Podstawy terapii genowej Hamowanie ekspresji genu przez

Podstawy terapii genowej
Wprowadzenie do zagadnień terapii genowej
Podstawy terapii genowej
Wprowadzenie do zagadnień terapii genowej
Terapia genowa – jako wprowadzanie prawidłowych genów do komórek w
celach terapeutycznych – została zaproponowana przez polskiego uczonego
prof. Szybalskiego w latach 60 ub. wieku.
Idea została wcielona w życie w 1962r. przez profesora w trakcie
eksperymentu na hodowli komórek gdzie zmutowane komórki zostały
„uleczone” przez wprowadzenie DNA prawidłowych komórek zawierających
prawidłowy gen HPRT – kodujący enzym uczestniczący w metabolizmie
puryn.
Pierwotnie terapia genowa była skierowana na leczenie chorób dziedzicznych
i monogenowych. Coraz częściej jednak próbuje się ją wykorzystać do
leczenia innych chorób, w tym nowotworów.
Obecnie schematy terapii genowej u ludzi są wciąż udoskonalane. Wiele z
nich znajduje się w trakcie badań klinicznych II lub III fazy.
Podstawy terapii genowej
Wprowadzenie do zagadnień terapii genowej
Najbardziej skuteczne terapie genowe:
1. Ciężki złożony niedobór odporności (SCID) – pierwsza udana terapia
genowa w historii medycyny (1990r.). Obecnie ok. 40 pacjentów przeszło
terapię: pobranie komórek macierzystych szpiku, ich transdukcję ex vivo
retrowirusem z genem kodującym deaminazę adenozyny, selekcję i
proliferację in vitro, przeszczep do pacjenta poddanego supresji komórek
szpiku.
2. Choroba Parkinsona – gen dekarboksylazy L-aminokwasów
aromatycznych (AADC) zawarty w wektorze AAV (wirus towarzyszący
adenowirusom) wprowadzono do mózgu przez kontrolowaną iniekcję
stereotaktyczną; 1 pacjent trwale wyleczony
3. Dystrofia mięśniowa Duchenne’a – antysensowny oligomer morfolinowy
(Eteplirsen) indukujący przeskok przez ekson 51 w mRNA dystrofiny –
powstaje skrócona ale funkcjonalna dystrofina; leczenie 12 chłopców daje
efekty kliniczne; prawdopodobna szybka ścieżka rejestracji leczenia
4. Mukowiscydoza – gen transbłonowego regulatora mukowiscydozy w
połączeniu z liposomami podawany przez nebulizację; największe
badanie kliniczne terapii genowej II fazy – 130 pacjentów; stabilizacja
czynności płuc ale brak poprawy w stosunku do wyjściowych parametrów
Podstawy terapii genowej
STRATEGIE TERAPII GENOWEJ:
I Komplementacja defektu genetycznego
polega na łagodzeniu skutków biologicznych
defektu genetycznego przez wprowadzenie
prawidłowego genu (nie usuwa defektu)
Przykład: mutacja punktowa w ORF genu β-globiny
prowadzi do anemi sierpowatej (zamiana 1 aminokwasu –
tetramery α i β-globiny tworzą strąty); wprowadzenie
prawidłowego genu β-globiny do komórek macierzystych
erytrocytów → wytwarzanie normalnych erytrocytów
Podstawy terapii genowej
Wprowadzanie genów do komórek docelowych:
A. in vivo – wprost do organizmu (domięśniowo, doguzowo,
systemowo – tj. do krwi)
celowane wprowadzanie jest możliwe przez
zastosowanie: wektorów wirusowych o określonym tropizmie,
