczepionki DNA DNA szczepionki Możliwości zwiększenia skuteczności szczepionek DNA zwiększenie poziomu ekspresji genu kodującego antygen • nowe silne promotory • promotory tkankowo-specyficzne • sekwencja Kozaka inicjacji translacji w komórkach eukariotycznych (-6GCCAGCCAUGGG+4) • codon usage – stosowanie kodonów preferowanych przez komórki ssacze • multimeryzacja genu kodującego antygen zwiększenie immunogenności DNA szczepionki • wprowadzenie do wektora plazmidowego immunogennych sekwencji CpG • koekspresja antygenu z cząsteczkami immunostymulującymi Szczepionki DNA poddawane próbom klinicznym Kodowane białko Odpowiedź humoralna Odpowiedź komórkowa HIV gp160, białka regulatorowe, białka rdzenia, enzymy nie badano + HBV HBsAg + + HSV glikoproteina HSV w ocenie w ocenie hemaglutynina w ocenie w ocenie nie badano + Patogen wirus grypy Plasmodium sp. CSP, Spf66 Metody genotypowe najczęściej stosowane w badaniach epidemiologicznych • Makrorestrykcyjna analiza genomowego DNA połączona z elektroforezą pulsacyjną (REA/PFGE) • Multilocus Sequence Typing (MLST) • Mikromacierze DNA • Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego DNA (PCR/RFLP) • Repetytywny ekstrageniczny palindromowy PCR (Rep-PCR) • Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA (RAPD) • Rybotypowanie • Metody oparte o ligację adaptorów Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego komórki „Złoty standard” w typowaniu mikroorganizmów” Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową (RFLP-PFGE) Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej jest obecnie metodą standardową w epidemiologii szpitalnej. Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A., Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Meth. 52 (2003) 341-351. Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury zachowania stałych warunków analizy. Cechy efektywnej metody typowania szczepów: • Wysoki stopień dyskryminacji • Powtarzalność • Zdolność do typowania wszystkich szczepów • Prosta w użyciu • Szybkość • Mało kosztowna • Wystandaryzowana Potrzeba poszukiwania nowych metod typowania genetycznego, które powinny charakteryzować się prostotą wykonania, porównywalną siłą dyskryminacji do RFLP/PFGE, niskimi kosztami oraz łatwością adaptacji do badań rutynowych METODY FINGERPRINTING Wiele obecnie stosowanych technik typowania molekularnego opiera się na analizie całego genomowego DNA Metody te wykorzystują: analizę restrykcyjną amplifikację fragmentów DNA in vitro, przy zastosowaniu reakcji PCR Rozdział powstałych fragmentów DNA o różnej długości uzyskuje się przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prążków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Różnice we wzorach świadczą o odmienności genetycznej badanych organizmów. wzór elektroforetyczny = „odcisk palca” Metody typowania molekularnego oparte na technice ang. Ligation Mediated PCR AFLP- Amplified Fragment Length Polymorphism, IRS- PCR – Infrequent Restriction Site PCR, ADSRRS- fingerprinting – Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites PCR- MP – PCR Melting Profiles. LM PCR (ang. Ligation – Mediated Polimerase Chain Reaction) Technika ta umożliwia analizę całego genomowego DNA zarówno prokariotycznego jak i eukariotycznego, bez potrzeby znajomości jego sekwencji Etapy: