Nota aplikacyjna - Shim-pol

Nota
aplikacyjna
Nr 0001
Symulacja metabolizmu amodiaquine
z zastosowaniem systemu
elektrochemicznego ROXY™ (Antec)
w połączeniu z LC/MS-2020 (Shimadzu)
Amodiaquine (AQ) to związek chemiczny
stosowany jako lek przeciwzapalny oraz
antymalaryczny w terapii malarii wywołanej
przez Plasmodium falciparum. Lek ten
został wycofany z rynku farmaceutycznego
w Stanach Zjednoczonych z powodu
swojej hepatotoksyczności, jednak dalej
jest stosowany w krajach afrykańskich
w leczeniu malarii.
Pomyślnie
przeprowadzono
elektrochemiczne utlenianie badanego związku
uzyskując metabolity Fazy I, które
następnie poddano reakcji sprzęgania
z glutationem (GSH). Powstałe produkty
utleniania i sprzęgania poddano analizie za
pomocą
spektrometru
masowego
LC/MS-2020 (Shimadzu).
Cl
Cl
N
Amodiaquine
jest
metabolizowany
w organizmie człowieka do reaktywnych
metabolitów, których wykrycie in vivo jest
niemożliwe z powodu natychmiastowych
reakcji
następczych,
prowadzących
do powstania
stabilnych
produktów.
Głównym
produktem
metabolizmu
wątrobowego
amodiaquine
jest
iminochinon,
który
ulega
reakcji
N-dealkilacji. Kolejnym metabolitem jest
odpowiedni aldehyd, wykazujący znacznie
większą trwałość. Wybrane metabolity oraz
odpowiednie szlaki metaboliczne dla
amodaquine przedstawiono na Rys. 1 oraz
opisano w Tabeli 1.
Amodiaquine wybrano jako modelowy lek
do badania metabolizmu oksydacyjnego
z zastosowaniem
systemu
elektrochemicznego ROXY™ (Antec).
N
NH
N
N
N
OH
O
Amodiaquine
m/z 356
Cl
Metabolit 1
m/z 299
Cl
O
NH
NH
N
H
N
N
O
OH
Metabolit 3
m/z 354
Metabolit 2
m/z 326
Rys. 1 Fragment szlaku metabolicznego amodiaquine
Tabela 1 Amodiaquine i wybrane metabolity
Związek
Wzór
Masa
monoizotopowa
[Da]
Amodiaquine
C20H22ClN3O
355,1
Metabolit 1
C20H20ClN3O
353,1
Metabolit 2
C18H16ClN3O
325,1
Metabolit 3
C16H11ClN2O2
298,1
”SHIM-POL A. M. BORZYMOWSKI” E. Borzymowska-Reszka, A. Reszka Spółka Jawna
ul. Lubomirskiego 5, 05 - 080 Izabelin, tel. (22) 722 70 48 do 50, faks: (22) 722 70 51, e-mail: [email protected] www.shim-pol.pl
Nr KRS: 0000279262 Sąd Rejonowy dla m. St. Warszawy w Warszawie, XIV wydział Gospodarczy Krajowego Rejestru Sądowego
NIP: 118-178-86-00,
REGON: 140 150 633,
Konto: 70 1240 1066 1111 0000 0000 6161
Bank PKO S.A. V Oddz./W-wa
MATERIAŁY I METODY
Symulacja metabolizmu Fazy I
Do symulacji metabolizmu zastosowano system
elektrochemiczny ROXY™ (Antec). System ten
wyposażony
jest
w
potencjostat,
celę
elektrochemiczną
ReactorCell™,
pompę
strzykawkową
oraz
niezbędne
połączenia.
Do
obsługi
urządzenia
zastosowano
oprogramowanie
Dialogue
(Antec).
Reakcje
prowadzono z zastosowaniem elektrody pracującej,
wykonanej z węgla szklistego (GC, ang. Glassy
Carbon). Jako elektrodę odniesienia zastosowano
elektrodę Pd/H2, HyREF™ (Antec). Parametry
elektrochemicznego
utleniania
przedstawiono
w Tabeli 2.
