ocena chemokin € we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka

advertisement
Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 2, zeszyt 2, 140-144, 2009
Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków
z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego
BARBARA KRÓLAK-OLEJNIK
Streszczenie
Zakażenie wrodzone noworodków, mimo znacznego postępu i rozwoju metod diagnostycznych, nadal stanowi istotny problem współczesnej perinatologii i neonatologii. Celem pracy jest określenie przydatności klinicznej wybranych chemokin $, uznanych jako
mediatory zakażenia w badaniach in vitro i u osób dorosłych, w diagnostyce wrodzonych zakażeń noworodków. Badaniami objęto
211 dzieci urodzonych przedwcześnie i o czasie, zarówno chorych, jak i zdrowych. Chemokiny $ – MIP-1" (CCL3), MIP-1$ (CCL4),
RANTES (CCL5) oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA, we krwi pępowinowej noworodków. Stężenie MIP-1" (CCL3) było
wyższe we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą, w przeciwieństwie do stężenia RANTES (CCL5), które wykazywało najniższe
wartości w grupach zarówno noworodków chorych, jak i urodzonych przedwcześnie. Nie wykazano natomiast różnic znamiennych
statystycznie w zakresie MIP-1$ (CCL4), w badanych grupach. Przeprowadzone badania pozwoliły potwierdzić obecność badanych
chemokin we krwi pępowinowej badanych grup noworodków. Uzyskane wyniki nie pozwalają jednoznacznie określić ich przydatności klicznej, ale stanowią wstępny element dalszych badań układu immunologicznego w tym okresie życia.
Słowa kluczowe: chemokiny, noworodek, zakażenie wrodzone
Wiele funkcji układu odpornościowego noworodka nie
jest w pełni sprawnych, co sprawia, że czynnikiem największego ryzyka wczesnego zakażenia, głównie uogólnionego, wydaje się stopień niedojrzałości, z którą bezpośrednio wiąże się niewydolność anatomiczna i czynnościowa
układu immunologicznego.
Układ ten jest immunokompetentny, lecz ze względu
na stan pewnej „naiwności” jego elementy nie reagują
zróżnicowaniem na antygen. Kształtowanie się mechanizmów obronnych zależy nie tylko od uwarunkowań genetycznych, obecności kompetentnych limfocytów i wzajemnych oddziaływań komórkowych, ale przede wszystkim
od kontaktu układu odpornościowego z obcym antygenem. Odporność noworodka zależy również od przebiegu
ciąży, czasu jej trwania oraz wydolności łożyska.
Większość noworodków z wczesną postacią zakażenia
prezentuje pewne słabo wyrażone objawy kliniczne. Mimo
że w wielu przypadkach możliwe jest udowodnienie występowania położniczych czynników ryzyka, istnieją duże
trudności diagnostyczne tym bardziej, że nie dysponujemy
powszechnie akceptowalnym panelem badań laboratoryjnych, który umożliwiłyby ich wczesne i pewne rozpoznanie.
Chemokiny są niskocząsteczkowymi białkami wydzielanymi przez leukocyty i inne komórki w stanie spoczynku
lub po stymulacji [1]. Przeprowadzone na zwierzętach i u
ludzi badania eksperymentalne in vivo wykazały, że stężenie chemokin wzrasta w przypadku zakażenia dróg oddechowych (w krótkim czasie po zakażeniu), powodując
napływ komórek zapalnych [2-4]. Uczestniczą one także w
wielu zakażeniach bakteryjnych, a zwłaszcza chorobach
wywołanych przez patogeny wewnątrzkomórkowe. Nie
ma jednoznacznego poglądu na zachowanie się chemokin
w zakażeniach uogólnionych [4, 5]. Wydaje się, że odgrywają istotną rolę w przebiegu większości chorób, w których dochodzi do aktywacji i kumulacji leukocytów
w tkankach [2, 6-9].
Celem pracy było określenie przydatności klinicznej
wybranych chemokin $ – MIP-1" (CCL3), MIP-1$ (CCL4),
RANTES (CCL5) w rozpoznawaniu wczesnych zakażeń
u noworodków urodzonych o czasie i przedwcześnie.
