PODSTAWY MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ

BIOLOGIA KOMÓRKI
http://www.uj.edu.pl/web/zbk/dydaktyka/kursy/wbt-336
Koordynator ćwiczeń:
Asystenci grup:
dr Marta Michalik
pokój C118 (2.0.23)
tel. 12 664 6144
[email protected]
mgr Monika Rak
pokój C122 (2.0.27)
tel. 12 664 6183
[email protected]
dr Marta Michalik
pokój C118 (2.0.23)
tel. 12 664 6144
[email protected]
BIOLOGIA KOMÓRKI
Ocena końcowa z kursu będzie liczona jako:
20% oceny z ćwiczeń
80% oceny z egzaminu
Ćwiczenia - zasady zaliczenia:
• uczestniczenie w zajęciach
(dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona)
• przygotowywanie się na ćwiczenia
(sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe)
• praktyczne zaliczenie ćwiczeń
Charakterystyka kursu:
• 30 godzin wykładów
• 60 godzin ćwiczeń
Prowadzący:
• wykłady:
prof. dr hab. Zbigniew Madeja
dr Marta Michalik
• ćwiczenia:
nauczyciele akademiccy ZBK
doktoranci ZBK
Ocenę z ćwiczeń wystawiamy na podstawie:
• średniej arytmetycznej: wszystkich ocen cząstkowych otrzymanych przez studenta
w trakcie ćwiczeń wraz z oceną z zaliczenia praktycznego
Podstawowe zasady BHP:
- Zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1
- Zasady BHP w pracowni chemicznej
PODSTAWY MIKROSKOPII ŚWIETLNEJ
Budowa i działanie mikroskopu jasnego pola i kontrastowo-fazowego
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z budową,
zasadą działania i prawidłowym przygotowaniem mikroskopu
świetlnego do pracy w trybie jasnego pola i kontrastu-fazowego
Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń:
- podstawowe pojęcia optyki, charakterystyka fali świetlnej;
- budowa mikroskopu świetlnego jasnego pola
- powiększenie, zdolność rozdzielcza mikroskopu, apertura numeryczna,
- rodzaje mikroskopów świetlnych
- budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo-fazowego
Zalecana literatura:
·
·
·
·
·
M. Pluta – Mikroskopia optyczna rozdz. 8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa.
L. Appel, R. Kowalczyk - Mikroskop. Budowa i użytkowanie.
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część I, panel 1.1
dostępny podręcznik fizyki doświadczalnej (dział – optyka- mikroskopy)
instrukcje dołączone do ćwiczenia
KOMÓRKI EUKARIOTYCZNE W MIKROSKOPIE
JASNEGO POLA I KONTRASTOWO-FAZOWYM;
Barwienie cytochemiczne komórek
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się:
- z zastosowaniem mikroskopu świetlnego z optyką do jasnegopola oraz do kontrastu- fazowego
- z metodami utrwalania i barwienia komórek zwierzęcych
Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń:
- Zastosowania mikroskopu świetlnego jasnego pola oraz kontrastowo-fazowego w badaniach biologii komórki
- Możliwości wizualizacji struktury wewnątrzkomórkowej komórek eukariotycznych w mikroskopie jasnego-pola
i kontrastowo-fazowym
- Utrwalanie i barwienie komórek zwierzęcych: różne metody, ich zalety i ograniczenia
- Określanie rzeczywistych wymiarów obiektów biologicznych
Zalecana literatura:
•B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część pierwsza, panel 1-1
•M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fazowo-kontrastowa.
•E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej; rozdziały 2 i 3.
PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 1
Barwienia przyżyciowe organelli wewnątrzkomórkowych
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się:
- z budową i działaniem mikroskopu fluorescencyjnego
- wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych do
wizualizacji organelli w żywych komórkach
DiOC6
Hoechst
Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń:
- Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
- Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej
- Budowa i funkcje podstawowych organelli wewnątrzkomórkowych komórki ssaka
- Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli
mitochondria
Zalecana literatura:
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdziały 14 i 15
M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str. 473-517
E. Kurczyńska i D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej,
rozdział 4
W. Kilarski: Strukturalne podstawy biologii komórki; rozdział 1 i 4
endosomy
PODSTAWY MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ – 2
Budowa i funkcje cytoszkieletu –barwienie F-aktyny
Jak wykorzystać niebezpieczną truciznę do celów naukowych? …czyli wizualizacja cytoszkieletu
aktynowego w komórkach prawidłowych (mysie fibroblasty linii 3T3) z hodowli in vitro za pomocą
znakowanej fluorescencyjnie falloidyny
oit.cm-uj.krakow.pl
pl.wikipedia.org
Muchomor sromotnikowy
(m. zielonawy , Amanita phalloides)
!