nośników (np. liposomy) zawierających odpowiednie ligandy
B. ex vivo – poza organizmem; polega na pobraniu komórek
(szpik, limfocyty, mioblasty), ich hodowli oraz modyfikacji
genetycznej i wprowadzeniu do organizmu
Podstawy terapii genowej
Powodzenie komplementacji zależy od wielu
czynników:
1. dostarczenie genu do określonych komórek
• np. w leczeniu mukowiscydozy – do komórek
nabłonka oddechowego, w nowotworach – do guza
ale też do węzłów chłonnych, limfocytów, komórek
dendrytycznych
• gdy suplementacji ulega białko surowicy – dowolna
komórka (np. mięśniowa, skóry) może produkować
aktywne białko wydzielane do krwiobiegu, np.
czynniki krzepnięcia w leczeniu hemofilii
2. przygotowanie konstruktu genowego o dużej i
trwałej aktywności (dobór odpowiedniego promotora)
3. wybór komórek o długim czasie życia
Podstawy terapii genowej
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ograniczenia metody komplementacji:
wielkość genu – duże geny trudniej wprowadzić lub nie mieszczą
się w wektorach wirusowych
wydajność transferu konstruktu genowego do komórek
docelowych – wydajność odwrotnie proporcjonalna do wielkości
DNA
wprowadzenie transgenu, który integruje do genomu gospodarza
– może zajść wyciszenie transgenu lub/i insercyjna inaktywacja
genu gospodarza
okres utrzymywania się efektu – może być nietrwały
bezpieczeństwo – wektory adenowirusowe oraz liposomy mogą
indukować reakcje zapalne i powstawanie przeciwciał
choroby związane z mutacjami dominującymi-negatywnymi –
wprowadzenie poprawnego białka nie ma sensu ponieważ
obecność zmutowanego białka indukuje zmiany konformacyjne w
białku prawidłowym inaktywując je:
domena
aktywna
białko
nieaktywne
domena
nieaktywn
a
Podstawy terapii genowej
II Hamowanie ekspresji genu
Specyficzne hamowanie ekspresji zmutowanego lub
nadmiernie aktywnego genu (wyciszanie na poziomie
DNA lub mRNA)
protonkogeny – normalne geny odpowiedzialne za
regulację podziałów komórkowych, różnicowanie i
wzrost (myc, ras, abl)
onkogen – powstaje na skutek aktywacji
protoonkogenu; bierze udział w promocji nowotworów
aktywacja protoonkogenu zachodzi na skutek:
transdukcji, mutacji, translokacji, amplifikacji
Podstawy terapii genowej
Hamowanie ekspresji genu przez:
1. oligonukleotydy antysensowne (ASO) –
oligonukleotydy liczące około 20 nukleotydów, których
sekwencja jest komplementarna do mRNA lub DNA
wyciszanego genu; wyciszanie przez:
• degradację mRNA (aktywacja RNAzyH)
• steryczną przeszkodę dla aparatu translacyjnego
• mechanizm epigenetyczny
2. rybozymy – krótkie cząsteczki RNA o
właściwościach nukleolitycznych, które wiążą się do
określonego fragmentu mRNA i przecinają wiązanie
fosfodwuestrowe w specyficzych miejscach
Podstawy terapii genowej
Rybozym o strukturze młotka (hammerhead rybozyme)
Podstawy terapii genowej
3. interferujący RNA (siRNA, small interfering RNA)