Materiał i metodyka
Badaniami objęto 211 noworodków urodzonych w Klinice Perinatologii i Ginekologii w Zabrzu w okresie od
01.07.2000 r. do 30.06.2004 r. (tab.1.)
Do badań włączono noworodki bez wad rozwojowych,
pochodzące z ciąż pojedynczych o prawidłowym przebiegu, matek zdrowych.
U 16 noworodków, które od urodzenia demonstrowały
kliniczne i laboratoryjne objawy zakażenia, ale w posiewach krwi nie wyhodowano drobnoustrojów, rozpoznawano zespół septyczny. Było to 6 noworodków urodzonych
o czasie i 10 urodzonych przedwcześnie.
U noworodków z retrospektywnie rozpoznaną posocznicą, zespołem septycznym lub zapaleniem płuc występowały najczęściej następujące czynniki ryzyka okołoporodowego: czynność porodowa niereagująca na leki tokolityczne, przedwczesne pęknięcie błon płodowych (tab. 2).
Powszechnie uznane za typowe badania laboratoryjne
upoważniające do rozpoznania zakażenia niejednoznacznie wskazywały na rozwijającą się infekcję wrodzoną. We
krwi pępowinowej tylko dwukrotnie stwierdzono zwiększone stężenie białka C-reaktywnego (15,2 i 19,3 mg/l),
Katedra i Oddział Kliniczny Ginekologii, Perinatologii i Neonatologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym
w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
141
Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego
Tabela 1. Charakterystyka badanych grup noworodków (wartości wyrażono jako Me [Q1-Q3])
Noworodki
N
Płeć
żeńska/męska
Wiek płodowy
[tygodnie ukończone]
Masa ciała
[g]
Długość
[cm]
Apgar
[punkty]
Zdrowe donoszone
(grupa I)
71
40/31
40,0
39,0-40,0
3290,0
2930,0-3515,0
53,5
52,0-55,0
10,0
9,0-10,0
Chore donoszone
(grupa II)
36
17/19
38,0
38,0-39,5
2855,0
2470,0-3140,0
52,0
48,5-53,0
9,0
4,5-10,0
Zdrowe wcześniaki
(grupa III)
45
24/21
35,0
34,0-36,0
2145,0
1880,0-2480,0
47,0
46,0-50,0
8,0
7,0-10,0
Chore wcześniaki
(grupa IV)
59
33/26
32,0
29,0-33,0
1670,0
1250,0-2240,0
44,0
41,0-48,0
7,0
6,0-9,0
Tabela 2. Czynniki ryzyka okołoporodowego dla posocznicy, zespołu septycznego i zapalenia płuc rozpoznawanych
retrospektywnie w badanej grupie chorych noworodków
N
Poród
przedwczesny
Przedwczesne
pęknięcie błon płodowych – PROM
Zespół septyczny
16
4
4
Posocznica
12
6
3
Zapalenie płuc
19
2
11
ZZO i zapalenie płuc
20
8
7
Tabela 3. Charakterystyka opisowa stężeń wyrażonych w pg/ml w postaci statystyk pozycyjnych Me (Q1-Q3)
dla noworodków zdrowych i chorych
Grupy
noworodków
MIP-1" (CCL3)
MIP-1$ (CCL4)
RANTES (CCL5)
Zdrowe donoszone
10,0*
(10,0-47,5)
208,9
(97,3-379,8
61110*
(44082-77725)
Zdrowe wcześniaki
10, 0
(10,0-88,0)
215,8
(103,0 -502,5)
52642
(32860-70347)
Chore donoszone
17,9*
(10,1-50,3,3)
217,7
(152,3-1800,9)
72128*
(44465-80461)
Chore wcześniaki
10,0
(10,0-172,4)
168,6
(98,2-536,3)
46 853
(32979-64009)
0,07*
NZ
0,006*
Znamienność statystyczna
leukocytoza w pierwszej dobie życia była dwucyfrowa,
w zakażeniach bakteriami Gram (!) obserwowano tendencję do małopłytkowości (65-150 × 109/l). Natomiast odmłodzenie rozmazu w pierwszym badaniu krwi występowało
w 42/67 (62%) rozpoznań zakażeń wczesnych. Wysokie
wartości stężeń IL-6 (> 65 pg/ml) stwierdzono we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą, natomiast wysokie
wartości IL-8 (> 150,0 pg/ml) tylko u noworodków urodzonych przedwcześnie z potwierdzonym zakażeniem wrodzonym.
