Michał Gorczykowski Wrocław 2012
advertisement
U N I W E R S Y T E T P R Z Y R O D N I C Z Y we W R O C Ł A W I U Wydział Medycyny Weterynaryjnej Michał Gorczykowski Zmiany ilościowe populacji limfocytów krwi obwodowej bydła jako wskaźnik aktywności IFN-tau PRACA DOKTORSKA Promotor: dr hab. Anna Chełmońska-Soyta prof. nadzw. Katedra Immunologii, Patofizjologii i Prewencji Weterynaryjnej Wrocław 2012 Pani Prof. Annie Chełmońskiej-Soyta za pomoc, cenne rady oraz cierpliwoś ć serdecznie dziękuję Za wsparcie merytoryczne i duchowe pragnę również podz iękow ać Przyjaciołom, Koleż ankom i Koleg om a zwłaszcz a: Magdzie Majewskiej, Tomaszowi Majowi, Joannie Gali, Joannie Bajzert i Patrycji Libako oraz Pani Iwonie Zbyryt Spis treści I. Wstęp 1. Właściwości IFN-τ …………………………………………………………………………………………………………. 4 1.1 Charakterystyka ogólna……………………………………………………………………………………………… 4 1.2 Polimorfizm i kontrola ekspresji IFN-τ ……………………………………………………………………………. 5 1.3 Szlaki przekazywania sygnału dla IFN-τ…………………………………………………………………………... 13 2. Fizjologiczne efekty IFN-τ w czasie ciąży u bydła…………………………………………………………………… 17 2.1 Elekt luteotropowy……………………………………………………………………………………………………. 17 2.2 Immunoregulacja……………………………………………………………………………………………………… 21 2.3 Inne efekty fizjologiczne IFN-τ………………………………………………………………………………………. 27 3. Postęp hodowlany a rozród……………………………………………………………………………………………… 27 4. Techniki rozrodu…………………………………………………………………………………………………………… 30 5. Ocena jakości zarodków…………………………………………………………………………………………………..32 II. Cel Pracy …………………………………………………………………………………………………………………………. 36 III. Materiał i metody………………………………………………………………………………………………………………... 37 1.Odczynniki gotowe stosowane w przeprowadzanych badaniach…………………………………………….... 37 2.Przygotowywane samodzielnie media i bufory…………………………………………………………………... 38 3.Technika izolacji i przygotowania do hodowli in vitro komórek mononuklearnych krwi obwodowej 39 4. Doświadczenie I Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na indukowaną mitogenami transformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT……………………………… 39 5. Doświadczenie II Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy anty-roINF-tau do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ ..……………………………………………………………………………………40 6. Doświadczenie III Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej…………41 7. Doświadczenie IV. Wpływ stężenia rekombinowanego IFN-τ na ilość limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej…………………………………………………………………………………… 42 8. Doświadczenie V. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności ConA i IFN-τ……………………………..……………………………… 42 9. Doświadczenie VI. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach z nad hodowli in vitro zarodków bydlęcych…………………………………………………………………………………………………… 43 10. Doświadczenie VII. Efekt dodatku supernatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów………………44 11. Sposób analizy zarchiwizowanych wyników immunofenotypizacji limfocytów…………………………………… 44 12. Sposób prezentacji i analiza statystyczna wyników………………………………………………………………… 47 IV. Wyniki badań……………………………………………………………………………………………………………………. 48 1. Doświadczenie I Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na indukowaną mitogenami tranformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT……………………………… 48 2. Doświadczenie II Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy anty-ro IFN-τ do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ …………………………………………………………………………………………… 52 3. Doświadczenie III Wpływ rekombinowanego interferonu-tau na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej………….53 4. Doświadczenie IV. Wpływ stężenia rekombinowanego IFN-τ na ilość limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami tranformacji blastycznej…………………………………………………………………………………….58 5. Doświadczenie V. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności ConA i IFN-τ…………………………….…………………………………61 6. Doświadczenie VI. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach z nad hodowli in vitro zarodków bydlęcych. 62 7. Doświadczenie VII. Efekt dodatku supernatanatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów. ………..63 V. Dyskusja………………………………………………………………………………………………………………………….. 68 1. Analiza wyników doświadczeń w których użyto rekombinowanego IFN-τ…………………………………… 68 2. Analiza wyników doświadczeń w których użyto nasączy znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych…. 72 3. Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny proliferacji…………………………………………………. 76 VI. Wnioski…………………………………………………………………………………………………………………………… 82 VII. Piśmiennictwo………………………………………………………………………………………………………………….. 83 VIII. Streszczenie……………………………………………………………………………………………………………………. 100 _____________________________________________________________________________ I. Wstęp 1. Właściwości intereronu tau 1.1 Charakterystyka ogólna Interferon tau (IFN-tau, IFN-τ) po raz pierwszy wyizolowano w latach 80-tych ubiegłego wieku z homogenatów 12 i 13 dniowych zarodków owczych, stąd też pierwotnie nazwano go trofoblastyną bądź białkiem-1 trofoblastu (oTP-1); (Winkelman i wsp., 1999; Demmers i wsp., 2001). Białko to produkowane jest wyłącznie przez komórki trofoblastu w okresie okołoimplantacyjnym, jest specyficzne jedynie dla podrzędu Ruminantia (Roberts i wsp., 1998). IFN-τ jest jednym z podstawowych czynników istotnych dla podtrzymania wczesnej ciąży u przeżuwaczy. U bydła produkcja IFN-τ przypada na 14 - 24 dzień ciąży, przy czym maksymalna synteza widoczna jest od 16 do 19 dnia po zapłodnieniu. Po implantacji zarodka ekspresja i wydzielanie IFN-τ zanikają (Farin i wsp., 1990; Low i wsp., 1990). Bydlęcy IFN-τ jest glikoproteiną o masie 20 – 22 kDa, o długości łańcucha wynoszącej 172 aminokwasy i należy do rodziny interferonów typu I (Roberts i wsp., 1997). Pod względem budowy aminokwasowej białko to wykazuje około 80% zgodności sekwencji z interferonem ω, ok. 50% z IFN-α i ok. 25% z IFN-beta (Roberts i wsp., 1997). Badania wykorzystujące modelowanie molekularne wskazują, że struktura przestrzenna cząsteczki IFN-τ jest zbliżona do pozostałych przedstawicieli interferonów typu I. Opiera się ona na pięciu długich alfa-helisach oznaczonych symbolami od A do E połączonych pętlami aminokwasowymi, przy czym na pętli łączącej helisy C i D występuje dodatkowa helisa krótka (Senda i wsp., 1995). Podobnie jak inne interferony typu I, IFN-τ posiada silne właściwości antywirusowe, jednak jego synteza nie jest indukowana przez wirusy (Leaman i wsp., 1994). W porównaniu z IFN-α jest on również znacznie mniej cytotoksyczny (Subramaniam i wsp., 1995) i dlatego też z jego antywirusowymi właściwościami wiązane są duże nadzieje przy leczeniu zakażeń wirusami, np. HIV i FIP (np.: Soos i wsp., 1995; Rogez i wsp., 2003; Pontzer i wsp., 1997). Szeroko opisywaną w literaturze właściwością IFN-τ jest jego antyproliferacyjne działanie w stosunku do komórek ssaków. Hamuje on m.in. stymulowaną mitogenami bądź alloantygenem proliferację limfocytów krwi obwodowej bydła, owiec i człowieka (np.: Emond i wsp., __________________________________________________________________________ 4 _____________________________________________________________________________ 2000; Tekin i wsp., 2000; Fillion i wsp., 1991). Antyproliferacyjne działanie IFN-τ nie jest natomiast widoczne w przypadku bydlęcych komórek endometrialnych, będących głównym celem działania IFN-τ. Jest to prawdopodobnie ewolucyjnym przystosowaniem, pozwalającym na wzrost endometrium w czasie ciąży, mimo obecności interferonów typu I (Davidson i wsp., 1994) i zwiększonej pod ich wpływem ekspresji białek proapoptotycznych (Groebner i wsp., 2010). Funkcjonowanie IFN-τ nie tylko jako cytokiny, ale jako hormonu ciążowego jest również widoczne w jego oddziaływaniu na zwierzęta nie będące w ciąży. Przykładowo, podanie IFN-τ owcom w trakcie cyklu płciowego powoduje zmiany polegające na „naśladowaniu” środowiska ciążowego (np. efekt antyluteolityczny, czy obniżenie ekspresji receptora oksytocynowego) (Chen i wsp., 2006). IFN-τ prócz szeregu cech charakterystycznych dla interferonów typu I, posiada również szereg cech unikatowych, związanych z ewolucyjnie nową funkcją tego białka, jako głównego czynnika warunkującego podtrzymanie ciąży u przeżuwaczy. 1.2 Polimorfizm i kontrola ekspresji IFN-τ Dane z piśmiennictwa dotyczące właściwości i funkcji IFN-τ bywają często ze sobą sprzeczne i wydaje się, że jednym z tego powodów jest istnienie różnych izoform tego białka, a także fakt, że poziom jego ekspresji jest silnie zróżnicowany nawet pomiędzy poszczególnymi komórkami trofoblastu (Guillomot i wsp., 1998; Johnson i wsp., 2006). Wszystkie gatunki w obrębie podrzędu Ruminantia z wyjątkiem żyraf, posiadają wiele genów dla IFN-τ (Roberts, 2007). Geny te są zlokalizowane na chromosomach 8q15 u bydła i kóz oraz 2p15 u owiec (Ryan i wsp., 1993; Martal i wsp., 1998). Szacuje się, że u bydła jest od 4 do 10 genów dla IFN-τ (Leaman i wsp., 1992; Ryan i wsp., 1993; Alexenko i wsp. 2000). Natomiast polimorficznych alleli IFN-τ znanych jest minimum 18 u owiec, 9 u kóz i od 12 do 18 u bydła (Alexenko i wsp., 2000; Ealy i wsp., 2004; Walker i wsp., 2009). Określenie liczby izoform IFN-τ komplikuje fakt, że u niektórych gatunków dochodzi do tzw. potranslacyjnej modyfikacji polipeptydu, a u bydła i kóz dodatkowo do zróżnicowanej glikozylacji (Guillomot i wsp., 1998; Early i wsp., 2006). Poszczególne izoformy zarówno w obrębie gatunku, jak i poza nim cechuje __________________________________________________________________________ 5 _____________________________________________________________________________ wysoki stopień zgodności sekwencji aminokwasowej i nukleotydowej co obrazuje tabela 1 (Ealy i wsp., 2004). caIFN-τ2a 90,7 caIFN-τ3 caIFN-τ4a caIFN-τ5 caIFN-τ6 ovIFN-τ4 boIFN-τ1a 90,7 88,4 87,2 87,2 94,3 79,1 99,4 96,5 95,3 94,2 93,3 84,9 97,1 95,9 94,8 93,3 84,9 98,8 97,7 91,2 83,7 96,5 90,2 81,4 90,2 80,8 caIFN-τ2a 95,9 caIFN-τ3 95,5 99,6 caIFN-τ4a 95,0 98,2 98,2 caIFN-τ5 94,7 98,2 98,2 99,3 caIFN-τ6 91,5 97,4 97,4 99,1 98,4 caIFN-τ4 97,9 90,2 95,9 95,4 95,0 caIFN-τ1a 89,2 91,4 91,1 90,4 90,4 identyczność sekwencji nukleotydowej (%) 94,7 89,7 81,5 identyczność sekwencji aminokwasowej (%) caIFN-τ1 caIFN-τ1 89,9 Tabela 1. Podobieństwo sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych wybranych izoform IFN-τ [ca – kozi; bo - bydlęcy; ov – owczy] (z Ealy i wsp., 2004) Walker i wsp. (2009) donosząc o 18 wariantach IFN-τ i analizując sekwencje cDNA otrzymane na bazie transkryptów z zarodków bydlęcych zaobserwowali, że za każdy zidentyfikowany wariant IFN-τ odpowiedzialne były jedynie pojedyncze, niesynonimiczne zmiany nukleotydowe. Niekonserwatywnymi było jedynie 9 z pośród 190 kodonów. Co więcej, zmienność aminokwasowa w transkryptach po każdej stronie była ograniczona do dwóch. Pozycjami kodonów zmiennych są: 5 (D/N); 46 (N/S); 65 (L/F); 69 (Y/H); 70 (T/I); 102 ( P/Q); 105 (G/E); 126 (G/D) i 146 (V/M). Na ogół warianty bydlęcego IFN-τ dzielone są na 3 klasy (1-3). Walker i wsp. (2009) konstruując swoje drzewo filogenetyczne dla IFN-τ proponują utrzymać podział na 3 grupy z tym, że pierwszą dzielą na dwie podgrupy I: zawierającą izoformy 1a, 1f, i 1g, oraz II zawierającą 1c i 1d, wyłączając z klasy pierwszej wariant 1b, który ma cechy pośrednie między klasą 1 i 3. Natomiast klasa 2 i 3 pozostają bez zmian, z tym że klasę 3 wzbogacono o nowo odkryte izoformy 3f, 3g, 3h oraz 3i. Podobnie jak w przypadku izoform IFN-alfa (Kumaran i wsp., 2007), poszczególne izoformy interferonów tau cechuje zróżnicowana aktywność biologiczna. Parent i wsp. (2003) badając m. in. boIFN-τ1a, boIFN-τ2b, boIFN-τ3b, wykazali, że izoformy 2b i 3b w komórkach nabłonkowych endometrium hamują ekspresję PGE2 i PGF2α niezależnie od stężenia w zakresie od 0,01 do 20 µg, przy nieznacznym tylko wpływie na komórki podścieliska. Zgoła odmienne działanie ma izoforma 1a, która w __________________________________________________________________________ 6 _____________________________________________________________________________ stężeniach 10 i 20 µg stymuluje ekspresję obu prostaglandyn zarówno w nabłonku, jak i w podścielisku. W obecności octanu mirystynianu forbolu (PMA) produkcja prostaglandyny PGE2 w hodowli pierwotnej bydlęcego nabłonka endometrialnego była najwyższa pod wpływem boIFN-τ1a. Natomiast hamowanie produkcji PGF2α w obecności oksytocyny było najsilniejsze pod wpływem boIFN-τ2b, a dla boIFN-τ1a i boIFN-τ3b niemal identyczne. Obecność IFN-τ w medium hodowlanym można wykryć już około 6-9 dnia po inseminacji w przypadku zarodków bydlęcych uzyskiwanych i hodowanych technikami in vitro (Hernandez-Ledezma i wsp., 1992; Chełmońska-Soyta, 2002). W warunkach in vivo maksymalna sekrecja odbywa się między 16 a 19 dniem (Robinson i wsp., 2006). W warunkach laboratoryjnych Stojkovic i wsp. (1995) w hodowli pierwotnej bydlęcej tkanki trofoblastycznej wykazali incydentalne utrzymanie produkcji IFN-τ nawet do 43 dnia po inseminacji, przy czym do 23 dnia następował równoczesny wzrost powierzchni tkanki trofoblastycznej, skutkujący wzrostem produkcji IFN-τ. Po 23 dniu tkanka w dalszym ciągu rozrastała się, ale poziom IFN-τ spadał. Yao i wsp. (2009) stosując hybrydyzację in situ z sondami cDNA dla IFN-τ znakowanymi digoksygeniną wykryli mRNA dla IFN-τ w bydlęcych zarodkach już od 4 do 9 dnia hodowli. Czas inicjacji ekspresji mRNA dla IFN-τ zależał od techniki uzyskania i hodowli zarodka. W przypadku techniki IVF (in vitro fertilization) mRNA dla IFN-τ po raz pierwszy wykryto czwartego dnia w stadium 16-komórkowym, w technice SCNT (somatic cell nuclear transfer) w stadium moruli piątego dnia, a przy PA (parthenogenetic activation) dopiero szóstego dnia w stadium blastocysty. W kontekście metod IVF warto wspomnieć także o zróżnicowanej produkcji IFN-τ w zależności od zagęszczenia zarodków hodowli. Zarodki hodowane in vitro w grupach po kilka produkują więcej IFN-τ w przeliczeniu na zarodek, niż hodowane pojedynczo. Mechanizm tego zjawiska nie jest jednak znany, choć można przypuszczać, że produkowane przez zarodki czynniki wzrostu oddziałują parakrynnie, wzajemnie stymulując tempo swojego dojrzewania i produkcję IFN-τ (Larson i Kubisch, 1999). W przypadku zarodków uzyskiwanych in vivo Short i wsp. (1991) obserwowali wzrost aktywności antywirusowej w płynie macicznym dopiero od 14 dnia ciąży, gdy zarodek mierzył około 4-5 mm długości. W 17 dniu zarodki produkowały 106 __________________________________________________________________________ 7 _____________________________________________________________________________ jednostek antywirusowych w przeliczeniu na sztukę w ciągu 24 godzin. Okazuje się, że w przypadku zarodków bydlęcych pozyskanych w dniu 14 i 18 poziom ekspresji mRNA dla IFN-tau jest podobny, natomiast ilość wydzielanego białka jest większa i wprost proporcjonalna do rozmiaru zarodka/trofoblastu (Robinson i wsp., 2006). Natomiast Lonergan i wsp. (2003) wykazali obecność mRNA dla IFN-τ w zarodkach bydlęcych zarówno hodowanych in vitro jak i hodowanych w jajowodach owcy już od 6 dnia po zapłodnieniu. Ealy i wsp. (2001) badając ekspresję trzech wariantów bydlęcego IFN-τ (1a; 2b i 3d) w 14, 17, 19 i 25 dniu po zapłodnieniu wykazali ich ekspresję we wszystkich terminach, z tym, że 14 i 25 dnia była ona na bardzo niskim poziomie, w dniu 17 najwyższy poziom ekspresji miał wariant 1a a o około 30% niższą ekspresję miały dwie pozostałe izoformy, natomiast w dniu 19 łączna ekspresja bo-IFN-τ 2b i 3d była zbliżona do ekspresji 1a. Zróżnicowana ekspresja i aktywność interferonów w obrębie jednego gatunku charakterystyczna jest nie tylko dla bydła. Winkelman i wsp., 1999 badając owcze interferony tau wykazali, że aktywność antywirusowa badanych izoform rosła w kolejności: p6, p3, p8. W czasie ekspresji genów interferonów tau poziom produkcji poszczególnych izoform różni się między sobą i zmienia się w czasie rozwoju zarodka. Z badań Matsuda-Minehata i wsp., (2005) że u owiec dominującymi izoformami są warianty 10, 4 i 2, przy czym około 80 % zidentyfikowanych transkryptów należało do pierwszego z nich. Walker i wsp., (2009) u 8 dniowych blastocyst bydlęcych opisali 4 warianty IFN-τ: 1c, 1d, 2b, 3a. Większość transkryptów męskich zarodków żeńskich i męskich było wariantem 1c lub 3a. Normalizowana ekspresja dla tych wariantów, na skali gdzie 1 oznacza brak ekspresji, wynosiła 4,8 i 4,75 dla 1c oraz 4,06 i 3,54 dla 3a odpowiednio dla samic i samców. Dla odmiany średnia ekspresja kolejnego z najintensywniej produkowanego wariantu, IFN-τ2b, wynosiła 1,41 dla obu płci. Poziom ekspresji poszczególnych izoform w późniejszych okresach hodowli przedstawia ryc. 1. __________________________________________________________________________ 8 Jednostki normalizowane ekspresji IFN-tau _____________________________________________________________________________ W arianty IFN -tau Ryc. 1 Ekspresja wariantów bydlęcego IFN-τ od 14 do 19 dnia. Na czarno podkreślono nowo opisane izoformy IFN-τ (reprod. z Walker i wsp., 2009) Jak już wspomniano, ekspresja IFN-τ jest regulowana zarówno przestrzennie jak i czasowo, jednak mimo coraz lepszego poznania mechanizmów kontroli transkrypcji tych genów nie jest ona w pełni zrozumiała (Roberts, 2007; Walker i wsp., 2009). Pierwsze koncepcje dotyczące regulacji ekspresji genów dla IFN-τ pojawiły się pod koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku i zakładały, że w obrębie miejsca promotorowego istnieją dwie sekwencje istotne dla poziomu transkrypcji IFN-τ. Jednym z nich jest miejsce konsensusowe dla czynnika transkrypcyjnego Ets-2. Czynnik ten występuje w trofektodermie, a testy z użyciem genu lucyferazy pod kontrolą promotora IFN-τ wykazały, że wzbudzenie ekspresji Ets-2 aktywuje jej transkrypcję spod promotora IFN-τ. Efekt ten jest wzmacniany przez inne czynniki z rodziny Ets-2, np. GABPalfa, jednak tylko Ets-2 samodzielnie transaktywuje gen IFN-τ (Ezashi i wsp., 1998). Rola czynnika Ets-2 została potwierdzona w kolejnych badaniach i jest on obecnie uznawany za główny czynnik transkrypcyjny kontrolujący ekspresję IFN-τ w komórkach trofoblastu. Dzięki tym odkryciom można było tłumaczyć fenomen niskiej produkcji IFN-τ około 7 dnia po zapłodnieniu i wysokiej, sięgającej nawet 100 µg, około dnia 16 (ryc. 2A), która wymaga przyłączenia się do sekwencji promotorowej koaktywatora. __________________________________________________________________________ 9 _____________________________________________________________________________ Ryc. 2 Proponowane modele kontroli transkrypcji IFN-ta (A) reprod. z Roberts i wsp., 1999; (B i C) reprod. Z Ealy i wsp., 2009 (opis w tekście): AP1, Cdx 2; Ets-2, Dlx3, CDP/p300, Oct 4 – czynniki transkrypcyjne. Z Ets-2 współdziałają kolejne białka koaktywatorowe, takie jak np. CBP/p300 (Xu i wsp., 2003). Kontrola aktywności CBP/p300 w trofoblaście przez kinazę białkową A otwiera drogę do regulacji transkrypcji IFN-τ przez czynniki wzrostu obecne w macicy i działające za pośrednictwem szlaku kinaz MAP (Das i wsp., 2008). Innym koaktywatorem Ets-2 jest czynnik DLX3, wzmacniający transkrypcję IFN-τ ok. 250 razy (Ezashi i wsp., 2008). Ekspresja IFN-τ może być dodatkowo wzmacniana przez kompleks cFos/cJun, wiążący się z miejscem AP-1 w rejonie -654 do -555 promotora IFN-τ (Xavier i wsp., 1997; Yamaguchi i wsp., 1999a). W trofoblaście owiec maksymalna ekspresja cFos i cJun występuje w 14 i 15 dniu ciąży, kiedy ma miejsce również maksymalna produkcja IFNτ. Test EMSA (electrophoretic mobility shift assay) jasno wskazuje, że czynniki te są w trofoblaście aktywne i przyłączają się do sekwencji w regionie promotorowym IFN-τ (Xavier i wsp., 1997). Stymulacja komórek nietrofoblastycznych transfekowanych plazmidem zawierającym gen IFN-τ za pomocą czynników pobudzających cJun również prowadzi do aktywacji transkrypcji (Yamaguchi i wsp., 1999b). AP-1 zdaje się współpracować z czynnikiem Ets-2 (Xu i wsp., 2003), chociaż z badań Das i wsp. (2008) __________________________________________________________________________ 10 _____________________________________________________________________________ wynika, że możliwe jest również działanie antagonistyczne. Większość badań nad regulacją transkrypcji IFN jest prowadzonych przy użyciu regionów promotorowych bydlęcego lub owczego interferonu wklonowanego do reporterowego plazmidu z genem lucyferazy lub transacetylazy chloramfenikolu w ludzkich komórkach rakowych JEG3 lub JAR. Spośród opisanych powyżej czynników Ets-2, Jun i CBP są znajdowane w wielu tkankach i komórkach, natomiast wydaje się że specyficznymi koaktywatorami są DLX3 i wspomniany dalej CDX2, kontrolują one ekspresję bIFN-τ i oIFN-τ w trofoblaście. W ostatnim czasie Bai i wsp. (2009) wykryli w obrębie regionu promotorowego bIFN-τ jeszcze 6 potencjalnych miejsc wiążących czynniki GATA (ryc. 3). Autorzy ci wykazali ponadto transkrypcję mRNA dla czynników GATA 2, 3 i 6 w komórkach bydlęcych trofoblastów CT-1. Ich transkrypty stwierdzono w 17, 20 i 22 dniowych zarodkach bydlęcych. W badaniach prowadzonych na innych liniach jajnikowej warstwy ziarnistej (oCG) i fibroblastach ucha (EF) wykryto obecność GATA2 i 3, ale nie GATA-6. W komórkach CT-1 transkrypcja genu dla endogennego bydlęcego bydlęcego IFN-τ była wzmacniana przez nadekspresję GATA2 lub/i GATA3 i dodatkowo była obniżana przez siRNA (mały interferencyjny RNA) specyficzny dla mRNA GATA2, co ostatecznie przemawia za udziałem GATA2/3 w kontroli ekspresji genów IFN-τ w trofoblastach. Nie wiadomo w chwili obecnej, czy czynniki GATA współpracują z Ets-2 i cFos/cJun. Ryc.3 Lokalizacja sekwencji GATA w obrębie sekwencji promotorowej IFN-τ (reprod. z Bai i wsp. 2009) Jak widać, ogólny proces regulacji ekspresji genów dla interferonów tau został już dość dobrze poznany, jednak mechanizm prowadzący do zróżnicowanej ekspresji poszczególnych wariantów IFN-τ jest wciąż niejasny. Promotory czterech wariantów bydlęcego interferonu (1a, 1c, 2b,3b), które zostały w pełni zsekwencjonowane na długości 430 pz w górę od miejsca startu transkrypcji wszystkie zachowały kompletną __________________________________________________________________________ 11 _____________________________________________________________________________ sekwencję wzmacniającą DLX3/Ets-2/AP1 i są w powyżej 99% konserwatywne na przestrzeni 430 pz. Również pozostałe opisane promotory w bazie Bovine Genome Datebase Assemble 3.1, są identyczne w 98,3 do 99% na długości powyżej 900 pz przed miejscem start transkrypcja. (Walker i wsp., 2009). Pomimo znacznej konserwatywności sekwencji enhancerowo-promotorowych dla IFN-τ z badań Matsuda-Minehata i wsp., 2005 wynika, że zamiana fragmentu promotra powyżej 452 pz od miejsca start transkrypcji bardzo wyraźnie wpływa na efektywność transkrypcji, co obrazuje rycina 4. Ryc. 4. (A) Wpływ mutacji w obrębie promotora na jego efektywność, mierzona na podstawie aktywności acetylotranferazy chloramfenikolu. (B) Efektywność promotorów dla trzech wariantów owczego IFN-τ z uwzględnieniem roli ich fragmentów w pozycji przed i po -452 pz. (reprod. z Mastuda-Minehata i wsp., 2005) Jeszcze słabiej niż kontrola ekspresji izoform poznane są sekwencje wyciszające, odpowiadające za wygaszenie ekspresji IFN-τ po implantacji – jak dotąd zidentyfikowano dwa regiony, mogące pełnić tę funkcję (Yamaguchi i wsp., 2000) oraz poznano rolę białka Oct-4, które jest odpowiedzialne za hamowanie transkrypcji interferonu (Kurosaka i wsp., 2007). Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że ekspresja __________________________________________________________________________ 12 _____________________________________________________________________________ genów dla IFN-tau podlega dodatkowo kontroli mechanizmów epigenetycznych. Metylacja sekwencji regulujących ekspresję IFN-τ jest regulowana czasowo i pokrywa się z okresem wydzielania IFN-τ przez zarodek (Nojima i wsp., 2004). Z kolei wspomniany powyżej czynnik transkrypcyjny CDX2 kontrolujący ekspresję IFN-τ we współpracy z Ets-2 jest również jednym z białek regulujących acetylację histonów poprzez współdziałanie z czynnikiem o aktywności acetylotransferazy histonowej. W regionie promotorowym IFN-τ znajdują się dwa miejsca wiążące CDX2 i w bezpośrednim otoczeniu jednego z nich rzeczywiście obserwuje się większy poziom acetylacji histonu H3K18, czemu towarzyszy zwiększenie aktywności transkrypcyjnej (Sakurai i wsp., 2010), ponadto kontrola ekspresji CDX2 i jego wyciszanie przy pomocy siRNA korelują z aktywnością promotora IFN-τ, być może we współpracy z metylacją innych histonów (Sakurai i wsp., 2009). Prawdopodobnie właśnie mechanizmy epigenetyczne są również odpowiedzialne za wyciszenie ekspresji genów IFN-τ w tkankach niezarodkowych. 