trawienie restrykcyjne ligacja adaptorów reakcja pre –PCR reakcja PCR elektroforeza produktów amplifikacji Trawienie restrykcyjne 5’ - P G GATC C C CTAG G 5’ - P GATCC 5’ - G CCTAG GP - 5’ CCTAG GP - 5’ P G GATCC G GATCC CCTAG G P - 5’ Ligacja adaptorów oligonukleotydowych 5’ - CTAG CTAG - 5’ 5’ - P GATC CTAG P - 5’ Ligacja adaptorów oligonukleotydowych 5’ - P GATC CTAG - 5’ 5’ - CTAG CTAG P - 5’ Ligacja adaptorów oligonukleotydowych P GATC CTAG CTAG CTAG P Ligacja adaptorów oligonukleotydowych GATC CTAG CTAG CTAG Reakcja pre - PCR GATC CTAG CTAG CTAG Reakcja PCR GATC CTAG Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym 1 2 3 Td [ºC] 100 75 Td [ºC] 100 75 PCR MP – PCR Melting Profile Ograniczoną reprezentację genomu można otrzymać stosując LM PCR z niższą niż zwykle temperaturą denaturacji w trakcie reakcji PCR PCR MP- cechy Zalety: Metoda nie wymaga znajomości analizowanej sekwencji; Wady: Prosta analiza wyników rozdziału w żelu Termocykler gradientowy; poliakryloamidowym wybarwionych bromkiem etydyny; Kalibracja Ten sam adaptor i enzymtermocyklera; restrykcyjny może być użyty do analizy DNA różnych gatunków organizmów; Wysoki potencjał różnicujący; Metoda szybka i stosunkowo tania ; Bardzo dobra powtarzalność uzyskiwanych wyników; PCR MP - PCR Melting Profile Etap wstępny Gradient temperatury denaturacji Wybór odpowiedniej temperatury denaturacji 87,7oC PCR MP w wykrywaniu zakażeń szpitalnych na poszczególnych oddziałach szpitala Krawczyk, B., Samet, A., Leibner, J., Śledzińska, A., Kur, J.: Evaluation of a PCR melting profile (PCR MP) technique for bacterial strain differentiation. J. Clin. Microbiol. 44 (2006) 2327-2332. H2 PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Sytuacja epidemiologiczna indywidualnego pacjenta Nr pacjenta Data Materiał Genotyp 6 23.09. 04 krew H1 6 05.02. 05 krew H11 6 05.02. 05 krew H12 6 05.02. 05 krew H13 6 07.02. 05 kał H13 6 07.02. 05 kał H12 6 10.05. 05 krew H19 6 10.05. 05 kał H19 6 19.05.05 krew H19 6 19.05.05 krew H19 6 22.05.05 krew H24 6 22.05.05 krew H24 6 25.05.05 krew H24 6 25.05.05 krew H24 6 27.05.05 krew H24 6 08.07.05 krew H24 PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii Co to jest translokacja bakterii? migracja bakterii pochodzących z prawidłowej flory bakteryjnej i ich toksyn przez ścianę przewodu pokarmowego i układu moczowego, co w konsekwencji może wywoływać bakteriemię, zakażenia narządowe, a nawet posocznicę oraz zapalenie otrzewnej u chorych z marskością wątroby. PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii Nr translokacji Nr izolatu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Data Źródło Nr pacjenta izolacji izolacji 12 07.02.05 13 07.02.05 69 10.05.05 70 10.05.05 39 15.02.05 40 18.02.05 1 12.11.04 2 12.11.04 35 12.02.05 36 13.02.05 37 15.02.05 23 14.12.04 24 15.12.04 45 22.02.05 46 25.02.05 28 01.01.05 29 02.01.05 52 03.03.05 53 04.03.05 33 12.02.05 34 13.02.05 67 03.05.05 68 03.05.05 6 6 24 1 23 15 26 17 31 22 40 Genotyp krew H13 kał H13 krew H20 kał H20 krew H15 kał H15 krew T1 mocz T1 krew T2 mocz T2 kał T2 krew P1 kał P1 krew H17 kał H17 krew H9 mocz H9 krew T4 mocz T4 krew IM1 kał IM1 krew UG1 mocz UG1 PCR MP w badaniu indywidualnego pacjenta Badanie transmisji (translokacji) bakterii Gradient temperatury denaturacji