Ocenę stopnia dojrzałości noworodków przeprowadzono w oparciu o czas trwania ciąży, obliczony według
reguły Naegellego i weryfikowany badaniem ultrasonograficznym, przed porodem oraz o urodzeniową masę ciała, odczytując wartość wieku płodowego z siatek centylowych opracowanych dla dzieci ze Śląska [10]. W przypadku niemożności ustalenia daty ostatniej miesiączki u matki
wiek płodowy noworodka oceniano na podstawie badania
w dniu porodu, posługując się skalą Ballarda [11].
Krew pępowinową pobierano bezpośrednio po porodzie. Po odwirowaniu surowicę zamrażano i do czasu
wykonania oznaczeń przechowywano w temperaturze
!70EC.
Chemokiny oznaczano metodą immunoenzymatyczną
ELISA, stosując zestawy Quantikine firmy R&D (Minneapolis, USA). Postępowano zgodnie z instrukcją oznaczania
chemokin na podstawie metodyki badań immunoenzymatycznych dla poszczególnych zestawów. Czułość metody
(minimalne wykrywane stężenia) wynosiła dla RANTES
(CCL5) — 8 pg/ml, dla MIP-1'’ (CCL3) – 4 pg/ml, dla MIP-1$
(CCL4) – 6 pg/ml.
Oznaczenia z jednej próbki wykonywano podwójnie,
podając wartość średnią, a współczynniki zmienności nie
przekraczały 10%.
142
B. Królak-Olejnik
Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji
Bioetycznej Śląskiej Akademii Medycznej, NN-013-14/01
z dnia 06.02.2001 r. i NN-013-14/II/05 z dnia 07.06.2005 r.
Do gromadzenia danych liczbowych wykorzystano
arkusz kalkulacyjny Excel 5, a w celu wykonania analiz
statystycznych zastosowano program Statistica 6 dla Windows [12]. W analizie posłużono się testem Shapiro-Wilka
i testem zgodności Chi2. Zbadano również symetrię rozkładów, opierając się na współczynniku skośności. Rozkłady
niektórych parametrów wykazały własności asymetrii dodatniej, inne ujemnej. W związku z tym porównań dwóch
prób dokonano testem U Manna-Whitneya, a charakterystykę opisową przedstawiono w postaci statystyk pozycyjnych, takich jak mediana, kwartyle (dolny i górny).
Przy wysoce istotnej różnicy cechy ciągłej, poprzez
zastosowanie regresji logistycznej podjęto próbę oceny
wpływu każdej z nich na cechę jakościową typu dychotomicznego, której wartości odpowiadały alternatywnym
stanom zdrowia. Wszystkie testy zostały wykonane na
poziomie istotności " = 0,05.
Wyniki i ich omówienie
Oceniono stężenia chemokin $ w grupach noworodków zdrowych i chorych (tab. 3).
Porównano wartości stężeń MIP-1" (CCL3) u noworodków zdrowych i chorych, urodzonych zarówno o czasie, jak i przedwcześnie, nie wykazano różnic znamiennych statystycznie. Kolejne analizy dotyczyły porównywania stężenia MIP-1" (CCL3) u noworodków zdrowych
z wartościami tego parametru u noworodków z posocznicą, a także chorych bez posocznicy. Na tej podstawie dokonano podziału noworodków chorych, zgodnie z przyjętą
w materiale zasadą, na noworodki z posocznicą (tu ujęto
także noworodki z zespołem septycznym) i z zakażeniem
(zapalenie płuc) oraz niewydolnością oddychania (ZZO
i TTN). Nie uzyskano różnic istotnych statystycznie w grupach innych niż z posocznicą — p = 0,0064 (ryc. 1).
750,0
500,0
MIP-1
250,0
Mediana
25-75%
Min.-Maks.