1.3 Szlaki przekazywania sygnału dla IFN-τ Podobnie jak pozostałe interferony typu I, interferon tau wiąże się z receptorami klasy II dla cytokin, określanymi mianem IFNAR (ang. interferon alpha/beta receptor). Receptory te składają się z dwóch podjednostek, IFNAR1 i IFNAR2c (Han i wsp., 1997; Rosenfeld i wsp., 2002). Cząsteczki IFNAR obecne są na powierzchni wielu komórek ciała, w tym limfocytach T i B oraz monocytach (Massirer i wsp., 2004; Pogue i wsp., 2004). W macicy, będącej głównym narządem docelowym IFN-τ, receptory IFNAR występują na nabłonku luminalnym i gruczołowym i wydaje się, że są to główne tkanki macicy, na które oddziałuje IFN-τ (Rosenfeld i wsp., 2002). Ze względu na współdzielenie tego samego receptora z pozostałymi interferonami typu I (Li i Roberts, 1994a), IFN-τ uruchamia podobne szlaki sygnałowe, co IFN-α i IFN-beta, a efekt działania tych szlaków jest rozległy. Obecnie proponowane są dwa modele szlaków przekazywania sygnału wewnątrzkomórkowego pod wpływem IFN-τ (ryc. 5). Pierwszy szlak (A), charakterystyczny dla komórek zrębu i nabłonka gruczołowego, znany jest od dawna i polega na aktywacji kinaz JAK i białek STAT (Spencer i wsp., 1998). W efekcie przyłączenia się interferonu do receptora IFNAR dochodzi do aktywacji reszt tyrozynowych kinaz białkowych z rodziny JAK, w szczególności Jak1 i __________________________________________________________________________ 13 _____________________________________________________________________________ Tyk2. Kinazy te fosforylują białka STAT, które łączą się w homo- lub heterodimery STAT1-STAT1 oraz STAT1-STAT2, a następnie ulegają translokacji do jądra komórkowego. Homodimer STAT1 znany jest jako czynnik transkrypcyjny GAF (ang. gamma activated factor) i ma on zdolność do łączenia się z sekwencjami regulatorowymi DNA określanymi jako GAS (ang. IFN-gamma activated site). Z kolei heterodimer STAT1-STAT2 wymaga połączenia z białkiem IRF-9, a tak powstały trimer to czynnik transkrypcyjny ISGF3 (ang. IFN-stimulated gene factor 3), który przyłącza się do sekwencji ISRE (ang. interferon stimulated response element) znajdującej się w obszarach promotorowymh genów indukowanych przez IFN-τ (Samuel, 2007). Za pośrednictwem szlaku JAK/STAT aktywowane są m. in. takie geny, jak STAT1, STAT2, IRF9, ISG15, MIC, OAS (Spencer i wsp., 2008). W bydlęcym endometrium wykazano nie tylko fosforylację białek STAT1, STAT2 i STAT3, ale także aktywację czynników regulowanych przez interferon (IRF), co ma istotne znaczenie w antyluteolitycznym działaniu IFN-τ omówionym dalej (Binelli i wsp., 2001). Czynniki te, szczególnie IRF-1, po wzbudzeniu transkrypcji przez aktywowane białka STAT uczestniczą w kontroli ekspresji kolejnych genów, stanowią one zatem swego rodzaju przedłużenie klasycznego szlaku JAK/STAT (Binelli i wsp., 2001; Wesseley, 2005). Doświadczalnie wykazano, że dynamika fosforylacji poszczególnych elementów szlaku JAK/STAT może być zróżnicowana. Przykładowo, IFN-τ w komórkach nabłonkowych endometrium owiec powoduje długotrwałą fosforylację oraz translokację do jądra komórkowego białek STAT1 i STAT2, trwającą od 10 minut do 48 godzin po stymulacji interferonem. Natomiast w przypadku białek STAT3; STAT5a/b oraz STAT6 fosforylacja i translokacja do jądra komórkowego jest przejściowa i trwa od 10 do 60 minut, a zjawiskom tym towarzyszy także zróżnicowana czasowo ekspresja genów zależnych od GAS (od 3 do 24 godz. po stymulacji) i ISRE (długotrwała ekspresja powyżej 24 godz.) (Steward i wsp., 2001). Regulacja fosforylacji białek STAT i ich aktywności jest dodatkowo regulowana poprzez zwiększenie ekspresji negatywnych regulatorów omawianego szlaku, wiadomo bowiem, że IFN-τ oddziałując na owcze endometrium nie tylko uaktywnia białka STAT, ale i podwyższa poziom mRNA dla białek SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling), hamujących fosforylację STAT (Sandra i wsp., 2005). Szlak JAK/STAT jest w wzbudzany pod wpływem IFN-τ nie __________________________________________________________________________ 14 _____________________________________________________________________________ tylko w endometrium, ale również w komórkach bydlęcego miometrium, czego efektem jest utworzenie funkcjonalnych dimerów GAF oraz czynnika transkrypcyjnego ISGF3 (Doualla-Bell i Koromilas, 2001). A B Migracja zarodek Proliracja Elongacja szlak Ekspresja genów & szlak Wydzielnicza odpowiedź Ryc. 5 Schemat wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów pod wpływem IFN-τ – szczegółowy opis w tekście; Uterine stroma – podścielisko macicy; Uterine LE/sGE – komórki nabłonka gruczołowego (reprod. ze Spencer i wsp., 2008 oraz Bazer i wsp., 2008) Drugi szlak (ryc. 5 B) dotyczy komórek adluminalnej warstwy nabłonka i gruczołów powierzchownych błony śluzowej macicy. Pod wpływem IFN-τ nie dochodzi w nich do aktywacji białek STAT1, gdyż w komórkach tych wzbudzenie ekspresji czynnika transkrypcyjnego IRF2 prowadzi do zablokowania sekwencji ISRE, które nie mogą odpowiadać na powstający w wyniku fosforylacji STAT1/STAT2 czynnik ISGF3 (Kim i wsp., 2003) i po stymulacji IFN-τ ekspresja genów STAT1zależnych jest jedynie przejściowa (Johnson i wsp., 1999a). Podobnie jak w przypadku innych IFN typu I, IFN-τ w wyniku oddziaływania z IFNAR może pobudzać także szlaki sygnałowe, w których pośredniczą kinazy MAP. IFN-τ z pewnością pobudza szlak zależny od p38 MAPK (Doualla-Bell i Koromilas, 2001; Guzeloglu i wsp., 2004b). Dodatkowo opisano także aktywację szlaków opartych o Ras, Raf, Erk1/2, Akt i Jnk w komórkach nabłonka i zrębu (Banu i wsp., 2010; Lee i wsp., 2011). Podobnie jak w przypadku innych cząsteczek pobudzających szlak sygnałowy kinaz MAP, także w przypadku IFN-τ zaobserwowano oddziaływania z innymi __________________________________________________________________________ 15 _____________________________________________________________________________ ścieżkami przekazywania sygnału np. z receptorami estrogenowymi i progesteronowymi. Przykładowo, doświadczalnie wykazano regulacyjny wpływ IFN-τ na ekspresję wielu genów, m. in.: CST3, CTSL, LGALS15 i WNT7A. Aktywacji ekspresji tych genów nie da się wyjaśnić samym oddziaływaniem IFN-τ. Bazer i wsp. (2008) sugerują powiązanie szlaków IFN-τ i progesteronu. Według nich progesteron (P4) obniża ekspresję swojego receptora w obrębie luminalnej warstwy nabłonka i w nabłonku gruczołowym oraz w gruczołach powierzchniowych (sGE). Natomiast w komórkach zrębu progesteron poprzez swój receptor (PGR) indukuje syntezę czynnika wzrostu fibroblastów FGF7 i FGF10 oraz czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), a skutkiem tego jest parakrynne ich działanie na śluzówkę macicy i zarodek, w których dochodzi do ekspresji receptorów FGFR2IIIb i MET. Natomiast pod wpływem IFN-τ czynnik IRF2 na zasadzie konkurencyjności łączy się z sekwencją ISRE i tym samym blokuje ekspresję białek aktywowanych w szlaku klasycznym, czyli m. in. STAT1 i PGR. W wyniku wzajemnej interakcji pomiędzy IFN-τ i receptorem progesteronowym dochodzi do aktywacji kolejnych czynników transkrypcyjnych w szlakach MAPK i PI3K. IFN-τ działa zatem za pośrednictwem dwóch typów szlaków sygnałowych, wzbudzanych w zależności od warunków osobno lub jednocześnie i oddziałujących z innymi ścieżkami sygnałowymi. W efekcie skutki działania IFN-τ mogą być rozległe. Przykładowo, Chen i wsp. (2007) wykazali, że w luminalnych komórkach nabłonkowych IFN-τ powoduje zmianę poziomu transkrypcji 1274 genów z 15 634 genów badanych przy użyciu mikromacierzy DNA. Gray i wsp. (2006) stosując technikę mikromacierzy na modelu owczym wykazali, że ekspresja wielu genów ważnych z punktu widzenia implantującego się zarodka oraz reaktywności macicy może być indukowana, wzmacniana lub blokowana przez IFN-τ, przy czym 180 zbadanych przez nich genów zależało wyłącznie od IFN-τ, natomiast 74 wymagało interakcji z progesteronem, a 70 zależało jedynie od progesteronu. Podobnymi metodami porównano wpływ IFN-τ oraz IFN-α i wykazano, że niektóre efekty IFN-τ są swoiste tylko dla niego i nie są obserwowane w przypadku innych IFN typu I, mimo działania za pośrednictwem tego samego receptora (Bauersachs i wsp., 2011). Metody wielkoskalowego badania transkryptomu i proteomu są coraz częściej stosowane w __________________________________________________________________________ 16 _____________________________________________________________________________ określaniu efektu IFN-τ i wszystkie one wskazują na zmianę ekspresji przynajmniej kilkuset genów pod wpływem tej cytokiny. 2. Fizjologiczne efekty IFN-τ w czasie ciąży u bydła 2.1 Efekt luteotropowy Jak już wspomniano, IFN-τ jest u przeżuwaczy jednym z podstawowych czynników utrzymania ciąży. Mimo współdzielenia szeregu właściwości z innymi interferonami, jego funkcja polega przede wszystkim na podtrzymywaniu aktywności ciałka żółtego (corpus luteum, CL) poza czas trwania cyklu płciowego (Hansen i Tekin, 2005). Na rycinie 6 przedstawiono schemat mechanizmu utrzymania ciąży u przeżuwaczy. U bydła i owiec regresja lub przetrwanie ciałka żółtego związane jest z sekrecją prostaglandyn: PGF2α, która powoduje regresję CL (luteoliza) oraz PGE2, która podtrzymuje funkcjonowanie CL (efekt luteotropowy albo antyluteolityczny). ZARODEK CYKL CIĄŻA IFN-TAU IFNR IFNR ENDOMETRIUM ENDOMETRIUM cox2 cox2 OTR ER PR ER OTR E OXT PR PGF2α OXT E P P PGF2αR CIAŁKO ŻÓŁTE PĘCHERZYK JAJNIKOWY JAJNIK PĘCHERZYK JAJNIKOWY CIAŁKO ŻÓŁTE PGF2αR JAJNIK Ryc.6. Uproszczony mechanizm antyluteolitycznego działania IFN-τ (opis w tekście). IFNR – receptor dla interferonów typu I; E- estradiol; ER – receptor dla estradiolu; PR – receptor dla progesteronu, OXT – oksytocyna; OTR – receptor dla oksytocyny, PGF2αR – receptor dla prostaglandyny F2 α (na podstawie Spencer i Bazer, 2004; Demeters i wsp., 2001 i Kimura, 2005, zmodyfikowano) Komórki nabłonka błony śluzowej macicy krowy są głównym źródłem uwalniania PGF2, produkują one około 10-krotnie więcej tej prostaglandyny niż komórki tkanki łącznej (Asselin i wsp., 1996; Skarżyński i wsp., 2000). Oba typy komórek zawierają kompletny zestaw enzymów niezbędnych do biosyntezy prostaglandyn: PTGS 1 i 2 __________________________________________________________________________ 17 _____________________________________________________________________________ (dawna nazwa cyklooksygenaza 1 i 2; COX-1, COX-2), fosfolipazę A2 (PLA2), syntazy PGE i PGF (PGES i PGFS) oraz dehydrogenazy i transportery prostaglandyn (Arosh i wsp., 2004). Zarówno w nabłonku jak i zrębie podstawowe uwalnianie PGE2 jest wyższe w okresie wczesnej ciąży w porównaniu z cyklem. Wykazano również, iż podstawowe uwalnianie PGF2α w obu wymienionych typach komórek jest wyraźnie obniżone, gdy porówna się je z analogicznym okresem cyklu jajnikowego (Woclawek-Potocka i wsp., 2009). Jeżeli nie doszło do zapłodnienia, 17β-estradiol produkowany przez pęcherzyk jajnikowy wiąże się ze swoim receptorem (ER) w endometrium, wywołując ekspresję receptora dla oksytocyny (OTR). Z kolei oksytocyna, produkowana przez ciałko żółte i przysadkę, po związaniu się z OTR indukuje syntezę PGF2α, a to prowadzi do zaniku luteolizy. Według jednej z dotychczas obowiązujących hipotez, gdy rozwijający się zarodek rozpoczyna implantację w macicy i zapoczątkowuje wydzielanie IFN-τ zahamowana zostaje ekspresja receptorów dla estradiolu i oksytocyny, w efekcie nie dojdzie do syntezy PGF2α i ciałko żółte przetrwa (Goff, 2004). Zanim jednak zacznie działać IFN-τ, który jest wydzielany przez zarodek bydlęcy od 7 do 24 dnia, główną rolę odgrywa progesteron (P4), którego stężenie we wczesnej ciąży i post-owulacyjnej fazie cyklu płciowego jest wysokie. Hormon ten działa za pośrednictwem receptora progesteronowego (PGR) i hamuje ekspresję OTR. Jeśli jednak nie doszło do zapłodnienia, w miarę jak wzrasta poziom P4, zmniejsza się poziom jego receptora i w efekcie blok progesteronowy zostaje zniesiony, np. u owiec około 10 - 12 dnia po owulacji (Bowen i Burghard, 2000). Wpływ IFN-τ jako czynnika podtrzymującego wczesną ciążę powinien zatem odbijać się na części lub wszystkich wymienionych powyżej cząsteczkach biorących udział w luteolizie lub podtrzymywaniu CL. We wcześniejszych badaniach wykazano, iż oksytocyna nie pełni pierwszoplanowej roli w luteolizie u krowy (Kotwica i wsp., 1997; Skarzyński i wsp. 1999), co prawdopodobnie wyjaśnia dlaczego w czasie trwania ciąży obserwowany jest jedynie nieznaczny spadek ekspresji OTR i ER w porównaniu do krów będących w cyklu, pozwala to wnioskować, że IFN-τ może hamować pulsacyjne wydzielanie __________________________________________________________________________ 18 _____________________________________________________________________________ PGF2α poprzez bezpośrednie blokowanie ekspresji PTGS-2 w endometrium (Asselin i wsp., 1997; Robinson i wsp., 1999; Guzeloglu 2004b; Chen i wsp., 2007) lub myometrium (Doualla-Bell i Koromilas, 2001). Komórki zrębu pod wpływem IFN-τ prawdopodobnie nie zmieniają poziomu ekspresji genu PTGS-2 (Okuda i wsp., 2004). Pru i wsp., (2001) sugerują, że osłabienie ekspresji genu PTGS-2 w nabłonku stymulowanym estrami forbolu jest wynikiem bezpośredniego i specyficznego działania czynników transkrypcyjnych aktywowanych przez sam IFN-τ, a nie poprzez hamowanie wpływu czynnika aktywującego. Inne badania wskazują jednak, że IFN-τ powoduje raczej podniesienie, a nie obniżenie poziomu PTGS-2 w luminalnej warstwie nabłonka endometrium u bydła (Emond i wsp., 2000) lub też zupełnie nie wpływa na ekspresję PTGS-2 u owiec (Kim i wsp., 2003). Generalnie akceptowany jest pogląd, że w warunkach in vitro u owiec i bydła, niskie stężenia IFN-τ hamują produkcję PGF2α oraz PGE2, natomiast wysokie stężenia IFN-τ stymuluje produkcję PGE2, nie wpływając na poziom PGF2alfa. Guzeologlu i wsp. (2004a) badając in vitro wpływ IFN-τ na produkcję prostaglandyn w komórkach BEND (Bovine Endometrial Cells) wykazali, że steżenia poniżej 5 µg/mL hamują zarówno produkcję PGE2, jak i PGF2α. Natomiast wzrost produkcji PGE2 wymagał dziesięciokrotnie lub stukrotnie wyższego dodatku IFN-τ, odpowiednio dla komórek stymulowanych i niestymulowanych estrami forbolu. Dane te są trudne do interpretacji w kontekście jedynie PTGS-2. Arosh i wsp. (2004) wykazali, że wspomniane efekty są regulowane w sposób bardziej skomplikowany i dotyczą różnych elementów biosyntezy prostaglandyn. W nabłonku endometrium oraz w myometrium IFN-τ powoduje spadek ekspresji PGFS, podczas gdy w ciałku żółtym wywołuje wzrost ekspresji PGES. Skutkiem tego jest przechylenie równowagi w kierunku syntezy PGE2, a efekty działania różnych stężeń IFN-τ można by tłumaczyć poprzez zróżnicowany wpływ szlaków interferonowych na każdy z tych enzymów. Zjawisko takie pozwala także zrozumieć znaczenie wzrostu ekspresji PTGS-2 pod wpływem IFN-τ (jeśli rzeczywiście do niego dochodzi), bowiem enzym ten jest niezbędny zarówno do wytwarzania PGE2, jak i PGF2α, zaś dopiero regulacja ekspresji specyficznych syntaz pozwala odpowiednio ukierunkować biosyntezę prostaglandyn. W takim ujęciu regulacja poziomu PTGS-2 wpływałaby raczej na całkowite tempo syntezy prostaglandyn (jako punkt limitujący szybkość reakcji), a nie na równowagę __________________________________________________________________________ 19 _____________________________________________________________________________ PGE2/PGF2α. Zdają się to potwierdzać eksperymenty in vitro przeprowadzone na komórkach bydlęcych. Otóż stymulacja komórek zwiększającymi się stężeniami IFN-τ prowadzi do wzrostu ekspresji PTSG-2 w komórkach nabłonka i podścieliska, nie wpływa natomiast na ekspresję PTGS-1 i PLA2, również uczestniczącej w produkcji PG. Co ciekawe, zwiększonemu poziomowi mRNA dla PTGS-2 towarzyszyło zwiększenie produkcji PGE2 i PGF2α przez komórki podścieliska, podczas gdy w komórkach nabłonka adluminalnego dochodziło do wzrostu poziomu jedynie PGE2. Jeżeli wyniki te potraktować jako całość, to wypadkowo dochodziło do wzrostu produkcji PGE2 (Asselin i wsp., 1997). Xiao i wsp. (1998) w podobnej metodzie zaobserwowali również korzystną zmianę stosunku wydzielanej PGE2 i PGF2α, ale w stosunku do komórek zrębu, natomiast w komórkach nabłonka odnotowali spadek ekspresji PTGS-2 i spadek ogólnej produkcji prostaglandyn. Co jednak istotne, w obydwu typach komórek znacząco spadła ekspresja mRNA dla PGFS i stąd prawdopodobnie wynika dominacja produkcji PGE2, a efekt ten może być jeszcze wzmocniony przez wzrost ekspresji PGES w komórkach zrębu i nabłonka (Parent i wsp., 2002) oraz obniżenie poziomu enzymu katabolizującego PGE2 – reduktazy 9-ketoprostaglandy E2 (Asselin i Fortier, 2000). Warto również pamiętać, że wpływ IFN-τ na produkcję PGF2α może polegać również na hamowaniu efektu działania oksytocyny (Mann i Lamming, 2001) gdyż istotnie zaobserwowano, że IFN-τ działa antagonistycznie, hamując stymulowaną OT produkcję za pośrednictwem uaktywnienia ekspresji PTGS-2 i PGFS (Asselin i wsp., 1997; Xiao i wsp., 1999). Mimo że in vivo u bydła obserwuje się wspomniany wcześniej nieznaczny spadek ekspresji OTR pod wpływem IFN-τ, to efekt ten niekoniecznie ma wpływ na luteotropowe działanie interferonu, bowiem w warunkach in vitro hamowanie wydzielania prostaglandyn jest niezależne od obniżenia poziomu OTR, które w ogóle nie jest obligatoryjne (Krishnaswamy i wsp., 2009). Przypuszcza się, że różne izoformy kwasu fosfatydylowego (PLA2) preferencyjnie wspierają tworzenie odpowiednich rodzajów PG, np. izoforma PLA2G6 jest odpowiedzialna za przygotowanie substratu do produkcji PGF2α, podczas gdy PLA2G4C dostarcza substratu zarówno do produkcji PGE2, jak i PGF2α, lecz z wyraźnym wskazaniem na PGE2. Izoformy te występują w __________________________________________________________________________ 20 _____________________________________________________________________________ nabłonku luminalnym bydlęcego endometrium i oksytocyny powoduje podniesienie ekspresji jedynie PLA2G6. IFN-τ znosi ten efekt, a jednocześnie stymuluje wytwarzanie izoformy PLA2G4C, wspierając tym samym produkcję PGE2 i antagonizując efekt OT (Tithof i wsp., 2007). Sam wpływ IFN-τ na obniżenie poziomu ekspresji OTR nie jest prawdopodobnie efektem bezpośrednim, ale polega raczej na obniżeniu poziomu receptora estrogenowego, będącego – jak już wspomniano – pozytywnym regulatorem ekspresji OTR. Jak już wspomniano mechanizm taki jest dominujący u owiec (Spencer i Bazer, 1996; Spencer i wsp., 1999; Fleming i wsp., 2006), a opiera się on na sekwencyjnej aktywacji szlaku JAK/STAT i czynników IRF-1 i IRF-2 (Spencer i wsp., 1998). 2.2 Immunoregulacja Allogeniczne komórki rozwijającego się w macicy zarodka, a następnie płodu mogą być celem rozpoznania immunologicznego matki. Z punktu widzenia układu odpornościowego antygeny ojcowskie są obce, powinno zatem dojść do odrzucenia zarodka/płodu tak, jak to ma miejsce w przypadku przeszczepu allogenicznego (paradoks „przeszczepu płodowego”, Medawar, 1953). Tak się jednak nie dzieje ze względu na towarzyszące ciąży zjawiska immunoregulacyjne. Są to z jednej strony zagadnienia związane z ekspresją cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II oraz rekrutacją wybranych populacji leukocytów do tkanek macicy, z drugiej zaś zjawiska opisane paradygmatem komórek Th. Poniżej zostaną one przedstawione w kontekście roli wydzielanego przez zarodek IFN-τ. Przeżycie antygenowo obcego płodu w organizmie matki uwarunkowane jest m. in. budową łożyska, które stanowi anatomiczna barierę pomiędzy matką a płodem oraz zmienna ekspresja antygenów MHC na komórkach trofoblastu. W tym miejscu należy zwrócić uwagę, iż budowa łożyska przeżuwaczy jest odmienna od budowy łożyska u ludzi (ryc. 7), a inwazyjność komórek pochodzenia płodowego ogranicza się do części nabłonkowej endometrium (Bowen i Burghardt, 2000). U owiec i świń brak jest klasycznych antygenów MHC klasy I w obrębie trofoblastu (Gogolin-Ewens, 1989; Ramsoondar 1999). Występują one wprawdzie u koni, ale ich ekspresja jest niska (Donaldson i wsp., 1992). U bydła natomiast metodami immunohistochemicznymi wykazano niewielką ekspresję MHC klasy I na blastocystach po „wykluciu” (ang. hatching) z osłonki przejrzystej oraz na nabłonku kosmówki (Low i wsp., 1990). __________________________________________________________________________ 21 _____________________________________________________________________________ Wykazano że cząsteczki MHC klasy I występują na komórkach zrębu, adluminalnej warstwie nabłonka i nabłonku gruczołowym endometrium. Podczas ciąży u owiec dochodzi do spadku ekspresji MHC klasy I w macicy, jednak IFN-τ ma zdolność do wybiórczego wzmocnienia ekspresji zarówno łańcucha alfa MHC klasy I (Todd i wsp., 1998; Choi i wsp., 2003), jak i beta2-mikroglobuliny na komórkach podścieliska i nabłonku gruczołowym (Choi i wsp., 2003). U bydła wykazano również ekspresję nieklasycznych receptorów MHC klasy I, przy czym pojawiają się one dopiero w trzecim trymestrze ciąży. Przy zastosowaniu techniki RT-PCR wykazano, że klasyczne MHC stanowią 34-79% transkryptów, zaś nieklasyczne 21-66% transkryptów (Davies i wsp., 2006). Badania na liniach bydlęcego endometrium przy użyciu testu lucyferazowego wskazują, że IFN-τ podnosi ekspresję nieklasycznych cząsteczek MHC klasy I, które potencjalnie mogą brać udział w ustaleniu tolerancji immunologicznej względem antygenów płodowych (O'Gorman i wsp., 2010). Niska ekspresja MHC klasy I, bądź jej brak, co prawda chroni komórkę przed atakiem limfocytów T cytotoksycznych ale jednocześnie naraża ją na atak ze strony komórek NK. U człowieka mechanizmem, który przypuszczalnie chroni trofoblast przed reakcją ze strony komórek NK jest fakt, że na jego powierzchni obecne są nieklasyczne receptory MHC takie jak HLA-G, HLA-E i HLA-F (Wood, 1994; Pende i wsp., 1997) a z klasycznych jedynie HLA-C. Przy czym te ostatnie, choć pojawiają się już w pierwszym trymestrze ciąży, to występują jedynie na powierzchni pozakosmówkowej trofoblastu (Chaouat, 1999; King i wsp., 2000). U bydła natomiast funkcje ochronną dla trofoblastu może pełnić prostaglandyna E2 (PGE2), udowodniono bowiem, że produkowana przez 12 dniowe zarodki bydlęce, hamuje lityczną aktywność ludzkich i króliczych komórek NK i LAK (Bergeron i wsp., 1997). Immunoregulacyjny efekt prostaglandyn jest tym bardziej prawdopodobny, że ich wydzielanie również jest regulowane przez IFN-τ, natomiast sam IFN-τ, jak wykazano na modelu owczym, stymuluje lityczną aktywność komórek NK (Tekin i Hansen, 2002). Wydaje się zatem, że potrzebny jest mechanizm ochronny i tę funkcję mogą pełnić właśnie prostaglandyny. __________________________________________________________________________ 22 _____________________________________________________________________________ Bydło i inne przeżuwające blastocysta trofoblast Epithelium glandular luminal s. spongiosum Stratum functionale s. compactum Stratum basale Człowiek i mięsożerne blastocysta trofoblast Epithelium s. spongiosum s. compactum Stratum functionale Stratum basale Ryc. 7 Schemat różnic anatomicznych w implantacji zarodka ludzkiego i bydlęcego (na podstawie Bowen i Burghardt, 2000; zmodyfikowano) Podobnie jak u człowieka, nie wykazano na trofoblaście występowania białek MHC klasy II (Low i wsp., 1990). Cząsteczki MHC klasy II występują co najwyżej na komórkach dendrytycznych, makrofagach i limfocytach B występujących w macicy. Niewiele jest prac dotyczących topografii występowania leukocytów u przeżuwaczy w endometrium. Cobb i Watson (1995) badając poubojowo jałówki wykazali, że limfocyty CD4+ występują głównie w warstwie gąbczastej (stratum spongiosum), CD8+ w nabłonku adluminalnym i gruczołowym oraz warstwie zbitej (stratum compactum), natomiast limfocyty B były obserwowane jedynie jako pojedyncze skupiska limfoidalne. Stosując technikę cytometrii przepływowej Majewska (2006) u krów w 8 – 9 dniu ciąży wykazała obecność limfocytów CD4, CD8, TCRγδ i CD21, zarówno w stromie jak i nabłonku. Stosunek limfocytów CD4:CD8 wynosił odpowiednio 0,99 i 0,65 natomiast procent limfocytów B wynosił średnio 9 i 11% wszystkich badanych subpopulacji. Z kolei Vander Wielen i King (1984) badając zmiany ilościowe limfocytów u jałówek będących w ciąży (między 19 a 27 od inseminacji) oraz w 5, 10, 15 i 20 dniu cyklu płciowego stwierdzili wyraźny spadek ilości limfocytów śródnabłonkowych począwszy od 23 dnia i niewielkie różnice w czasie cyklu. Wydaje się, że IFN-τ może wpływać na dystrybucję leukocytów w macicy u bydła, wiadomo bowiem, że u owiec jest on odpowiedzialny za wzbudzenie ekspresji mRNA dla chemokiny IP-10 (ang. IFN-gamma inducible protein 10 kDa) w macicznych __________________________________________________________________________ 23 _____________________________________________________________________________ monocytach. Dalsze eksperymenty in vitro wykazały, że IP-10 rzeczywiście jest produkowana pod wpływem IFN-τ w tkankowych hodowlach endometrium, a przeciwciała neutralizujące IP-10 w znacznej mierze ograniczają chemotaktyczne właściwości nadsączy z takich hodowli (Nagaoka i wsp., 2003). Również u owiec wykazano udział IFN-τ we wzmocnieniu ekspresji chemokin MCP-1 i MCP-2 w macicznych eozynofilach (Asselin i wsp., 2001). U bydła natomiast IFN-τ reguluje także ekspresję białka chemotaktycznego dla granulocytów 2 (GCP-2), które w kooperacji z innymi cytokinami może wpływać w macicy na rekrutację granulocytów (Teixeira i wsp., 1997). Jednorazowe domaciczne podanie IFN-τ w 7 dniu cyklu płciowego wywołuje u krów przejściowe obniżenie liczby limfocytów i neutrofilów (Matsunaga i wsp., 2011). IFN-τ wzmacnia również ekspresję czynnika hamującego migrację makrofagów (MIF) w komórkach nabłonka, ale nie zrębu u bydła. Efekt ten jest widoczny zarówno na poziomie mRNA, jak i białka (Wang i Goff, 2003). Przykłady te wskazują, że IFN-τ lokalnie reguluje napływ leukocytów, przynajmniej w pobliżu miejsca implantacji, chociaż badania Leung i wsp. (2000) zdają się przeczyć temu poglądowi, przynajmniej w kontekście komórek CD4+, CD14+ i CD21+. Jak wyżej wspomniano, obok regulacji ekspresji MHC i zmian liczby leukocytów w macicy istotną rolę w ustaleniu areaktywności na antygeny płodowe odgrywa immunomodulacja oparta na aktywnym udziale komórek T helper. Według hipotezy Wegmanna i wsp. (1993) w trakcie ciąży dochodzi do ustalenia odpowiedzi typu Th2, która jest korzystna, i zahamowania odpowiedzi typu Th1. Prawidłowa ciąża cechuje się zatem produkcją cytokin takich jak IL-4, IL5, IL-6, IL10. Innymi czynnikami które nie należą do odpowiedzi typu Th2, ale również promują rozwój ciąży są CSF-1, GMC-SF i TGF-beta2. Prowadzi to do proliferacji limfocytów B, czyli nasilenia odpowiedzi humoralnej z jednoczesnym zahamowaniem odpowiedzi typu komórkowego (Malinowski, 2000). Z wielu prac doświadczalnych wynika, że u kobiet z tendencją do nawykowych poronień we krwi obwodowej poziom cytokin charakterystycznych dla odpowiedzi Th1 jest znacząco wyższy niż u kobiet zdrowych. dotyczy to zwłaszcza IL2, IL-12 oraz IFN-γ (Jenkins i wsp., 2000; Wilson i wsp., 2004; Hadinedoushan i wsp., 2007). Hipoteza Wegmanna została więc potwierdzona w wielu badaniach, jednak obecnie jest ona rozszerzona o udział dodatkowych populacji komórek CD4+: __________________________________________________________________________ 24 _____________________________________________________________________________ limfocytów T regulatorowych (Treg) oraz limfocytów wydzielających IL-17 (Th17), przy czym wszystkie te subpopulacje limfocytów Th są powiązane wzajemnymi zależnościami. Limfocyty Treg biorą udział w antygenowo-swoistym lub antygenowonieswoistym hamowaniu odpowiedzi odpornościowej jako komórki ogólnie immunosupresyjne, zaś limfocyty Th17 wspierają odpowiedź zapalną (Saini i wsp., 2011). Udział IFN-τ u bydła w kontekście regulacji odpowiedzi Th1/Th2 oraz aktywnej odpowiedzi tolerogennej jest obecnie słabo poznany. Eksperymenty in vitro wskazują, że czynnik ten powoduje wzrost ekspresji mRNA dla IL-4 i IFN-gamma w pobudzonych antygenem bydlęcych limfocytach T CD4+, nie wpływa natomiast na ekspresję IL-10 (Tuo i wsp., 1999b). W tym kontekście nie można zatem stwierdzić, że IFN-τ pobudza odpowiedź typu Th1 lub Th2. Z kolei eksperymenty in vivo wykazały, że domaciczne podanie IFN-τ u bydła powoduje spadek poziomu transkryptów kodujących trzy izoformy TGF-beta w endometrium (Godkin i wsp., 1997), a sama produkcja TGF-beta w czasie ciąży rozpoczyna się dopiero w momencie, gdy zanika sekrecja IFN-τ (Imakawa i wsp., 1998). Cytokina ta jest istotna z punktu widzenia aktywności limfocytów Treg, wykazuje także szereg właściwości immunosupresyjnych, stąd wpływ IFN-τ na obniżenie poziomu transkryptu paradoksalnie wydaje się być szkodliwy z punktu widzenia prawidłowej ciąży. Sam IFN-τ wpływa natomiast ogólnie immunosupresyjnie, podobnie jak inne IFN typu I, poprzez hamowanie indukowanej przez IL-2 proliferacji limfocytów (Niwano i wsp., 1989). Efekt ten może być wybiórczy, bowiem w warunkach in vitro zaobserwowano, iż IFN-τ hamuje ekspansję stymulowanych antygenami pasożytów bydlęcych limfocytów Tγδ WC1+CD2-CD6CD8-, jednocześnie jednak wspiera rozwój subpopulacji komórek Tγδ WC1CD2+CD6+CD8+ i Tαβ CD8+ (Tuo i wsp., 1999). Innym mechanizmem immunosupresyjnym może być stymulacja ekspresji 2,3-dioksygenazy indoleaminowej (IDO), enzymu odpowiadającego za katabolizm tryptofanu i powstanie L-kinureniny, metabolitu tryptofanu wywierającego efekty immunosupresyjne i wspierającego rozwój odpowiedzi tolerogennej (Mandi i Vecsei, 2011). Ekspresja tego enzymu wzrasta od 12 do 18 dnia ciąży u krów, głównie w komórkach stromy, czemu towarzyszy obniżenie poziomu tryptofanu w endometrium i podwyższenie poziomu kinureniny. IFN-τ w __________________________________________________________________________ 25 _____________________________________________________________________________ warunkach in vitro znacząco podnosi ekspresję mRNA dla IDO w tkankowych hodowlach endometrium, działając przede wszystkim na komórki stromy, co powoduje powstanie środowiska immunosupresyjnego i wspierającego rozwój aktywnych mechanizmów tolerancji immunologicznej (Groebner i wsp., 2011). Również ludzkie makrofagi reagują podniesieniem ekspresji IDO w odpowiedzi na stymulację interferonem tau (Maneglier i wsp., 2007). U bydła, pod wpływem IFN-τ produkowanego przez zarodek wydzielanych jest miejscowo szereg czynników promujących rozwój ciąży, takich jak m. in.: UCRPubiquitin cross-reactive protein (Austin i wsp., 1996), GM-CSF- granulocyte, macrophage – colony stimulating factor (Emond i wsp., 2000). Wpływ IFN-τ nie zawsze ma zasięg miejscowy, może on powodować reakcję ogólnoustrojową. Yankey i wsp. (2001) sugerują, że IFN-τ powoduje u owiec wydzielanie białka Mx przez komórki mononuklearne krwi obwodowej. Podwyższony poziom tego białka utrzymuje się od 15 do 30 dnia po inseminacji i jest prawie dwukrotnie wyższy u owiec w ciąży niż w trakcie cyklu. Także w pracy Gifforda i wsp. (2008) wykazano, że IFN-τ wpływa na owcze leukocyty krwi obwodowej i reguluje ekspresję białka RTP4, zarówno u zwierząt w ciąży, jak i w modelu in vitro. Jak widać na powyższych przykładach, dane dotyczące immunoregulacyjnych efektów IFN-τ są czasami sprzeczne. Sprzeczności te mogą wynikać np. z faktu występowania różnych izoform IFN-τ. Tekin i wsp. (2000) badając in vitro owczy IFN-τ (izoformy 4, 6d i 11) wykazali, że wszystkie one działają silnie antyproliferacyjnie na limfocyty stymulowane PHA. Działanie to w każdym przypadku jest silniejsze w porównaniu z IFN-ω, ale zależy od izoformy, przy czym najsilniej działa IFN-τ4, a najsłabiej IFN-τ11. Należy także podkreślić, iż ze względu na charakter implantacji u przeżuwaczy wiele efektów IFN-τ, również tych immunoregulacyjnych, może mieć charakter pośredni, wynikający ze zmian ekspresji innych czynników bioaktywnych pod wpływem IFN-τ. Biorąc pod uwagę badania nad IFN-τ prowadzone na myszach, szczurach i materiale ludzkim w kontekście potencjalnych korzyści immunoterapeutycznych, najbardziej prawdopodobne jest działanie IFN-τ wspierające odpowiedź typu Th2 i promowanie rozwoju limfocytów T regulatorowych (Treg) __________________________________________________________________________ 26 _____________________________________________________________________________ poprzez regulację wydzielania takich cytokin, jak IL-10, IFN-gamma czy TGF-beta (np. Soos i wsp., 1995; Soos i wsp., 1997 Mujtaba i wsp., 1997; Rogez-Kreuz i wsp., 2005). 