Potwierdzenie pokrewieństwa genetycznego Optymalizacja procedury PCR MP dla Enterococcus faecium Optymalizacja - cykl badań, który pozwoli określić parametry krytyczne poszczególnych etapów metody oraz wyznaczyć ich wartości optymalne Cel optymalizacji: skrócenie czasu przeprowadzania badania zmniejszenie stopnia skomplikowania przeprowadzania badania obniżenie kosztów analizy z zachowaniem jakości i powtarzalności otrzymywanych wyników Podczas optymalizacji PCR MP badano wpływ zmiany: ilości, rodzaju i stężenia stosowanych odczynników czasu trwania poszczególnych etapów temperatury poszczególnych etapów na jakość otrzymywanych wyników Izolacja genomowego DNA Enterococcus faecium Trawienie restrykcyjne genomowego DNA Reakcja ligacji W wyniku optymalizacji PCR MP określono: parametry krytyczne metody wartości optymalne badanych parametrów Inaktywacja termiczna Reakcja PCR Elektroforeza poliakrylamidowa Wizualizacja Wyznaczenie parametrów krytycznych Wyznaczenie ilości mieszaniny ligacyjnej w reakcji PCR M 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 3 4 5 6 10 Wyznaczenie aktywności enzymu restrykcyjnego M 0.1 0.5 1 2 3 4 5 10 K- Rys.1. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości enzymu restrykcyjnego w reakcji trawienia; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.1 – 10 –ilości enzymu w kolejnych próbach Rys.2. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości mieszaniny ligacyjnej; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.2 – 10 – objętość mieszaniny ligacyjnej w kolejnych próbach [ul] Procedura skrócona (wg Krawczyk B., Samet A., Leibner. J, Śledzińska A. Kur J. (2006); 1h; 37°C 500 ng DNA 5U HindIII Izolacja genomowego DNA Enterococcus faecium Trawienie restrykcyjne genomowego DNA 1h, 16°C adaptor: 20pmol każdego oligonukleotydu Vc= 25 μl mieszanina ligacyjna 1μl starter 25 pmol Polimeraza PwoHis 0.6 U Cykle: 22 20 min; 37°C 600 - 1000 ng DNA 3U Hind III 20min; 16°C Reakcja ligacji 1U ligazaT4 10 min; 70°C Procedura zoptymalizowana adaptor: 10pmol każdego oligonukleotydu 0,6U ligazaT4 Inaktywacja termiczna Reakcja 10 min; PCR 70°C Elektroforeza poliakrylamidowa Wizualizacja Vc= 25 μl mieszanina ligacyjna 1μl starter 25 pmol Polimeraza PwoHis 0.6 U Cykle: 22 Weryfikacja zoptymalizowanej procedury PCR MP Procedura standardowa M1 1 2 3 4 Procedura zoptymalizowana 5 M2 1 2 3 4 5 Analiza porównawcza pięciu różnych szczepów E. faecium Parametr Skrócona procedura PCR MP Zoptymalizowan a procedura PCR MP czas badania 8h 6-7h koszt badania ? Zredukowany ze względu na zmniejszenie ilości stosowanych odczynników jakość otrzymywanyc h wyników bardzo dobra bardzo dobra interpretacja wyników łatwa łatwa Konstrukcja zestawu diagnostycznego PCR MP unique Zestaw diagnostyczny PCR MP unique wykorzystuje zoptymalizowaną technikę PCR MP Służy do różnicowania i genotypowania drobnoustrojów w badaniach epidemiologicznych Zestaw pozwala na przeprowadzenie 100 pełnych analiz, przy zastosowaniu gotowych do użycia odczynników o stężeniach i aktywnościach odpowiadającym optymalnym Walidacja zestawu diagnostycznego PCR MP unique Walidacja dowolnej metody badawczej jest to działanie mające na celu potwierdzenie w sposób udokumentowany i zgodny z założeniami, że dana metoda badawcza jest odpowiednia dla zamierzonego