75,0
50,0
25,0
7,5
zdrowe
z zakażeniem
z posocznicą
z ZZO i TTN
Noworodki
Ryc. 1. Porównanie wartości stężeń MIP-1" (CCL3) we krwi
pępowinowej noworodków zdrowych i chorych
Szukając powiązania prawdopodobieństwa choroby
z wielkością MIP-1" (CCL3), poddano analizie regresji logistycznej wartości tej chemokiny we krwi pępowinowej
noworodków chorych i zdrowych. Uzyskany model był
istotny statystycznie, jednak z powodu niskiej zdolności
klasyfikacyjnej (10,0%) dla noworodków chorych nie
umieszczono go w pracy.
Także wartości przeciętne stężeń chemokiny MIP-1$
(CCL4) we krwi pępowinowej noworodków chorych, bez
względu na rodzaj schorzenia, nie wykazały różnic znamiennych statystycznie w porównaniu z noworodkami
zdrowymi.
Wykazano natomiast, że wartość przeciętna stężeń
RANTES (CCL5) u noworodków zdrowych była znamiennie wyższa niż u nowrodków chorych. Na podstawie wyników uzyskanych dla zdrowych noworodków, wykazano że
wiek płodowy ma statystycznie istotny wpływ na przeciętną wartość stężenia RANTES (CCL5) [13-15]. Mediana
stężeń tej chemokiny noworodków urodzonych o czasie
jest wyższa niż noworodków urodzonych przedwcześnie.
W grupie zdrowych było aż 60% (64/107) noworodków
urodzonych o czasie, natomiast w grupie chorych tylko
18% (12/67). Sytuacja ta mogła spowodować, że uzyskano
wyższą wartość przeciętną dla grupy noworodków zdrowych. Aby ocenić wpływ choroby na przeciętną wartość
stężenia RANTES (CCL5) niezależnie od wieku płodowego,
dokonano rozłącznych porównań chorych i zdrowych
w podgrupach, czyli urodzonych o czasie i przedwcześnie.
Potwierdza to, że różnice znamienne statystycznie przeciętnych wartości stężeń RANTES (CCL5) grup chorych
i zdrowych wynikały z różnic wieku płodowego noworodków, nie były zależne od występowania choroby. Odstąpiono zatem od analizy stężenia RANTES (CCL5) we krwi
pępowinowej noworodków w zależności od rodzaju choroby.
W przeprowadzonych badaniach spośród chemokin
$ we krwi pępowinowej noworodków chorych wartości
stężeń RANTES (CCL5) były znamiennie niższe [48 923 (34
624-69 981) pg/ml] niż u noworodków zdrowych [61 110
(44 082-77 725) pg/ml]. Również Ng PC i wsp. wykazali
znamienne obniżenie stężenia RANTES (CCL5) u dzieci
z najcięższą postacią posocznicy powikłanej zespołem
wykrzepiania wewnątrznaczyniowego [8]. Badali oni panel
cytokin i chemokin w początkowym okresie wystąpienia
objawów posocznicy u noworodków z masą ciała poniżej
1500 g wykazując ich wzrost, z wyjątkiem stężenia RANTES. Wartości RANTES (CCL5) poniżej 3110 ng/l wraz
z IL-10 powyżej 208 ng/l i IL-6 powyżej 168 ng/l pozwoliły
autorom przewidzieć rozpoznanie zespołu wykrzepiania
wewnątrznaczyniowego w przebiegu posocznicy przed
wystąpieniem objawów klinicznych (czułość 100%, specyficzność 97%) [8]. Podobne dane przedstawili Fotopoulos
i wsp., badając zachowanie się chemokin we krwi obwodowej noworodków z niedotlenieniem okołoporodowym
oraz okołoporodowym i nabytym zakażeniem [5]. Stężenie
Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego
RANTES (CCL5) było znamiennie niższe u noworodków
z perinatalnym zakażeniem w porównaniu z grupą kontrolną noworodków zdrowych. Wartości RANTES (CCL5) dla
noworodków zdrowych w 1. dobie życia wynosiły 50 280
(43 765-69 415) pg/ml, a dla noworodków z zakażeniem —
32 181 (22 612- 41 910) pg/ml. Według Fotopoulos i wsp.
redukcja stężenia RANTES (CCL5) obserwowana u noworodków w stosunku do dorosłych jest efektem występowania mniejszej liczby komórek T CD45RO+/ CD8+ odpowiedzialnych za ich sekrecję [5]. Ponadto zakażenie
może nasilać supresję stężenia RANTES (CCL5) w surowicy. Autorzy wykazali wzrost stężenia tej chemokiny dopiero w czwartej dobie zakażenia w porównaniu z grupą
kontrolną.