2.3 Inne efekty fizjologiczne IFN-tau Mając na uwadze szeroki zestaw genów regulowanych przez IFN-τ nie powinien dziwić fakt, że cytokina ta wywiera także wpływ na szereg zjawisk, szczególnie zachodzących lokalnie w macicy, nie mających bezpośredniego związku z immunoregulacją bądź efektem luteotropowym. Przykładem takiego zjawiska może być zwiększenie produkcji katepsyn, proteaz odpowiedzialnych za przebudowę tkanek oraz aktywację hormonów peptydowych. IFN-τ zwiększa ekspresję katepsyny L, a w połączeniu z progesteronem — także ekspresję katepsyn H, K, S i Z w owczym endometrium i w trofoblaście, uczestniczy zatem pośrednio w rozwoju łożyska (Song i wsp., 2005). IFN-τ bierze także udział w rozwoju trofoblastu i regulacji funkcji endometrium u owiec poprzez podwyższenie ekspresji receptora dla czynnika hamującego białaczkę (LIFR) oraz jego koreceptora IL6ST na trofoblaście i nabłonku gruczołowym endometrium (Song i wsp., 2009). U owiec wykazano również efekt IFNτ polegający na podniesieniu poziomu mRNA dla receptora prolaktyny w kompartymencie gruczołowym endometrium (Martin i wsp., 2004), zwiększeniu ekspresji syntazy tlenku azotu 1 w luminalnej warstwie nabłonka (Gao i wsp., 2009) oraz pobudzeniu ekspresji receptorów prostaglandynowych EP2 i EP4 na komórkach endometrium (Lee i wsp., 2011). U bydła IFN-τ wydzielany przez zarodki powoduje również obniżenie produkcji metaloproteinaz przez komórki endometrialne w hodowlach in vitro (Hashizume i wsp., 2003). Wszystkie te zjawiska mogą być związane z powodzeniem implantacji i ustaleniem odpowiednich interakcji matczynopłodowych, wymagają jednak dalszych badań. 3. Postęp hodowlany a rozród Do szybko postępującego wzrostu produktywności krów przyczynia się poprawa warunków bytowania i żywienia. Ekonomiczny wynik hodowli bydła w __________________________________________________________________________ 27 _____________________________________________________________________________ największym stopniu zależy jednak od racjonalnego rozrodu. W wyniku prowadzonej ciągłej pracy hodowlanej uzyskano około 1000 ras bydła domowego, z czego dobrze poznanych jest około 250 (cyt. za Karczmarkiem, 2005). Wielkość pogłowia bydła na świecie szacuje się na prawie 1,5 miliarda sztuk, z czego w Polsce wynosi ono 5,7 milionów sztuk (Mały Rocznik Statystyczny 2010). Około 85% pogłowia krajowego stanowi bydło rasy czarno−białej, która użytkowana jest dwukierunkowo, dla pozyskania mleka i mięsa (Rycombel, 2004). Niestety intensywna eksploatacja zwierząt nie jest obojętna dla ich rozrodczości. Dla zobrazowania postępu hodowlanego, jaki się ostatnio dokonał warto podać, że w latach 50 ubiegłego wieku średnia roczna produkcja mleka w USA wynosiła około 2,5 tysiąca kg od krowy podczas gdy w roku 2000 wydajność ta osiągnęła wartość 6,5 – 8 tysięcy kg rocznie (Stevenson, 2001). Wynik będzie jeszcze bardziej zdumiewający jeśli zestawi się to z 400 - 800 litrami rocznie jakie można było uzyskać od wymarłego już tura będącego, jak się uważa, protoplastą współczesnego bydła. Z badań Stevensona (2001) wynika jednak bardzo wyraźnie, że Procent zacieleń Produkcja mleka w tys. kg / rok wysoka mleczność stoi w sprzeczności z dobrymi wynikami rozrodu (ryc.8). lata Ryc. 8. Zestawienie średniej mleczności krów z wynikami reprodukcyjnymi. (Stevenson, 2001). Dane dotyczące zacieleń odnoszą się do jednokrotnego zabiegu inseminacji. Skala problemów związanych z rozrodem bydła mięsnego jest zdecydowanie mniejsza z uwagi na warunki utrzymania i intensywność użytkowania (Żółkowski i Przysucha, 2005). Potwierdzają to badania Alves’a i wsp. (1996) którzy badając w Kanadzie częstość poronień u krów mlecznych i mięsnych wykazali znacznie niższy ich odsetek u tych drugich (ryc. 9). __________________________________________________________________________ 28 _____________________________________________________________________________ Ryc.9. Częstość utrat ciąż u bydła w Kanadzie z uwzględnieniem sposobu jego użytkowania w latach 1993 – 1995 (Alves i wsp., 1996) Główną przyczyną niepowodzeń reprodukcyjnych u bydła jest wczesna utrata ciąż, czyli przed 42 dniem jej trwania (zanim wytworzy się funkcjonalne łożysko). W roku 1980 Diskin i wsp. (2006) szacowali, że 28% zabiegów inseminacyjnych kończy się niepowodzeniem właśnie z tego powodu, podczas gdy w roku 2006 problem ten dotyczył już aż 43 % krów (ryc. 10). Ryc.10. Porównanie wyników reprodukcyjnych bydła (Diskin i wsp. 2006) Mimo intensywnych i zakrojonych na szeroką skalę badań etiologia poronień u bydła w większości przypadków nie jest znana i na przestrzeni lat utrzymuje się na zbliżonym poziomie (ryc. 11). Zdefiniowane przyczyny dotyczą przeciętnie 40 % wszystkich przypadków (Kirkbride, 1992; Alves i wsp., 1996; Campero i wsp., 2003), dodatkowo znaczący wpływ na płodność krów mlecznych mogą mieć czynniki lokalne, jak np. klimat (Paula-Lopes i wsp., 2003; Flamenbaum i Galon, 2010). __________________________________________________________________________ 29 _____________________________________________________________________________ Ryc.11. Etiologia poronień u krów w USA (Kirkbride, 1992) Jak widać problem wczesnych utrat ciąż miał i ma u bydła zasięg światowy, jest on przyczyną poważnych strat finansowych. U „nowoczesnych” ras krów wysokomlecznych przypuszczalnie związany jest m. in. z wysokim wskaźnikiem imbredu zwierząt, ociepleniem klimatu i związanym z nim stresem cieplnym (Hansen 2007). 4. Techniki rozrodu Postęp hodowlany nie byłby możliwy bez doskonalenia technik rozrodu. Pierwszym krokiem w tym względzie było sztuczne unasiennianie, pozwala ono na racjonalne wykorzystanie samca. Przy tradycyjnym użytkowaniu jeden buhaj obsługuje maksymalnie przy kryciu haremowym 30 krów i do 100 przy kryciu z ręki. (Litwińczuk i Szulc 2005). Podczas gdy przy stosowaniu nasienia rozrzedzanego a następnie mrożonego można z tylko jednej porcji nasienia, teoretycznie inseminować nawet 400 do 600 krów (Głód, 1969). Obecnie krycie naturalne stosowane jest jeszcze głównie przy hodowli bydła mięsnego oraz w przypadkach, gdy sztuczna inseminacja nie zakończyła się zacieleniem. Stosunkowo najmłodszym osiągnięciem sztucznej inseminacji jest tak zwane seksowanie nasienia celem uzyskania potomstwa o pożądanej płci. __________________________________________________________________________ 30 _____________________________________________________________________________ Prawie równocześnie z doskonaleniem technik sztucznej inseminacji zaczęły się rozwijać się techniki embriotransferu, a ich podstawowym założeniem jest racjonalne wykorzystywanie samicy. Jest to w zasadzie cały wachlarz technik pozwalających na: uzyskanie oocytów lub zarodków, zapłodnienie in vitro lub in vivo, hodowlę zarodków in vitro, przygotowanie biorczyń zarodków i transfer. Wśród korzyści wynikających z embriotransferu najczęściej wymieniane są: zwiększenie tempa podstępu hodowlanego osiąganego poprzez selekcję genetyczną i skracanie odstępu międzypokoleniowego, ograniczenie frekwencji określonych genów w populacji (np. DUMPS i BLAD) oraz możliwość selekcji płci (Chełmońska-Soyta i Jaśkowski, 2007). Technika ta może być szczególnie przydatna w ograniczaniu niepowodzeń w zacieleniach krów wysokowydajnych, które w technice tej są jedynie dawcami oocytów lub zarodków, ponieważ cały wydatek energetyczny związany z wydaniem potomstwa ponosi krowa biorczyni, od której nie wymaga się wysokiej wydajności a jedynie dobrej kondycji zdrowotnej. Skuteczność zacieleń przy użyciu technik z szeroko pojętego embriotransferu jest zróżnicowana i w dużej mierze zależy od sprawności i doświadczenia poszczególnych zespołów zajmujących się embriotransferem oraz szeregu innych aspektów, takich jak jakość gamet, prawidłowość i precyzja oszacowania cyklu płciowego krów-biorczyń, brak zaburzeń hormonalnych, uzyskanie odpowiedniego środowiska grasicy oraz jakość samego zarodka (Walsh i wsp., 2011). Powodzenie zabiegu zależy również od wieku zarodka, jego stadium rozwojowego oraz techniki samego embriotransferu. Z przeprowadzonego przez Kanagawa i wsp. (1995) przeglądu literatury wynika, że skuteczne zabiegi embriotransferu można wykonać u bydła dla zarodków w wieku od 3 dni do 13 dni lub będących od stadium 16-komórkowego po stadium blastocysty bez otoczki przejrzystej. Jednak najwyższy procent zacieleń uzyskuje się dla embrionów w wieku 6 – 9 dni i będących w stadium od późnej moruli po blastocystę rozpoczynającą opuszczanie osłonki przejrzystej. __________________________________________________________________________ 31 _____________________________________________________________________________ Ryc. 12. Schemat rozwoju zarodka od zapłodnienia do implantacji z orientacyjnym uwzglednieniem nastęstwa czasu i miejsca w drogach rodnych krowy. Na podstawie Kanagawa i wsp. 1995, Bowen JA, Burghardt RC, 2000 i Gordon I, 2003 (zmodyfikowano) W badaniach Sartori i wsp. (2006) prowadzonych w USA, porównujących skuteczność sztucznej inseminacji i embriotransferu krów mlecznych po synchronizacji rui przez dwukrotne podanie GnRH i jednokrotne PGF2α, uzyskiwano przy sztucznej inseminacji 37% zacieleń, przy embriotransferze 41%, natomiast ilość poronień do 66 dnia ciąży wynosiła odpowiednio 15 i 25%. W warunkach krajowych, Jaśkowski (2000) w latach 1997-1998 skuteczność embriotransferu dla zarodków świeżych wynosił od 44 do 51% a dla mrożonych 46 do 51%. 5. Ocena jakości zarodków Głównym kryterium oceny zarodków pod względem ich przydatności do embriotransferu jest ich ocena mikroskopowa pod względem: kształtu, wielkości, koloru blastomerów, ziarnistości i ciągłości osłonki przejrzystej. Dobrej jakości zarodek jest kulisty, symetryczny z komórkami jednakowej wielkości i konsystencji oraz bez przebarwień. Metoda ta jest jednak bardzo subiektywna i zależy w dużej mierze od doświadczenia osoby badającej, dlatego też zaczęto poszukiwać innych sposobów oceny laboratoryjnej wśród których wymienić należy testy pozwalające określić żywotność komórek zarodka z barwnikami fluorescencyjnymi takimi jak: FDA (dwuoctan fluoresceiny), DAPI, czy Hoechst 33342. Jednak tylko pierwszy z nich jest nietoksyczny dla zarodków i pozwala na późniejsze wykorzystanie ich do embriotransferu (Bielański i Tischner, 1997). Wraz z rozwojem technik hodowli in vitro __________________________________________________________________________ 32 _____________________________________________________________________________ zarodków wykorzystujących nowoczesne media o ściśle zdefiniowanym składzie pojawiła się możliwość oceny metabolizmu pojedynczych zarodków, jak choćby przez pomiar zużycia glukozy (np: Gardner i Leese, 1987; Rieger i Guay, 1988; Swain i wsp., 2002), stężenia dehydrogenazy mleczanowej (Lane i Gardner, 2000) będącej markerem komórek martwych lub zdegenerowanych, czy też badań gazometrycznych pozwalających mierzyć dynamikę zużycia tlenu i wzrostu stężenia dwutlenku węgla (Overström i wsp., 1992; Lopes i wsp., 2005 i 2006). Technika opisana przez Lopes’a i wsp. wykorzystuje nanorespirometr pozwala na pomiar zużycia tlenu przez pojedynczy zarodek w czasie rzeczywistym, jednak w przypadku zarodków bydlęcych nie potwierdzono korelacji pomiędzy zużyciem tlenu a żywotnością zarodków i powodzeniem ciąży (Lopes i wsp., 2007). Dzięki rozwojowi jaki dokonał się ostatnio w nanotechnologii możliwe jest obecnie konstruowanie czułych aparatów do równoczesnego pomiaru poziomu wielu metabolitów w czasie rzeczywistym i w zasadzie dowolnym momencie rozwoju zarodka. Szczytowym osiągnięciem w tym względzie jest obecnie skaningowa mikroskopia elektrochemiczna (ang. Scaning electrochemical microscopy, SEMC), która oprócz oceny morfologicznej zarodka pozwala na badanie w czasie rzeczywistym i zupełnie bezinwazyjnie stężenia: DNA, enzymów, oddziaływań antygen-przeciwciało. System taki składa się z urządzenia pomiarowego w mikroskopie odwróconym, komputera do archiwizacji danych, mikroelektrody i specjalnej płytki do hodowli w której dokonuje się pomiarów (ryc. 13). Ryc. 13. System SEMC: a) mikroskop odwrócony, b) potentiostat, c) laptop, e) mikroelektroda, f) płytka (z Abe, 2007). __________________________________________________________________________ 33 _____________________________________________________________________________ Absolutnym novum w zakresie oceny zarodków jest wykorzystanie technik mikrofluidycznych do oceny kompetencji biologicznej zarodków. Technikę tę w Polsce zapoczątkował zespół prof. Jana Dziubana z Politechniki Wrocławskiej przy współpracy zespołu prof. Jędrzeja Jaśkowskiego z Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu i zespołu prof. Anny Chełmońskiej-Soyta z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Jak dotąd wykonano trzy prototypy chipów: dwa do pomiarów transmisji światła widzialnego dla oocytów i zarodków świń i bydła oraz jeden do pomiarów intensywności fluorescencji zarodków mysich. (Chełmońska-Soyta, 2011; inf. ustna). W pierwszym urządzeniu jakość zarodków i oocytów jest korelowana z wielkością transmisji światła widzialnego przez badane obiekty. Analiza krzywych spektralnych światła absorbowanego przez oocyty pozwala na ich kategoryzację, która jest częściowo zgodną oceną morfologiczną opartą o wielkość izolowanych pęcherzyków. Podobnie analiza widm spektralnych zarodków umożliwiła ich kategoryzację zgodną z oceną morfologiczną i w niektórych przypadka zdolnością do rozwoju w drogach rodnych samicy. Ostatnie z wymienionych urządzeń służy do badania jakości mysich zarodków w stadium przedimplantacyjnym, przy czym wyznacznikiem tej jakości jest poziom apoptozy obserwowany w zarodkach, oparty o podstawowy marker tego zjawiska jakim jest fosfatydyloseryna. Przy zastosowaniu tego chipu możliwa jest ocena intensywności fluorescencji zarodków barwionych koniugatem Annexyny V z FITC. W przeprowadzonych badaniach obserowano, iż klasyfikacja pozyskanych ex-vivo morul metodą lab-on-a-chip korelawoała z ich prawidłowym rozwojem w warunkach in vitro do stadium blastocysty. Tym samym wykazano, że urządzenie typu LOC można z powodzeniem wykorzystywać jako narzędzie umożeliwiające przyżyciowe badanie apoptozy w zarodkach i ich klasyfikację według potencjału rozwojowego (Walczak, 2011; Walczak i wsp., 2011). Podsumowanie: IFN-τ jako jeden z podstawowych czynników utrzymania ciąży, jest brany pod uwagę przy ocenie jakości zarodków bydlęcych. Jego stężenie w medium hodowlanym jest silnie skorelowane z jakością zarodka oznaczaną przy pomocy innych metod (Russell i wsp., 2006; Neira i wsp., 2007). Biorąc pod uwagę rolę IFN-τ we wczesnych __________________________________________________________________________ 34 _____________________________________________________________________________ etapach utrzymania ciąży, a także fakt, iż obecnie nakłady pracy i koszt embriotransferu są wciąż jeszcze wyższe niż sztucznego unasienniania przy jednoczesnej nieco niższej efektywności, podjęta próba oceny przydatności zarodków na podstawie nie tylko ilości, ale i biologicznej aktywności produkowanego przez nie IFN-τ, może okazać się cennym uzupełnieniem informacji o ich przydatności do embriotransferu, tym bardziej, że jest to technika stosunkowo prosta i nie wymaga skomplikowanej i kosztownej aparatury jak np. w przypadku systemu SEMC. Interferon-τ jest najważniejszym białkiem decydującym o rozpoznaniu i utrzymaniu ciąży u przeżuwaczy. Wykazuje silne działanie miejscowe, umożliwiające implantację i endokrynologiczną kontrolę matki nad rozwijającym się zarodkiem. Jednocześnie wywiera mniej wyrażone, ale molekularnie zauważalne dzianie ogólne wobec krążących limfocytów. Ten przede wszystkim lokalnych charakter oddziaływania tej cytokiny praktycznie zamyka drogę do jej diagnostycznego wykorzystania w detekcji wczesnej ciąży u przeżuwaczy. Z drugiej strony zarówno ilość jak i jakość produkowanego interferonu tau jest zróżnicowana pomiędzy zarodkami i jest jednocześnie warunkiem sine qua non powodzenia ciąży. Wykorzystując wcześniejsze doświadczenia nad dobrze wyrażonym w warunkach in vitro antyproliferacyjnym wpływem IFN-τ na limfocyty krwi obwodowej bydła postanowiono sprawdzić czy działanie to jest ukierunkowane / wybiórcze wobec szczególnej subpopulacji limfocytów i czy można wykorzystać antyprolliferacyjny wpływ tej cytokiny wobec limfocytów dla oceny biologicznej wartości zarodków bydlęcych. __________________________________________________________________________ 35 _____________________________________________________________________________ II. Cel pracy Celem pracy było opracowanie testu do oceny aktywności biologicznej IFN-τ produkowanego przez zarodki bydlęce na podstawie jego antyproliferacyjnego oddziaływania wobec limfocytów krwi obwodowej bydła. Badania przeprowadzono w następujących etapach: 1. Ocena antyproliferacyjnego wpływu ro-IFN-τ wobec komórek mononuklearnych krwi obwodowej jałówek. 2. Ocena efektywności antyproliferacyjnej ro-IFN-τ wobec wybranej populacji limfocytów i standaryzacja warunków testu 3. Ocena aktywności IFN-τ produkowanego przez zarodki bydlęce uzyskane techniką IVF (in vitro fertilization) wobec wybranej populacji limfocytów krwi obwodowej bydła. __________________________________________________________________________ 36 _____________________________________________________________________________ III Materiał i metody Materiałem do badań była krew obwodowa jałówek rasy czarno-białej z podwrocławskiego gospodarstwa rolnego specjalizującego się w produkcji mleka. Obsadę fermy stanowiło około 400 krów, 180 jałówek i 150 cielaków, utrzymywanych w systemie wolnostanowiskowym. Warunki zoohigieniczne warunki panujące na terenie obiektu były dobre, zwierzęta były klinicznie zdrowe i znajdowały się pod stałą opieką weterynaryjną. Ogółem krew pobrano od 43 jałówek w wieku 6–7 miesięcy. Materiał do badań pobierany był sukcesywnie, jednorazowo od 2 do maksymalnie 6 zwierząt. Doświadczenia przeprowadzono za zgodą II Lokalnej Komisji Etycznej we Wrocławiu (opinia nr 41/02 z 27.02.2002r.) Odczynniki gotowe stosowane w przeprowadzanych badaniach: Albumina bydlęca – frakcja V (Sigma Aldrich) Błękit trypanu (Sigma –Aldrich) DMF – N,N–dimetyloformamid, (Sigma-Aldrich) DMSO – dimetylosulfotlenek, (Sigma-Aldrich) FCS - bydlęca surowica płodowa – (Gibco Invitrogen Life Technologies) Fungizone – amfoterycyna B (Gibco Invitrogen Life Technologies) Gentamycyna (Gibco Invitrogen Life Technologies) L- Glutamina (Sigma – Aldrich) Histopaque 1083 (Sigma–Aldrich) Jodek propidyny (Sigma – Aldrich) koncentrat płynu Hanksa, 10x stężony (IIiTD PAN we Wrocławiu) Con A - konkanawalina A, mitogen z konwalii mieczokształtnej (Canavalia ensiformis) (Sigma – Aldrich) MTT — bromek 3-(4,5-dimetylodiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (SigmaAldrich) PBS – buforowany roztwór soli fizjologicznej, bez jonów Ca2+ i Mg2+ (IIiTD PAN we Wrocławiu) PHA – fitohemaglutynina, mitogen z fasoli zwykłej (Phaseolus vulgaris) (SigmaAldrich) roIFN-τ - rekombinowany owczy interferon tau (stężenie 1 mg/ml, aktywność przeciwwirusowa 108 U/mg), wyprodukowany w drożdżach Pichia pastoris, otrzymany dzięki uprzejmości prof. F.W. Bazera. Texas A&M University, College of Agriculture and Life Sciences poliklonalna królicza surowica anty-roIFN-τ (dzięki uprzejmości prof. W. Nowackiego; UP we Wrocławiu) Przeciwciała stosowane do immunofenotypizacji komórek – tabela 1 __________________________________________________________________________ 37 _____________________________________________________________________________ PWM, mitogen ze szkarłatki amerykańskiej (Phytolacca americana) (SigmaAldrich) RPMI 1610– IIiTD PAN we Wrocławiu SDS – dodecylosiarczan sodu (POCH-Gliwice) Tab.2. Przeciwciała użyte do immunofenotypizacji limfocytów Przeciwciała monoklonalne poliklonalne, antyizotypowe, skoniugowane z barwnikiem fluorescencyjnym Antygeny różnicowania CD4 CD8 TCR1-N24 WC1-N1 IgM CD25 CD21 Goat anti mouse IgG1 Goat anti mouse IgG2b Goat anti mouse IgG izotyp nr klonu IgG1 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG2a IgG1 CACT138A CACT80C GB21A BAQ4A BIG73a CACT108A CC21 IgG STAR81PE IgG STAR83F IgG F0479 producent VMRD SEROTEC DAKOCYTOMATION Przygotowywane samodzielnie media hodowlane i bufory RPMI kompletne: 10% (o/o) FCS; 0,03% (w/o) glutamina; 0,5% (o/o) gentamycyna i 1% (o/o) fungizone w RPMI 1610 Bufor do płukania i barwienia komórek: 1% (w/o) roztwór albuminy bydlęcej w PBS bez jonów Ca2+ i Mg2+ Bufor do utrwalania komórek: 2% formalina w PBS bez jonów Ca2+ i Mg2+ Bufor lizujący: 13,5% roztwór w/o SDS w 45% w/w wodnym roztworze DMF Medium do zamrażania limfocytów: 10% o/o FCS i 10% o/o DMSO w RPMI kompletnym Antykoagulant – 3,8% w/v cytrynian sodu (C6H5O7Na3 x 5H2O) (POCh- Gliwice) Fiolet krystaliczny – 1% roztwór wodny 0,83%, wodny roztwór chlorku amonu NH4Cl (POCh-Gliwice) Wszystkie przygotowywane media do hodowli komórek były jałowione przy użyciu sączków strzykawkowych o średnicy porów 0,22µm (Millex-GS) __________________________________________________________________________ 38 _____________________________________________________________________________ Technika izolacji i przygotowania do hodowli in vitro komórek mononuklearnych krwi obwodowej Krew pobierano z żyły szyjnej zewnętrznej do probówek typu Falcon (50 ml) z dodatkiem antykoagulantu - 3,8% cytrynianu sodu (w proporcji 4 : 1). Izolację komórek mononuklearnych rozpoczynano przed upływem 2 godzin od pobrania i prowadzono ją w gradiencie gęstości. Krew nawarstwiano na preparat Histopaque 1083 w stosunku objętościowym 1:1 i wirowano przy prędkości 600xg w temperaturze 4ºC, przez 20 minut (Williams i wsp., 1986; Abella i wsp., 1994). Otrzymaną zawiesinę komórek mononuklearnych przepłukiwano jednokrotnie w wodnym roztworem 0,83% NH4Cl, potem dwukrotnie w PBS i jednokrotnie w płynie Hanksa, wirując przy 400xg, 6 minut w temp. 4ºC. Tak przygotowane komórki ostatecznie zawieszano w 1–3 ml RPMI kompletnego, liczono w komorze Thoma–Zeissa i doprowadzano do koncentracji 4x106 komórek/ml, rozcieńczając zawiesinę w RPMI kompletnym. Hodowle limfocytów prowadzono na płaskodennych płytkach titracyjnych (Nunc) w objętości 150 µl – 2x105 komórek lub ich wielokrotności. Podane w dalszej części pracy stężenia, jeśli nie określono inaczej, dotyczą ilości substratów w przeliczeniu na 1,0 ml hodowli, pierwotnie jednak przy ustalaniu optymalnych stężeń wyliczano je na dołek, czyli 150 µl. Hodowlę limfocytów prowadzono przez 72 godziny, w 37ºC, przy 5% wysyceniu środowiska CO2. Dla ułatwienia przeliczenia stężeń podano w tabeli poniżej ng/150µl 10 5 1 0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 ng/ml 66,7 33,3 6,67 0,667 0,333 0,0667 0,0333 0,00667 0,00333 0,000667 ng/ml 6,67x101 3,33x101 6,67x100 6,67x10-1 3,33x10-1 6,67x10-2 3,33x10-2 6,67x10-3 3,33x10-3 6,67x10-4 nM1 3,34x100 1,67 x100 3,34x10-1 3,34x10-2 1,67 x10-2 3,34x10-3 1,67 x10-3 3,34x10-3 1,67 x10-3 3,34x10-4 Doświadczenie 1. Wpływ ro-IFN-τ na indukowaną mitogenami transformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT. Celem doświadczenia było wyznaczenie progowego stężenia IFN-τ hamującego proliferację limfocytów oraz sprawdzenie, czy istnieje korelacja pomiędzy stężeniem roIFN-τ a siłą hamowania proliferacji. Hodowlę limfocytów prowadzono na 961 nano (n) = 10-9 ; za masę cząsteczki IFN-tau przyjęto 20 kDa __________________________________________________________________________ 39 _____________________________________________________________________________ dołkowych płytkach mikrotitracyjnych. Komórki stymulowane były różnymi stężeniami mitogenów: Con A (2,67 µg/ml), PHA (6,66 µg/ml) i PWM (3,33 µg/ml). Antyproliferacyjny wpływ ro-IFN-τ badano testując stężenia w zakresie od 6,67 x10-4 ng/ml do 6,7x101 ng/ml. Wpływ na tempo podziałów określano testem opartym na redukcji soli tetrazolowych (Mosmann 1983). Na 3 godziny przed końcem inkubacji do każdego dołka dodawano po 25 µl MTT (5 mg/ml) i dalej inkubowano w cieplarce. Następnie dodawano po 125 µl buforu lizującego i pozostawiano w tych samych warunkach przez następne 12 - 16 godzin, tj. do momentu odczytu. Absorbancję (OD) mierzono przy użyciu czytnika Labsystems Uniscan I (Finlandia) używając filtra 540 nm względem RPMI kompletnego z dodatkiem MTT i buforu lizującego jako próby ślepej. W metodzie tej, dzięki aktywności oksydoredukcyjnej mitochondriów, MTT zostaje zredukowany do formazanu. Obserwowana przy tym zmiana barwy z żółtej na purpurową jest wprost proporcjonalna do ilości zredukowanego MTT i pośrednio przekłada się na ilość żywych komórek oraz poziom ich proliferacji w hodowli. Za podstawę pomiaru intensywności proliferacji przyjęto średnią z trzech powtórzeń dla danego stężenia substratu, natomiast miarą tempa proliferacji były indeksy proliferacyjne, wyliczane wg wzoru: IP = OD dla próby badanej --------------------------------------OD dla kontroli Doświadczenie 2. Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy anty-ro-IFN-τ do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ Poliklonalną surowicę anty-roINF-tau uzyskano przez immunizację dwóch królików ro-IFN-τ Immunizację prowadzono podłopatkowo, pierwszą dawkę podano wraz z pełnym adiuwantem Freunda (0,1 mg ro-IFN-τ w 100 µl PBS + 100 µl adiuwantu Freunda) a następne w odstępach dwutygodniowych, z niekompletnym adiuwantem Freunda. W sumie immunizację przeprowadzono pięciokrotnie. Miano otrzymanej surowicy anty-roIFN-τ w teście immunodyfuzji radialnej z 1 μg IFN-τ wynosiło 128 __________________________________________________________________________ 40 _____________________________________________________________________________ jednostek. Surowice kontrolną uzyskano od zwierząt, którym podawano adiuwant z PBS (bez IFN-τ) według schematu analogicznego do schematu immunizacji. Część uzyskanych surowic wysolono 50% siarczanem amonu. Po wysoleniu ponownie sprawdzono miano frakcji γ-globulinowej anty-IFN-τ i wynosiło ono. Do rozpoczęcia doświadczenia rozampułkowane surowice przechowywano w temp. -80ºC. Znoszenie antyproliferacyjnego efektu interferonu przy użyciu króliczej poliklonalnej surowicy anty-ro-IFN-τ mierzono testem mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT opisanym wyżej. Podobnie jak poprzednio, hodowlę prowadzono na płytkach 96-dołkowych. Limfocyty stymulowane były Con A w stężeniu 2,67 μg/ml, a antyproliferacyjny efekt uzyskano przez zastosowanie IFN-τ w stężenia 6,7x101 ng/ml. Za wyjściową objętość surowic uznano 66,7 μl/ml (1:15), którą rozcieńczano w postępie geometrycznym od 1:30 do 1:480 przed wysoleniem i od 1:30 do 1:240 po wysoleniu. Doświadczenie 3. Wpływ ro-IFN-τ na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami transformacji blastycznej Celem doświadczenia było wyznaczenie subpopulacji limfocytów, której liczebność ulega zmianie pod wpływem IFN-τ. Immunofenotypizację limfocytów po hodowli in vitro wykonano metodą cytometrii przepływowej. Stężenia mitogenów były identyczne, jak w doświadczeniu 1, natomiast stężenie interferonu tau dla Con A wynosiło 67 ng/ml, a dla PHA i PWM 33 ng/ml. Po 72 godzinnej hodowli komórki przenoszono na nowe, U-denne, 96 dołkowe płytki, odpłukiwano z medium i zawieszano w PBS. W każdym dołku nowej płytki było około 2x105 komórek. Zastosowano barwienie pojedyncze, dwuetapowe. W pierwszym etapie użyto mysich przeciwciał monoklonalnych anty-CD4, anty-CD8, anty–TCR, anty-WC1, anty–IgM, anty-CD21 i anty-CD25. Specyfikację użytych przeciwciał podano w tabeli nr 2 (str. 38). Inkubację z przeciwciałami prowadzono w temp. 4ºC, przez 30 min. Następnie ich nadmiar usuwano przez zwirowanie (8 min. przy 350xg) i odpłukiwanie w PBS. Do drugiego etapu barwienia użyto odpowiednich przeciwciał antyizotypowych skoniugowanych z barwnikami fluorescencyjnymi (FITC lub RPE). Inkubację z przeciwciałami drugiej warstwy prowadzono w ciemności, w temperaturze 4 ºC, przez __________________________________________________________________________ 41 _____________________________________________________________________________ 30 min. Podobnie jak poprzednio, nadmiar przeciwciał usuwano przez zwirowanie (8 min. przy 350xg) i odpłukiwanie w PBS. Odczyt odbywał się tego samego dnia, a jeśli nie było takiej możliwości, komórki utrwalano w 2% roztworze formaliny w PBS i przechowywano w ciemności w temp 4ºC do czasu odczytu, nie dłużej jednak niż 7 dni. Odczyty wykonano na aparacie FACSCalibur (Becton Dickinson). Wszystkie rozcieńczenia przeciwciał wykonano zgodnie z zaleceniami producentów, w przeliczeniu na 2x105 komórek. Doświadczenie 4. Wpływ stężenia ro-IFN-τ na liczbę limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami transformacji blastycznej Celem doświadczenia było wyznaczenie progowego stężenia IFN-τ hamującego proliferację komórek Tγδ oraz sprawdzenie możliwości znoszenia jego działania przez poliklonalną króliczą surowicę przeciw rekombinowanemu owczemu IFN-τ. Immunofenotypizacja komórek przebiegała tak jak w doświadczeniu 2, z tą jednak różnicą, że limfocyty barwione były jedynie w kierunku receptorów TCRγδ i WC1. Badano wpływ malejących stężeń roIFN-τ (począwszy od 6,7x101 ng/ml do 6,67 x 10-3 ng/ml) na mierzoną fluorocytometrycznie transformację blastyczną indukowaną Con A i PHA. Doświadczenie 5. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności Con A i IFN-τ Celem doświadczenia było porównanie reaktywności komórek po mrożeniu z komórkami sprzed mrożenia i zawyrokowanie o ich potencjalnej przydatności do badania supernatantów. Do kriokonserwacji wybrano krew jednej jałówki, której limfocyty cechowała duża wrażliwość na IFN-τ. Wyizolowane komórki mononuklearne doprowadzono do koncentracji 1,4x106 komórek/ml PRMI kompletnego. Po 1,44 ml takiej zawiesiny przenoszono do krioprobówek i uzupełniano FCS i DMSO w ilości 0,18 ml. Delikatnie mieszano i przez 2 godziny przechowywano w temperaturze -20°C, następnie 24 godziny w -70°C a potem poddawano głębokiemu mrożeniu w ciekłym azocie. __________________________________________________________________________ 42 _____________________________________________________________________________ Rozmrażanie odbywało się wg następującej procedury. Probówki po wyciągnięciu z ciekłego azotu probówki przenoszono do łaźni wodnej o temp. 37°C, natychmiast po rozmrożeniu zawartość każdej z probówek nawarstwiano na 3 ml ogrzanego FCS i dalej inkubowano przez 5 min, następnie dolewano około 7 ml również ogrzanego kompletnego RPMI, delikatnie mieszano i zwirowywano przy 400xg, przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant usuwano, komórki pulowano, zawieszano w RPMI kompletnym i doprowadzano do żądanej koncentracji, uwzględniając ich żywotność. Z limfocytów przygotowanych w ten sposób zakładano hodowlę in vitro. Doświadczenia 6. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych Supernatanty znad hodowli in vitro 7–9 dniowych zarodków bydlęcych otrzymano z Instytutu Zootechniki w Balicach k./Krakowa, dzięki uprzejmości prof. dr hab. Lucyny Kąckiej-Książkiewicz. Zarodki produkowane były metodą kokultury z komórkami wątroby szczura (BRL), w objętości około 0,5 ml. Pojedyncza hodowla zawierała od 4 do 12 blastocyst. Nadsącze do czasu rozpoczęcia doświadczenia przechowywane były w temperaturze -70°C. Stężenie IFN-τ w nadsączach określono metodą hamowania efektu cytopatycznego powodowanego przez VSV2 na komórkach MDBK3 (Sparreboom i wsp., 1994). Za wzorzec przyjęto aktywność antywirusową znanych stężeń rekombinowanego owczego IFN-τ. Komórki MDBK hodowano na płytkach 96-dołkowych. Po uzyskaniu jednowarstwowej hodowli (monolayer) na poszczególne dołki nanoszono odpowiednie rozcieńczenia supernatantów i standardu. Tak przygotowaną hodowlę prowadzono jeszcze przez 24 godziny, dodawano zawiesinę wirusa VSV i hodowano przez następną dobę. Efekt cytopatyczny mierzono kolorymetrycznie, barwiąc płytki roztworem fioletu krystalicznego i odczytując OD przy 540 nm względem H2O. Badane supernatanty były rozcieńczane w proporcji od 1:2 do 1:128 w postępie co 4. Ilość interferonu w badanych próbach odczytywano z wykresu kalibracyjnego dla każdej płytki. Próg czułości metody wynosił, zależnie od płytki, od 0,063 do 0,125 ng/ml. 2 3 wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (IIiTD we Wrocławiu) ustalona linia komórkowa nerki bydła (IIiTD we Wrocławiu) __________________________________________________________________________ 43 _____________________________________________________________________________ Doświadczenie 7. Efekt dodatku supernatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów Celem doświadczenia było porównanie efektu działania roIFN-τ z interferonem zawartym w nadsączach znad hodowli zarodków na spontaniczną i indukowaną transformację blastyczną mrożonych limfocytów krwi obwodowej wybranej jałówki. Przygotowanie komórek do hodowli in vitro było identyczne jak w doświadczeniu 5. Z uwagi na małą objętość badanych nadsączy badano jedynie zmiany w ilości limfocytów TCRγδ+. Ogółem w różnych układach doświadczalnych przebadano 21 supernatantów. Do hodowli stymulowanych Con A supernatanty dodawane były w objętości od 4,16 do 75 µl na dołek, natomiast do komórek niestymulowanych dodawano jedynie 25 lub/i 50 µl nadsączu. Sposób analizy zarchiwizowanych wyników immunofenotypizacji limfocytów Immunofenotypizację komórek przy użyciu cytometru przepływowego oparto o pomiary ich wielkości, granularności i fluorescencji wzbudzonej związanej z użytym przeciwciałem. Uzyskane wyniki analizowano w programie CellQuest (Becton Dickinson). Rycina 14A przedstawia typowy rozkład parametrów FSC (wielkość) / SSC (granularność) komórek kontrolnych (inkubowanych w RPMI kompletnym), ryc. 14B charakterystyczna jest dla stymulacji limfocytów Con A lub PHA, natomiast ryc. 14C dla PWM. Po 72 godzinnej hodowli we wszystkich próbach na podstawie różnic w wielkości i granularności wyróżniano trzy populacje komórek: limfocyty małe, duże i martwe (odpowiednio bramka: R1, R2, R3). Następnie na podstawie pomiaru fluorescencji wzbudzonej dokonywano właściwej fenotypizacji komórek, określano ilość limfocytów określonej subpopulacji. Na rycinie 15 przedstawiono przykładowo intensywność fluorescencji wzbudzonej przez komórki o fenotypie TCRγδ+ (czytane odpowiednio w bramce R1, R2 i R3). Przyjęto, że komórki w bramce R1 to limfocyty spoczynkowe w fazie G0/G1 lub takie, które właśnie wyszły fazy G2/M. W bramce R2 zlokalizowane są limfocyty proliferujące, a w bramce R3 limfocyty martwe (apoptotyczne lub nekrotyczne). Podobną interpretację obrazu cytometrycznego limfocytów po stymulacji mitogenami przedstawił Schmid i wsp. (2000). __________________________________________________________________________ 44 _____________________________________________________________________________ Rycina 14. Zróżnicowanie morfologiczno – fizjologiczne limfocytów po 72 godzinnej hodowli in vitro A B zanieczyszczenia SSC - (granularność) SSC - (granularność) zanieczyszczenia R3 „martwe” R3 „martwe” R2 „duże” R2 „duże” R1 „małe” R1 „małe” FSC - (wielkość) FSC - (wielkość) C SSC - (granularność) zanieczyszczenia R3 „martwe” R2 „duże” R1 „małe” FSC - (wielkość) a) komórki kontrolne (hodowane w RPMI kompletnym) b) komórki stymulowane ConA lub PHA c) komórki stymulowane PWM Limfocyty małe – to komórki spoczynkowe lub zaraz po podziale Limfocyty duże - to limfoblasty, komórki pobudzone Rycina 15. Przykładowe obrazy fluorescencji wzbudzonej poszczególnych grup morfologiczno – fizjologicznych po wyznakowaniu przeciwciałami A B autofluorescencja – komórki niewyznakowane Limfocyty duże R4 fluorescencja wzbudzona komórki wyznakowane przeciwciałem FL-2 - (intensywność fluorescencji TCR-PE) SSC – (granularność) SSC – (granularność) Limfocyty małe R5 fluorescencja wzbudzona komórki wyznakowane przeciwciałem autofluorescencja – komórki niewyznakowane FL-2 - (intensywność fluorescencji TCR-PE) C __________________________________________________________________________ 45 _____________________________________________________________________________ SSC – (granularność) Limfocyty martwe R6 fluorescencja wzbudzona komórki wyznakowane przeciwciałem autofluorescencja – komórki niewyznakowane FL-2 - (intensywność fluorescencji TCR-PE) Bezwzględna liczba limfocytów poszczególnych subpopulacji była szacowana. Z każdej próby aparat zbierał po 10000 komórek. Ponieważ próby często były zanieczyszczone, w różnym stopniu, przez fragmenty komórek, które aparat traktował jako całe komórki, zastosowano „matematyczny threshold.” Ilość komórek w bramkach R1 R2 i R3 przeliczono proporcjonalnie, tak aby ich suma wynosiła 10000 (tab. 3). W efekcie wynikiem są ilości limfocytów w poszczególnych grupach morfologiczno– fizjologicznych w przeliczeniu na 10000 komórek. Proponowany sposób prezentacji wyników jest zbliżony do podawanego przez Dorn’a i wsp. (2002), pozwala on ponadto na wyliczanie, analogicznych jak w metodzie z MTT, indeksów prolifercyjnych osobnych dla limfoblastów, komórek spoczynkowych i martwych. Tabela 3 Przykładowy „matematyczny trash hold” Przed przeliczeniem Po przeliczeniu liczba limfocytów wybarwionych przeciwciałem ogólna liczba limfocytów R1 R2 R3 R4 R5 R6 3100 2600 3500 1700 500 300 9200 komórek liczba limfocytów wybarwionych przeciwciałem ogólna liczba limfocytów R1' 3370 R2' R3' 2826 3804 R4' 1848 R5' 543 R6' 326 R’ / 9200 x 10000 Ogólna liczba: R1- limfocytów małych; R2-limfocytów dużych; R3-limfocytów martwych. Liczba limfocytów wybarwionych przeciwciałem: R4-limfocytów małych; R5-limfocytów dużych; R6-limfocytów martwych. Na żółtym tle te sama próba w przeliczeniu na 10000 komórek czytanych przez cytometr. __________________________________________________________________________ 46 _____________________________________________________________________________ Sposób prezentacji i statystyczna analiza wyników Wyniki przedstawiono w postaci tabel z podaniem średniej, liczebności i błędu standardowego lub na wykresach ze średnimi arytmetycznymi i ich 95% przedziałami ufności. Istotność różnic między średnimi testowano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji i testu NIR Fishera. Przed analizą, w celu normalizacji rozkładów, dokonano transformacji danych. Dane procentowe przekształcono wg wzoru acsin√X, a pozostałe zlogarytmowano. Wszystkie obliczenia wykonano w programie Microsoft Excel i Statistica for Windows v. 6.0 (Statsoft). Za próg istotności statystycznej przyjęto p≤0,05. We wszystkich prezentowanych doświadczeniach wpływ mitogenów na limfocyty w hodowli in vitro odnoszono do kontroli, czyli komórek hodowanych jedynie w RPMI kompletnym. Natomiast wyniki uzyskane dla komórek stymulowanych mitogenami w obecności IFN-τ odnoszono do hodowli z odpowiednim mitogenem. Ponadto porównywano jeszcze efekt działania IFN-τ na niestymulowane komórki i wtedy wynik odnoszono do kontroli. __________________________________________________________________________ 47 _____________________________________________________________________________ IV Wyniki badań Doświadczenie 1. Wpływ ro-IFN-τ na indukowaną mitogenami tranformację blastyczną limfocytów w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT. Celem doświadczenia było wyznaczenie minimalnego stężenia IFN-τ wykazującego antyproliferacyjne działanie na stymulowane mitogenami limfocyty. Miarą intensywności proliferacji była odczytywana ekstynkcja. Użyte w doświadczeniu mitogeny (tj. Con A, PHA i PWM) stymulowały limfocyty do proliferacji. Przy użytych w eksperymencie stężeniach najsilniejszym stymulatorem była Con A, a najsłabszym PWM. Dla Con A indeks proliferacyjny wynosił średnio 4,12 (od 1,57 do 8,0; n=33); dla PHA 3,49 (od 1,55 do 7,08; n = 34) a dla PWM 1,83 (od 1,19 do 2,59; n = 22). Dla Con A i PHA doświadczenie zrealizowano w trzech seriach, a dla PWM w dwu. W pierwszej serii najniższym testowanym stężeniem IFN-τ było stężenie 6,67x10-3 ng/ml, w drugiej 3,33x10-3 ng/ml, a w trzeciej 6,7x10-4 ng/ml. Limfocyty poszczególnych jałówek wykazywały zróżnicowaną wrażliwość zarówno na IFN-τ, jak i na mitogeny (wykresy 1-3). Przy stymulacji Con A we wszystkich trzech seriach stężenie IFN-τ 6,7x10-2 ng/ml zmniejszała proliferację, średnio o 39 do 51% w stosunku do proliferacji z samym mitogenem (p≤0,01). Również niższe stężenia interferonu w indywidualnych przypadkach były efektywne. W 18 z 33 prób, przy stężeniu interferonu 6,7x10-3 ng/ml i w 9 z 18, przy stężeniu 3,33x10-3 ng/ml oraz w 2 na 10 przypadków przy stężeniu 6,67 x10-4 ng/ml intensywność proliferacji była niższa od 80% wyjściowej. Rzeczą dosyć charakterystyczną, obserwowaną zwłaszcza przy stężeniu 6,7x10-4 ng/ml, było osiąganie wyższego indeksu proliferacyjnego, niż w przypadku stymulacji samym mitogenem. Podobne tendencje widać przy stymulacji PHA, co obrazują wykresy. Wspólną cechą dla badanych mitogenów był fakt, iż stosowanie stężeń powyżej 6,7x101 ng/ml nie zwiększało hamowania proliferacji. Limfocyty stymulowane PWM nie tylko najsłabiej reagowały na mitogen, ale również na IFN-τ. Dopiero stężenie 6,7x100 ng/ml skutecznie i istotnie statystycznie hamowała proliferację (wykres 3). Stężenia poniżej 6,67x10-1 ng/ml hamowały proliferację w sposób zależny od stężenia. Liniowość tego zjawiska jest jednak cechą osobniczą, dlatego współczynnik __________________________________________________________________________ 48 _____________________________________________________________________________ korelacji Pearsona wyliczono osobno dla każdego osobnika z 3 serii doświadczenia (Con A i PHA) oraz 2 serii dla PWM. Wykres. 1 Wpływ różnych stężeń IFN-τ na proliferację limfocytów stymulowanych Con A mierzoną w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT. N=15 6,0 7,0 5,0 6,0 5,0 4,0 3,0 indeks proliferacyjny in d e k s p ro life ra c y jn y A *** *** 2,0 *** *** 1,0 *** *** 0,067 0,333 0,667 6,666 33,330 3,0 2,0 1,0 0,0 -3,000 0,0 0,007 4,0 66,660 -2,500 -2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000 0,500 1,000 log (stężenia INF-tau) stężenie INF-tau (ng / ml) B N=8 6,0 8,0 7,0 6,0 4,0 3,0 * 2,0 *** *** *** *** 1,0 *** *** indeks proliferacyjny in d eks p ro liferacyjn y 5,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0033 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 6,666 33,33 0,0 -3,5 66,66 -3 -2,5 -2 stężenie INF-tau (ng / ml) -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 log (stężenia INF-tau) C N=10 5,0 7,0 4,5 6,0 5,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 * *** *** *** *** *** *** *** 1,0 indeks proliferacyjny in d eks p ro liferacyjn y 4,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,5 0,0 0,0 0,00067 0,0033 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 stężenie INF-tau (ng / m l) 6,666 33,33 66,66 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 log (stężenia INF-tau) ___________________________________________________________________________ Symbole A, B i C oznaczają kolejne powtórzenia doświadczenia. Na wykresach po lewej stronie na czerwono przedstawiono proliferację stymulowanych ConA limfocytów inkubowanych w obecności różnych stężeń INF-tau * p≤ 0,05 ** p≤ 0,01 *** p≤ 0,001 względem komórek stymulowanych samym mitogenem (kolor niebieski) Po prawej stronie przedstawiono zależność liniową pomiędzy indeksem proliferacyjnym a log stęzenia INF-tau -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- __________________________________________________________________________ 49 _____________________________________________________________________________ Wykres 2. Wpływ różnych stężeń INF-tau na proliferację limfocytów stymulowanych PHA mierzoną w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT. N=15 6,00 6,0 5,00 5,0 4,00 4,0 3,00 *** *** 2,00 *** *** *** *** 1,00 indeks proliferacyjny in d e k s p ro lif e ra c y jn y A 3,0 2,0 1,0 0,00 0,0 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 6,666 33,33 66,66 -3 -2,5 -2 -1,5 stężenie INF-tau (ng / ml) -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 log (stężenia INF-tau) B N=8 5,00 6,0 4,50 5,0 3,50 3,00 2,50 ** 2,00 *** 1,50 *** *** 1,00 *** *** indeks proliferacyjny in d e k s p ro life ra c y jn y 4,00 4,0 3,0 2,0 1,0 0,50 0,0 -3,5 0,00 0,0033 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 6,666 33,33 66,66 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 1,5 log (stężenia INF-tau) stężenie INF-tau (ng / ml) N=10 4,00 4,5 3,50 4,0 3,00 3,5 2,50 2,00 1,50 * *** *** *** *** *** *** 1,00 0,50 indeks proliferacyjny in d e k s p ro lif e ra c y jn y C 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,00 0,00067 0,0033 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 stężenie INF-tau (ng / ml) 6,666 33,33 66,66 0,0 -4 -3 -2 -1 0 1 2 log (stężenia INF-tau) ___________________________________________________________________________________________________________________________ Symbole A, B i C oznaczają kolejne powtórzenia doświadczenia. Na wykresach po lewej stronie na czerwono przedstawiono proliferację stymulowanych PHA limfocytów inkubowanych w obecności różnych stężeń INF-tau * p≤ 0,05 ** p≤ 0,01 *** p≤ 0,001 względem komórek stymulowanych samym mitogenem (kolor niebieski) Po prawej stronie przedstawiono zależność liniową pomiędzy indeksem proliferacyjnym a log stężenia INF-tau -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- __________________________________________________________________________ 50 _____________________________________________________________________________ Wykres 3. Wpływ różnych stężeń INF-tau na proliferację limfocytów stymulowanych PWM mierzoną w teście mikromiareczkowania kolorymetrycznego z MTT. N=14 3,0 3,5 2,5 3,0 2,5 2,0 1,5 *** *** *** 1,0 0,5 indeks proliferacyjny in d e ks p ro life rac yjn y A 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 6,666 33,33 66,66 -3 -2,5 -2 -1,5 stężenie INF-tau (ng / ml) -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 log (stężenia INF-tau) B N=8 2,5 3,0 2,5 * 1,5 ** *** *** 1,0 0,5 indeks proliferacyjny in d e ks p ro liferac yjn y 2,0 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0033 0,0067 0,0667 0,3333 0,6666 6,666 stężenie INF-tau (ng / ml) 33,33 66,66 0,0 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 log (stężenia INF-tau) ____________________________________________________________________________________________________________________________ Symbole A, B i C oznaczają kolejne powtórzenia doświadczenia. Na wykresach po lewej stronie na czerwono przedstawiono proliferację stymulowanych mitogenem limfocytów inkubowanych w obecności różnych stężeń INFtau * p≤ 0,05 ** p≤ 0,01 *** p≤ 0,001 względem komórek stymulowanych samym mitogenem (kolor niebieski) Po prawej stronie przedstawiono zależność liniową pomiędzy indeksem proliferacyjnym a log stężenia INF-tau Korelację wyliczono pomiędzy log stężenia IFN-τ i indeksem proliferacyjnym dla każdej jałówki osobno. Przy stymulacji limfocytów con A współczynnik korelacji wahał się zakresie od 0,89 do 0,99 i we wszystkich 10 przypadkach był istotny statystycznie. Dla PHA u 10 z 11 osobników r wynosiło od 0,83 do 0,99. Natomiast limfocyty od jednej jałówki, w prawdzie odpowiedziały hamowaniem proliferacji pod wpływem IFN-τ, ale odpowiedź ta była prawie niezmienna w zakresie od 6,67x10-4 do 6,67x101 ng/dołek. Najniższe wartości współczynnika korelacji r zanotowano dla PWM i wynosił on od 0,73 do 0,98 i w dwu przypadkach korelacja ta była nie istotna statystycznie. __________________________________________________________________________ 51 _____________________________________________________________________________ Reasumując, za minimalne efektywne stężenie IFN-τ hamujące transformację blastyczną powodowaną ConA i PHA przyjęto 6,67x10-2 ng/ml. Przy tej koncentracji IFN-τ w 62 na 67powtórzeń hamował o minimum 15 a maksymalnie o 80% proliferację w stosunku do wyjściowej. Natomiast w przypadku stymulacji PWM za analogiczne stężenie uznano 6,67x100 ng/ml. Doświadczenie 2. Ocena przydatności poliklonalnej króliczej surowicy antyroINF-tau do znoszenia efektu antyproliferacyjnego IFN-τ Nieoczyszczone surowice, zarówno kontrolna jak i anty-IFN-τ, silnie stymulowały proliferację limfocytów. Indeksy proliferacyjne dla nierozcieńczonych surowic wynosił odpowiednio 2,11±0,150 i 2,85±0,355. Surowica anty-IFN-τ, co prawda znosiła antyproliferacyjny efekt interferonu przy mianach w zakresie 1:15 - 1:120, jednak przy tych samych mianach surowica kontrolna działa niemal identycznie (tab. 4A). Czyste frakcje γ-globulinowe, zwłaszcza nierozcieńczone, wykazywały nieznaczną aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek niestymulowanych, ale ich dodatek ich w rozcieńczeniach od 1:60 do 1:240 nie wpływał istotnie statystycznie na stymulację limfocytów Con A. Dodatek oczyszczonej frakcji globulinowej surowicy normalnej pogłębiał jedynie antyproliferacyjne działanie IFN-τ (tab. 4B).Znoszenie efektu antyproliferacyjnego IFN-τ obserwowano natomiast przy wszystkich rozcieńczeniach frakcji globulinowej surowicy anty-roIFN-τ, najsilniej przy mianie 1:120, rozcieńczenie to uznano za optymalne do wykorzystania w późniejszych eksperymentach. Tabela 4. Znoszenie efektu antyproliferacyjnego IFN-τ przy użyciu poliklonalnej króliczej surowicy anty-roINF-tau mierzona testem kolorymetrycznym z MTT A) przed wysoleniem n=9 a) kontrolna surowica normalna (SN) ConA ConA +IFN-tau SN 1 : 15 3,54±0,455 *** 1,31±0,220 ** 2,11±0,150 *** SN 1 : 15 SN 1 : 30 3,67±0,396 *** 3,77±0,450 *** ConA + INF-tau SN SN 1 : 60 1 : 120 3,02±0,400 *** 2,22±0,286 ** SN 1 : 240 SN 1 : 480 1,59±0,222 1,73±0,210 __________________________________________________________________________ 52 _____________________________________________________________________________ b) surowica anty-roINF-tau (Ab) ConA ConA +IFN-tau Ab 1 : 15 3,54±0,455 *** 1,31±0,220 ** 2,85±0,355 *** ConA + INF-tau Ab Ab 1 : 60 1 : 120 Ab 1 : 15 Ab 1 : 30 3,62±0,300 *** 3,96±0,401* ** 3,36±0,463 *** 2,44±0,443 * Ab 1 : 240 Ab 1 : 480 1,98±0,292 1,86±0,280 B) po wysoleniu n=8 a) frakcja globulinowa kontrolnej surowicy normalnej (SN) ConA ConA IFN 4,35± 0,654 *** 1,14± 0,264 *** b) SN 1 : 15 0,77± 0,053 ** SN 1 : 30 0,86± 0,074 kontrola SN SN 1 : 60 1 : 120 0,98± 0,94± 0,078 0,060 SN 1 : 240 1,01± 0,044 SN 1 : 60 4,05± 0,641 ConA SN 1 : 120 4,33± 0,583 SN 1 : 240 4,26± 0,623 SN 1 : 15 0,99± 0,225 * SN 1 : 30 1,04± 0,253 ConA+INF-tau SN SN 1 : 60 1 : 120 0,99± 1,05± 0,225 0,259 * SN 1 : 240 1,04± 0,269 * frakcja globulinowa surowicy anty-roINF-tau (Ab) ConA ConA IFN 4,35± 0,654 *** 1,14± 0,264 *** kontrola ConA ConA+INF-tau Ab 1 : 15 Ab 1 : 30 Ab 1 : 60 Ab 1 : 120 Ab 1 : 240 Ab 1 : 60 Ab 1 : 120 Ab 1 : 240 Ab 1 : 15 Ab 1 : 30 Ab 1 : 60 Ab 1 : 120 Ab 1 : 240 0,85± 0,031 ** 0,86± 0,046 * 0,92± 0,064 0,99± 0,073 1,05± 0,077 4,22± 0,663 4,20± 0,662 4,34± 0,662 1,38± 0,225 ** 1,41± 0,221 ** 3,81± 0,605 *** 4,31± 0,586 *** 2,70± 0,291 *** Podane wartości są indeksami proliferacyjnymi ± SE Nierozcieńczona surowica anty-roIFN-tau (1:0) = 10 µl / dołek Różnice istotne statystycznie * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 ConA; SN; Ab vs komórki niestymulowane (kontrola) ConA+INF-tau vs ConA ConA+Ab vs ConA ConA+SN vs ConA ConA+INF-tau+SN vs ConA+INF-tau ConA+INF-tau+Ab vs ConA+INF-tau Doświadczenie 3. Wpływ ro-IFN-τ na frekwencję limfocytów TCD4, TCD8, Tγδ i B oraz ekspresję receptora CD25 w spontanicznej i indukowanej mitogenami transformacji blastycznej. Wpływ IFN-τ na frekwencję badanych subpopulacji limfocytów stymulowanych in vitro mitogenami przebadano na 27 osobnikach w przypadku Con A i PHA oraz na 23 dla PWM. Stymulacja limfocytów Con A nie zmieniała składu odsetkowego poszczególnych subpopulacji limfocytów w porównaniu do hodowli kontrolnej (tab. 5) Natomiast pod wpływem traktowania IFN-τ komórek stymulowanych Con A obserwowano niższy procent limfocytów Tγδ (p≤0,01) oraz minimalnie wyższy procent limfocytów B IgM+ (p≤0,05). PHA wpływało na wzrost ilości limfocytów Tγδ (p≤0,01) oraz B IgM+ (p≤0,05). Łączna inkubacja komórek z PHA i IFN-τ skutkowała jedynie dalszym wzrostem odsetka limfocytów B IgM+ z 13,7±2,27% do 27,2±4,06% (p≤0,01). __________________________________________________________________________ 53 _____________________________________________________________________________ Tab. 5 Wpływ mitogenów i IFN-τ na skład procentowy poszczególnych subpopulacji limfocytów w hodowli in vitro. a) dla Con A i PHA b) dla PWM procent limfocytów (średnia ± SEMa) procent limfocytów (średnia ± SEMa) status status CD4 n=13 CD8 n=13 TCR n=26 WC1 n=8 IgM n=10 CD21 n=4 CD25 n=5 kontrola 30,4 ± 2,78 23,3 ± 0,99 38,7 ± 1,44 28,3 ± 2,83 8,7 ± 1,03 10,8 ± 1,64 9,1 ± 2,14 ConA 30,1 ± 2,25 25,9 ± 1,51 43,0 ± 2,20 34,3 ± 3,26 9,8 ± 1,17 14,7 ± 2,99 78,2 ± 4,60 ConA +IFN-tau 33,1 ± 1,44 27,6 ± 1,62 35,4 ± 1,82** 28,1 ± 2,41 13,3 ± 1,19* 15,7 ± 2,45 71,7 ± 4,49 PHA 24,4 ± 1,95 25,0 ± 1,44 52,8 ± 2,29** nb 15,3 ± 2,16* 13,7 ± 2,27 63,0 ± 3,22 PHA +IFN-tau 29,9 ± 2,65 26,3 ± 1,47 48,9 ± 1,87 nb 27,8± 2,71*** 27,2 ± 4,06 54,8 ± 2,93 IFN-tau 28,6 ± 1,59 22,4 ± 1,21 33,3 ± 1,66 nb 9,3 ± 1,02 11,7 ± 2,02 10,2 ± 1,88 * różnica istotna przy p≤0,05 ** różnica istotna przy p≤0,01 *** różnica istotna przy p≤0,001 a – błąd standardowy nb- nie badano CD21 i CD25 z uwagi na niską liczebność powtórzeń nie testowano statytycznie CD4 n=16 CD8 n=16 TCR n=23 IgM n=12 CD21 n=4 CD25 n=4 kontrola 30,5 ± 2,39 22,9 ± 1,15 38,7 ± 1,57 7,7 ± 1,10 10,8 ± 1,64 10,4 ± 2,18 PWM 22,6 ± 1,01** 21,8 ± 1,53 47,3 ± 2,18** 7,3 ± 0,71 9,9 ± 2,56 74,8 ± 2,90 PWM +IFN-tau 23,7 ± 1,43 20,7 ± 1,87 46,7 ± 2,30 6,0 ± 