Tabela 2 Parametry elektrochemicznego utleniania
Parametr
Potencjostat
Opis
ROXY™ (Antec)
Cela pomiarowa
ReactorCell™ (Antec)
Elektroda pracująca
GC
Elektroda odniesienia
HyREF™ (Antec)
Stosowany potencjał
scan 0 – 2000 mV
20 mM mrówczan amonu
(pH 7,4), 50% acetonitryl
Elektrolit
10 μM roztwór amodiaquine w 20 mM mrówczanie
amonu o pH 7,4 z dodatkiem 50% acetonitrylu
tłoczono do celi elektrochemicznej ze stałą
szybkością przepływu wynoszącą 10 μl/min,
za pomocą pompy strzykawkowej. Wylot celi został
bezpośrednio połączony on-line ze źródłem jonów
spektrometru masowego, co umożliwiło pomiar
widm masowych dla produktów elektrochemicznego
utleniania dla różnych potencjałów. Potencjał
elektrody pracującej zwiększano liniowo od 0 do
2000 mV z szybkością 10 mV/s, dzięki czemu
zarejestrowano
odpowiednie
woltamogramy
masowe. Całkowity czas analizy wyniósł około 5
min. Schemat stosowanej aparatury przedstawiono
na Rys. 2.
4
1
3
2
Roztwór amodiaquine o stężeniu 10 μM w 20 mM
mrówczanie amonu o pH 7,4 z dodatkiem 50%
acetonitrylu był podawany z pompy strzykawkowej
z szybkością 10 μl/min. Jako detektor posłużył
spektrometr masowy LC/MS-2020 (Shimadzu)
wyposażony w źródło jonów typu DUIS pracujące w
trybie electrospray (ESI) rejestrując jony dodatnie.
Parametry
rejestracji
widm
masowych
przedstawiono w Tabeli 3. Analizę danych
pomiarowych przeprowadzono z zastosowaniem
oprogramowania LabSolutions (Shimadzu).
Tabela 3 Parametry rejestracji widm masowych
Parametr
Spektrometr
Zakres m/z
Jonizacja
DL Temperature
Heat Block
Nebulizer
Dry gas
Detector Voltage
Interface Voltage
DL Voltage
Qarray DC Voltage
Opis
LC/MS-2020 (Shimadzu)
50 – 750
Dodatnia
250ºC
350ºC
1,0 l/min
OFF
Default (Tuning File)
4,5 kV
Default (0 V)
Default (0 V)
Rys. 2 Schemat aparatury do symulacji metabolizmu fazy I
(1 – pompa strzykawkowa, 2 – potencjostat, 3 – cela
elektrochemiczna, 4 – spektrometr masowy)
Symulacja metabolizmu fazy II
Analogicznie jak dla symulacji metabolizmu Fazy I,
roztwór amodiaquine o stałym stężeniu w buforze
mrówczanowo-amonowym
(pH
7,4)
został
wprowadzony
do
celi
elektrochemicznej
z szybkością 10 μl/min. Powstałe produkty
opuszczające celę elektrochemiczną były mieszane
z roztworem glutationu o stężeniu 100 μM
w buforze mrówczanowo-amonowym. Pomiędzy
mieszalnikiem
a
spektrometrem
masowym
umieszczono reaktor o objętości 100 μl, uzyskując
opóźnienie
wynoszące
5
min.
Szybkość
wprowadzania
roztworu
glutationu
wynosiła
10 μl/min.
Schemat
stosowanej
aparatury
przedstawiono na Rys. 3. Metabolity amodiaquine
przeznaczone do reakcji sprzęgania z glutationem
zostały wygenerowane stosując stałe potencjały
wynoszące odpowiednio 400 mV dla metabolitu 1
oraz 1200 mV dla metabolitów 2 i 3.