Z przeprowadzonych badań wynika, odmiennie niż
przedstawił w pracy Fotopoulos i wsp., że stężenie MIP-1"
(CCL3) wzrastało we wczesnej posocznicy [5]. Wzrost stężenia badanej chemokiny autorzy obserwowali w zakażeniu nabytym. Wartości MIP-1" (CCL3) wynosiły dla zdrowych noworodków 53,1 (48,7-64,6), a dla noworodków z
zakażeniem — 48,8 (36,3-50,0) pg/ml [5]. W naszych badaniach wartości tej chemokiny wynosiły 10,0 (10,0-47,5)
pg/ml dla zdrowych noworodków oraz 14,0 (10,0-118,3) dla
chorych i stwierdzono jedynie tendencję w kierunku istotnej różnicy. Dopiero wyodrębnienie grupy dzieci z posocznicą i porównanie wartości ich stężeń MIP-1" (CCL3)
ze stężeniami zdrowych noworodków i chorych bez posocznicy pozwoliło uzyskać różnice znamienne statystycznie. Najwyższe wartości stężeń MIP-1" (CCL3) wykazano
we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą [125,8
(10,3- 301,0) pg/ml]. Wyniki własne nie potwierdzają zatem
danych uzyskanych przez Fotopoulos i wsp. dotyczących
tej chemokiny.
Uzyskane wyniki są natomiast zgodne z ustaleniami
Knapp i wsp., którzy badali stężenie MIP-1" (CCL3) we
krwi pacjentów z posocznicą wywołaną przez bakterie
Gram (+) [16]. Stężenie tej chemokiny było znamiennie
wyższe u chorych niż u zdrowych osób, odpowiednio 50
pg/ml i 25 pg/ml. Na podkreślenie zasługuje rola MIP-1"
(CCL3) i MIP-1$ (CCL4), jaką odgrywają one w rozwoju
odpowiedzi zapalnej w przebiegu zakażenia poprzez regulację napływu komórek jednojądrzastych, modulację produkcji cytokin i wpływ na ciepłotę ciała [4].
Istotne jest wykazanie obecności innych mediatorów
zakażenia, trudnych jeszcze do określenia jako pro- lub
przeciwzapalne, we krwi pępowinowej wszystkich badanych noworodków. Wyjaśnienie mechanizmów immunologicznych, zarówno u noworodków zdrowych, jak i chorych, pozwoli w przyszłości na wprowadzenie skuteczniejszych metod diagnostycznych i leczniczych, być może
umożliwi ocenę stosowanej terapii, pozwoli wyselekcjonować noworodki szczególnie zagrożone, a może nawet
ułatwi profilaktykę zakażeń.
143
Piśmiennictwo
[1] Rollins B.J. (1997) Chemokines. Blood 90: 909-928.
[2] Gerard C., Rollins B.J. (2001). Chemokines and disease. Nature Immunol. 2: 108-115.
[3] Jasiewicz-Worsztynowicz B.M. Karnas-Kalemba W.Z. (2004).
Różne aspekty działania chemokiny RANTES i możliwości
jej wykorzystania w diagnostyce i terapii. Wiad. Lek. LVII:
653-658.
[4] O’Grady N.P., Tropea M., Preas II H.L. et al. (1999). Detection
of Macrophage Inflammatory Protein (MIP)- " and -1$ during
experimental endotoxemia and human sepsis. J. Infect. Dis.
179: 136-141.
[5] Fotopoulos S., Mouchtouri A., Xanthou G. et al. (2005). In-
flammatory expression in the peripheral blood of neonates
with perinatal asphyxia and perinatal or nosocomial infections. Acta Paediatr. 94: 800-806.