– małe cząsteczki dwuniciowego RNA (20-25 nt), które
powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej
sekwencji (interferencja RNA, RNAi – RNA
interference). Działanie przez:
• indukcję degradacji mRNA
• blokowanie translacji
Podstawy terapii genowej
III Korekta wadliwego genu
Naprawa mutacji o charakterze trwałym
Wykorzystuje:
• enzymy naprawiające błędne sparowania (mismatch repair)
• enzymy wycinające nukleotydy (excision repair)
• enzymy biorące udział w rekombinacji homologicznej
Podstawy terapii genowej
IV Celowana eliminacja komórek
Precyzyjne zabijanie komórek zainfekowanych wirusem lub
komórek nowotworowych
Dla nowotworów:
1. eliminacja bezpośrednia
a. wprowadzenie do komórek genu kodującego toksyczne białko
(pod kontrolą promotora specyficznego dla nowotworów)
b. stosowanie genów samobójczych – przekształcających
podawany systemowo prolek do toksycznego leku (np. deaminaza
cytozynowa z E. coli przekształca 5-fluorocytozynę do 5fluorouracylu; kinaza tymidynowa HSV – fosforyluje gancyklowir
c. radiouczulanie - deaminaza cytozynowa
d. geny proapoptotyczne – indukujące apoptozę (kaspazy, Bax)
2. eliminacja pośrednia
a. przez aktywację odpowiedzi immunologicznej
b. hamowanie angiogenezy
Podstawy terapii genowej
V Wprowadzenie dodatkowych genów
Nadanie komórkom nowej cechy fizjologicznej lub
wzmocnienie już cechy posiadanej
Przykłady:
geny immunomodulacyjne – głównie cytokiny (IL-2, GM-CSF tj. czynnik
stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) → nowotwory
geny o funkcji ochronnej – podawanie genów oporności wielolekowej (MDR)
do szpiku kostnego przed chemoterapią → nowotwory
geny antyangiogenne – angiostatyna, endostatyna, tkankowe inhibitory
metaloproteaz (TIMP) → nowotwory
geny proangiogenne – indukowanie terapeutycznej angiogenezy (naczyniowo
śródbłonkowy czynnik wzrostu - VEGF) → miażdżyca, choroba niedokrwienna
serca
Podstawy terapii genowej
Ogólna zasada postępowania przy modyfikacjach
genetycznych (takich jak np. wprowadzanie dodatkowych
genów, hamowanie aktywności genów, naprawa genów)
Podstawy terapii genowej
Ogólna zasada postępowania przy modyfikacjach
genetycznych – cd.
5
namnażanie bakterii rekombinowanych
6
izolacja plazmidów rekombinowanych
7
7
produkcja rekombinowanych
białek/badania podstawowe
wprowadzanie
(transfekcja)
rekombinowanych
plazmidów
7
produkcja rekombinowanych
białek/badania podstawowe
terapia genowa
Podstawy terapii genowej
Metody wprowadzania DNA do
komórek
Komórki prokariotyczne (E. coli), drożdże:
-
Elektroporacja
Generowanie komórek kompetentnych (chemicznie)
Transformacja protoplastów
Komórki eukariotyczne (ustalone linie komórkowe):
- metody niewirusowe
- fizyczne
- chemiczne
- metody wirusowe
Wprowadzony do komórki gospodarza obcy gen (transgen) może
ulec integracji z genomem gospodarza lub pozostać na terenie
cytoplazmy jako forma autonomiczna tzw. episom.
Podstawy terapii genowej
Metody fizyczne