0,63 8,1 ± 1,60 65,5 ± 4,24 IFN-tau 29,4 ± 1,46 22,0 ± 1,17 32,9 ± 1,72 8,2 ± 1,00 11,7 ± 2,02 11,2 ± 2,06 Dla: ConA; PHA; PWM i IFN-tau względem kontroli ConA + IFN-tau względem ConA PHA + IFN-tau względem PHA PWM + IFN-tau względem PWM Do zupełnie innych wniosków prowadzi analiza cytometryczna uwzględniająca typ morfologiczny i fizjologiczny komórek (tab. 6). W hodowli w RPMI kompletnym (kontroli) na 10000 analizowanych komórek, średnio prawie połowę stanowiły limfocyty martwe: 4910 dla Con A i PHA, 4227 dla PWM. Żywe, małe limfocyty (spoczynkowe) stanowiły odpowiednio 4450 i 5112, a duże (limfoblasty) 639 i 661. Dodatek do hodowli Con A lub PHA skutkował pojawieniem się znacznej liczby komórek blastycznych i spadkiem ilości limfocytów małych, przy czym ich łączna ilość wzrastała tylko nieznacznie. W przypadku PWM obserwowano jedynie nieznaczny wzrost liczby limfoblastów, przy równoczesnym spadku liczby limfocytów małych i ogólnej liczebności komórek żywych. Traktowanie komórek stymulowanych Con A i PHA IFN-τ prowadziło do zmniejszenia zarówno liczby limfocytów małych i dużych, jak i do wysoce istotnego statystycznie wzrostu liczby komórek martwych. Z kolei hodowla limfocytów niestymulowanych mitogenem, ale traktowanych samym interferonem w zasadzie nie powodowała zmian we frekwencji poszczególnych grup morfologicznych komórek. __________________________________________________________________________ 54 _____________________________________________________________________________ Tabela 6. Wpływ IFN-τ na frekwencję limfocytów stymulowanych różnymi mitogenami po 72 godzinnej inkubacji in vitro ConA (n=27) średnia ± SEMa na 10000 analizowanych komórek PHA (n=27) małe 4450,3 ± 245,80 4450,2 ± 245,80 5112,2 ± 233,05 duże 639,6 ± 39,14 639,6 ± 39,14 661,1 ± 41,01 łącznie duże i małe 5089,9 ± 251,71 5089,9 ± 251,71 5773,2 ± 209,65 martwe 4910,1 ± 251,71 4910,1 ± 251,71 4226,8 ± 209,65 małe 1517,9 ± 98,90*** 1548,7 ± 73,67*** 2914,6 ± 171,75*** duże status kontrola mitogen mitogen + IFN-tau IFN-tau * ** *** limfocyty PWM (n=23) 3915,3 ± 324,56*** 3628,2 ± 231,86*** 1153,7 ± 78,48*** łącznie duże i małe 5433,2 ± 324,76 5176,9 ± 252,85 4068,3 ± 157,65*** martwe 4566,8 ± 324,76 4823,1 ± 252,85 5931,7 ± 157,65*** 3452,0 ± 182,99* małe 1929,6 ± 121,08** 1669,6 ± 92,58 duże 1870,8 ± 158,45*** 1753,3 ± 107,73*** 872,8 ± 68,47* łącznie duże i małe 3800,4 ± 212,74*** 3422,9 ± 180,30*** 4324,8 ± 171,35 martwe 6199,6 ± 212,74*** 6577,1 ± 180,30*** 5675,2 ± 171,35 małe 4102,1 ± 186,29 4102,1 ± 186,29 4739,7 ± 182,94 duże 490,3 ± 37,73 490,3 ± 37,73** 476,8 ± 37,14** łącznie duże i małe 4592,4 ± 194,64 4592,4 ± 194,64 5216,5 ± 164,74 martwe 5407,6 ± 194,64* 5407,6 ± 194,64 4783,5 ± 164,74* różnica istotna przy p≤0,05 różnica istotna przy p≤0,01 różnica istotna przy p≤0,001 Dla: ConA; PHA; PWM i IFN-tau; względem kontroli mitogen + IFN-tau względem mitogenu a – błąd standardowy Analiza fenotypów komórek w analizowanych hodowlach pozwala dostrzec wybiórcze działanie IFN-τ. Wskazuje ona, że w przypadku stymulacji limfocytów Con A proliferowały zarówno limfocyty T (CD4+, CD8+ i Tγδ), jak i limfocyty B IgM+. Podobnie było w przypadku PHA, z tą jednak różnicą ze nie wykazano istotnego statystycznie wzrostu ilości limfocytów B. W obydwu przypadkach dominującą subpopulacją w obrębie blastów były limfocyty Tγδ, stanowiące odpowiednio 49,3±2,99% i 58,9±2,66%. Hodowla limfocytów w obecności Con A i IFN-τ prowadziła do wysoce istotnego statystycznie spadku ilości tej populacji w obrębie limfoblastów i nieznacznego, choć również istnego wzrostu w obrębie limfocytów małych i martwych. Poza tym IFN-τ powodował spadek ilości dużych komórek o fenotypie CD4+. Stymulacja limfocytów PHA z równoczesnym traktowaniem IFN-τ, podobnie jak w poprzednim przypadku wykazała jego silny, antyproliferacyjny wpływ głównie na populację limfocytów Tγδ. Ponadto stwierdzono słabszy, ale również istotny antyproliferacyjny wpływ na limfocyty CD4+ i CD8+. __________________________________________________________________________ 55 _____________________________________________________________________________ Tabela 7. Liczebność limfocytów różnicowanych na podstawie morfologii po 72 godzinnej inkubacji z Con A i IFN-τ liczba limfocytów na10000 analizowanych (średnia ± SEM) status limfocyty CD4 n=13 kontrola ConA ConA + IFN-tau IFN-tau * ** *** CD8 n=13 TCR n=26 WC1 n=8 IgM n=10 CD21 n=4 CD25 n=5 małe 1586,5 ± 173,49 1166,5 ± 71,9 1648,0 ± 135,61 1108,6 ± 321,88 304,6 ± 40,49 360,9 ± 16,27 215,9 ± 59,20 duże 173,0 ± 14,78 171,2 ± 24,48 377,2 ± 30,63 189,2 ± 11,08 194,3 ± 29,17 182,7 ± 29,16 250,2 ± 83,81 łącznie duże i małe 1759,5 ± 169,42 1337,6 ± 60,52 2035,5 ± 140,69 1297,7 ± 327,18 498,9 ± 64,53 543,6 ± 25,27 466,1 ± 142,52 martwe 564,3 ± 53,93 556,4 ± 57,86 570,6 ± 47,99 388,1 ± 61,12 2077,4 ± 182,01 198,9 ± 31,29 217,0 ± 41,31 małe 752,9 ± 90,54*** 404,1 ± 56,6*** 472,6 ± 36,49*** 373,0 ± 84,65** 220,2 ± 26,33 400,8 ± 100,72 645,0 ± 120,07 duże 1006,8 ± 156,9*** 1112,4± 130,1*** 1980,8 ± 212,3*** 1060,6 ± 266,7*** 331,6 ± 52,15** 438,2 ± 86,22 3904,3 ± 616,72 łącznie duże i małe 1759,8 ± 143,48 1516,5 ± 94,38 2453,4 ± 225,15 1433,6 ± 337,32 551,8 ± 62,19 839,0 ± 103,98 4549,2 ± 600,72 martwe 882,5 ± 126,85* 756,5 ± 78,02 585,1 ± 58,89 487,3 ± 162,57 2261,5 ± 220,59 330,5 ± 62,10 689,3 ± 100,57 małe 784,2 ± 101,69 379,2 ± 56,6 685,1 ± 49,33** 458,2 ± 115,47 296,0 ± 41,26 486,1 ± 73,47 912,1 ± 188,79 duże 640,4 ± 96,23* 813,4 ± 117,58 669,0 ± 67,60*** 382,1 ± 84,60*** 219,7 ± 21,13 271,1 ± 27,69 2458,0 ± 379,00 łącznie duże i małe 1424,6 ± 102,52 1192,6 ± 101,04 1354,1 ± 103,1*** 840,4 ± 179,19 515,7 ± 46,39 757,3 ± 93,04 3370,1 ± 472,66 martwe 983,3 ± 117,87 1013,5 ± 143,06* 970,3 ± 66,33*** 541,7 ± 169,23 3030,7 ± 238,32* 412,1 ± 42,16 804,5 ± 43,13 małe 1380,3 ± 125,29 1043,3 ± 88,6 1293,0 ± 97,34* 607,5 ± 118,58 328,3 ± 41,83 395,7 ± 26,96 340,2 ± 71,46 duże 120,2 ± 11,70* 126,0 ± 17,23 256,0 ± 28,87** 118,3 ± 13,38 141,0 ± 13,49 164,4 ± 24,62 154,8 ± 51,46 łącznie duże i małe 1500,5 ± 124,05 1169,4 ± 86,12 1571,2 ± 104,22* 725,9 ± 128,42 469,2 ± 50,19 560,1 ± 50,52 495,1 ± 121,92 martwe 620,2 ± 69,64 653,9 ± 79,11 882,2 ± 76,73*** 698,9 ± 150,28 2246,8 ± 172,88 201,4 ± 40,49 281,0 ± 54,93 różnica istotna przy p≤0,05 różnica istotna przy p≤0,01 różnica istotna przy p≤0,001 Dla: ConA i IFN-tau; względem kontroli ConA + IFN-tau względem mitogenu a – błąd standardowy Intensywność proliferacji limfocytów pod wpływem PWM, mimo testowania różnych stężeń mitogenu (dane nie prezentowane) zawsze była słaba. Nie mniej jednak kontrolne barwienie komórek na obecność receptora CD25 wykazało że pod wpływem PWM dochodziło do wzrostu liczby limfocytów CD25+ (średnia 550±147 w grupie kontrolnej do 3079±377 w grupie stymulowanej) i tym samym udowodniono aktywność mitogenu. Stymulacja limfocytów PWM powodowała zwiększenie ilości blastów o fenotypie CD4+ i CD8+, ale nie TCRγδ+ oraz wzrost łącznej ilości limfocytów B (IgM+). Interferon tau w tym przypadku wpłynął jedynie na nieznaczny spadek ilości dużych limfocytów TCRγδ+. Wpływ IFN-τ na niestymulowane limfocyty widoczny był praktycznie jedynie w obrębie subpopulacji Tγδ, co wyrażało się spadkiem ilości limfocytów małych i dużych oraz wzrostem ilości limfocytów martwych. __________________________________________________________________________ 56 _____________________________________________________________________________ Tabela 8. Liczebność limfocytów różnicowanych na podstawie morfologii po 72 godzinnej inkubacji z PHA i IFN-τ liczba limfocytów na10000 analizowanych (średnia ± SEM a) status kontrola PHA PHA + IFN-tau IFN-tau limfocyty CD4 n=13 CD8 n=13 TCR γδ n=26 IgM n=10 CD21 n=4 CD25 n=5 małe 1586,5 ± 173,49 1166,5 ± 71,94 1648,0 ± 135,61 304,6 ± 40,49 360,9 ± 16,27 215,9 ± 59,2 duże 173,0 ±14,78 171,2 ± 24,48 387,5 ± 34,14 194,3 ± 29,17 182,7 ± 29,16 250,2 ± 83,8 łącznie duże i małe 1759,5 ± 169,42 1337,6 ± 60,52 2035,5 ± 140,69 498,9 ± 64,53 543,6 ± 25,27 466,1 ± 142,5 martwe 564,3 ± 53,93 556,4 ± 57,86 570,6 ± 47,99 2077,4 ± 182,01 198,9 ± 31,29 217,0 ± 41,3 małe 507,4 ± 37,53*** 381,4 ± 37,31*** 623,2 ± 42,84*** 288,8 ± 37,55*** 389,2 ± 43,42 403,6 ± 53,3 duże 835,6 ± 68,08*** 1024,6 ± 78,73*** 2194,4 ± 200,4*** 527,5 ± 64,52 312,1 ± 56,65 2831,2 ± 276,9 łącznie duże i małe 1343,0 ± 80,57* 1406,0 ± 89,81 2817,5 ± 217,77** 816,3 ± 97,71 701,3 ± 63,57 3234,8 ± 322,4 martwe 936,4 ± 162,69* 827,8 ± 111,44* 568,5 ± 49,17 2450,1 ± 253,76 365,9 ± 88,56 597,5 ± 97,2 małe 531,8 ± 84,58 334,3 ± 42,55 760,4 ± 58,42 436,6 ± 44,34* 547,4 ± 79,96 624,2 ± 150,0 duże 531,2 ± 68,63*** 617,0 ± 49,97** 934,5 ± 81,04*** 556,9 ± 54,13 357,3 ± 47,42 1264,4 ± 168,4 łącznie duże i małe 1063,0 ± 83,03* 951,3 ± 68,20*** 1694,9 ± 125,2*** 993,5 ± 83,06 904,7 ± 100,41 1888,6 ± 306,8 martwe 1194,7 ± 152,11 1230,4 ± 161,12* 1029,6 ± 70,58* 3792,4 ± 244,77 585,7 ± 135,12 783,2 ± 113,6 małe 1380,3 ± 125,29 1043,3 ± 88,61 1293,0 ± 97,34* 328,3 ± 41,83 395,7 ± 26,96 340,2 ± 71,5 duże 120,2 ± 11,70 126,0 ± 17,23 278,2 ± 34,41** 141,0 ± 13,49 164,4 ± 24,62 154,8 ± 51,5 łącznie duże i małe 1500,5 ± 124,05 1169,4 ± 86,12 1571,2 ± 104,22* 469,2 ± 50,19 560,1 ± 50,52 495,1 ± 121,9 martwe 620,2 ± 69,64** 653,9 ± 79,11 882,2 ± 76,73* 2246,8 ± 172,88 201,4 ± 40,49 281,0 ± 54,9 * różnica istotna przy p≤0,05 ** różnica istotna przy p≤0,01 a – błąd standardowy *** różnica istotna przy p≤0,001 CD21 i CD25 z uwagi na niską liczebność powtórzeń nie testowano statystyczni Dla: PHA i IFN-tau względem kontroli PHA + IFN-tau względem PHA Tabela 9. Liczebność limfocytów różnicowanych na podstawie morfologii po 72 godzinnej inkubacji z PWM i IFN-τ liczba limfocytów na10000 analizowanych (średnia ± SEM a) status kontrola PWM PWM + IFN-tau IFN-tau limfocyty CD4 n=16 CD8 n=16 TCR γδ n=23 IgM n=12 CD21 n=4 CD25 n=4 małe 1643,7 ± 144,3 1206,4 ± 88,81 1838,2 ± 134,1 292,6 ± 37,08 360,9 ± 16,27 253,8 ± 58,72 duże 157,6 ± 15,90 148,2 ± 23,29 422,0 ± 32,65 168,4 ± 29,71 182,7 ± 29,16 297,0 ± 89,73 łącznie duże i 1801,3 ± 140,5 małe 1354,6 ± 80,65 2260,2 ± 128,4 461,0 ± 62,07 543,6 ± 25,27 550,8 ± 147,95 martwe 589,0 ± 62,75 522,32 ± 51,48 489,9 ± 51,78 1964,4 ± 187,2 198,9 ± 31,29 254,4 ± 22,52 małe 717,1 ± 55,5*** 458,0 ± 47,6*** 1526,5 ± 111,6 184,2 ± 18,62 279,0 ± 72,20 1841,9 ± 249,4 duże 250,1 ± 25,62** 466,7 ± 69,4*** 420,5 ± 34,72 128,2 ± 21,57 95,2 ± 13,95 1237,2 ± 276,9 łącznie duże i 967,2 ± 45,9*** małe 924,7 ± 63,4*** 1947,0 ± 130,5 312,4 ± 29,78* 374,3 ± 84,45 3079,1 ± 377,9 martwe 927,1 ± 70,9*** 850,25 ± 76,0** 967,7 ± 97,1*** 2448,7 ± 201,1 375,2 ± 27,22 1100,3 ± 125,6 małe 853,2 ± 74,05 578,7 ± 87,95 1709,1 ± 113,9 174,8 ± 16,59 257,7 ± 33,78 1849,1 ± 281,5 duże 221,9 ± 27,47 366,8 ± 67,46 318,2 ± 31,09* 98,0 ± 12,09 73,7 ± 10,70 989,9 ± 157,57 łącznie duże i 1075,0 ± 63,74 małe 945,5 ± 91,54 2027,3 ± 127,3 272,8 ± 22,98 383,9 ± 59,63 2839,0 ± 355,2 martwe 804,4 ± 84,56 841,51 ± 88,88 1028,9 ± 116,2 2404,6 ± 205,4 257,9 ± 48,23 771,3 ± 54,01 małe 1501,5 ± 126,2 1087,4 ± 84,89 1454,0 ± 86,26* 316,0 ± 39,46 395,7 ± 26,96 381,4 ± 75,40 duże 107,4 ± 12,04* 107,3 ± 17,19 266,4 ± 30,6*** 124,1 ± 14,99 164,4 ± 24,62 179,8 ± 58,11 łącznie duże i 1608,8 ± 121,1 małe 1194,7 ± 81,22 1720,4 ± 82,6** 440,1 ± 48,78 560,1 ± 50,52 561,2 ± 132,26 martwe 622,18 ± 66,35 765,2 ± 77,85** 1904,8 ± 191,6 201,4 ± 40,49 322,3 ± 46,75 593,7 ± 59,34* * różnica istotna przy p≤0,05 ** różnica istotna przy p≤0,01 *** różnica istotna przy p≤0,001 a – błąd standardowy CD21 i CD25 z uwagi na niską liczebność powtórzeń nie testowano statystyczni Dla: PWM i IFN-tau względem kontroli PWM + IFN-tau względem PWM __________________________________________________________________________ 57 _____________________________________________________________________________ Doświadczenie 4. Wpływ stężenia rekombinowanego IFN-τ na ilość limfocytów Tγδ w indukowanej mitogenami transformacji blastycznej Ponieważ stymulacja limfocytów z użyciem PWM była bardzo słaba oraz nie wykazano w tym przypadku różnic spowodowanych IFN-τ, kolejne doświadczenie przeprowadzono jedynie dla Con A i PHA. Z uwagi na fakt, że większość zmian wykazanych w poprzednim doświadczeniu dotyczyła populacji limfocytów Tγδ, w dalszych analizach ograniczono się jedynie do tej subpopulacji. Dla Con A przebadano 8 osobników, testując zarówno frekwencję limfocytów z receptorem TCRγδ jak i WC1, a dla PHA 6 jałówek oceniając tylko zmiany w ilości limfocytów TCRγδ+. Stężenie IFN-τ zmniejszano w postępie logarytmicznym od 6,7x101 ng/ml do 6,7x10-3 ng/ml. Podobnie jak w doświadczeniu nr 3 wykazano, że stymulacja limfocytów zarówno Con A, jak i PHA powodowała wzrost ilości limfoblastów, przy jednoczesnym spadku ilości limfocytów małych (tab. 10). Dodatek interferonu zmieniał sytuację, na odwrotną wywołując w wyższych stężeniach istotny efekt antyproliferacyjny, manifestujący się statystycznie znaczącym spadkiem liczby limfoblastów, przy jednoczesnych nieistotnych zmianach w liczebności komórek spoczynkowych. Analiza tych danych wskazuje, że ostatnim hamującym stężeniem interferonu w przypadku Con A jest stężenie 6,7x10-2 ng/ml, natomiast w przypadku PHA jest ono o rząd wielkości wyższe (6,7x10-1 ng/ml). W toku doświadczenia stwierdzono dość dużą zmienność osobniczą, głównie w zakresie reakcji na niskie stężenia IFN-τ. Podobne zależności ujawnia głębsza analiza pod kątem fenotypów TCRγδ+ i WC1+ (tab. 11). Także w tym przypadku zaobserwowano zależny od stężenia antyproliferacyjny charakter IFN-τ na hodowle stymulowane mitogenami, który dotyczył zarówno limfoblastów TCRγδ+, jak i WC1+. Tabela 10. Wpływ stężenia IFN-τ na frekwencję limfocytów po 72 godzinnej stymulacji Con A i PHA in vitro. a)Con A (n = 8) Con A mitogen 0 0 stężenie IFNtau (ng/ml) 0 0 6,67x101 6,67x10-1 6,67x10-2 6,67x10-3 6,67x101 limfocyty małe 3861,0±627,44 1313,4±225,09 *** 1668,9±318,06 1647,6±372,42 1432,8±309,40 1357,5±257,74 3435,4±441,93 limfocyty duże 511,6±60,04 2517,2±368,44 *** 1147,0±158,38 *** 1168,0±147,89 *** 1600,5±311,10 * 2004,9±296,15 365,5±37,00 limfocyty martwe 5627,4±642,19 6169,3±532,23 7184,1±457,81 7184,4±425,51 6966,7±482,71 6637,5±501,41 6199,0±458,19 __________________________________________________________________________ 58 _____________________________________________________________________________ b)PHA (n = 6) PHA mitogen 0 stężenie IFNtau (ng/ml) 0 limfocyty małe 2951,9±256,37 limfocyty duże 498,7±74,32 limfocyty martwe 6549,4±294,24 0 1439,4±215,69 ** 2073,3±225,77 *** 6487,3±417,02 0 6,67x101 6,67x10-1 6,67x10-2 6,67x10-3 6,67x101 1174,0±224,28 1161,3±167,79 1180,1±204,29 1184,5±216,51 2874,1±279,50 1126,4±119,29 ** 1256,1±180,63 ** 1537,9±240,91 1711,0±249,80 338,2±40,35 7699,6±338,34 7582,6±313,69 7282,0±419,38 7104,6±450,25 6787,7±294,38 Tabela 11. Wpływ stężenia IFN-τ na frekwencję i procent limfocytów TCR i WC1 po 72 godzinnej stymulacji mitogenami WC1 TCR γδ subpo -pulacja a) TCR γδ con A mitogen 0 stężenie IFNtau (ng/ml) 0 0 6,67x101 6,67x10-1 6,67x10-2 6,67x10-3 6,67x101 limfocyty małe 1488,4±295,56 444,8±72,77 *** 597,0±113,12 556,5±101,93 454,7±68,96 446,9±63,38 861,5±110,00 * limfocyty duże 256,3±39,56 1163,1±262,52 *** 432,8±96,47 *** 450,6±78,86 ** 657,4±133,02 * 962,4±228,51 187,0±28,67 limfocyty martwe 657,8±78,82 900,9±107,75 1120,0±118,25 1082,4±142,91 1041,1±124,43 1005,5±144,20 1166,2±172,80 * limfocyty małe 1108,1±321,97 385,2±79,57 *** 413,7±89,90 423,0±90,70 371,1±92,75 369,2±100,69 604,9±119,29 limfocyty duże 189,0±11,02 1060,0±266,81 *** 380,9±84,94 ** 433,0±±85,46 ** 645,2±143,44 p=0,06 980,3±237,04 117,9±13,53 limfocyty martwe 388,1±61,12 453,3±168,47 541,7±169,23 607,9±180,04 584,7±181,24 573,0±207,87 698,9±150,28 b) * ** *** Con A in vitro (n=8) 0 PHA (n=6) mitogen 0 stężenie IFNtau (ng/ml) 0 limfocyty małe 1089,9±152,89 limfocyty duże 239,2±44,83 limfocyty martwe 701,2±96,04 różnica istotna przy p≤0,05 różnica istotna przy p≤0,01 różnica istotna przy p≤0,001 PHA 0 581,1±110,27 ** 1320,1±197,17 ** 742,4±76,78 a 0 6,67x101 6,67x10-1 6,67x10-2 6,67x10-3 6,67x101 605,2±155,20 540,8±86,83 501,7±100,96 442,8±112,80 762,4±115,23 p>0,05 604,8±88,31 ** 683,6±145,23 ** 928,0±216,02 1027,2±223,54 169,5±35,57 1170,2±157,27 1005,4±120,25 925,2±127,76 881,6±115,35 1060,7±194,69 p>0,05 – błąd standard. Dla: Mitogen i IFN-tau vs kontrola Mitogen + IFN-tau vs Mitogen W tab. 12 i 13 przedstawiono wpływ poliklonalnej króliczej surowicy anty-roIFN-τ na poszczególne typy morfologiczne komórek jednojądrzastych krwi obwodowej oraz na limfocyty TCRγδ+ i WC1+. W zakresie ogólnej liczby limfocytów, znoszenie efektu działania IFN-τ przez surowicę jest słabo widoczne. Porównanie liczby limfoblastów inkubowanych w obecności ConA+IFN-τ +Ab – anty IFN-τ vs ConA + IFN-τ, wskazuje w prawdzie na wzrost ich liczby (922±76,95 vs 1349,8±178,65) ale jest on nie istotny statystycznie. W analogicznej sytuacji z użyciem PHA tendencja ta jest __________________________________________________________________________ 59 _____________________________________________________________________________ wyrażona silniej i jest istotna statystycznie przy p ≤0,01. Fenotypizacja komórek przeciwciałami antyTCRγδ i anty-WC1 potwierdziła, że komórkami docelowymi w krwi obwodowej dla IFN-τ są limfocyty γδ, a zwłaszcza populacja WC1. Przy użyciu obu mitogenów IFN-τ w obecności przeciwciała przywracał aktywność proliferacyjną te grupie komórek, w przypadku populacji WC1 niemal w 100% (653,1±153 z 697,8±164 blastocyst, przy wyjściowej 280±53; p<0,01). Na podstawie powyższych wyników, mając na względzie dużą zmienność osobniczą, zdecydowano się wyselekcjonować jedną jałówkę na której materiale prowadzono dalsze doświadczenia. Limfocyty wybranej jałówki były w hodowli in vitro wysoce wrażliwe na niskie stężenia IFN-τ. Wyraźne hamowanie proliferacji indukowanej Con A w jej przypadku widoczne było jeszcze przy stężeniu 3,33x10-3 ng IFN-τ na dołek. Tabela 12. Wpływ poliklonalnej króliczej surowicy (Ab) przeciw rekombinowanemu owczemu IFN-τ na mononuklearne komórki krwi obwodowej bydła w hodowli in vitro. a) b) w kombinacji z Con A limfocyty kontr. ConA ConA+IFN Ab ConA+Ab ConA+IFN+Ab małe 2951,9±256,37 996,8±110,81 1224,0±160,28 2468,0±213,11 1082,0±65,96 1031,2±73,12 duże 498,7±74,32 2084,6±288,14 922,0±76,95 594,8±135,68 1588,9±344,50 p>0,05 1349,8±178,65 p>0,05 martwe 6549,4±294,24 6918,6±264,80 7854,1±172,63 6937,2±261,42 7329,1±396,61 7619,0±220,21 w kombinacji z PHA limfocyty kontr. PHA PHA+IFN Ab PHA+Ab PHA+IFN+Ab małe 2951,9±256,37 1439,4±215,69 1174,0±224,28 2468,0±213,11 1233,4±160,49 1246,4±168,75 duże 498,7±74,32 2073,3±225,77 1126,4±119,29 594,8±135,68 1799,9±225,15 1772,1±230,19 * martwe 3450,6±294,24 3512,7±417,02 2300,4±338,34 3062,8±261,42 3033,3±373,77 3018,5±376,87 Istotność statystyczna testowano między grupami: Kontr. vs Ab; Mitogen vs Mitogen+Ab; Mitogen + IFN-τ vs Mitogen+ IFN-τ+AB __________________________________________________________________________ 60 _____________________________________________________________________________ Tabela 13. Wpływ poliklonalnej króliczej surowicy (Ab) przeciw rekombinowanemu owczemu IFN-τ na limfocyty TCR γδ i WC1 bydła w hodowli in vitro. a) w kombinacji z Con A liczba na 10000 komórek liczba na 10000 komórek WC1 TCR γδ Limfocyty małe ConA+IFN +Ab kontr. ConA ConA+IFN Ab ConA+Ab 1089,9±152,89 354,1±56,86 479,6±96,96 829,9±86,98 374,2±66,84 358,4±46,13 duże 239,2±44,83 770,9±71,72 295,3±45,35 238,5±23,10 570,3±87,65 532,2±100,64 ** martwe 701,2±96,0 860,9±142,7 1023,4±135,0 672,4±141,0 797,5±101,3 932,9±122,4 małe 623,2±57,69 272,7±28,71 293,3±58,67 653,6±75,50 279,6±41,51 293,5±27,73 duże 179,2±5,90 697,8±164,72 280,5±53,19 154,9±7,50 579,3±180,99 653,1±153,33 ** martwe 320,0±56,99 278,0±97,57 340,8±82,79 366,2±75,93 365,0±84,12 356,8±92,25 b) w kombinacji z PHA liczba na 10000 komórek TCR γδ limfocyty kontr. PHA PHA+IFN Ab PHA+Ab PHA+IFN+Ab małe 1089,9±152,89 581,1±110,27 605,2±155,20 829,9±86,98 445,3±77,58 453,5±73,50 duże 239,2±44,83 1336,8±188,73 604,8±88,31 238,5±23,10 1064,5±207,98 1118,0±176,47 ** martwe 701,2±96,04 742,4±76,78 1170,2±157,27 672,4±140,96 849,7±127,73 885,7±121,55 Istotność statystyczna testowano między grupami: Kontr. vs Ab; Mitogen vs Mitogen+Ab; Mitogen + IFN-τ vs Mitogen+ IFN-τ+AB Doświadczenie 5. Reaktywność kriokonserwowanych komórek mononuklarnych krwi obwodowej wybranej jałówki hodowanych in vitro w obecności ConA i IFN-τ Przed rozpoczęciem badań nad wpływem supernatantów znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych sprawdzono przydatność do tego celu limfocytów mrożonych. Doświadczenie w różnych kombinacjach powtórzono trzykrotnie, całość kombinacji przedstawiono w tabeli nr 14. Obserwowane reakcje na Con A i IFN-τ były zasadniczo podobne do obserwowanych poprzednio. Jednakże obserwowana proporcja ilościowa pomiędzy limfocytami żywymi a martwymi była znacząco przesunięta w kierunku tych drugich. Ponadto limfocyty te cechowały się minimum pięciokrotnie wyższą czułością na niskie stężenia IFN-τ. __________________________________________________________________________ 61 _____________________________________________________________________________ Tabela 14. Reaktywność i powtarzalność wpływu IFN-τ na limfocyty jałówki, której krew została poddana kriokonserwacji status limfocyty małe kontrola ConA ConA +INF-tau 6,67x101ng/ml ConA + INF-tau 6,67x100ng/ml ConA + INF-tau 6,67x10-1ng/ml ConA + INF-tau 6,67x10-2g/ml ConA + INF-tau 3,37x10-2ng/ml ConA + INF-tau 6,67x10-3 ng /ml ConA + INF-tau 6,67x10-4 ng /ml ConA + INF-tau 6,67x101ng/ml + Ab liczba limfocytów TCRγδ na 10000 komórek powt. I powt. II powt. III 385 480 368 duże 69 34 41 martwe 720 511 631 małe 372 359 236 duże 1257 1881 1709 martwe 384 211 238 małe 448 381 258 duże 705 873 732 martwe 249 269 347 małe 321 322 duże 796 783 martwe 359 321 małe 286 267 duże 833 716 martwe 320 374 małe 287 237 duże 936 811 martwe 308 293 małe 262 duże 933 martwe 289 małe 207 duże 1039 martwe 289 małe 290 duże 1398 martwe 300 małe 363 333 270 duże 1178 1812 1302 martwe 142 233 279 Doświadczenia 6. Określenie stężenia IFN-τ w supernatantach znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych Stężenie IFN-τ metodą pomiaru hamowania efektu cytopatycznego VSV określono w 21 supernatantach znad hodowli zarodków bydlęcych pochodzących z Instytutu Zootechniki w Balicach. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 15. Próg czułości metody, zależnie od płytki, wynosił 63 – 125 pg/ml, a oznaczane stężenia wahały się w zakresie 230 do 8590 pg/ml. W sześciu przypadkach stężenie IFN-τ było poniżej czułości metody. Supernatanty podzielone arbitralnie na dwie ustalone grupy tj. grupę I – o niskiej zawartości interferonu (≤0,51 ng/ml) oraz II o wysokiej zawartości interferonu (≥0,52 ng/ml). __________________________________________________________________________ 62 _____________________________________________________________________________ Tabela 15. Stężenie IFN-τ w supernatantach znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych* grupa Końcowe stężenie IFN-tau w ng/mL zawarte w: ng/ml < 0,063 < 0,063 < 0,125 grupa I – < 0,125 supernatanty < 0,063 o niskiej zawartości < 0,063 0,23 IFN-tau 0,45 0,50 0,51 0,52 0,63 0,67 grupa II – 0,78 supernatanty 1,11 o wysokiej 1,58 zawartości 1,86 IFN-tau 1,9 2,565 4,545 8,59 4,16µl 12,5µl 25µl 50µl 75µl pM 0,001 0,002 0,002 0,002 0,002 0,003 0,003 0,003 0,005 0,007 0,008 0,008 0,011 0,019 0,036 0,003 0,006 0,006 0,006 0,006 0,008 0,008 0,010 0,014 0,020 0,023 0,024 0,032 0,057 0,107 0,006 0,011 0,012 0,013 0,013 0,016 0,017 0,019 0,028 0,039 0,046 0,047 0,064 0,113 0,214 0,011 0,022 0,025 0,025 0,026 0,031 0,033 0,039 0,055 0,079 0,093 0,095 0,128 0,227 0,429 0,017 0,034 0,037 0,038 0,039 0,047 0,050 0,058 0,083 0,118 0,139 0,142 0,192 0,340 0,643 11,5 22,5 25,0 25,5 26,0 31,5 33,5 39,0 55,5 79,0 93,0 95,0 128,3 227,3 429,7 *wyliczono w odniesieniu do aktywności antywirusowej rekombinowanego owczego IFN-τ w hodowli in vitro komórek MDBK zakażanych wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (Vesicular stomatitis virus) Doświadczenie 7. Efekt dodatku supernatanatantów zarodkowych do hodowli in vitro limfocytów Supernatanty z nad hodowli zarodków do czasu rozpoczęcia doświadczenia przechowywano w temp. -70°C. Zależnie od posiadanej objętości nasączy badano ich wpływ na limfocyty w dwu różnych układach doświadczalnych. W pierwszym etapie badano wpływ IFN-τ produkowanego przez zarodki na stymulowane Con A mrożone limfocyty pochodzące od wyselekcjonowanej jałówki, a w drugim na niestymulowane mitogenami limfocyty. Na rycinach 16-17 przedstawiono wyniki hamowania proliferacji przez nadsącza o stężeniu IFN-τ przekraczającym 0,5 ng/ml. Z wykresów wyraźnie wynika, że choć dodatek od 4,14 do 25 µl supernatantu zmniejsza proliferację limfoblastów ogółem oraz z receptorem TCRγδ+, to dodatek większej objętości skutkował wzmożeniem proliferacji. Łączna inkubacja nadsączy z przeciwciałem antyIFN-τ nie znosiła jego działania. __________________________________________________________________________ 63 _____________________________________________________________________________ Ryc.16 Wpływ dodatku od 4,16 do 25 µl nadsączu znad hodowli zarodków na ogólna liczbę limfocytów limfocyty ma łe lim fo cyty du że liczba lim focytów na 10000 kom óre k 400 500 600 700 800 licz ba lim fo cytów n a 10000 kom ó re k 900 1000 1100 1000 150 0 1 750 20 00 2250 2500 2750 3000 3250 4 ,16μ l conA + supernatant conA + supernatant 4,16μl 125 0 12,5μl 25μl 12,5μl+Ab 1 2,5μ l 25μ l 12,5μ l+A b conA co nA+IFN -tau conA+IFN-tau (10 ng/dołek) conA (10 ng/dołek) li m fo cy ty m a rtw e l ic z b a lim fo c ytó w n a 100 00 ko m ó re k 5600 58 0 0 60 0 0 62 0 0 64 0 0 6 60 0 6 8 00 7 00 0 7 2 00 7400 conA + supernatant 4,1 6 μ l 12 ,5 μ l 25μl 1 2 ,5 μ l+A b co n A co n A +IFN -tau (10 n g/d o łe k ) Ryc. 17 Wpływ dodatku od 4,16 do 25 µl nadsączu znad hodowli zarodków na limfocyty TCR γδ lim fo cyty m a łe limfocyty duże liczba limfocytów TCRγ δ na 10000 komóre k licz ba lim focytów TCRγ δ na 10000 ko m óre k 600 1 50 175 200 225 250 275 300 32 5 350 37 5 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 4,16μ l conA + supernatant 4,16μ l conA + supernatant 700 400 12,5μ l 25μ l 12,5μ l 25μ l 12,5μ l+Ab 1 2,5μ l+Ab con A conA+IFN-tau (10 ng/do łek) conA+IFN-tau (10 ng/dołek) conA li m fo cyty m a rtw e li cz ba li m fo cytów TCR γ δ n a 10000 ko m óre k 0 50 100 150 200 250 300 350 conA + supernatant 4,16μ l 12,5μ l 25μ l 12, 5μl+ A b conA conA +IF N -t au (10 ng/dołek) * wybrano supernatanty w których stężenie IFN-τ było wyższe niż 0,5 ng / ml Poszczególnymi kolorami oznaczono supernatanty pochodzące z jednej hodowli zarodków. Liniami pionowymi zaznaczono wartości uzyskane dla komórek stymulowanych samą Con A oraz Con A i roINF-tau w stężeniu 67000 ng/ml __________________________________________________________________________ 64 _____________________________________________________________________________ Ryciny 18 i 19 przedstawiają wyniki inkubacji limfocytów z supernatantami zawierającymi mniej niż 0,52 ng/ml. W odróżnieniu od poprzedniego doświadczania objętość dodawanego nadsączu była dwu i trzykrotnie wyższa od najwyższej poprzednio. Z ryciny 16 można odczytać, że proliferacja limfocytów była znacznie wyższa niż w przypadku inkubacji z samym mitogenem. Podobną tendencję widać na w przypadku limfoblastów TCRγδ+. Ryc.18 Wpływ dodatku od 25 do 50 µl nadsączu znad hodowli zarodków na ogólna liczbę limfocytów lim focyty m a łe lim focyty du ż e licz ba lim focytów T CRγ δ n a 10000 ko m ó re k 100 150 20 0 2 50 300 licz b a lim fo