in vitro - Zakład Biologii Komórki

BIOLOGIA KOMÓRKI
dla BIOCHEMIKÓW
http://www.uj.edu.pl/web/zbk/dydaktyka/kursy/wbt-336
Koordynator ćwiczeń:
dr Marta Michalik
pokój C118 (2.0.23)
tel. 12 664 6144
[email protected]
Asystenci grup:
dr hab. Justyna Drukała
pokój C124 (2.0.23)
tel. 12 664 6145
[email protected]
dr Katarzyna Piwowarczyk
pokój C122 (2.0.27)
tel. 12 664 6183
[email protected]
BIOLOGIA KOMÓRKI
Ocena końcowa z kursu będzie liczona jako:
20% oceny z ćwiczeń
80% oceny z egzaminu
Ćwiczenia - zasady zaliczenia:
• uczestniczenie w zajęciach
(dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona)
• przygotowywanie się na ćwiczenia
(sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe)
• praktyczne zaliczenie ćwiczeń
Charakterystyka kursu:
• 30 godzin wykładów
• 60 godzin ćwiczeń
Prowadzący:
• wykłady:
prof. dr hab. Zbigniew Madeja
dr Marta Michalik
• ćwiczenia:
nauczyciele akademiccy ZBK
doktoranci ZBK
Ocenę z ćwiczeń wystawiamy na podstawie:
• średniej arytmetycznej: wszystkich ocen cząstkowych otrzymanych przez studenta
w trakcie ćwiczeń wraz z oceną z zaliczenia praktycznego
Podstawowe zasady BHP:
- Zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1
- Zasady BHP w pracowni chemicznej
PODSTAWY MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ
Budowa i działanie mikroskopu jasnego pola i kontrastowo-fazowego
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z budową,
zasadą działania i prawidłowym przygotowaniem mikroskopu
świetlnego do pracy w trybie jasnego pola i kontrastu-fazowego
Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń:
- podstawowe pojęcia optyki, charakterystyka fali świetlnej;
- budowa mikroskopu świetlnego jasnego pola
- powiększenie, zdolność rozdzielcza mikroskopu, apertura numeryczna,
- rodzaje mikroskopów świetlnych
- budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo-fazowego
Zalecana literatura:
·
·
·
·
·
M. Pluta – Mikroskopia optyczna rozdz. 8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa.
L. Appel, R. Kowalczyk - Mikroskop. Budowa i użytkowanie.
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część I, panel 1.1
dostępny podręcznik fizyki doświadczalnej (dział – optyka- mikroskopy)
instrukcje dołączone do ćwiczenia
KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE
JASNEGO POLA I KONTRASTOWO-FAZOWYM;
Barwienie cytochemiczne komórek
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się:
- z zastosowaniem mikroskopu świetlnego z optyką do jasnegopola oraz do kontrastu- fazowego
- z metodami utrwalania i barwienia komórek zwierzęcych
Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń:
- Zastosowania mikroskopu świetlnego jasnego pola oraz kontrastowo-fazowego w badaniach biologii komórki
- Możliwości wizualizacji struktury wewnątrzkomórkowej komórek eukariotycznych w mikroskopie jasnego-pola
i kontrastowo-fazowym
- Utrwalanie i barwienie komórek zwierzęcych: różne metody, ich zalety i ograniczenia
- Określanie rzeczywistych wymiarów obiektów biologicznych
Zalecana literatura:
•B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część pierwsza, panel 1-1
•M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fazowo-kontrastowa.
•E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej; rozdziały 2 i 3.
PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 1
Barwienia przyżyciowe organelli wewnątrzkomórkowych
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się:
- z budową i działaniem mikroskopu fluorescencyjnego
- wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych do
wizualizacji organelli w żywych komórkach
DiOC6
Hoechst
Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń:
- Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
- Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej
- Budowa i funkcje podstawowych organelli wewnątrzkomórkowych komórki ssaka
- Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli
mitochondria
Zalecana literatura:
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdziały 14 i 15
M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str. 473-517
E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej,
rozdział 4
W. Kilarski: Strukturalne podstawy biologii komórki; rozdział 1 i 4
endosomy
PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 2
Budowa i funkcje cytoszkieletu –barwienie F-aktyny
Jak wykorzystać niebezpieczną truciznę do celów naukowych? …czyli wizualizacja cytoszkieletu
aktynowego w komórkach prawidłowych (mysie fibroblasty linii 3T3) z hodowli in vitro za pomocą
znakowanej fluorescencyjnie falloidyny
oit.cm-uj.krakow.pl
pl.wikipedia.org
Muchomor sromotnikowy
(m. zielonawy , Amanita phalloides)
!