Elektroporacja

mikroiniekcja

Transfekcja przy użyciu
ultradźwięków

Immunoporacja

„Gene gun” (transfekcja balistyczna)
Podstawy terapii genowej
mikroiniekcja – roztwór DNA wstrzykiwany do
pojedynczych komórek pod kontrolą mikroskopu
(tworzenie organizmów na poziomie
przedzarodkowym)
Podstawy terapii genowej
elektroporacja – czyste DNA wprowadzane do zawiesiny
komórek (komórki krwiotwórcze lub macierzyste) lub in
vivo (mięśnie, wątroba, naczynia) – krótki impuls
elektryczny wywołuje chwilowe przerwanie ciągłości
błony komórkowej
Podstawy terapii genowej
balistyczne – drobinki złota lub wolframu pokryte DNA
wstrzeliwane do mięśni lub skóry (fala uderzeniowa
generowana rozprężającym się gazem lub prochem),
stosowane też w hodowlach komórek
Podstawy terapii genowej
Metody chemiczne

Lipofekcja (liposomy)

Precypitacja (fosforan
wapnia)

DEAE – Dekstran
(diethylaminoethyl-dekstran)

PEI (polietylenoimina)

Kompleksy liposomowopolimerowe (z polilizyną,
PEG)
Podstawy terapii genowej
Kompleksy liposomowo-polimerowe
dzięki ładunkowi (+) kondensują DNA (-) i wiążą się z zewn. powierzchnią
błony komórkowej (-). Wnikają do komórki na zasadzie endocytozy i fuzji błon
Podstawy terapii genowej
Wektory wirusowe
Wektory wirusowe to replikacyjnie defektywne wirusy, których
wirusowa sekwencja kodująca została całkowicie lub częściowo
usunięta na rzecz wprowadzonego transgenu. Wirusy takie mogą
transdukować komórki ale nie ulegają w nich namnażaniu i nie
powodują lizy komórek.
Synteza cząstek wirusa (rekombinowane wirusy) zachodzi tylko w
specjalnych liniach komórek eukariotycznych – tzw. liniach
pakujących
Najczęściej stosowane wirusy:
•Retrowirusy
•Adenowirusy
•AAV (adeno-associated virus) – wirusy tow. adenowirusom
Podstawy terapii genowej
Zarejestrowane preparaty
terapii genowej
Podstawy terapii genowej
Glybera (gen lipazy lipoproteinowej, LPL, zawarty w wirusie tow. adenowirusom,
AAV-1) – pierwszy zarejestrowany (2012; UE) lek terapii genowej:
 w leczeniu dziedzicznego niedoboru lipazy lipoproteinowej (LPLD)
 LPL odpowiedzialna za metabolizm tłuszczu: produkowana w mięśniach,
adipocytach, sercu, płucach, wątrobie i inn.; przekształca triglicerydy w
chylomikronach do wolnych kw. tłuszcz.
 rzadka choroba (ultra sieroca) : 1-2 przypadki na 1mln
 objawy – m.in. nawracające zapalenia trzustki
Koszt terapii – 1.2 mln £
Leczenie: jednorazowe iniekcje domięśniowe (ok. 60 miejsc w k. dolnych) –
efekt ok. 1 rok, stosowanie tylko u chorych z wykrywalnym LPL
Podstawy terapii genowej
Strimvelis (cDNA deaminazy adenozynowej, ADA, zawarty w retrowirusie) –
rejestracja 27 maja 2016 (UE):
 w leczeniu dziedzicznego złożonego niedoboru odporności SCID-ADA
 rzadka choroba – 14 przypadków rocznie w Europie
 transdukcja ex-vivo komórek szpiku kostnego pobranego od pacjenta
(CD34+)
 mieloablacja pozostałego szpiku (chemioterapia)
 infuzja transdukowanych komórek CD34+
Dotychczasowe dane:
 18 dzieci leczonych na przestrzeni 13 lat
 Wszystkie żyją
 Wszystkie populacje limfocytów zawierają modyfikację genetyczną
 Trwale zredukowana zapadalność na infekcje
 17 (82%) leczonych nie wymagało dodatkowych interwencji medycznych
Podstawy terapii genowej
Imlygic (T-VEC) – rejestracja 2015 (USA), 2016 (UE):
 w leczeniu nieoperacyjnego czerniaka
 modyfikowany onkolityczny wirus HSV-1
 atenuowany
 dodana specyficzność dla komórek nowotworowych
 dodana sekwencja cDNA GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie
kolonii granulocytów i makrofagów)
 kilkukrotne iniekcje wirusa do guza przez okres 6-12 mies.
Dotychczasowe dane:
 430 pacjentów w badaniu III fazy (2:1 grupa kontrolna – GM-CSF)
 17% pacjentów – całkowita eliminacja czerniaka
 mediana przeżycia 2-krotnie większa (41 mies. vs. 21 mies)
Podstawy terapii genowej
Eteplirsen - rejestracja 2016 (USA), leczenie dystrofii mięśniowej Duchenne’a
(DMD)
 antysensowny oligomer morfolinowy indukujący przeskok przez ekson 51
dystrofiny
 powstaje krótsza ale funkcjonalna dystrofina
Podstawy terapii genowej
Eteplirsen znajdzie zastosowanie w 13% przypadków DMD
około 80% mutacji w DMD może się kwalifikować do leczenia
przeskokiem przez eksony