cytó w TCR γ δ na 10000 ko m ó re k 350 4 00 600 1 000 1200 14 00 1600 18 00 50µl conA + supernatant conA + supernatant 50µl 800 75µl 50µl+Ab 75µl 50µl+Ab con A conA +IF N-tau (10ng/dołek) conA +IF N-tau (10ng /dołek) c onA lim focyty m a rtw e licz ba lim focytów T CRγ δ n a 10000 ko m ó re k 50 150 2 50 350 450 55 0 conA + supernatant 50µl 75µl 50µl+Ab co nA c onA+IFN-tau (1 0ng/do łek) Ryc. 19. Wpły w dodatku od 25do 50 µl nadsączu znad hodowli zarodków na limfocyty TCR γδ limfocyty małe limfocyty duże liczba limfocytów na 10000 komórek 300 400 500 600 700 liczba limfocytów na 10000 komórek 800 900 1400 1800 2000 2200 2400 2600 50µl conA + supernatant conA + supernatant 50µl 1600 75µl 50µl+Ab 75µl 50µl+Ab conA conA+IFN-tau (66 ng/ml) conA+IFN-tau (66 ng/ml) conA __________________________________________________________________________ 65 _____________________________________________________________________________ limfocyty martwe liczba limfocytów na 10000 komórek 6500 6700 6900 7100 7300 7500 7700 7900 conA + supernatant 50µl 75µl 50µl+Ab conA+IFN-tau (66 ng/ml) conA * wybrano supernatanty w których stężenie IFN-τ było niższe niż 0,52 ng / ml Poszczególnymi kolorami oznaczono supernatanty pochodzące z jednej hodowli zarodków. Liniami pionowymi zaznaczono wartości uzyskane dla komórek stymulowanych samą Con A oraz Con A i roINF-tau w steżeniu 67000 ng/ml Wobec wyników prezentowanych wyżej zdecydowano się sprawdzić jak dodatek nadsączy wpływa na limfocyty niestymulowane Con A. W efekcie przy dodatku 25 lub 50 µl nadsączu (ryc. 20) w obrazie cytometrycznym nie stwierdzono obecności limfoblastów charakterystycznych dla komórek proliferujących. Ogólna liczba limfocytów w hodowlach zawierających supernatanty była niższa lub zbliżona do wykazanej w hodowlach niestymulowanych, nieznacznie wyższa natomiast była tylko liczba limfocytów martwych, ale nie były one reprezentowane przez populację TCRγδ+. Ryc. 20. Wpływ dodatku nadsączu znad hodowli zarodków bydlęcych na niestymulowane mitogenami ogólną liczbę limfocytów Lim focyty ma łe i d uże Lim focyty ma rtwe licz ba limfocytów na 10000 komóre k licz ba lim focytów n a 10000 k om ór e k 600 800 1000 1200 1400 1600 8000 1800 82 00 8400 8600 88 00 9000 2 3 4 25 µl 50 µl supernatant supernatant 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5 6 25μl 7 50μl 8 9 10 11 12 13 ko ntrola ko ntrola __________________________________________________________________________ 66 _____________________________________________________________________________ Lim focyty ma łe i d uże Lim focyty ma rtwe liczb a lim fo cytów Tγ δ na 10000 k om ó re k licz ba lim fo cytó w Tγ δ na 10000 k om ó r e k 200 250 300 350 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 400 100 450 25 µl 50 µl kon trola supernatant supernatant 150 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 25 µl 50 µl k ontrola Supernatanty uszeregowano wg rosnącego stężenia IFN-τ. (oznaczonego w odniesieniu do aktywności antywirusowej rekombinowanego owczego IFN-τ w hodowli in vitro komórek MDBK zakażanych wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (Vesicular stomatitis virus) ) Nadsącza o numerach od 1 do 8 zawierały mniej niż 1 ng IFN-τ /ml 9-13 zawierały od 1 do 10 ng IFN-τ /ml __________________________________________________________________________ 67 ___________________________________________________________________________ V. Dyskusja 1. Analiza wyników doświadczeń w których użyto rekombinowanego IFN-τ Niektóre lektyny takie, jak np. PHA (Nowell, 1960), PWM (Chessin i wsp., 1966), czy Con A (Smith i Barker, 1972) stymulują małe spoczynkowe limfocyty ludzkie do transformacji blastycznej, manifestującej się pojawieniem się w kulturach in vitro limfoblastów i form mitotycznych. Ponieważ pod wpływem mitogenów reaguje aż 50–90 % limfocytów szybko zaczęto wykorzystywać je do mierzenia aktywności antyproliferacyjnej różnych związków (np. Goodwin i wsp., 1977). W wielu badaniach mitogeny te były wykorzystywane również do badań nad leukocytami zwierząt, w tym także bydła (np. Ahmed i wsp., 2007; Baldwin i wsp., 1985; Joshi i wsp., 2009; Waters i wsp., 2007; Renner i wsp., 2011). Quade i Roth (1999), bazując na cytometrycznym oznaczeniu proliferacji z użyciem barwnika fluorescencyjnego PKH26 wykazali, że u bydła pod wpływem Con A silnie (z indeksem proliferacyjnym ≥4) proliferują subpopulacje CD4+, CD8+ i TCRγδ+, pod wpływem PHA głównie limfocyty TCRγδ. W porównaniu do poprzednich, PWM słabo stymuluje wszystkie limfocyty z wyjątkiem TCRγδ. W badaniach własnych wykazano, że w teście z MTT najsilniejszym stymulatorem była Con A a najsłabszym PWM. W badaniach cytometrycznych podobnie jak u Quade i Roth (1999) wykazano istotny statystycznie wzrost ilości limfoblastów o fenotypie CD4+ i CD8+ dla wszystkich zastosowanych mitogenów oraz brak wzrostu ilości limfocytów TCRγδ po stymulacji PWM. Nie stwierdzono również wzrostu ilości limfocytów B po stymulacji PWM. W badaniach własnych z zastosowaniem testu MTT wykazano m. in., że przy stymulacji Con A stężenie IFN-τ 6,7x10 -3 ng/ml zmniejszało proliferację, średnio o 39 do 51 % w stosunku do proliferacji z samym mitogenem. Ponadto, stosowanie stężeń IFN-τ powyżej 6,7x10-2 ng/ml nie zwiększało już bardziej hamowania proliferacji. Podobne wyniki uzyskał Skopets i wsp. (1991) testując ________________________________________________________________________ 68 ___________________________________________________________________________ stężenia 4 0,5; 5 i 50 nM IFN-τ przy stymulacji limfocytów krwi obwodowej Con A, PHA i PWM nie obserwowali różnic w hamowaniu stężeń 5 i 50 nM IFN-τ. Ciekawym zjawiskiem obserwowanym w badaniach własnych był fakt, że przy traktowaniu najniższymi testowanymi stężeniami IFN-τ tj. 6,7x10 -3 i 6,7x10 4 ng/ml limfocytów stymulowanych Con A i PHA uzyskiwano często wyższy poziom proliferacji niż przy stymulacji samym mitogenem. Częściowo tłumaczyć mogą to wyniki Pontzera i wsp. (1991), którzy wykazali, że mechanizm antyproliferacyjnego działania może być dwojaki i z jednej strony polegać na hamowaniu komórek w fazie S, a z drugiej na działaniu apoptotycznym. Teoretycznie niskie stężenia być może hamują komórki w fazie S, ale nie są w stanie skierować ich na drogę apoptozy. Pogląd taki wydają się wspierać badania nad IFN-α. Komórki raka wątrobowokomórkowego oraz nowotworowe linie neuroendokrynne człowieka w obecności IFN-α łatwo przechodzą z fazy G0 do fazy S, jednak nie dochodzi do fazy G2/M i – co istotne – nie obserwuje się także zwiększonego udziału komórek apoptotycznych (Detjen i wsp., 2000; Murphy i wsp., 2001). Natomiast Erdmann i wsp. (2011) wykazali, że w przypadku ludzkich komórek nabłonkowych to IFN-beta, ale nie IFN-α, hamuje proliferację i ma działanie antyapoptotyczne. Wskazuje to na fakt, że poszczególne rodzaje IFN typu I mogą wykazywać różne efekty w kontekście zjawisk proliferacji i śmierci różnych typów komórek. Obserwowany efekt antyproliferacyjny IFN-τ względem mitogenów może być jego unikalną cechą. Ponadto wykazane słabe hamowanie proliferacji limfocytów po stymulacji z PWM może wskazywać, iż IFN-τ działa przede wszystkim na limfocyty pobudzone. Z badań Fillion i wsp. (1991) wynika, że populacją docelową dla IFN-τ są limfocyty CD4+. Jednak na podstawie badań pilotażowych, jak również obserwacji Tuo i wsp. (1999a) oraz Gierek i wsp. (2006) można wnioskować, iż IFN-τ działa przede wszystkim na limfocyty TCRγδ+. W badaniach własnych wykazano, że IFN-τ wpływa na wszystkie subpopulacje limfocytów z wyjątkiem komórek 4 B, jednak hamowanie proliferacji limfocytów TCRγδ+ było Przyjmując za masę cząsteczki IFN-tau 20 kDa to stężenia te odpowiadają odpowiednio 10; 100 i 1000 ng/mL ________________________________________________________________________ 69 ___________________________________________________________________________ najsilniejsze i najbardziej powtarzalne, stąd też do dalszych badań nad nadsączami znad hodowli zarodków wybrano tę populację. Wybór modelu doświadczalnego nie był przypadkowy, u człowieka w błonie śluzowej macicy limfocyty Tγδ stanowią do 40% ogółu limfocytów (Mincheva-Nilsson i wsp., 1992), a u jałówek we krwi populacja limfocytów TCRγδ+ stanowić może nawet 50% wszystkich limfocytów, podczas gdy u zwierząt dorosłych już tylko 10-25% (Clevers i wsp., 1990). Limfocyty Tγδ+ u bydła tworzą dwie zasadnicze populacje WC1+CD2+ i WC1-CD2+. Pierwsza z nich dominuje w krwi obwodowej limfocyty drugiej populacji lokalizują się w narządach limfatycznych i błonach śluzowych. Oddziaływanie IFN-τ wobec limfocytów Tγδ jest zróżnicowane w zależności od subpopulacji. Wykazano, że roIFN-τ hamuje proliferacje owczych, mysich i ludzkich limfocytów w teście mieszanej reakcji limfocytów (MLR) i po stymulacji PHA (MasalMeliani i wsp. 1993). U myszy w przebiegu eksperymentalnie wywołanego zapalenia opon mózgowych i mózgu o przebiegu chronicznym, podaż tego białka hamowała rozwój choroby wskutek supresyjnego oddziaływania na proliferacje limfocytów i syntezy TNF-alpha (Mujtaba, 1998). Domięśniowa podaż IFN-τ jagniętom wywoływała limfopenię i neutropenię w krwi obwodowej, szczególnie obniżając liczbę limfocytów γδ+ (Tuo i wsp. 1999b). Z kolei w badaniach nad wpływem IFN-tau na stymulowane antygenami pasożytów (Babesia bovis, Fasciola hepatica i Anaplasma marginalne) subpopulacje limfocytów gamm-delta wykazano, że ma on zdolność wybiórczego zależnego od IL-2 hamowania proliferacji limfocytów WC1+CD2-CD6CD8-Tγδ+ i stymulacji populacji komórek WC1-CD2+CD6+CD8+ Tγδ+ (Tuo i wsp., 1999a). Do niedawna sądzono, że IFN-τ ma działanie wyłącznie lokalne i oraz iż nie przenika do krwiobiegu (Bazer i wsp., 1997). Jednak już Yankey i wsp. (2001) wykazali, że IFN-τ powoduje u owiec wydzielanie białka Mx przez komórki mononuklearne krwi obwodowej. Fenomen ten można było tłumaczyć w dwojaki i niewykluczający sposób: stosowane wówczas techniki badawcze miały zbyt niską czułość lub opisany przez Yankeya i wsp. efekt jest skutek migracji limfocytów z macicy do obwodu. Obecnie Oliveira i wsp. (2008) udowodnili, że IFN-τ przenika do krwiobiegu (do żyły macicznej) a tym samym potwierdzili ________________________________________________________________________ 70 ___________________________________________________________________________ oni, iż ekspresja białka Mx, OAS, oraz ISG w krwi obwodowej krów w ciąży może być bezpośrednim efektem układowej odpowiedzi na działanie IFN-τ (Green i wsp., 2010). Dane te wskazują, że bydlęce limfocyty mogą być jednym z celów działania IFN-τ in vivo, zarówno lokalnie w macicy, jak i ogólnoustrojowo, we krwi obwodowej. Przyjmując, że dojrzała rozrodczo krowa waży około 700 kg, ilość krwi obwodowej powinna stanowić około 50 litrów (około 7% na każdy kilogram masy ciała; Stankiewicz 1973). Zarodki 16-24 dniowe dziennie mogą produkować do 100 µg IFN-τ (Martal i wsp., 1997), przy założeniu 100% wydajności przenikania IFN-τ do krwiobiegu możliwa do uzyskania jego koncentracja wynosi 2 ng/ml, co w świetle badań własnych jest stężeniem bardzo wysokim. Te wyliczenia są w pewnym stopniu zgodne z obserwacjami Oliveira i wsp. 2008, w których wykazano, że stężenie IFN-τ w żyle macicznej u owiec w 15 dniu po inseminacji wynosiło 5-10ng/ml. Z drugiej strony, w tych samych badaniach, aktywność antywirusowa krwi pobranej z żyły szyjnej i tętnicy macicznej pobranej w 15 dniu ciąży była niska i nie wykazywała różnic w porównaniu z aktywności przeciwwirusową surowicy krwi pobranej z żyły szyjnej samic będących w 15 dni cyklu. Pozostaje więc otwarte pytanie czy niskie stężenie IFN-tau na obwodzie (z wyjątkiem żyły macicznej) w czasie wysokiej aktywności wydzielniczej zarodka wynika z jego rozcieńczenia czy być może jest efektem intensywnego wiązania przez wszedobylskie receptory dla interferonów I typu. W teście z MTT w badaniach własnych przy stymulacji Con A wykazano silny antyproliferacyjny efekt IFN-τ możliwy jest do uzyskania przy stężeniach przeszło 1000-krotnie niższych. Obserwowano hamowanie proliferacji w dwu na dziesięć przypadków, przy stężeniu 6,67x10 -4 ng/ml a przy cytometrycznym oznaczaniu frekwencji kriokonserwowanych limfocytów TCRγδ+ nawet przy stężeniu 3,33 x 10 -4 ng/ml. Dlatego można sądzić, że IFN-tau w limfocytach krwi obwodowej nie tylko indukuje ekspresję białek takich jak OAS czy ISG ale również może aktywnie hamować zdolności proliferacyjne krążących limfocytów. Do znoszenia działania IFN-τ używano, uzyskanej we własnym zakresie, króliczej surowicy poliklonalnej. W założeniu miała ona selektywnie wyłączać ________________________________________________________________________ 71 ___________________________________________________________________________ działanie IFN-τ zawartego w supernatantach znad hodowli zarodków, tym samym udowadniać zaplanowany działała jego ona obecność i jedynie w aktywność. Niestety, doświadczeniach z w sposób interferonem rekombinowanym. Ponieważ surowica królicza może być dla limfocytów bydlęcych źródłem antygenów ksenogenicznych jako kontroli użyto surowicy królika immunizowanego samym adiuwantem. Przed wysoleniem, zarówno surowica kontrolna jak i surowica anty-IFN-τ wykazywały efekt cytotoksyczny w stosunku do limfocytów, być może ze względu na obecność mediatorów powstających w wyniku immunizacji lub podania samego adiuwantu. Efekt ten zanikał w hodowlach stymulowanych Con A z dodatkiem interferonu, obydwie surowice w wyższych stężeniach znosiły efekt interferonu. Taki ochronny efekt surowicy opisano w przypadku hodowli ludzkiej linii komórkowej MCF-7 stymulowanej konkanawaliną: przy niskich stężeniach surowicy Con A jest dla tych komórek toksyczna, przy wysokich, dochodzących do 20%, efekt ten zanika (Faheina-Martins i wsp., 2011). Także efekt stymulacji ludzkich limfocytów T za pomocą PHA przy różnych stężeniach surowicy bydlęcej w hodowli wskazuje, że jej zawartość interferuje z odpowiedzią komórek na mitogeny (Tabakov i wsp., 2009). Tierney i Simpson-Morgan (1997) w badaniach limfocytów bydlęcych zaobserwowali hamujący wpływ normalnej surowicy królika na limfoproliferacyjną odpowiedź na Con A, PHA i PWM. Co ciekawe, efekt może być gatunkowo swoisty, bowiem np. w hodowlach owczych limfocytów dodatek surowicy końskiej wzmacnia efekt proliferacyjny pod wpływem Con A względem hodowli prowadzonych przy tym samym stężeniu surowicy bydlęcej (Gottshall i Hansen, 1994). Mając na uwadze niejednorodne i skomplikowane interakcje pomiędzy mitogenami i surowicą, podobny wpływ surowicy kontrolnej i anty-IFN-τ nie jest więc zaskakujący, wymusił jednak oczyszczenie frakcji gamma-globulinowej. Po wysoleniu zadowalający efekt znoszenia hamowania proliferacji przez IFN-τ (66 ng/ml) otrzymano w rozcieńczeniach w zakresie od 1:60 do 1:240. Jednak najbardziej optymalne było rozcieńczenie 1:120. Po wysoleniu nie obserwowano już znoszenia hamowania proliferacji ________________________________________________________________________ 72 ___________________________________________________________________________ przez surowice kontrolną, miała ona jednak szczątkowe działanie cytotoksyczne w niskich rozcieńczeniach w stosunku do hodowli limfocytów kontrolnych. 2. Analiza wyników doświadczeń w których użyto nasączy znad hodowli in vitro zarodków bydlęcych. Chęć uniezależnienia oceny zarodków od badań morfometrycznych nie jest pomysłem nowym, opracowano szereg testów oceniających np. żywotność, zużycie glukozy i/lub tlenu (Bielański i Tischner, 1997). Fakt, że komórki zarodka są żywe, wykazują sprawny metabolizm, mają „dobre oddychanie i zużycie glukozy,” czy nawet produkują IFN-τ nie przesądza jeszcze o tym, że zarodek się poprawnie implantuje. Jak przedstawiono we wstępie IFN-τ może być produkowany w różnych izoformach, które posiadają zróżnicowaną aktywność biologiczną. Na przykład z badań Parenta i wsp. (2003) wynika, iż izoformy bydlęcego interferonu-tau cechuje zróżnicowana aktywność antywirusowa wobec VSV w komórkach MDBK, aktywność ta rośnie w kierunku 3b<1a<2b, przy czym działanie antywirusowe izoformy 2b jest prawie 6 razy silniejsze, niż izoformy 3b. Brak jest natomiast przełożenia aktywności antywirusowej na hamowanie lub stymulowanie produkcji prostaglandyn. Zjawisko to jednak nie dziwi, ponieważ efekt antywirusowy interfernów typu I, w tym IFN-τ, zależy od aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF2 (Rubinstein i Pontzer, 2000), podczas gdy wiele innych efektów jest zależnych od innych szlaków sygnałowych co szczegółowo opisano w rozdziale 1.3 wstępu. Poszczególne fragmenty cząsteczki IFN-τ są odpowiedzialne za różne efekty. Szczególną rolę odgrywa tu C-koniec, który nie jest odpowiedzialny za wiązanie interferonu do receptora, ale modyfikuje szlaki przekazywania sygnału. Eksperymenty modyfikacje wykorzystujące C-końca przeciwwirusowe lub IFN-τ ukierunkowaną mutagenezę mogą wpływać różnie antyproliferacyjne, np. zastąpienie wykazały, na że właściwości izoleucyny 143 tyrozyną skutkuje jedynie zredukowaniem aktywności przeciwwirusowej, przy jednoczesnym zupełnym zniesieniu właściwości antyproliferacyjnych (Li i Roberts, 1994b). Z drugiej jednak strony trzeba pamiętać że antyluteolityczne ________________________________________________________________________ 73 ___________________________________________________________________________ działanie IFN-τ uzależnione jest również od rodzaju komórek docelowych i izoform IFN-τ (Parent i wsp., 2003). Zróżnicowane efekty izoform IFN-τ mogą być szczególnie istotne w kontekście badań Greena i wsp. (2005), które prowadzą do wniosku, iż luteotropowy efekt IFN-τ zależy nie tyle od jego specyficznych właściwości, co raczej od łącznego efektu współdziałających izoform, tym bardziej że efekt luteotropowy jest widoczny u owiec także po podaniu IFN-α. Warto jeszcze dodać, że ekspresja IFN-τ może być wzmacniana lub osłabiana przez różne czynniki produkowane przez endometrium, szczególnie te działające za pośrednictwem kinaz białkowych i szlaku kinaz MAP (Ezashi i Roberts, 2004; Chakrabarty i Roberts, 2007; Yang i wsp., 2011). Przykładami pozytywnych regulatorów wydzielania IFN-τ przez trofoblast mogą być: czynniki wzrostu fibroblastów (Michael i wsp., 2006b; Cooke i wsp., 2009), czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów - GM-CSF (Imakawa i wsp., 1993; Imakawa 1997) czy też IL-3 (Imakawa i wsp., 1995). Nawet nieskomplikowane w budowie chemicznej związki, jak arginina, mogą wpływać na ekspresję IFN-τ (Kim i wsp., 2011). Czynniki te mogą być przydatne w poprawie jakości mediów hodowlanych, bowiem suplementacja mediów znacznie podnosi jakość zarodków właśnie poprzez podwyższenie produkcji IFN-tau. Wykazano to np. w przypadku GM-CSF (Michael i wsp., 2006a) i CSF2 (Loureiro i wsp., 2011). Z badań Kubish i wsp., (2001 i 2004) wynika ponadto, że ilość produkowanego interferonu przez zarodki zależy w dużej mierze nie tylko od medium hodowlanego, zawartości glukozy, surowicy ale również użytego nasienia do inseminacji i wreszcie płci zarodka. Zarodki żeńskie produkują średnio dwa razy więcej interferonu niż męskie. W większości prac, w których badano wpływ dodatku nadsączy znad hodowli zarodków przeżuwaczy używano supernatanty znad późnych stadiów blastocysty, czyli dwunastodniowych i starszych, a to eliminuje je z późniejszego wykorzystania do embriotransferu. Obecnie pomiar ilości interferonu produkowanego przez zarodki wciąż jeszcze opiera się głównie na podstawie jego aktywności antywirusowej. Z ________________________________________________________________________ 74 ___________________________________________________________________________ badań Kubish (2001) wynika, że ilość interferonu produkowanego przez pojedynczy 7-9 dniowy zarodek waha się w szerokich granicach od 148±10,7 pM do 616±123 pM. Podobne wyniki uzyskała Chełmońska-Soyta (2002). Pozornie jest to ilość dość duża, trzeba jednak pamiętać, że są one hodowane w objętości od 25 µl do 40 µl. Stąd też ilość interferonu jaka zostaje do potencjalnych badań jest niewielka. W doświadczeniu pierwszym wykazano, że IFN-τ w stężeniu poniżej 6,67x10 -1 ng/ml hamuje proliferację zależnie od jego koncentracji oraz że możliwe jest hamowanie proliferacji przez stężenie IFN-τ 3,33x10 -3 ng/ml, a w pojedynczych przypadkach nawet przez stężenie 6,67x10 -4 ng/ml. Tym samym potwierdziło to potencjalną możliwość badania interferonu zawartego w nadsączach metodą mikromiareczkowania na hodowlach limfocytów z MTT. Dla wyeliminowania różnic osobniczych w reaktywności limfocytów na mitogeny i interferon tau doświadczalną ocenę jakościową zarodków przeprowadzono na kriokonserwowanych limfocytach wybranej wcześniej jałówki, cechujących się dużą wrażliwością na IFN-τ. Wybór jako metody oceny zarodków cytometrii przepływowej podyktowany był objętością w jakiej zarodki są hodowane. Przy badaniu aktywności antyprofileracyjnej z użyciem H3-tymidyny czy MTT wymagane są trzykrotne powtórzenia. Jak wykazano w niniejszych badaniach aby objętość jaką należy użyć raczej nie powinna być niższa niż 12,5 – 25 ul. Dodatek 50 lub 75 ul nadsączu do hodowli skutkował wzrostem proliferacji limfocytów wyższym, niż przy stymulacji samą konkanawaliną. Również użycie przeciwciała w teoretycznie optymalnym rozcieńczeniu nie inaktywowało IFN-τ zawartego w supernatantach. Przyczyn tego upatrywać można w tym, że w doświadczeniu 6 określono zawartość IFN-τ metodą hamowania efektu cytopatycznego z komórkami MDBK. Oznaczenie to miało charakter orientacyjny. W supernatantach znajdowały się przypuszczalnie różne izoformy IFN-τ lub/i uzyskana poliklonalna surowica była specyficzna głównie dla rekombinowanego owczego IFN-τ. Uzyskane wyniki supernatantów nie przesądzają o braku przydatności tej metody. Być może wskazane byłoby użycie świeżych niemrożonych nasączy. Przemawia za tym fakt, że wykryta w teście aktywności antywirusowej ilość ________________________________________________________________________ 75 ___________________________________________________________________________ IFN-τ była stosunkowo niska, choć zarodki hodowane w grupach powinny produkować więcej IFN-τ, niż hodowane pojedynczo (Larson i Kubisch, 1999), taka sytuacja nie powinna mieć miejsca. Poza tym media do produkcji zarodków zawierają w swoim składzie surowicę, w której po mrożeniu może przywracać się szczątkowa aktywność układu dopełniacza. Także skład mediów przeznaczonych do hodowli zarodków jest inny, niż klasycznych mediów do hodowli komórkowych, co również może rzutować na efekt limfoproliferacyjny (Stiekema i Kapsenberg, 1987). Wydaje się, że w świetle powyższych rozważań należałoby ustalić warunki hodowli limfocytów w obecności nadsączy znad zarodków, gdyż możliwe jest, że także koncentracja mitogenu lub gęstość hodowli mają tu wpływ na oznaczanie aktywności IFN-τ. Z uwagi na trudności z pozyskaniem supernatantów doświadczenia nie można jednak było powtórzyć. Dalszym krokiem powinno być sprawdzenie jak metoda działa w przypadku zarodków hodowanych pojedynczo, bez udziału kultur i sprawdzenie, jak zdolność supernatantu do hamowania proliferacji wpływa na wyniki embriotransferu. Metoda ta wydaje się o tyle interesująca, że ilość materiału potrzebna do badania jest stosunkowo mała. Szczególnie warte podkreślenia jest to, iż z punktu widzenia badań jakości zarodków proponowana metoda jest całkowicie nie inwazyjna i nie wyklucza stosowania innych testów oceny zarodków. Przedstawione powyżej informacje, szczególnie te odnoszące się do zróżnicowanej aktywności i ekspresji izoform IFN-τ wskazują, że sam pomiar stężenia tego czynnika nie jest miarodajny, bowiem przy tym samym stężeniu efekty mogą się różnić ze względu na skład mieszaniny. Z tego względu istnieje potrzeba rozwoju metod umożliwiających oszacowanie biologicznej aktywności IFN-τ nie bazująca na aktywności przeciwwirusowej. Warto też zwrócić uwagę na fakt, że rozwój metod biotechnologicznych pozwala obecnie na uzyskanie rekombinowanego IFN-τ, np. produkowanego przez Pichia pastoris (Johnson i wsp., 1999b), Escherichia coli (Li i wsp., 1995) lub w larwach jedwabnika morwowego zakażanych rekombinowanym bakulowirusem (Nagaya i wsp., 2004). Tak otrzymywany IFN-τ z przyczyn oczywistych nie może naśladować ________________________________________________________________________ 76 ___________________________________________________________________________ mieszanki izoform i z tego względu wnioski płynące z takich eksperymentów mogą mieć ograniczone znaczenie. 3. Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny proliferacji limfocytów Technika z użyciem MTT ma ograniczone zastosowanie w ocenie antyproliferacyjnego działania nadsączy znad hodowli zarodków głównie z uwagi na małą objętość supernatantów. Z konieczności więc badania kontynuowane były przy użyciu techniki cytometrii przepływowej. W trakcie opracowywania wyników cytometrycznych dla interferonu rekombinowanego spostrzegłem, że uzyskane wyniki można zaadoptować do badania proliferacji. MTT mierzy „żywotność i aktywność metaboliczną”, którą przekładamy na terminy „proliferacja” i „cytotoksyczność”, ale wynikiem testu jest jedna liczba będąca odzwierciedleniem tych dwóch pojęć. Natomiast Niks i wsp., 1990 uważają, że redukcję soli tetrazolu można rozpatrywać jedynie w kontekście ogólnego odzwierciedlenia aktywności metabolicznej komórek. Test cytometryczny daje więcej informacji, bo bada więcej parametrów i do pewnego stopnia pozwala wnioskować o relacjach pomiędzy proliferacją, żywotnością i cytotoksycznością. W rozdziale „Materiał i Metody”, str. 45 pokazano przykładowy dot-plot uzyskiwany po 72 godzinnej hodowli limfocytów z podziałem na trzy populacje limfocytów: spoczynkowe, blasty i martwe. Technika cytometryczna zastosowana do badania odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów a także w innych układach in vitro pozwala obliczać indeks proliferacyjny (IP) analogicznie jak w przypadku MTT. Z tym że indeks taki wylicza się nie jako stosunek gęstości optycznej uzyskanej dla próby badanej do OD kontroli, a jako stosunek ilościowy limfocytów dużych w próbie badanej do tego samego parametru w kontroli. Wybór limfoblastów jako miernika proliferacji jest naturalny, bowiem to właśnie one z definicji są komórkami, które proliferują. Dla zilustrowania wybrano odpowiadające sobie wyniki z testu MTT i cytometrycznego. Stężenia interferonu i mitogenów w obu testach są identyczne. Analiza statystyczna testem Manna-Whitneya dla dwóch grup, gdzie porównywany jest efekt traktowania „mitogen+interferon” z samym ________________________________________________________________________ 77 ___________________________________________________________________________ mitogenem. Dla MTT i limfoblastów wykazała istotność statystyczną dla wszystkich trzech mitogenów przy p<0,001. O ile w przypadku limfoblastów widoczny wpływ na proliferację, o tyle indeksy dla komórek martwych są efektem cytotoksyczności. Frekwencja komórek martwych rośnie po dodatku IFN-τ w przypadku Con A (p<0,001) i PHA (p<0,001), natomiast nie zmienia się w przypadku PWM (p=1,0). Jedynie dla porządku porównano indeksy dla komórek w fazie G0: dodatek IFN-τ powoduje wzrost frekwencji w przypadku Con A (p<0,001) i PHA (p<0,001), ale nie w przypadku PWM (p=0,80). Ryc. 21 Indeksy proliferacyjne uzyskane techniką MTT i cytometrii przepływowej z uwzględnieniem stanu fizjologicznego komórek. Gruba, czarna, poprzeczna kreska oznacza medianę; „wąsy” minimum i maksimum; pudełko pierwszy i trzeci kwartyl. Podsumowując, wyniki testu MTT są podobne do wyników analizy limfoblastów. Jeśli przyjrzeć się wykresom bliżej, to na uwagę zasługuje jedna fakt, że w teście MTT średnie indeksy proliferacyjne po zadziałaniu IFN ________________________________________________________________________ 78 ___________________________________________________________________________ oscylują w granicach wartości 1,0 lub poniżej a w teście cytometrycznym wszystkie są powyżej a dla ConA i PHA nawet znacznie (Tab. 16) Wynika to przypuszczalnie z różnych mechanizmów hamowania proliferacji, które mogą być zarówno skutkiem zahamowania podziałów komórki jak i skutkiem oddziaływań cytotoksycznych. Przy czym należy pamiętać że zjawiska te nie wykluczają się wzajemnie. Tab. 16 Porównanie indeksów proliferacyjnych uzyskanych techniką MTT i cytometrii przepływowej 5 rodzaj pomiaru ConA n=16 PHA n=15 PWM n=10 MTT 3,82±0,39 3,30±0,39 1,55±0,12 cytometr 6,66±0,49 5,92±0,42 1,39±0,19 MTT 1,05±0,07 0,92±0,1 0,91±0,09 cytometr 3,03±0,27 2,71±0,23 1,15±0,16 mitogen mitogen + IFN-τ Na koniec chciałem podzielić się kilkoma ogólnymi uwagami odnośnie cytometrycznej metody oceny proliferacji w porównaniu z innymi metodami oceny proliferacji: 1. Ocena stopnia proliferacji bazuje na parametrach FSC-H i SSC-H, które są mierzone przez każdy cytometr i w odróżnieniu od badań z użyciem barwników fluorescencyjnych w zasadzie nie wymaga kalibracji. Standardowe ustawienia cytometru umożliwiają odczytanie badanych próbek, w związku z czym nawet osoby z małym doświadczeniem w zakresie metod cytometrycznych nie powinny mieć kłopotu z odczytem i analizą wyników. (przykładowy obraz cytometryczny dla parametrów FSC/SSC przedstawiono na ryc. 14 w rozdziale Materiał i metody; str. 45) 2. Kolejną zaletą metody jest możliwość określenia IP dla wybranych populacji komórek, jeśli dodatkowo zostaną użyte przeciwciała pozwalające na immunofenotypizację. Test MTT nie 5 daje takich informacji z przyczyn indeksy proliferacyjne dla limfoblastów ________________________________________________________________________ 79 ___________________________________________________________________________ oczywistych. Stanowi on bowiem test żywotności, z którego o proliferacji można wnioskować jedynie pośredni. Co więcej w teście z MTT żywe komórki nieproliferujące mogą stanowić wysokie tło, co z kolei może to utrudniać śledzenie zmian proliferacyjnych w rzadkich populacjach komórek. 