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
falloidyna
+
fluorochrom - TRITC
(izotiocyjanian
rodaminy)
1) Organizacja cytoszkieletu aktynowego w mięśniach
i komórkach niemięśniowych
2) Funkcje cytoszkieletu aktynowego w komórkach niemięśniowych
3) Mechanizm skurczu mięśni prążkowanych
4) Białka motoryczne związane z filamentami aktynowymi
5) Rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu aktynowego
ZALECANA LITERATURA
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdział 17
red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdział 7
red. R Makuch i M. Rędowicz: Cytoszkielet; Kosmos, 2001, t.50, nr 3, str. 283-295
red. H. Strzelecka-Gołaszewska: Motory molekularne, Kosmos, 2001, t.50, nr 4, str. 349-358; 375-390
HODOWLE KOMÓREK in vitro
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie
się z podstawowymi procedurami
związanymi z hodowlami
prawidłowych i nowotworowych
komórek in vitro
ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
„Hodowla komórek i tkanek in vitro”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz II, str 49-63;
„Wzrost komórek”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz X, str 345-65;
„Metody badań budowy i funkcji komórek”. SEMINARIA Z CYTOFIZJOLOGII pod redakcją J.Kawiaka i M.Zabla. 2002;
rozdz 14, str 364-9;
„Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami”. PODSTAWY CYTOFIZJOLOGII
pod redakcja J Kawiaka i wsp.. 1998. str. 488-504
OBSŁUGA KOMORY BUERKERA
„Mammalian Cell Culture. Methods. Dieter F. Huelser.
Materiały zawarte w instrukcjach do ćwiczeń.
BANKOWANIE KOMÓREK
Cel ćwiczenia: zapoznanie z podstawowymi technikami bankowania komórek
-80°C
1
2
daigger.com
Wykonanie bankowania (1),
rozbankowania komórek (2),
weryfikacja prawidłowości
przeprowadzenia procedur (test
witalności komórek).
„General guide…”
John A. Ryan
www.alcor.org
info.wiadomosci.gazeta.pl
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
Hodowla tkanek, jej rozwój i znaczenie dla rozwoju nauki.
In vitro versus in vivo, zalety, ograniczenia, klasyfikacja hodowli tkanek.
Środowisko hodowlane. Linie komórkowe. Bankowanie komórek.
ZALECANA LITERATURA
„Molecular biology of the cell” Fifth edition , Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts,
Walter, Garland Science Taylor & Francis Group, Part III Chapter 8 Manipulating proteins,
DNA, and RNA - Isolating cells and growing them in culture str. 501-510
„Hodowla komórek i tkanek” pod redakcją Stanisławy Stokłosowej,
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 - rozdz. 1 str. 2-6,
rozdz. 5 str. 45-50, rozdz. 6 str. 51-60, rozdz. 11 str. 140-152
doz.pl
vitalmedica.pl
www.dziennikpolski24.pl
TESTY WITALNOŚCI KOMÓREK
Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się
z podstawowymi testami witalności wykorzystywanymi
na co dzień w pracy laboratoryjnej
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Transport przez błonę komórkową
2. Testy witalności – rodzaje, zastosowanie, ograniczenia
3. Barwniki stosowane do wizualizacji struktur w
komórkach żywych i utrwalonych
ZALECANA LITERATURA:
1. Instrukcja do ćwiczeń
2. Seminaria z cytofizjologii Pod redakcją Jerzego Kawiaka i Macieja Zabla (rozdz.4 i 6).
3. Podstawy cytofizjologii, Praca zbiorowa pod Redakcją J.Kawiaka,
J.Mireckiej, M.Olszewskiej, J.Warchoła (rozdz.2 str 58-90 i rozdz.4 358-376)
WZROST KLONALNY KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Większość komórek nowotworowych hodowanych
in vitro, w przeciwieństwie do komórek prawidłowych,
nie wykazuje zależności wzrostu od przyczepienia do
podłoża.
Celem ćwiczenia jest założenie półpłynnej hodowli
komórek szczurzego mięsaka XC, a następnie obserwacja
powstałych kolonii.
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
Molekularne podstawy transformacji nowotworowej i tworzenia przerzutów.
Hodowle komórek in vitro.
Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami, wzrost komórek na podłożach stałych i
półpłynnych.
ZALECANA LITERATURA:
B. Alberts. Podstawy biologii komórki. PWN 2005. rozdz. 21.
J. Kawiak i in. Podstawy cytofizjologii. PWN 1995, rozdz. 29.
B. Alberts. Molecular Biology of the cell. Garland Science 2002, rozdz. 23.
PINOCYTOZA
Ćwiczenie ma na celu obserwację (w mikroskopie
kontrastowo-fazowym) zjawiska pinocytozy indukowanej
zachodzącej w komórkach pierwotniaków (Amoeba
proteus) oraz sprawdzenie czy aktywność pinocytozy
zależy od czynników zewnętrznych (skład jonowy pożywki,
pH).
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
·1. Przebieg procesu endocytozy – drogi transportu pęcherzykowego w komórce
(szlaki endocytarne; przedziały endosomalne)
·2. Różne mechanizmy endocytozy (fagocytoza, makropinocytoza, endocytoza
przez pęcherzyki otoczone klatryną, endocytoza przez kaweole)
·3. Znaczenie procesu endocytozy dla komórki zwierzęcej i organizmu
ZALECANA LITERATURA:
· B. Alberts i inni.- „Podstawy Biologii Komórki”, red. H. Kmity i P. Wojtaszka, PWN 2005;
Rozdz.15.