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
falloidyna
+
fluorochrom - TRITC
(izotiocyjanian
rodaminy)
1) Organizacja cytoszkieletu aktynowego w mięśniach
i komórkach niemięśniowych
2) Funkcje cytoszkieletu aktynowego w komórkach niemięśniowych
3) Białka motoryczne związane z filamentami aktynowymi
4) Rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu aktynowego
ZALECANA LITERATURA
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdział 17
red. J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdział 7
red. R Makuch i M. Rędowicz: Cytoszkielet; Kosmos, 2001, t.50, nr 3, str. 283-295
red. H. Strzelecka-Gołaszewska: Motory molekularne, Kosmos, 2001, t.50, nr 4, str. 349-358; 375-390
HODOWLE KOMÓREK in vitro
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie
się z podstawowymi procedurami
związanymi z hodowlami
prawidłowych i nowotworowych
komórek in vitro
ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
„Hodowla komórek i tkanek in vitro”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz II, str 49-63;
„Wzrost komórek”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz X, str 345-65;
„Metody badań budowy i funkcji komórek”. SEMINARIA Z CYTOFIZJOLOGII pod redakcją J.Kawiaka i M.Zabla. 2002;
rozdz 14, str 364-9;
„Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami”. PODSTAWY CYTOFIZJOLOGII
pod redakcja J Kawiaka i wsp.. 1998. str. 488-504
OBSŁUGA KOMORY BUERKERA
„Mammalian Cell Culture. Methods. Dieter F. Huelser.
Materiały zawarte w instrukcjach do ćwiczeń.
BANKOWANIE KOMÓREK
Cel ćwiczenia: zapoznanie z podstawowymi technikami bankowania komórek
-80°C
1
2
daigger.com
Wykonanie bankowania (1),
rozbankowania komórek (2),
weryfikacja prawidłowości
przeprowadzenia procedur (test
witalności komórek).
„General guide…”
John A. Ryan
www.alcor.org
info.wiadomosci.gazeta.pl
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
Hodowla tkanek, jej rozwój i znaczenie dla rozwoju nauki.
In vitro versus in vivo, zalety, ograniczenia, klasyfikacja hodowli tkanek.
Środowisko hodowlane. Linie komórkowe. Bankowanie komórek.
ZALECANA LITERATURA
„Molecular biology of the cell” Fifth edition , Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts,
Walter, Garland Science Taylor & Francis Group, Part III Chapter 8 Manipulating proteins,
DNA, and RNA - Isolating cells and growing them in culture str. 501-510
„Hodowla komórek i tkanek” pod redakcją Stanisławy Stokłosowej,
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 - rozdz. 1 str. 2-6,
rozdz. 5 str. 45-50, rozdz. 6 str. 51-60, rozdz. 11 str. 140-152
doz.pl
vitalmedica.pl
www.dziennikpolski24.pl
TESTY WITALNOŚCI KOMÓREK
Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się
z podstawowymi testami witalności wykorzystywanymi
na co dzień w pracy laboratoryjnej
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Transport przez błonę komórkową
2. Testy witalności – rodzaje, zastosowanie, ograniczenia
3. Barwniki stosowane do wizualizacji struktur w
komórkach żywych i utrwalonych
ZALECANA LITERATURA:
1. Instrukcja do ćwiczeń
2. Seminaria z cytofizjologii Pod redakcją Jerzego Kawiaka i Macieja Zabla (rozdz.4 i 6).
3. Podstawy cytofizjologii, Praca zbiorowa pod Redakcją J.Kawiaka,
J.Mireckiej, M.Olszewskiej, J.Warchoła (rozdz.2 str 58-90 i rozdz.4 358-376)
WZROST KLONALNY KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Większość komórek nowotworowych hodowanych
in vitro, w przeciwieństwie do komórek prawidłowych,
nie wykazuje zależności wzrostu od przyczepienia do
podłoża.
Celem ćwiczenia jest założenie półpłynnej hodowli
komórek szczurzego mięsaka XC, a następnie obserwacja
powstałych kolonii.
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
Molekularne podstawy transformacji nowotworowej i tworzenia przerzutów.
Hodowle komórek in vitro.
Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami, wzrost komórek na podłożach stałych i
półpłynnych.
ZALECANA LITERATURA:
B. Alberts. Podstawy biologii komórki. PWN 2005. rozdz. 21.
J. Kawiak i in. Podstawy cytofizjologii. PWN 1995, rozdz. 29.
B. Alberts. Molecular Biology of the cell. Garland Science 2002, rozdz. 23.
PINOCYTOZA
Ćwiczenie ma na celu obserwację (w mikroskopie
kontrastowo-fazowym) zjawiska pinocytozy indukowanej
zachodzącej w komórkach pierwotniaków (Amoeba
proteus) oraz sprawdzenie czy aktywność pinocytozy
zależy od czynników zewnętrznych (skład jonowy pożywki,
pH).