celu i pozwala uzyskać zaplanowane (prawidłowe) wyniki z odpowiednią precyzją i dokładnością. Walidacja przeprowadzona zgodnie z wytycznymi ICH (The International Conferencer on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) oraz monografii EP (European Pharmacopeia) dla metod analitycznych, wykorzystujących techniki amplifikacji kwasów nukleinowych (NAT – Nucleic Acid Amplification Techniques) Cechy walidowane: specyficzność i selektywność granica wykrywalności elastyczność powtarzalność precyzja otrzymywanych wyników Precyzja Stopień zgodności otrzymanych wyników, gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtórzonych, niezależnych oznaczeń. Miarą precyzji jest stopień zgodności profili elektroforetycznych produktów reakcji PCR otrzymanych na drodze niezależnych badań tego samego szczepu. powtarzalność M Precyzja oznaczeń wykonanych przez tą samą osobę w tym samym laboratorium na tej samej aparaturze oraz z wykorzystaniem tych samych odczynników w krótkim odstępie czasu odtwarzalność Precyzja oznaczeń wykonywanych przez: inną osobę w tym samym laboratorium stosując te same odczynniki i aparaturę 3 23.01.2007 1 2 4 K- M 1 2 3 4 6. 02.2007 K- M 1 2 3 4 20. 02. 2007 K- Walidacja zestawu diagnostycznego PCR MP unique podsumowanie Zoptymalizowana procedura PCR MP jest: specyficzna selektywna charakteryzuje się granicą oznaczalności DNA w ilości 250 ng elastyczna uniwersalna ADSRRS fingerprinting (ang. Amplification of DNA Surrounding Rare Restriction Sites) Zjawisko supresji Badania relacji epidemiologicznych pomiędzy nosicielstwem Staphylococcus aureus a czyracznością (metoda ADSRRS) Źródło izolacji Numer izolatu Oznaczenie rodziny/pacjenta PCR MP genotyp 1 I/A nos A’ 2 I/B nos A’ 3 I/B czyrak A’ 4 II/A nos B’ 5 II/A czyrak B’ 6 II/B nos C’ 7 III/A nos D’ 8 III/B czyrak B’ 9 III/B nos D’ 10 III/B czyrak (pacha) B’ 11 IV/A nos E’ 12 IV/B nos F’ 13 IV/B czyrak F’ Nowa klasa homodimerycznych białek SSB z rodziny Deinococcaceae /Thermaceae – charakterystyka molekularna, zastosowanie SSB (ang. single stranded DNA - binding protein) białka wiążące się z jednoniciowym DNA Funkcje białek SSB są niezbędne w procesie replikacji DNA stymulują polimerazy DNA oddziaływują z innymi białkami replikacyjnymi (np. helikazą) biorą udział w rekombinacji i naprawie DNA Występowanie białek SSB wszystkie żywe organizmy wirusy mitochondria Klasyfikacja białek SSB ze względu na budowę ► homotetramer: - większość bakterii - mitochondria ► heterotrimer: - archaea - eukaryota ► dimer: - Thermus thermophilus (263 aa) - Thermus aquaticus (264 aa) - Deinococcus radiodurans (301 aa) Termostabilność TaqSSB i TthSSB T.aquaticus i T. thermophilus rosną w optymalnej temp. 70ºC Termostabilność białek TaqSSB i TthSSB w T = 85ºC okres półtrwania wynosi 10 min Termostabilność DgeoSSB i DmurSSB 95 85 okres półtrwania [min] okres półtrwania [min] 50 40 30 20 10 0 75 65 55 45 35 25 65 70 75 80 85 Temperatura [°C] DgeoSSB 61,93 kDa monomer: 300 aa 90 95 80 85 90 95 100 Temperatura [°C] DmurSSB 49,51kDa monomer: 276 aa 105 110 Zastosowanie białek TaqSSB i TthSSB w reakcji PCR…i nie tylko… Aplikacje białek SSB Zastosowanie białek TaqSSB i TthSSB Inne techniki wykorzystujące ssDNA i RNA Reakcje PCR Reakcja multipleks PCR Odwrotna transkrypcja (RT) Legenda: Zastosowanie