[6] Baggiolini M.(2001) Chemokines in pathology and medicine.
J. Inter. Med. 249: 1-14
[7] Locati M., Bonecchi R., Corsi M.M. (2005). Chemokines and
their receptors. Roles in specific clinical conditions and
measurement in the clinical laboratory. Am. J. Clin. Pathol.
123 (suppl.1): S1-S14.
[8] Ng P.C., Li K., Leung T.F. et al. (2006). Early prediction of
sepsis-induced disseminated intravascular coagulation with
interleukin-10, interleukin-6, and RANTES in preterm infants.
Clin. Chem. 52: 1181-1189.
[9] Sullivan S.E., Staba S.L., Gersting J.A. et al. (2002). Circulating
concentrations of chemokines in cord blood, neonates and
adults. Pediatr. Res. 51: 653-657.
[10] Baumert M., Osuch-Jaczewska R., Paprotny M., Machalski T.
(1993).Wskaźniki biologiczne rozwoju noworodków śląskich
urodzonych między 30 a 42 tygodniem ciąży. Wiad. Lek. 46:
123-126.
[11] Gomella T.L. Red. Neonatologia, Śląska Akademia Medyczna, Katowice 1993.
[12] Stanisz A. (2000). Przystępny kurs statystyki z wykorzystaniem programu Statistica pl na przykładach z medycyny. t. II,
StatSoft Polska Sp. z o.o, 205-236.
[13] Królak-Olejnik B., Olejnik I., Beck B. (2006). Umbilical serum
concentrations of chemokines (RANTES, MGSA/GRO-") in
preterm and term neonates. Pediatr. Int. 48(6): 586-590.
[14] Królak-Olejnik B., Olejnik I., Kaźmierczak W. (2005). CC-chemokines concentrations in the umbilical cord blood preterm
and term neonates. J. Ped. Neonatal. 2(1), N36-40.
[15] Królak-Olejnik B. (2007) Stężenie wybranych chemokin a –
GRO a (CXCL1), ENA-78 (CXCL5) oraz wybranych chemokin
b - MIP-1a (CCL3), MIP-1b (CCL4), RANTES (CCL5) we krwi pępowinowej noworodków urodzonych o czasie i przedwcześnie w zależności od sposobu rozwiązania ciąży i patologii okołoporodowej. Rozprawa habilitacyjna. Śląska Akademia Medyczna w Katowicach.
[16] Knapp S., Thalhammer F., Locker G.J. et al. (1998) Prognos-
tic value of MIP-1alpha, TGF-beta2, sELAM-1, and sVCAM-1
in patients with Gram-positive sepsis. Clin. Immunol. Immu-
nopathol. 87: 139-144.
J
Katedra i Oddział Kliniczny Ginekologii, Perinatologii
i Neonatologii Wydziału Lekarskiego w Zabrzu
41-800 Zabrze, Wolności 232/6
e-mail: [email protected]
144
B. Królak-Olejnik
Chemokines $ in the umbilical cord blood in the newborns from risk groups of intrauterine infection
Newborns’ intrauterine infection is very serious problem of current perinatology and neonatology. Aim of the study is to determine
the clinical usefulness of chosen chemokines $ in the umbilical cord blood of newborns, recognised as mediators of infection in the
study both in vitro and in adults, in the diagnosis of intrauterine infection in newborns. In the study level of MIP-1" (CCL3), MIP-1$
(CCL4), RANTES (CCL5) in the umbilical cord blood of 211 newborns was measured. Serum cord blood MIP-1" (CCL3) was higher
in newborns with bacterial sepsis, however RANTES (CCL5) was lower in the cord blood of newborn both preterm and infected. Level
of MIP-1$ (CCL4) was almost the same in the study groups of newborns. Research which was carried out allowed for the confirmation
of the presence of study chemokines in the cord blood of study group of newborns. But the results achieved do not allow determining
categorically their clinical usefulness. However they constitute important element of further study into the immunological system
in the period of life.
Key words: chemokines, newborn, intrauterine infection
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

Create flashcards