”SHIM-POL A. M. BORZYMOWSKI” E. Borzymowska-Reszka, A. Reszka Spółka Jawna
ul. Lubomirskiego 5, 05 - 080 Izabelin, tel. (22) 722 70 48 do 50, faks: (22) 722 70 51, e-mail: [email protected] www.shim-pol.pl
Nr KRS: 0000279262 Sąd Rejonowy dla m. St. Warszawy w Warszawie, XIV wydział Gospodarczy Krajowego Rejestru Sądowego
NIP: 118-178-86-00,
REGON: 140 150 633,
Konto: 70 1240 1066 1111 0000 0000 6161
Bank PKO S.A. V Oddz./W-wa
WYNIKI
Metabolizm Fazy I
5
4
1
3
2
Rys. 3 Schemat aparatury do symulacji metabolizmu Fazy II
(1 – pompa strzykawkowa, 2 – potencjostat, 3 – cela
elektrochemiczna, 4 – reaktor, 5 – spektrometr masowy)
Analiza LC-MS produktów utleniania
Produkty
utleniania
elektrochemicznego
amodiaquine zostały zebrane odpowiednio dla
400 mV i 1200 mV, a następnie rozcieńczone
10-krotnie przy pomocy 0,1% roztworu kwasu
trifluorooctowego w wodzie i poddane analizie
LC-MS. Stosowano system UHPLC Nexera
(Shimadzu) w połączeniu ze spektrometrem
masowym LC/MS-2020 (Shimadzu). Rozdział
chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie ze
złożem typu PFP (ang. pentafluorophenyl)
(Phenomenex). Dokładne parametry rozdziału
chromatograficznego przedstawiono w Tabeli 4.
Spektrometr masowy pracował w trybie SIM (ang.
Single Ion Monitoring), zgodnie z parametrami
przedstawionymi w Tabeli 5.
W Tabeli 1 przedstawiono główne metabolity
amodiaquine oraz ich masy monoizotopowe,
wykorzystane do interpretacji danych. Na Rys. 4
przedstawiono chromatogramy dla wybranych
wartości
m/z odpowiadających
jonom
dla
amodiaquine (m/z 356) oraz metabolitów (m/z 354,
326, 299). Na podstawie przedstawionych
woltamogramów masowych (patrz skala poniżej
Rys. 4) ustalono optymalne wartości potencjałów
dla wybranych produktów utleniania (400 mV dla
metabolitu 1 oraz 1200 mV dla metabolitów 2 i 3).
Na Rys. 5 przedstawiono przykładowe widma
masowe zarejestrowane dla potencjałów 400 mV
i 1200 mV oraz pomiar kontrolny przy wyłączonej
celi elektrochemicznej.
356.00(+)
Amodiaquine
1000000
0
354.00(+)
Metabolit 1
1000000
500000
0
326.00(+)
200000
Metabolit 2
100000
0
200000 299.00(+)
Metabolit 3
100000
Tabela 4 Parametry rozdziału chromatograficznego
Parametr
0
0.0
Opis
System
chromatograficzny
Detektor
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
Nexera (Shimadzu)
LC/MS-2020 (Shimadzu)
Faza ruchoma
złoże 2,6 μm PFP 100 Å
100 × 2,1 mm
Faza A: 2% ACN, 0,1% FA
Faza B: 80% ACN, 0,1% FA
Gradient
Przepływ
5-100% fazy B w 20 min.
400 μl/min
Kolumna
Tabela 5 Parametry pracy detektora podczas analizy LC-MS
Parametr
Spektrometr
Jonizacja
DL Temperature
Heat Block
Nebulizer
Dry gas
Detector Voltage
Interface Voltage
DL Voltage
Qarray DC Voltage
Opis
LC/MS-2020 (Shimadzu)
Pozytywna
300ºC
400ºC
1,5 l/min
15 l/min
2 kV
4,5 kV
Default (0 V)
Default (0 V)
Rys. 4 Woltamogramy masowe zarejestrowane podczas
elektrochemicznego utleniania amodiaquine
Chromatogramy dla wybranych jonów o m/z 356
(amodiaquine) oraz 299 (metabolit 3), uzyskane
w wyniku analiz LC-MS, przedstawiono na Rys. 6.
Dla potencjału 1200 mV widoczny jest sygnał
pochodzący od metabolitu 3, a jednocześnie
obserwuje się spadek intensywności jonu
pochodzącego od badanego leku (chromatogram
dla m/z 356). Przedstawiony eksperyment
potwierdza możliwość analizy LC-MS uzyskanych
produktów utleniania elektrochemicznego. Na
uwagę zasługuje fakt, iż analiza nietrwałych
produktów utleniania (takich jak metabolity 1 i 2)
jest również możliwa, jak przedstawiono na Rys. 4.