· B. Alberts et al. – Molecular Biology of the cell. – 4th. Ed. Garland Science 2002, part IV/13.
· Strukturalne podstawy biologii komórki „Transport pęcherzykowy” – W. Kilarski, Warszawa
2003; rozdział:
5.1. D. Cichoń, M. Michalik. Wnikanie wirusów do komórek na drodze endocytozy
–mechanizmy i wybrane aspekty kliniczne. Mikrobiologia Medycyna 4: 16-26, 2004.
WPŁYW ANESTETYKÓW NA RUCHLIWOŚĆ
KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z mechanizmami ruchu komórek
zwierzęcych oraz obserwację wpływu etanolu i jonów wapnia na ruchliwość ameb.
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Mechanizm działania anestetyków.
2. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych.
3. Cytoszkielet aktynowy i mikrotubularny - rola w migracji komórek;
rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu i migracji.
Amoeba proteus, by Wim van Egmond
4. Rola jonów wapnia w migracji komórek.
Zalecana literatura:
lidokaina
Podstawy Biologii Komórki. Wprowadzenie do Biologii Molekularnej.
Alberts i wsp.
FUZJA KOMÓREK
…to proces łączenia się dwóch lub więcej komórek w jedną strukturę, podczas którego dochodzi
do zlewania się błon, w wyniku czego powstają struktury o nowych cechach i funkcjach.
Ćwiczenie ma na celu obserwację zjawiska fuzji, przyczepionych
do podłoża komórek szczurzego mięsaka XC, wywołanej działaniem
glikolu polietylenowego (PEG) o masie cząsteczkowej 6000.
Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń:
1. Budowa błony komórkowej.
2. Fuzja błon komórkowych:
a) związki chemiczne wywołujące fuzję;
b) warunki niezbędne do fuzji;
c) zjawisko fuzji w procesach fizjologicznych;
d) praktyczne zastosowanie zjawiska fuzji.
Zalecana literatura:
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdz. 11(str. 365-388), rozdz. 15 (str. 512-516).
J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdz. 6 (str. 127-141).
Praca zbiorowa po redakcją J. Kawiaka: „Podstawy cytofizjologii” Warszawa 1998; część II (str. 58-78).
Praca zbiorowa pod redakcją J. Kawiaka i K. Ostrowskiego: Cytofizjologia, 1990; rozdz.2 (str. 56-58), rozdz. 13 (str.
406-408).
KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA
Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych
tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz zbudowane są z
dwóch koneksonów, heksamerów białek z rodziny koneksyn
Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z prosta techniką wizualizacji
komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
2. Test żywotności komórek z wykorzystaniem dwuoctanu fluoresceiny
Zalecana literatura:
1. Instrukcje do ćwiczeń
2. Alberts, Biologia komórki
Zastosowanie metod wirowania do rozdziału
komórek ssaczych - SEPARACJA KOMÓREK W
GRADIENCIE GĘSTOŚCI
Ćwiczenie ma na celu:
Zapoznanie się z podstawowymi
technikami separacji komórek
zwierzęcych oraz próbę rozdzielenia
komórek różniących się gęstością
wypornościową przy zastosowaniu
wirowania w nieciągłym gradiencie
gęstości
Zakres materiału,
który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Zasady separacji komórek
2. Podstawowe techniki separacji komórek
3. Sposoby weryfikacji czystości
otrzymanych frakcji.
Zalecana literatura:
1. P.C. Turner, A.G. Mc Leeman, A.D. Bates, M.R.H. White
Krótkie wykłady- Biologia Molekularna (Sekcja A2izolacjia organelli)
2. Alberts, Podstawy Biologii Komórki od str 17 (jedność i
różnorodność komórek)/ str 32-33 (panel)/ 160-161- (panelrozbicie komórek i frakcjonowanie)
Uwaga:
„Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń”
oraz
„Zalecana literatura”
mogą zostać uaktualnione przez asystenta prowadzącego dane ćwiczenie.
Informacje na ten temat zostaną zamieszczone na tablicy dla studentów (obok
wejścia do Sali ćwiczeń ZBK) oraz na stronie www kursu Biologia komórki,
najpóźniej tydzień przed planowanymi zajęciami.
Proszę sprawdzać komunikaty.
PRAKTYCZNE KOLOKWIUM ZALICZENIOWE
SAMODZIELNE WYKONANIE JEDNEGO Z PONIŻSZYCH ZADAŃ:
- Ustawienie preparatu w mikroskopie jasnego pola,
w trybie kontrastu faz lub mikroskopie fluorescencyjnym;
- Przeprowadzenie testu witalności komórek;
- Oznaczenie gęstości komórek w zawiesinie;
- Wykonanie pasażu komórek.