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
·1. Przebieg procesu endocytozy – drogi transportu pęcherzykowego w komórce
(szlaki endocytarne; przedziały endosomalne)
·2. Różne mechanizmy endocytozy (fagocytoza, makropinocytoza, endocytoza
przez pęcherzyki otoczone klatryną, endocytoza przez kaweole)
·3. Znaczenie procesu endocytozy dla komórki zwierzęcej i organizmu
ZALECANA LITERATURA:
· B. Alberts i inni.- „Podstawy Biologii Komórki”, red. H. Kmity i P. Wojtaszka, PWN 2005;
Rozdz.15.
· B. Alberts et al. – Molecular Biology of the cell. – 4th. Ed. Garland Science 2002, part IV/13.
· Strukturalne podstawy biologii komórki „Transport pęcherzykowy” – W. Kilarski, Warszawa
2003; rozdział: 5.1.
WPŁYW ANESTETYKÓW NA RUCHLIWOŚĆ
KOMÓREK ZWIERZĘCYCH
Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z mechanizmami ruchu komórek
zwierzęcych oraz obserwację wpływu etanolu i jonów wapnia na ruchliwość ameb.
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Mechanizm działania anestetyków.
2. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych.
3. Cytoszkielet aktynowy i mikrotubularny - rola w migracji komórek;
rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu i migracji.
Amoeba proteus, by Wim van Egmond
4. Rola jonów wapnia w migracji komórek.
Zalecana literatura:
lidokaina
Podstawy Biologii Komórki. Wprowadzenie do Biologii Molekularnej.
Alberts i wsp.
FUZJA KOMÓREK
…to proces łączenia się dwóch lub więcej komórek w jedną strukturę, podczas którego dochodzi
do zlewania się błon, w wyniku czego powstają struktury o nowych cechach i funkcjach.
Ćwiczenie ma na celu obserwację zjawiska fuzji, przyczepionych
do podłoża komórek szczurzego mięsaka XC, wywołanej działaniem
glikolu polietylenowego (PEG) o masie cząsteczkowej 6000.
Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń:
Budowa błony komórkowej.
Fuzja błon a fuzja komórek.
Zjawisko fuzji komórek w procesach fizjologicznych.
Metody fuzji komórek in vitro, warunki niezbędne do fuzji.
Teorie tłumaczące proces fuzji błon komórkowych, białka fuzyjne.
Praktyczne wykorzystanie zjawiska fuzji – komórki mieszańcowych w badaniach naukowych, zastosowanie
przeciwciał monoklonalnych.
Zalecana literatura:
B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdz. 11(str. 365-388), rozdz. 15 (str. 512-516).
J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdz. 6 (str. 127-141).
Praca zbiorowa po redakcją J. Kawiaka: „Podstawy cytofizjologii” Warszawa 1998; część II (str. 58-78).
Praca zbiorowa pod redakcją J. Kawiaka i K. Ostrowskiego: Cytofizjologia, 1990; rozdz.2 (str. 56-58), rozdz. 13 (str.
406-408).
KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA
Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych
tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz zbudowane są z
dwóch koneksonów, heksamerów białek z rodziny koneksyn
Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z prosta techniką wizualizacji
komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych
Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
2. Test żywotności komórek z wykorzystaniem dwuoctanu fluoresceiny
Zalecana literatura:
1. Instrukcje do ćwiczeń
2. Alberts, Biologia komórki
Zastosowanie metod wirowania do rozdziału
komórek ssaczych - SEPARACJA KOMÓREK W
GRADIENCIE GĘSTOŚCI
Ćwiczenie ma na celu:
Zapoznanie się z podstawowymi
technikami separacji komórek
zwierzęcych oraz próbę rozdzielenia
komórek różniących się gęstością
wypornościową przy zastosowaniu
wirowania w nieciągłym gradiencie
gęstości
Zakres materiału,
który należy przygotować do ćwiczeń:
1. Zasady separacji komórek
2. Podstawowe techniki separacji komórek
3. Sposoby weryfikacji czystości
otrzymanych frakcji.
Zalecana literatura:
1. P.C. Turner, A.G. Mc Leeman, A.D. Bates, M.R.H. White
Krótkie wykłady- Biologia Molekularna (Sekcja A2izolacjia organelli)
2. Alberts, Podstawy Biologii Komórki od str 17 (jedność i
różnorodność komórek)/ str 32-33 (panel)/ 160-161- (panelrozbicie komórek i frakcjonowanie)
PRAKTYCZNE KOLOKWIUM ZALICZENIOWE
SAMODZIELNE WYKONANIE JEDNEGO Z PONIŻSZYCH ZADAŃ:
- Ustawienie preparatu mikroskopie jasnego pola,
w trybie kontrastu faz lub mikroskopie fluorescencyjnym;
- Przeprowadzenie testu witalności komórek;
- Oznaczenie gęstości komórek w zawiesinie;
- Wykonanie pasażu komórek.