”SHIM-POL A. M. BORZYMOWSKI” E. Borzymowska-Reszka, A. Reszka Spółka Jawna
ul. Lubomirskiego 5, 05 - 080 Izabelin, tel. (22) 722 70 48 do 50, faks: (22) 722 70 51, e-mail: [email protected] www.shim-pol.pl
Nr KRS: 0000279262 Sąd Rejonowy dla m. St. Warszawy w Warszawie, XIV wydział Gospodarczy Krajowego Rejestru Sądowego
NIP: 118-178-86-00,
REGON: 140 150 633,
Konto: 70 1240 1066 1111 0000 0000 6161
Bank PKO S.A. V Oddz./W-wa
min
Inten. (x10,000)
Inten. (x1,000,000)
1.00
3.0
356.2
0.75
Cela OFF
Cela OFF
2.0
0.50
1.0
0.25
0.00
200.0
225.0
250.0
275.0
300.0
325.0
350.0
375.0
m/z
Inten. (x1,000,000)
550
600
650
Inten. (x100,000)
1.25
354.2
1.0
0.0
500
1.00
400 mV
700
m/z
700
m/z
700
m/z
661.2
400 mV
0.75
0.5
0.50
0.25
0.0
200.0
225.0
250.0
275.0
300.0
325.0
350.0
375.0
m/z
Inten. (x100,000)
0.00
500
2.0
7.5
356.1
1.5
550
600
650
Inten. (x10,000)
661.1
326.1
1200 mV
299.0
5.0
1.0
0.5
1200 mV
2.5
633.3
0.0
200.0
225.0
250.0
275.0
300.0
325.0
350.0
375.0
m/z
0.0
500
550
600
650
Rys. 5 Widma masowe – metabolizm Fazy I
Rys. 7 Widma masowe – metabolizm Fazy II
WNIOSKI
356.10(+)
1500000 299.10(+)
Cela OFF
1000000
500000
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
min
7.5
10.0
12.5
min
356.10(+)
750000 299.10(+)
400 mV
500000
250000
0
0.0
2.5
5.0
500000 356.10(+)
299.10(+)
1200 mV
250000
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
Połączenie systemów ROXY™ (Antec) oraz
LC/MS-2020 (Shimadzu) (patrz Rys. 8) stwarza
zaawansowany system umożliwiający symulację
metabolizmu (zarówno Fazy I, jak i Fazy II) dla
narkotyków, leków, herbicydów i innych związków
istotnych w życiu człowieka. Przeprowadzenie
analiz wymaga zaledwie kilku minut oraz umożliwia
dogłębną analizę powstałych produktów z zastosowaniem chromatografii cieczowej w połączeniu
ze spektrometrią mas.
min
Rys. 6 Chromatogramy analiz LC-MS obrazujące powstanie
metabolitu 3 (m/z 299, różowy chromatogram)
Metabolizm fazy II
W celu potwierdzenia zachodzenia reakcji
sprzęgania metabolitów amodiaquine z glutationem
(GSH), zapisano widma masowe po zmieszaniu
produktów utleniania dla 400 mV i 1200 mV
z roztworem GSH. Zarejestrowane widma masowe
przedstawiono na Rys. 7. Uzyskane wyniki
potwierdzają zachodzenie reakcji sprzęgania
z GSH dla metabolitów 1 i 2 (jony o m/z 661 i 633).
Rys. 8 Połączenie systemów ROXY™ (Antec)
oraz LC/MS-2020 (Shimadzu)
Podziękowania
Serdecznie dziękujemy firmie Antec, Holandia, za użyczenie
aparatury, wsparcie techniczne oraz cenne uwagi odnośnie
użytkowania systemu elektrochemicznego ROXY™.
”SHIM-POL A. M. BORZYMOWSKI” E. Borzymowska-Reszka, A. Reszka Spółka Jawna
ul. Lubomirskiego 5, 05 - 080 Izabelin, tel. (22) 722 70 48 do 50, faks: (22) 722 70 51, e-mail: [email protected] www.shim-pol.pl
Nr KRS: 0000279262 Sąd Rejonowy dla m. St. Warszawy w Warszawie, XIV wydział Gospodarczy Krajowego Rejestru Sądowego
NIP: 118-178-86-00,
REGON: 140 150 633,
Konto: 70 1240 1066 1111 0000 0000 6161
Bank PKO S.A. V Oddz./W-wa