dowiedzione Zastosowanie potencjalne Reakcje sekwencjonowania trudnych matryc Reakcja PCR – jedną z najbardziej popularnych aplikacji termostabilnych białek SSB Wykorzystaliśmy białko TthSSB i TaqSSB do amplifikacji fragmentu DNA wirusa CMV. Rozdział elektroforetyczny w 2% żelu agarozowym produktów reakcji PCR przeprowadzanej w nieobecności TthSSB (góra) lub z białkiem TthSSB (dół). Powyżej ścieżek wskazano liczbę cząsteczek DNA (pCDNA21/CMV) w każdej amplifikowanej próbce. Rezultat: TthSSB podnosi wydajność reakcji PCR o 4 rzędy wielkości Wykorzystanie białka TaqSSB w reakcji multipleks PCR ► Krótkie tandemowe sekwencje repetytywne występujące w ludzkim chromosomie Y (YSTR) wykazują wysoki stopień polimorfizmu i są znacznikiem różnicującym osobniki. Analiza polimorfizmu ludzkiego Y-STR umożliwia ustalenie ojcostwa i jest szeroko stosowana w laboratoriach medycyny sądowej. Loci DYS390, DYS392 i DYS393 występujące w Y-STR są dobrym markerem różnicującym ► W Zakładzie Medycyny Sądowej AM Gdańsk badano wpływ białka TaqSSB na amplifikację multiplex PCR z dimeryzacją starterów. Do badania wpływu białka TaqSSB na efektywność amplifikacji układu wybrano amplifikację dupleksu DYS390-DYS392, w której dimeryzacja starterów zachodzi w trakcie procesu i powstaje nieprawidłowy produkt PCR długości 36 pz, uniemożliwiający syntezę właściwych produktów PCR w standardowych warunkach Hybryd utworzony przez startery DYS390 i DYS392 starter DYS390 5’ 3’ 3’ 5’ starter DYS392 Wynik reakcji multiplex PCR Startery DYS390 = A Startery DYS392 = B Startery DYS393 = C M – wzorzec wielkości DNA (pGEM, Promega) 1 - produkty amplifikacji ze starterami C-A+TaqSSB 2 - produkty amplifikacji ze starterami C-A 3 - produkty amplifikacji ze starterami C-B+TaqSSB 4 - produkty amplifikacji ze starterami C-B 5 - produkty amplifikacji ze starterami A-B+TaqSSB 6 - produkty amplifikacji ze starterami A-B 7 - produkty amplifikacji ze starterami A-B-C+TaqSSB 8 - produkty amplifikacji ze starterami A-B-C Wnioski dotyczące reakcji PCR DYS390, DYS392 i DYS393 ► Startery DYS390 i DYS392 tworzą bardzo stabilną hybrydę, łącząc się ze sobą na 3’ końcach, do których polimeraza dosyntetyzowuje nukleotydy i tworzy się dodatkowy produkt o wielkości 36 pz. ► Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wnioskować, że dodatek termostabilnego białka SSB uniemożliwia tworzenie się struktur drugorzędowych, zarówno wewnątrzcząsteczowych, jak i międzycząsteczkowych, dzięki czemu, uzyskuje się większą wydajność reakcji PCR, a tym samym pozwala na uzyskanie oczekiwanego produktu reakcji PCR. Wpływ białka TaqSSB na reakcję PCR Wynik reakcji PCR modelowego układu, w którym startery wiążą się ze sobą na końcach 3’ 5’ CGACGATTCTGAGTACTTGCA 3’ 3’ AGACTCATGAACGTAGCAGCA 5’ M – marker wielkości M100-500 1 – reakcja bez białka TaqSSB 2 – reakcja z dodatkiem 6l białka TaqSSB 3 – reakcja z dodatkiem 8l białka TaqSSB 4 – reakcja z dodatkiem 9l białka TaqSSB 5 – reakcja z dodatkiem 10l białka TaqSSB 6 – reakcja z dodatkiem 11l białka TaqSSB 7 – reakcja z dodatkiem 12l białka TaqSSB 8 – reakcja z dodatkiem 14l białka TaqSSB stężenie białka TaqSSB – 1.12 g/l Dodatek innych znanych „wzmacniaczy” reakcji PCR jak np.: EcoSSB/Formamid/TMAC/DMSO/TritonX-100 nie przyniósł satysfakcjonujących rezultatów !!!