3. W przypadku, gdy w danym eksperymencie przeprowadzane jest jakiekolwiek badanie cytometryczne, zapisywane są również dane z detektorów FSC-H i SSC-H i w takim wypadku nie ma potrzeby przeprowadzania dodatkowego proliferacyjnym. prowadzonych badania testem Możliwa nawet jest kilka lat MTT też lub dowolnym analiza wcześniej, danych nawet innym testem zarchiwizowanych, jeśli próby nie były analizowane pod kątem proliferacji. 4. W stosunku do innych cytometrycznych metod oceny proliferacji, przedstawiony sposób analizy jest tańszy. Obecnie najczęściej stosowanym testem proliferacyjnym jest badanie komórek barwionych przyżyciowo za pomocą takich barwników fluorescencyjnych, jak ester sukcynyloimidowy karboksyfluoresceiny (CFSE) lub barwnik PKH26 (Parish, 1999). Fluorochromy te są w obecnej chwili kosztowne, zaś optymalizacja metody barwienia i hodowli jest trudna i pracochłonna, m.in. ze względu na cytotoksyczność barwników (Quach i Parish, 2010). O ile pewne zalety takich barwień są nie do przecenienia (np. śledzenie proliferacji in vivo), o tyle w prostych układach in vitro prezentowana w pracy metoda dostarcza podobnych informacji. 5. Metoda może być w miarę potrzeby rozszerzona o pomiar całkowitej liczby komórek w hodowli, dzięki czemu nie jest potrzebna wiedza na temat działania mitogenów w wybranym układzie doświadczalnym. W celu oszacowania liczby komórek wystarczy użyć kulek fluorescencyjnych do kalibracji cytometru. Określona ich ilość dodana do hodowli przed rozpoczęciem barwienia pozwala określić liczbę każdej badanej populacji. Przykładowo, jeśli do dołka dodano 8000 kulek, a po odczytaniu 10 000 komórek cytogram ujawnił 2000 kulek, to w całej hodowli musiało być 40 000 komórek. Z informacji nt. odsetków można prosto obliczyć liczebność dowolnej populacji. Dane te, połączone z przedstawioną analizą blastów, dają pełen obraz zmian ________________________________________________________________________ 80 ___________________________________________________________________________ ilościowych zachodzących w hodowli, o których można wnioskować na podstawie tylko jednej próbki. W trakcie przedstawionych w pracy badań fluorescencyjne kulki kalibracyjne takie były trudno dostępne i drogie, jednak w obecnej chwili są łatwo dostępne, ich zastosowanie bywa niemal rutynowe, a dodatkowo niektóre produkty są przeznaczone głównie do liczenia komórek (Storie i wsp., 2004). 6. Jeżeli testowane substancje wykazują silny wpływ na proliferację limfocytów, ilość potrzebnego materiału jest dużo mniejsza, niż w przypadku standardowych metod. 7. Pomiar jest szybki w porównaniu do testu MTT, testu na wbudowywaną bromodeoksyurydynę oraz testów proliferacyjnych z użyciem radioizotopów, szczególnie, jeśli wyznaczany jest całościowy IP, bez znakowania poszczególnych populacji. Wszystkie te metody wymagają użycia dodatkowych odczynników, w przypadku metody izotopowej i MTT szkodliwych dla zdrowia. Wymagają przeprowadzenie też testu, dodatkowego np. lizy czasu, komórek około w kilka godzin, na MTT czy przypadku przeprowadzenia testu immunoenzymatycznego w przypadku BrDU. Główną wadą morfologicznych metody badanych jest fakt, komórek, że opiera uniemożliwia się ona zatem na cechach badanie linii komórkowych (wszystkie komórki są w trakcie podziału) i ogranicza się do limfocytów. Nie mniej jednak nie ma przeszkód w adaptacji procedury do badań proliferacji innych typów komórek, pod warunkiem, że w trakcie proliferacji charakteryzują się one widoczną zmianą wielkości lub granularności. Warunkiem limitującym jest także dostęp do cytometru. W porównaniu do testu MTT zaobserwowano wprawdzie pewne rozbieżności w wartościach IP. Wynikają one jednak z faktu, że parametry użyte do obliczeń są różne: absorbancja w przypadku testu formazanowego oraz liczba blastów w teście cytometrycznym. Limfoblasty są komórkami aktywnie dzielącymi się, podczas gdy w przypadku przekształcania soli tetrazolowej mamy do czynienia z szeregiem zjawisk, które jedynie w pewnym przybliżeniu odpowiadają żywotności komórek. ________________________________________________________________________ 81 ___________________________________________________________________________ VI. Wnioski 1. W warunkach in vitro populacją docelową, wobec, której ro-IFN-τ wykazuje najwyższą aktywność antyproliferacyjną jest izolowana z krwi obwodowej populacja limfocytów T z receptorem TCRγδ+. 2. Hamowanie proliferacji limfocytów z receptorem TCRγδ+ przez ro-IFN-τ jest czułym, zależnym od stężenia wskaźnikiem jego aktywności. 3. Nadsącze znad hodowli zarodków uzyskanych metodą IVM-IVF (in vitro Maturation - in vitro Fertilization) wykazywały antyproliferacyjną aktywność wobec limfocytów krwi obwodowej bydła w tym limfocytów T z receptorem TCRγδ+, jednak efekt ten nie zależał od stężenia zawartego w nich IFN-τ. 4. Zaproponowana cytometryczna metoda oceny proliferacji limfocytów może być alternatywą dla technik kolorymetrycznych i radioizotopowych. ________________________________________________________________________ 82 ___________________________________________________________________________ VII. Piśmiennictwo 1. Abe H. A Non-invasive and Sensitive Method for Measuring Cellular Respiration with a Scanning Electrochemical Microscopy to Evaluate Embryo Quality J Mamm Ova Res. 2007; 24 (3): 70-78. 2. Abella N, Schelcher F, Delverdier M, Concordet D, Valarcher JF, Espinasse J, Cabanie P. Flow cytometric analysis of bovine CD4 and CD8 lymphocytes: influence of blood sampling and processing methods. Res Vet Sci. 1994 Sep; 57 (2): 163-71. 3. Ahmed M, Shaban Z, Yamaji D, Okamatsu-Ogura Y, Soliman M, Abd Eldaim M, Ishioka K, Makondo K, Saito M, Kimura K. Induction of proinflammatory cytokinez and caspase-1 by leptin in monocyte/macrophages from holstein cows. J Vet Med. Sci. 2007 May; 69 (5): 509-14. 4. Alexenko AP, Ealy AD, Bixby JA, Roberts RM. A classification for the interferon-tau. J Interferon Cytokine Res. 2000;; 20 (9): 817-22. 5. Alves D, McEwen B, Hazlett M, Maxie G, Anderson N. Trends in bovine abortions submitted to the Ontario Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, 1993-1995. Can Vet J. 1996 May; 37 (5): 287-8. 6. Arosh JA, Banu SK, Kimmins S, Chapdelaine P, Maclaren LA, Fortier MA. Effect of interferon-tau on prostaglandin biosynthesis, transport, and signaling at the time of maternal recognition of pregnancy in cattle: evidence of polycrine actions of prostaglandin E2. Endocrinology 2004; 145: 5280-93 7. Assal-Meliani A, Charpigny G, Reinaud P, Martal J, Chaouat G. Recombinant ovine trophoblastin (roTP) inhibits ovine, murine and human lymphocyte proliferation. J Reprod Immunol. 1993 Nov; 25 (2): 14965. 8. Asselin E, Drolet P, Fortier MA. Cellular mechanisms involved during oxytocin-induced prostaglandin F2alpha production in endometrial epithelial cells in vitro: role of cyclooxygenase-2. Endocrinology. 1997 Nov;138 (11): 4798-805 9. Asselin E, Fortier MA. Detection and regulation of the messenger for a putative bovine endometrial 9keto-prostaglandin E(2) reductase: effect of oxytocin and interferon-tau. Biol Reprod 2000; 62:125-31 10. Asselin E, Goff AK, Bergeron H, Fortier MA. Influence of sex steroids on the production of prostaglandins F2α and E2 and response to oxytocin in cultured epithelial and stromal cells of the bovine endometrium. Biology of Reproduction.; 1996; 54: 371-379. 11. Asselin E, Johnson GA, Spencer TE, Bazer FW. Monocyte chemotactic protein-1 and -2 messenger ribonucleic acids in the ovine uterus: regulation by pregnancy, progesterone, and interferon-tau. Biol Reprod 2001; 64: 992-1000 12. Asselin E, Lacroix D, Fortier MA. IFN-tau increases PGE2 production and COX-2 gene expression in the bovine endometrium in vitro. Mol Cell Endocrinol. 1997 Sep 19; 132 (1-2): 117-26. 13. Austin KJ, Ward SK, Teixeira MG, Dean VC, Moore DW, Hansen TR. Ubiquitin cross-reactive protein is released by the bovine uterus in response to interferon during early pregnancy. Biol Reprod. 1996 Mar; 54 (3): 600-6. ________________________________________________________________________ 83 ___________________________________________________________________________ 14. Bai H, Sakurai T, Kim MS, Muroi Y, Ideta A, Aoyagi Y, Nakajima H, Takahashi M, Nagaoka K, Imakawa K. Involvement of GATA transcription factors in the regulation of endogenous bovine interferon-tau gene transcription. Mol Reprod Dev. 2009 Dec; 76 (12): 1143-52. 15. Baldwin CL, Antczak DF, Winter AJ. Cell titration assay for measuring blastogenesis of bovine lymphocytes. Vet Immunol Immunopathol. 1985 Aug; 9 (4): 319-33. 16. Banu SK, Lee J, Stephen SD, Nithy TK, Arosh JA. Interferon tau regulates PGF2alpha release from the ovine endometrial epithelial cells via activation of novel JAK/EGFR/ERK/EGR-1 pathways. Mol Endocrinol. 2010; 24: 2315-30 17. Bauersachs S, Ulbrich SE, Reichenbach HD, Reichenbach M, Büttner M, Meyer HH, Spencer TE, Minten M, Sax G, Winter G, Wolf E. Comparison of the Effects of Early Pregnancy with Human Interferon, Alpha 2 (IFNA2), on Gene Expression in Bovine Endometrium. Biol Reprod. 2011 18. Bazer FW, Burghardt RC, Johnson GA, Spencer TE, Wu G. Interferons and progesterone for establishment and maintenance of pregnancy: interactions among novel cell signaling pathways. Reprod Biol. 2008 Nov; 8 (3): 179-211. 19. Bazer FW, Spencer TE, Ott TL. Interferon tau: a novel pregnancy recognition signal. Am J Reprod Immunol. 1997 Jun; 37(6): 412-20. 20. Bergeron D, Ouellette MJ, Lambert RD. PGE2, but not TGF beta 2, in rabbit blastocoelic fluid regulates the cytotoxic activities of NK and LAK cells. J Reprod Immunol. 1997 Jul; 33 (3): 203-19. 21. Bielański A, Tischner M. Biotechnologia rozrodu zwierząt udomowionych. Wydawnictwo i Drukarnia Drukpol s. c.; 1997: 144 – 147 22. Binelli M, Subramaniam P, Diaz T, Johnson GA, Hansen TR, Badinga L, Thatcher WW. Bovine interferon-tau stimulates the Janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathway in bovine endometrial epithelial cells. Biol Reprod 2001; 64: 654-65 23. Bowen JA, Burghardt RC. Cellular mechanisms of implantation in domestic farm animals. Semin Cell Dev Biol. 2000 Apr; 11 (2): 93-104. 24. Campero CM, Moore DP, Odeón AC, Cipolla AL, Odriozola E. Aetiology of bovine abortion in Argentina. Vet Res Commun. 2003 Jul; 27 (5): 359-69. 25. Chakrabarty A, Roberts MR. Ets-2 and C/EBP-beta are important mediators of ovine trophoblast Kunitz domain protein-1 gene expression in trophoblast. BMC Mol Biol. 2007; 8:14 26. Chaouat G. Regulation of T-cell activities at the feto-placental interface—by placenta? Am J Reprod Immunol. 1999 Oct; 42(4): 199-204. 27. Chełmońska-Soyta A, Jaśkowski JM. Badania nad ekspresją białek w zarodkach bydlęcych. Weterynaria w terenie 2007; 1(4):58-63 28. Chełmońska-Soyta A. Immunobiologiczne interakcje pomiędzy Ureoplasma diversum i zarodkami bydlęcymi w stadium przedimplatacyjnym. Zeszyty naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu 2002; nr 435, Rozprawy CLXXXVII, Wydział Medycyny Weterynaryjnej. ________________________________________________________________________ 84 ___________________________________________________________________________ 29. Chen Y, Antoniou E, Liu Z, Hearne LB, Roberts RM. A microarray analysis for genes regulated by interferon-tau in ovine luminal epithelial cells. Reproduction 2007; 134:123-35 30. Chen Y, Green JA, Antoniou E, Ealy AD, Mathialagan N, Walker AM, Avalle MP, Rosenfeld CS, Hearne LB, Roberts RM. Effect of interferon-tau administration on endometrium of nonpregnant ewes: a comparison with pregnant ewes. Endocrinology 2006; 147:2127-37 31. Chessin LN, Börjeson J, Welsh PD, Douglas SD, Cooper HL. Studies on human peripheral blood lymphocytes in vitro. II. Morphological and biochemical studies on the transformation of lymphocytes by pokeweed mitogen. J Exp Med. 1966 Nov 1; 124 (5): 873-84. 32. Choi Y, Johnson GA, Spencer TE, Bazer FW. Pregnancy and interferon tau regulate major histocompatibility complex class I and beta2-microglobulin expression in the ovine uterus. Biol Reprod 2003; 68:1703-10 33. Clevers H, MacHugh ND, Bensaid A, Dunlap S, Baldwin CL, Kaushal A, Iams K, Howard CJ, Morrison WI. Identification of a bovine surface antigen uniquely expressed on CD4-CD8- T cell receptor gamma/delta+ T lymphocytes. Eur J Immunol. 1990 Apr; 20 (4): 809-17. 34. Cobb SP, Watson ED. Immunohistochemical study of immune cells in the bovine endometrium at different stages of the oestrous cycle. Res Vet Sci. 1995 Nov;59 (3): 238-41. 35. Cooke FN, Pennington KA, Yang Q, Ealy AD. Several fibroblast growth factors are expressed during preattachment bovine conceptus development and regulate interferon-tau expression from trophectoderm. Reproduction 2009; 137:259-69 36. Das P, Ezashi T, Gupta R, Roberts RM. Combinatorial roles of protein kinase A, Ets2, and 3',5'-cyclicadenosine monophosphate response element-binding protein-binding protein/p300 in the transcriptional control of interferon-tau expression in a trophoblast cell line. Mol Endocrinol 2008; 22: 331-43 37. Davidson JA, Betts JG, Tiemann U, Kamwanja LA, Monterroso VH, Hansen PJ. Effects of interferon-tau and interferon-alpha on proliferation of bovine endometrial cells. Biol Reprod 1994; 51: 700-5 38. Davies CJ, Eldridge JA, Fisher PJ, Schlafer DH. Evidence for expression of both classical and nonclassical major histocompatibility complex class I genes in bovine trophoblast cells. Am J Reprod Immunol. 2006 Mar; 55 (3): 188-200. 39. Demmers KJ, Derecka K, Flint A. Trophoblast interferon and pregnancy. Reproduction. 2001 Jan; 121 (1): 41-9. 40. Detjen KM, Welzel M, Farwig K, Brembeck FH, Kaiser A, Riecken EO, Wiedenmann B, Rosewicz S. Molecular mechanism of interferon alfa-mediated growth inhibition in human neuroendocrine tumor cells. Gastroenterology. 2000 Apr;118(4):735-48. 41. Diskin MG, Murphy JJ, Sreenan JM. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim Reprod Sci. 2006 Dec; 96 (3-4): 297-311. 42. Donaldson WL, Oriol JG, Plavin A, Antczak DF. Developmental regulation of class I major histocompatibility complex antigen expression by equine trophoblastic cells. Differentiation. 1992 Dec; 52 (1): 69-78. ________________________________________________________________________ 85 ___________________________________________________________________________ 43. Dorn AD, Waters WR, Byers VM, Pesch BA, Wannemuehler MJ. Characterization of mitogen-stimulated porcine lymphocytes using a stable fluorescent dye (PKH2) and multicolor flow cytometry. Vet Immunol Immunopathol. 2002 Aug; 87 (1-2): 1-10. 44. Doualla-Bell F, Koromilas AE. Induction of PG G/H Synthase-2 in Bovine Myometrial Cells by Interferon-τ Requires the Activation of the p38 MAPK Pathway. Endocrinology 2001; 142:5107-5115 45. Ealy A, Pennington K, Rodina T. Interferon-tau Polymorphisms and Their Potential Functions in Ruminants. Annu Rev Biomed Sci. 2006; 8 (1): 9-18 46. Ealy AD, Larson SF, Liu L, Alexenko AP, Winkelman GL, Kubisch HM, Bixby JA, Roberts RM. Polymorphic forms of expressed bovine interferon-tau genes: relative transcript abundance during early placental development, promoter sequences of genes and biological activity of protein products. Endocrinology. 2001 Jul;142 (7): 2906-15. 47. Ealy AD, Wagner SK, Sheils AE, Whitley NC, Kiesling DO, Johnson SE, Barbato GF. Identification of interferon-tau isoforms expressed by the peri-implantation goat (Capra hircus) conceptus. Domest Anim Endocrinol. 2004 Jul; 27 (1): 39-49. 48. Ealy AD, Yang QE. Control of interferon-tau expression during early pregnancy in ruminants. Am J Reprod Immunol. 2009 Feb; 61 (2): 95-106. 49. Emond V, Asselin E, Fortier MA, Murphy BD, Lambert RD. Interferon-tau stimulates granulocytemacrophage colony-stimulating factor gene expression in bovine lymphocytes and endometrial stromal cells. Biol Reprod. 2000 Jun; 62 (6): 1728-37. 50. Erdmann J, Vitale G, van Koetsveld PM, Croze E, Sprij-Mooij DM, Hofland LJ, van Eijck CH. Effects of interferons α/β on the proliferation of human micro- and macrovascular endothelial cells. J Interferon Cytokine Res. 2011 May; 31 (5): 451-8. 51. Ezashi T, Das P, Gupta R, Walker A, Roberts RM. The role of homeobox protein distal-less 3 and its interaction with ETS2 in regulating bovine interferon-tau gene expression-synergistic transcriptional activation with ETS2. Biol Reprod 2008; 79:115-24. 52. Ezashi T, Ealy AD, Ostrowski MC, Roberts RM. Control of interferon-τ gene expression by Ets-2. PNAS 1998; 95:7882-7887 53. Ezashi T, Roberts RM. Regulation of interferon-tau (IFN-tau) gene promoters by growth factors that target the Ets-2 composite enhancer: a possible model for maternal control of IFN-tau production by the conceptus during early pregnancy. Endocrinology 2004; 145: 4452-60 54. Faheina-Martins GV, da Silveira AL, Ramos MV, Marques-Santos LF, Araujo DA. Influence of fetal bovine serum on cytotoxic and genotoxic effects of lectins in MCF-7 cells. J Biochem Mol Toxicol. 2011 Sep; 25(5): 290-6. 55. Farin CE, Imakawa K, Hansen TR, McDonnell JJ, Murphy CN, Farin PW, Roberts RM. Expression of trophoblastic interferon genes in sheep and cattle. Biol Reprod. 1990 Aug; 43 (2): 210-8. 56. Fillion C, Chaouat G, Reinaud P, Charpigny JC, Martal J. Immunoregulatory effects of ovine trophoblastin protein (oTP): all five isoforms suppress PHA-induced lymphocyte proliferation. J Reprod Immunol. 1991 Apr; 19 (3): 237-49. ________________________________________________________________________ 86 ___________________________________________________________________________ 57. Flamenbaum I, Galon N. Management of heat stress to improve fertility in dairy cows in Israel. J Reprod Dev 2010; 56 Suppl: S36-41. 58. Fleming JG, Spencer TE, Safe SH, Bazer FW. Estrogen regulates transcription of the ovine oxytocin receptor gene through GC-rich SP1 promoter elements. Endocrinology 2006; 147: 899-911. 59. Gao H, Wu G, Spencer TE, Johnson GA, Bazer FW. Select nutrients in the ovine uterine lumen. V. Nitric oxide synthase, GTP cyclohydrolase, and ornithine decarboxylase in ovine uteri and periimplantation conceptuses. Biol Reprod 2009; 81:67-76. 60. Gardner DK, Leese HJ. Assessment of embryo viability prior to transfer by the noninvasive measurement of glucose uptake. J Exp Zool. 1987 Apr; 242 (1): 103-5. 61. Gierek D, Baczyńska D, Ugorski M, Bazer F, Kurpisz M, Bednarski T, Gorczykowski M, ChełmońskaSoyta A. Differential effect of IFN-tau on proliferation and distribution of lymphocyte subsets in one-way mixed lymphocyte reaction in cows and heifers. J Reprod Immunol. 2006 Oct; 71 (2): 126-31. 62. Gifford CA, Assiri AM, Satterfield MC, Spencer TE, Ott TL. Receptor transporter protein 4 (RTP4) in endometrium, ovary, and peripheral blood leukocytes of pregnant and cyclic ewes. Biol Reprod 2008; 79:518-24 63. Głód W. Rozród i unasiennianie bydła. PWRiL, Warszawa. 1969: 17-21 64. Godkin JD, Smith SE, Johnson RD, Doré JJ. The role of trophoblast interferons in the maintenance of early pregnancy in ruminants. Am J Reprod Immunol 1997; 37:137-43. 65. Goff AK. Steroid hormone modulation of prostaglandin secretion in the ruminant endometrium during the estrous cycle. Biol Reprod 2004; 71(1):11-6. 66. Gogolin-Ewens KJ, Lee CS, Mercer WR, Brandon MR. Site-directed differences in the immune response to the fetus. Immunology. 1989 Feb; 66 (2): 312-7. 67. Goodwin JS, Bankhurst AD, Messner RP. Suppression of human T-cell mitogenesis by prostaglandin. Existence of a prostaglandin-producing suppressor cell. J Exp Med. 1977 Dec; 146 (6): 1719-34. 68. Gordon I. Laboratory Production of Cattle Embryos. 2003: CABI Publishing, ss. 14 i 223 69. Gottshall SL, Hansen PJ. Enhancement of mitogen-induced lymphocyte proliferation in sheep. Zentralbl Veterinarmed B. 1994 Oct; 41 (7-8): 541-7. 70. Gray CA, Abbey CA, Beremand PD, Choi Y, Farmer JL, Adelson DL, Thomas TL, Bazer FW, Spencer TE. Identification of endometrial genes regulated by early pregnancy, progesterone, and interferon tau in the ovine uterus. Biol Reprod. 2006 Feb; 74 (2): 383-94. 71. Green JC, Okamura CS, Poock SE, Lucy MC. Measurement of interferon-tau (IFN-tau) stimulated gene expression in blood leukocytes for pregnancy diagnosis within 18-20d after insemination in dairy cattle. Anim Reprod Sci. 2010 Aug; 121 (1-2): 24-33. 72. Green MP, Spate LD, Bixby JA, Ealy AD, Roberts RM. A comparison of the anti-luteolytic activities of recombinant ovine interferon-alpha and -tau in sheep. Biol Reprod 2005; 73:1087-93. ________________________________________________________________________ 87 ___________________________________________________________________________ 73. Groebner AE, Schulke K, Schefold JC, Fusch G, Sinowatz F, Reichenbach HD, Wolf E, Meyer HH, Ulbrich SE. Immunological mechanisms to establish embryo tolerance in early bovine pregnancy. Reprod Fertil Dev 2011; 23: 619-32. 74. Groebner AE, Schulke K, Unterseer S, Reichenbach HD, Reichenbach M, Büttner M, Wolf E, Meyer HH, Ulbrich SE. Enhanced proapoptotic gene expression of XAF1, CASP8 and TNFSF10 in the bovine endometrium during early pregnancy is not correlated with augmented apoptosis. Placenta. 2010; 31: 16877. 75. Guillomot M, Reinaud P, La Bonnardière C, Charpigny G. Characterization of conceptus-produced goat interferon tau and analysis of its temporal and cellular distribution during early pregnancy. J Reprod Fertil 1998; 112: 149-56. 76. Guzeloglu A, Michel F, Thatcher WW. Differential effects of interferon-tau on the prostaglandin synthetic pathway in bovine endometrial cells treated with phorbol ester. J Dairy Sci. 2004a Jul; 87 (7): 2032-41. 77. Guzeloglu A, Subramaniam P, Michel F, Thatcher WW. Interferon-τ Induces Degradation of Prostaglandin H Synthase-2 Messenger RNA in Bovine Endometrial Cells Through a TranscriptionDependent Mechanism. Biol Reprod 2004b; 71: 170-176. 78. Hadinedoushan H, Mirahmadian M, Aflatounian A. Increased natural killer cell cytotoxicity and IL-2 production in recurrent spontaneous abortion. Am J Reprod Immunol. 2007 Nov; 58 (5): 409-14 79. Han CS, Mathialagan N, Klemann SW, Roberts RM. Molecular cloning of ovine and bovine type I interferon receptor subunits from uteri, and endometrial expression of messenger ribonucleic acid for ovine receptors during the estrous cycle and pregnancy. Endocrinology. 1997 Nov; 138 (11): 4757-67. 80. Hansen PJ, Tekin S. Pregnancy-associated immunoregulatory molecules discovered in ruminants and their possible relevance to other species. Chem Immunol Allergy 2005; 88: 109-16. 81. Hansen PJ. Exploitation of genetic and physiological determinants of embryonic resistance to elevated temperature to improve embryonic survival in dairy cattle during heat stress. Theriogenology. 2007 Sep; 68 Suppl 1: S242-9. 82. Hashizume K, Takahashi T, Shimizu M, Todoroki J, Shimada A, Hirata M, Sato T, Ito A. Matrixmetalloproteinases-2 and -9 production in bovine endometrial cell culture. J Reprod Dev 2003; 49: 4553. 83. Hernandez-Ledezma JJ, Sikes JD, Murphy CN, Watson AJ, Schultz GA, Roberts RM. Expression of bovine trophoblast interferon in conceptuses derived by in vitro techniques. Biol Reprod. 1992 Sep; 47 (3): 374-80 84. Imakawa K, Carlson KD, McGuire WJ, Christenson RK, Taylor A. Enhancement of ovine trophoblast interferon by granulocyte macrophage-colony stimulating factor: possible involvement of protein kinase C. J Mol Endocrinol 1997; 19: 121-30. 85. Imakawa K, Helmer SD, Nephew KP, Meka CS, Christenson RK. A novel role for GM-CSF: enhancement of pregnancy specific interferon production, ovine trophoblast protein-1. Endocrinology 1993; 132: 1869-71. ________________________________________________________________________ 88 ___________________________________________________________________________ 86. Imakawa K, Ji Y, Yamaguchi H, Tamura K, Weber LW, Sakai S, Christenson RK. Co-expression of transforming growth factor beta and interferon tau during peri-implantation period in the ewe. Endocr J 1998; 45: 441-50. 87. Imakawa K, Tamura K, McGuire WJ, Khan S, Harbison LA, Stanga JP, Helmer SD, Christenson RK. Effect of interleukin-3 on ovine trophoblast interferon during early conceptus development. Endocrine 1995; 3: 511-7. 88. Jaśkowski JM. Transfer zarodkow bydlecych w Polsce w latach 1997-1998 - skala i skuteczność metody. Medycyna Wet. 2000; 56 (1), 29-31, 89. Jenkins C, Roberts J, Wilson R, MacLean MA, Shilito J, Walker JJ. Evidence of a T(H) 1 type response associated with recurrent miscarriage. Fertil Steril. 2000 Jun; 73 (6): 1206-8. 90. Johnson GA, Burghardt RC, Newton GR, Bazer FW, Spencer TE. Development and characterization of immortalized ovine endometrial cell lines. Biol Reprod 1999a; 61:1324-30. 91. Johnson KM, Alvarez X, Borkhsenious ON, Kubisch HM. Nuclear and cytoplasmic localization of interferon-tau in in vitro-produced bovine blastocysts. Reprod Nutr Dev 2006; 46: 97-104. 92. Johnson TM, Holaday SK, Sun Y, Subramaniam PS, Johnson HM, Krishna NR. Expression, purification, and characterization of interferon-tau produced in Pichia pastoris grown in a minimal medium. J interferon Cytokine Res. 1999b Jun;19 (6): 631-6. 93. Joshi G, Sharma R, Kakker NK. Phenotypic and functional characterization of T-cells and in vitro replication of FMDV serotypes in bovine lymphocytes. Vaccine. 2009 Nov 12; 27(48): 6656-61. 94. Kanagawa H, Shimohira I, Saitoh N. Manual of bovine embryo transfer. Japan Livestock Technology Association, 1995: 88 95. Karczmarek A (red.). Hodowla bydła. Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu 2005:, 11-12. 96. Kim J, Burghardt RC, Wu G, Johnson GA, Spencer TE, Bazer FW. Select nutrients in the ovine uterine lumen. IX. Differential effects of arginine, leucine, glutamine, and glucose on interferon tau, ornithine decarboxylase, and nitric oxide synthase in the ovine conceptus. Biol Reprod. 2011; 84: 1139-47. 97. Kim S, Choi Y, Bazer FW, Spencer TE. Identification of genes in the ovine endometrium regulated by interferon tau independent of signal transducer and activator of transcription 1. Endocrinology 2003; 144: 5203-14. 98. Kimura K., Mechanisms for Establishment of Pregnancy in Mammalian Species. J Mamm Ova Res. 2005; 22 (3): 101-118 99. King A, Burrows TD, Hiby SE, Bowen JM, Joseph S, Verma S, Lim PB, Gardner L, Le Bouteiller P, Ziegler A, Uchanska-Ziegler B, Loke YW. Surface expression of HLA-C antigen by human extravillous trophoblast. Placenta. 2000 May; 21 (4): 376-87. 100. Kirkbride CA. Etiologic agents detected in a 10-year study of bovine abortions and stillbirths. J Vet Diagn Invest. 1992 Apr; 4 (2): 175-80. ________________________________________________________________________ 89 ___________________________________________________________________________ 101. Kotwica J, Skarzynski D, Bogacki M, Melin P, Starostka B. The use of an oxytocin antagonist to study the function of ovarian oxytocin during luteolysis in cattle. Theriogenology; 1997; 48: 1287-1299. 102. Krishnaswamy N, Danyod G, Chapdelaine P, Fortier MA. Oxytocin receptor down-regulation is not necessary for reducing oxytocin-induced prostaglandin F(2alpha) accumulation by interferon-tau in a bovine endometrial epithelial cell line. Endocrinology 2009; 150: 897-905. 103. Kubisch HM, Larson MA, Ealy AD, Murphy CN, Roberts RM. Genetic and environmental determinants of interferon-tau secretion by in vivo- and in vitro-derived bovine blastocysts. Anim Reprod Sci. 2001 Apr 30; 66 (1-2): 1-13. 104. Kubisch HM, Sirisathien S, Bosch P, Hernandez-Fonseca HJ, Clements G, Liukkonen JR, Brackett BG. Effects of developmental stage, embryonic interferon-tau secretion and recipient synchrony on pregnancy rate after transfer of in vitro produced bovine blastocysts. Reprod Domest Anim. 2004 Apr; 39 (2): 120-4. 105. Kumaran J, Wei L, Kotra LP, Fish EN. A structural basis for interferon-alpha-receptor interactions. FASEB J. 2007; 21: 3288-96. 106. Kurosaka S, Eckardt S, Ealy AD, McLaughlin KJ. Regulation of blastocyst stage gene expression and outgrowth interferon tau activity of somatic cell clone aggregates. Cloning Stem Cells. 2007; 9: 630-41. 107. Lane M, Gardner DK. Lactate regulates pyruvate uptake and metabolism in the preimplantation mouse embryo. Biol Reprod. 2000 Jan; 62 (1): 16-22. 108. Larson MA, Kubisch HM. The effects of group size on development and interferon-tau secretion by invitro fertilized and cultured bovine blastocysts. Hum Reprod 1999; 14: 2075 – 2079. 109. Leaman DW, Cross JC, Roberts RM. Multiple regulatory elements are required to direct trophoblast interferon gene expression in choriocarcinoma cells and trophectoderm. Mol Endocrinol. 1994 Apr; 8 (4): 456-68. 110. Leaman DW, Roberts RM. Genes for the trophoblast interferons in sheep, goat, and musk ox and distribution of related genes among mammals. J Interferon Res. 1992 Feb; 12 (1): 1-11. 111. Lee J, Banu SK, Nithy TK, Stanley JA, Arosh JA. Early pregnancy induced expression of prostaglandin E2 receptors EP2 and EP4 in the ovine endometrium and regulated by interferon tau through multiple cell signaling pathways. Mol Cell Endocrinol. 2011 Aug 31. 112. Leung ST, Derecka K, Mann GE, Flint AP, Wathes DC. Uterine lymphocyte distribution and interleukin expression during early pregnancy in cows. J Reprod Fertil 2000; 119: 25-33. 113. Li J, Alexenko AP, Roberts RM. A bifunctional vector suitable for both site-directed mutagenesis and recombinant expression of interferon-tau in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 1995 Aug; 6(4): 401-7. 114. Li J, Roberts RM. Interferon-tau and interferon-alpha interact with the same receptors in bovine endometrium. Use of a readily iodinatable form of recombinant interferon-tau for binding studies. J Biol Chem 1994a; 269: 13544-50. 115. Li J, Roberts RM. Structure-function relationships in the interferon-tau (IFN-tau). Changes in receptor binding and in antiviral and antiproliferative activities resulting from site-directed mutagenesis performed near the carboxyl terminus. J Biol Chem. 1994b; 269: 24826-33. ________________________________________________________________________ 90 ___________________________________________________________________________ 116. Litwińczuk Z i Szulc T. (red.); Hodowla i użytkowanie bydła. PWRiL Warszawa; 2005:,97. 117. Lonergan P, Rizos D, Gutierrez-Adán A, Moreira PM, Pintado B, de la Fuente J, Boland MP. Temporal divergence in the pattern of messenger RNA expression in bovine embryos cultured from the zygote to blastocyst stage in vitro or in vivo. Biol Reprod. 2003 Oct; 69 (4): 1424-31. 118. Lopes AS, Larsen LH, Ramsing N, Løvendahl P, Räty M, Peippo J, Greve T, Callesen H. Respiration rates of individual bovine in vitro-produced embryos measured with a novel, non-invasive and highly sensitive microsensor system. Reproduction. 2005 Nov; 130 (5): 669-79. 119. Lopes AS, Madsen SE, Ramsing NB, Løvendahl P, Greve T, Callesen H. Investigation of respiration of individual bovine embryos produced in vivo and in vitro and correlation with viability following transfer. Hum Reprod. 2007 Feb; 22 (2): 558-66. 120. Loureiro B, Block J, Favoreto MG, Carambula S, Pennington KA, Ealy AD, Hansen PJ. Consequences of conceptus exposure to colony-stimulating factor 2 on survival, elongation, interferon-τ secretion, and gene expression. Reproduction 2011; 141:617-24. 121. Low BG, Hansen PJ, Drost M, Gogolin-Ewens KJ. Expression of major histocompatibility complex antigens on the bovine placenta. J Reprod Fertil. 1990 Sep; 90 (1): 235-43. 122. Majewska M. Ocena jakościowa i ilościowa subpopulacji limfocytów obecnych we krwi obwodowej i błonie śluzowej macicy u krów we wczesnej ciąży. Praca magisterska (2006): Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt UP we Wrocławiu. 123. Malinowski A. Immunologiczne zaburzenia rozrodu w: Kowalski M. (red.), 2000: Immunologia kliniczna. Mediton – Łódź: 557-593. 124. Mały Rocznik Statystyczny 2010 125. Mándi Y, Vécsei L. The kynurenine system and immunoregulation. J Neural Transm. 2011 Jul 9. 126. Maneglier B, Rogez-Kreuz C, Spreux-Varoquaux O, Malleret B, Thérond P, Samah B, Drouet I, Dormont D, Advenier C, Clayette P. Comparative effects of two type I interferons, human IFN-alpha and ovine IFN-τ on indoleamine-2,3-dioxygenase in primary cultures of human macrophages. Fundam Clin Pharmacol 2007; 21: 29-34. 127. Mann GE, Lamming GE. Relationship between maternal endocrine environment, early embryo development and inhibition of the luteolytic mechanism in cows. Reproduction 2001; 121: 175-178. 128. Martal J, Chêne N, Camous S, Huynh L, Lantier F, Hermier P, L'Haridon R, Charpigny G, Charlier M, Chaouat G. Recent developments and potentialities for reducing embryo mortality in ruminants: the role of IFN-tau and other cytokines in early pregnancy. Reprod Fertil Dev. 1997; 9 (3): 355-80. 129. Martal JL, Chêne NM, Huynh LP, L'Haridon RM, Reinaud PB, Guillomot MW, Charlier MA, Charpigny SY. IFN-tau: a novel subtype I IFN1. Structural characteristics, non-ubiquitous expression, structurefunction relationships, a pregnancy hormonal embryonic signal and cross-species therapeutic potentialities. Biochimie. 1998 Aug-Sep; 80 (8-9): 755-77. 130. Martin C, Pessemesse L, De La Llosa-Hermier MP, Martal J, Djiane J, Charlier M. Interferon-tau upregulates prolactin receptor mRNA in the ovine endometrium during the peri-implantation period. Reproduction 2004; 128: 99-105. ________________________________________________________________________ 91 ___________________________________________________________________________ 131. Massirer KB, Hirata MH, Silva AE, Ferraz ML, Nguyen NY, Hirata RD. Interferon-alpha receptor 1 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells is associated with response to interferon-alpha therapy of patients with chronic hepatitis C. Braz J Med Biol Res. 2004 May; 37 (5): 643-7. 132. Matsuda-Minehata F, Katsumura M, Kijima S, Christenson RK, Imakawa K. Different levels of ovine interferon-tau gene expressions are regulated through the short promoter region including Ets-2 binding site. Mol Reprod Dev. 2005 Sep; 72 (1): 7-15. 133. Matsunaga S, Osawa T, Geshi M, Takahashi H, Inumaru S, Yokomizo Y, Miyake YI. Effect of a single intrauterine administration of recombinant bovine interferon-τ on day 7 of the estrous cycle on the luteal phase length and blood profile in dairy cows. Res Vet Sci. 2011. 134. Medawar PD. Some immunological and endocrinological problems raised by the evolution of viviparity in vertebrates. Symposium of the Society for Experimental Biology. 1953: 320. 135. Michael DD, Alvarez IM, Ocón OM, Powell AM, Talbot NC, Johnson SE, Ealy AD. Fibroblast growth factor-2 is expressed by the bovine uterus and stimulates interferon-tau production in bovine trophectoderm. Endocrinology. 2006b; 147: 3571-9. 136. Michael DD, Wagner SK, Ocón OM, Talbot NC, Rooke JA, Ealy AD (2006a). Granulocyte-macrophage colony-stimulating-factor increases interferon-tau protein secretion in bovine trophectoderm cells. Am J Reprod Immunol 2006a; 56: 63-7. 137. Mincheva-Nilsson L, Hammarström S, Hammarström ML. Human decidual leukocytes from early pregnancy contain high numbers of gamma delta+ cells and show selective down-regulation of alloreactivity. J Immunol. 1992 Sep 15; 149 (6): 2203-11. 138. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65 (1-2): 55-63. 139. Mujtaba MG, Soos JM, Johnson HM. CD4 T suppressor cells mediate interferon tau protection against experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 1997; 75: 35-42. 140. Murphy D, Detjen KM, Welzel M, Wiedenmann B, Rosewicz S. Interferon-alpha delays S-phase progression in human hepatocellular carcinoma cells via inhibition of specific cyclin-dependent kinases. Hepatology. 2001 Feb; 33 (2): 346-56. 141. Nagaoka K, Sakai A, Nojima H, Suda Y, Yokomizo Y, Imakawa K, Sakai S, Christenson RK. A chemokine, interferon (IFN)-gamma-inducible protein 10 kDa, is stimulated by IFN-τ and recruits immune cells in the ovine endometrium. Biol Reprod 2003; 68:1413-21. 142. Nagaya H, Kanaya T, Kaki H, Tobita Y, Takahashi M, Takahashi H, Yokomizo Y, Inumaru S. Establishment of a large-scale purification procedure for purified recombinant bovine interferon-tau produced by a silkworm-baculovirus gene expression system. J Vet Med Sci. 2004 Nov; 66 (11): 1395-401. 143. Neira JA, Tainturier D, L'Haridon RM, Martal J. Comparative IFN-tau secretion after hatching by bovine blastocysts derived ex vivo and completely produced in vitro. Reprod Domest Anim. 2007; 42: 68-75. 144. Niks M, Otto M, Busová B, Stefanovic J. Quantification of proliferative and suppressive responses of human T lymphocytes following ConA stimulation. J Immunol Methods. 1990 Feb 9; 126 (2): 263-71. ________________________________________________________________________ 92 ___________________________________________________________________________ 145. Nitta A, Shirasuna K, Haneda S, Matsui M, Shimizu T, Matsuyama S, Kimura K, Bollwein H, Miyamoto A. Possible involvement of IFNT in lymphangiogenesis in the corpus luteum during the maternal recognition period in the cow. Reproduction. 2011 Sep 20. 146. Niwano Y, Hansen TR, Kazemi M, Malathy PV, Johnson HD, Roberts RM, Imakawa K. Suppression of Tlymphocyte blastogenesis by ovine trophoblast protein-1 and human interferon-alpha may be independent of interleukin-2 production. Am J Reprod Immunol 1989; 20: 21-6. 147. Nojima H, Nagaoka K, Christenson RK, Shiota K, Imakawa K. Increase in DNA methylation downregulates conceptus interferon-tau gene expression. Mol Reprod Dev. 2004; 67: 396-405. 148. Nowell PC. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res. 1960 May; 20: 462-6. 149. O'Gorman GM, Al Naib A, Ellis SA, Mamo S, O'Doherty AM, Lonergan P, Fair T. Regulation of a bovine nonclassical major histocompatibility complex class I gene promoter. Biol Reprod 2010; 83: 296-306. 150. Okuda K, Kasahara Y, Murakami S, Takahashi H, Woclawek-Potocka I, Skarzynski DJ. Interferon-tau blocks the stimulatory effect of tumor necrosis factor-alpha on prostaglandin F2alpha synthesis by bovine endometrial stromal cells. Biol Reprod 2004; 70: 191-7. 151. Oliveira JF, Henkes LE, Ashley RL, Purcell SH, Smirnova NP, Veeramachaneni DN, Anthony RV, Hansen TR. Expression of interferon (IFN)-stimulated genes in extrauterine tissues during early pregnancy in sheep is the consequence of endocrine IFN-tau release from the uterine vein. Endocrinology. 2008 Mar; 149 (3): 1252-9. 152. Overstrom EW, Duby RT, Dobrinsky J, Roche JF, Boland MP. Viability and oxidative metabolism of the bovine blastocyst. Theriogenology. 1992;37: 269-73 153. Parent J, Chapdelaine P, Sirois J, Fortier MA. Expression of microsomal prostaglandin E synthase in bovine endometrium: coexpression with cyclooxygenase type 2 and regulation by interferon-tau. Endocrinology 2002; 143:2936-43. 154. Parent J, Villeneuve C, Alexenko AP, Ealy AD, Fortier MA. Influence of different isoforms of recombinant trophoblastic interferons on prostaglandin production in cultured bovine endometrial cells. Biol Reprod. 2003 Mar; 68 (3): 1035-43. 155. Parish CR. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 1999 Dec; 77 (6): 499-508. 156. Paula-Lopes FF, Chase CC Jr, Al-Katanani YM, Krininger CE 3rd, Rivera RM, Tekin S, Majewski AC, Ocon OM, Olson TA, Hansen PJ. Genetic divergence in cellular resistance to heat shock in cattle: differences between breeds developed in temperate versus hot climates in responses of preimplantation embryos, reproductive tract tissues and lymphocytes to increased culture temperatures. Reproduction. 2003 Feb; 125 (2): 285-94. 157. Pende D, Sivori S, Accame L, Pareti L, Falco M, Geraghty D, Le Bouteiller P, Moretta L, Moretta A. HLAG recognition by human natural killer cells. Involvement of CD94 both as inhibitory and as activating receptor complex. Eur J Immunol. 1997 Aug; 27 (8): 1875-80. ________________________________________________________________________ 93 ___________________________________________________________________________ 158. Pogue SL, Preston BT, Stalder J, Bebbington CR, Cardarelli PM. The receptor for type I IFNs is highly expressed on peripheral blood B cells and monocytes and mediates a distinct profile of differentiation and activation of these cells. J Interferon Cytokine Res. 2004 Feb; 24 (2): 131-9. 159. Pontzer CH, Bazer FW, Johnson HM. Antiproliferative activity of a pregnancy recognition hormone, ovine trophoblast protein-1. Cancer Res. 1991 Oct; 51 (19): 5304-7. 160. Pontzer CH, Yamamoto JK, Bazer FW, Ott TL, Johnson HM. Potent anti-feline immunodeficiency virus and anti-human immunodeficiency virus effect of IFN-tau. J Immunol. 1997 May; 158 (9): 4351-7. 161. Pru JK, Rueda BR, Austin KJ, Thatcher WW, Guzeloglu A, Hansen TR. Interferon-tau suppresses prostaglandin F2alpha secretion independently of the mitogen-activated protein kinase and nuclear factor kappa B pathways. Biol Reprod. 2001 Mar; 64 (3): 965-73. 162. Quade MJ, Roth JA. Dual-color flow cytometric analysis of phenotype, activation marker expression, and proliferation of mitogen-stimulated bovine lymphocyte subsets. Vet Immunol Immunopathol. 1999 Jan 4; 67 (1): 33-45. 163. Quah BJ, Parish CR. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. 2010 Oct; (44). 164. Ramsoondar JJ, Christopherson RJ, Guilbert LJ, Dixon WT, Ghahary A, Ellis S, Wegmann TG, Piedrahita JA. Lack of class I major histocompatibility antigens on trophoblast of periimplantation blastocysts and term placenta in the pig. Biol Reprod. 1999 Feb; 60 (2): 387-97. 165. Renner L, Schwabe A, Döll S, Höltershinken M, Dänicke S. Effect of rare earth elements on beef cattle growth performance, blood clinical chemical parameters and mitogen stimulated proliferation of bovine peripheral blood mononuclear cells in vitro and ex vivo. Toxicol Lett. 2011 Mar 25; 201 (3): 277-84. 166. Rieger D, Guay P. Measurement of the metabolism of energy substrates in individual bovine blastocysts. J Reprod Fertil. 1988 Jul; 83 (2): 585-91. 167. Roberts RM, Ealy AD, Alexenko AP, Han CS, Ezashi T. Trophoblast interferons. Placenta. 1999 May; 20 (4): 259-64. 168. Roberts RM, Liu L, Alexenko A. New and atypical families of type I interferons in mammals: comparative functions, structures, and evolutionary relationships. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1997; 56: 287325. 169. Roberts RM, Liu L, Guo Q, Leaman D, Bixby J. The evolution of the type I interferons. J Interferon Cytokine Res. 1998 Oct;18 (10): 805-16. Erratum in: J Interferon Cytokine Res 1999 Apr;19 (4): 427 170. Roberts RM. Interferon-tau, a Type 1 interferon involved in maternal recognition of pregnancy. Cytokine Growth Factor Rev. 2007 Oct-Dec; 18 (5-6): 403-8. 171. Robinson RS, Fray MD, Wathes DC, Lamming GE, Mann GE. In vivo expression of interferon tau mRNA by the embryonic trophoblast and uterine concentrations of interferon tau protein during early pregnancy in the cow. Mol Reprod Dev 2006; 73: 470-4. 172. Robinson RS, Mann GE, Lamming GE, Wathes DC. The effect of pregnancy on the expression of uterine oxytocin, oestrogen and progesterone receptors during early pregnancy in the cow. J Endocrinol. 1999 Jan; 160 (1): 21-33. ________________________________________________________________________ 94 ___________________________________________________________________________ 173. Rogez C, Martin M, Dereuddre-Bosquet N, Martal J, Dormont D, Clayette P. Anti-human immunodeficiency virus activity of tau interferon in human macrophages: involvement of cellular factors and betachemokines. J Virol. 2003 Dec; 77 (23): 12914-20. 174. Rogez-Kreuz C, Manéglier B, Dereuddre-Bosquet N, Dormont D, Clayette P. Lack of IFN-gamma production in response to antigenic stimulation in human IFN-tau-treated lymphocytes. J Interferon Cytokine Res 2005; 25: 444-52. 175. Rosenfeld CS, Han CS, Alexenko AP, Spencer TE, Roberts RM. Expression of interferon receptor subunits, IFNAR1 and IFNAR2, in the ovine uterus. Biol Reprod. 2002 Sep; 67 (3): 847-53. 176. Rubinstein YR, Pontzer CH. Loss of interferon alpha and interferon tau-induced antiviral protection in interferon regulatory factor-2 DNA-binding domain dominant negative mutants. Antiviral Res 2000; 46: 207-13. 177. Russell DF, Baqir S, Bordignon J, Betts DH. The impact of oocyte maturation media on early bovine embryonic development. Mol Reprod Dev. 2006; 73: 1255-70. 178. Ryan AM, Gallagher DS, Womack JE. Somatic cell mapping of omega and trophoblast interferon genes to bovine syntenic group U18 and in situ localization to chromosome 8. Cytogenet Cell Genet. 1993; 63 (1): 6-10. 179. Rycombel D.: Produkcja wołowiny i cielęciny. Publikacja Funduszu Współpracy Agro-Info w serii Polska Wieś w Europie 2004. (http://www.agro.mckirg.ires./rynki/wolowina.pdf) 180. Saini V, Arora S, Yadav A, Bhattacharjee J. Cytokines in recurrent pregnancy loss. Clin Chim Acta 2011; 412: 702-8. 181. Sakurai T, Bai H, Konno T, Ideta A, Aoyagi Y, Godkin JD, Imakawa K. Function of a transcription factor CDX2 beyond its trophectoderm lineage specification. Endocrinology 2010; 151: 5873-81. 182. Sakurai T, Sakamoto A, Muroi Y, Bai H, Nagaoka K, Tamura K, Takahashi T, Hashizume K, Sakatani M, Takahashi M, Godkin JD, Imakawa K. Induction of endogenous interferon tau gene transcription by CDX2 and high acetylation in bovine nontrophoblast cells. Biol Reprod 2009; 80: 1223-31. 183. Samuel CE. Interferons, Interferon Receptors, Signal Transducer and Transcriptional Activators, and Interferon Regulatory Factors. J Biol Chem 2007; 282: 20045-20046. 184. Sandra O, Bataillon I, Roux P, Martal J, Charpigny G, Reinaud P, Bolifraud P, Germain G, Al-Gubory KH. Suppressor of cytokine signalling (SOCS) genes are expressed in the endometrium and regulated by conceptus signals during early pregnancy in the ewe. J Mol Endocrinol 2005; 34: 637-44. 185. Sartori R, Gümen A, Guenther JN, Souza AH, Caraviello DZ, Wiltbank MC. Comparison of artificial insemination versus embryo transfer in lactating dairy cows. Theriogenology. 2006 Apr 15; 65 (7): 131121. 186. Schmid I, Cole SW, Zack JA, Giorgi JV. Measurement of lymphocyte subset proliferation by three-color immunofluorescence and DNA flow cytometry. J Immunol Methods. 2000 Feb 21; 235 (1-2): 121-31 187. Senda T, Saitoh SI, Mitsui Y, Li J, Roberts RM. A three-dimensional model of interferon-tau. J Interferon Cytokine Res. 1995; 15: 1053-60. ________________________________________________________________________ 95 ___________________________________________________________________________ 188. Short EC Jr, Geisert RD, Helmer SD, Zavy MT, Fulton RW. Expression of antiviral activity and induction of 2',5'-oligoadenylate synthetase by conceptus secretory proteins enriched in bovine trophoblast protein-1. Biol Reprod. 1991 Feb; 44 (2): 261-8. 189. Skarzynski DJ, Bogacki M, Kotwica J. Involvement of ovarian steroids in basal and oxyticin-stimulated prostaglandin F2α secretion by the bovine endometrium in vitro. Theriogenology; 1999b; 52: 385-397. 190. Skarżyński DJ, Miyamoto Y, Okuda K. Production of prostaglandin F2α by cultured bovine endometrial cells in response to tumor necrosis factor α: cell type specifity and intracellular mechanisms. Biology of Reproduction; 2000; 62: 1116-1120. 191. Skopets B, Li J, Thatcher WW, Roberts RM, Hansen PJ. Inhibition of lymphocyte proliferation by bovine trophoblast protein-1 (type I trophoblast interferon) and bovine interferon-alpha I1. Vet Immunol Immunopathol. 1992 Oct; 34 (1-2): 81-96. 192. Smith JL, Barker CR. Production of mitogenic factor by concanavalin A stimulated lymphocytes. Clin Exp Immunol. 1972 Dec; 12 (4): 507-14. 193. Song G, Satterfield MC, Kim J, Bazer FW, Spencer TE. Progesterone and interferon tau regulate leukemia inhibitory factor receptor and IL6ST in the ovine uterus during early pregnancy. Reproduction 2009; 137 (3): 553-65. 194. Song G, Spencer TE, Bazer FW. Cathepsins in the ovine uterus: regulation by pregnancy, progesterone, and interferon tau. Endocrinology 2005; 146: 4825-33. 195. Soos JM, Mujtaba MG, Subramaniam PS, Streit WJ, Johnson HM. Oral feeding of interferon tau can prevent the acute and chronic relapsing forms of experimental allergic encephalomyelitis. J Neuroimmunol 1997; 75: 43-50. 196. Soos JM, Subramaniam PS, Hobeika AC, Schiffenbauer J, Johnson HM. The IFN pregnancy recognition hormone IFN-tau blocks both development and superantigen reactivation of experimental allergic encephalomyelitis without associated toxicity. J Immunol. 1995 Sep 1; 155 (5): 2747-53. 197. Sparreboom A, Rongen HAH, van Bennekom. WP Assays for interferons and interleukins in biological matrices. Analytica Chimica Acta . 1994Sept; 295 (1-2): 1-26. 198. Spencer TE, Bazer FW. Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 2004 Jul; 2: 49. 199. Spencer TE, Bazer FW. Ovine interferon tau suppresses transcription of the estrogen receptor and oxytocin receptor genes in the ovine endometrium. Endocrinology 1996; 137: 1144-7. 200. Spencer TE, Ott TL, Bazer FW. Expression of interferon regulatory factors one and two in the ovine endometrium: effects of pregnancy and ovine interferon tau. Biol Reprod 1998; 58: 1154-62. 201. Spencer TE, Sandra O, Wolf E. Genes involved in conceptus-endometrial interactions in ruminants: insights from reductionism and thoughts on holistic approaches. Reproduction. 2008 Feb; 135 (2): 16579. 202. Spencer TE, Stagg AG, Ott TL, Johnson GA, Ramsey WS, Bazer FW. Differential effects of intrauterine and subcutaneous administration of recombinant ovine interferon tau on the endometrium of cyclic ewes. Biol Reprod 1999; 61 (2): 464-70. ________________________________________________________________________ 96 ___________________________________________________________________________ 203. Stankiewicz W. Hematologia weterynaryjna. PZRiL, Warszawa; 1973: 26. 204. Stevenson JS. Reproductive management of dairy cows in high milk-producing herds. J Dairy Sci. 2001; 84 (E. Suppl.): E128-E143. 205. Stewart MD, Johnson GA, Vyhlidal CA, Burghardt RC, Safe SH, Yu-Lee LY, Bazer FW, Spencer TE. Interferon-tau activates multiple signal transducer and activator of transcription proteins and has complex effects on interferon-responsive gene transcription in ovine endometrial epithelial cells. Endocrinology. 2001 Jan;142(1):98-107. 206. Stiekema FE, Kapsenberg ML. Accessory cell requirements in mitogen-induced rabbit T lymphocyte proliferation in an improved tissue culture system. In Vitro Cell Dev Biol. 1987 Apr; 23 (4): 253-6. 207. Stojkovic M, Wolf E, Büttner M, Berg U, Charpigny G, Schmitt A, Brem G. Secretion of biologically active interferon tau by in vitro-derived bovine trophoblastic tissue. Biol Reprod. 1995 Dec; 53 (6): 1500-7. 208. Storie I, Sawle A, Goodfellow K, Whitby L, Granger V, Ward RY, Peel J, Smart T, Reilly JT, Barnett D. Perfect count: a novel approach for the single platform enumeration of absolute CD4+ T-lymphocytes. Cytometry B Clin Cytom. 2004 Jan; 57 (1): 47-52. 209. Subramaniam PS, Khan SA, Pontzer CH, Johnson HM. Differential recognition of the type I interferon receptor by interferons tau and alpha is responsible for their disparate cytotoxicities. PNAS 1995; 92: 12270-4. 210. Swain JE, Bormann CL, Clark SG, Walters EM, Wheeler MB, Krisher RL. Use of energy substrates by various stage preimplantation pig embryos produced in vivo and in vitro. Reproduction. 2002 Feb; 123 (2): 253-60. 211. Tabakov VU, Litvina MM, Schepkina JV, Jarilin AA, Chestkov VV. Studying the proliferation of human peripheral blood T lymphocytes in serum-free medium. Bull Exp Biol Med. 2009 Jan; 147 (1): 120-4. 212. Teixeira MG, Austin KJ, Perry DJ, Dooley VD, Johnson GA, Francis BR, Hansen TR. Bovine granulocyte chemotactic protein-2 is secreted by the endometrium in response to interferon-tau (IFN-tau). Endocrine. 1997 Feb; 6 (1): 31-7. 213. Tekin S, Ealy AD, Wang SZ, Hansen PJ. Differences in lymphocyte-regulatory activity among variants of ovine IFN-tau. J Interferon Cytokine Res. 2000 Nov; 20 (11): 1001-5. 214. Tekin S, Hansen PJ. Natural killer-like cells in the sheep: functional characterization and regulation by pregnancy-associated proteins. Exp Biol Med (Maywood) 2002; 227: 803-11. 215. Tierney TJ, Simpson-Morgan MW. The proliferative responses of lymphocytes from foetal calves and adult cattle. Vet Immunol Immunopathol. 1997 Oct 6; 59 (1-2): 49-64. 216. Tithof PK, Roberts MP, Guan W, Elgayyar M, Godkin JD. Distinct phospholipase A2 enzymes regulate prostaglandin E2 and F2alpha production by bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol 2007; 5: 16. 217. Todd I, McElveen JE, Lamming GE. Ovine trophoblast interferon enhances MHC class I expression by sheep endometrial cells. J Reprod Immunol. 1998 Feb; 37 (2): 117-23. ________________________________________________________________________ 97 ___________________________________________________________________________ 218. Tuo W, Bazer FW, Davis WC, Zhu D, Brown WC (1999a). Differential effects of type I IFNs on the growth of WC1- CD8+ gamma delta T cells and WC1+ CD8- gamma delta T cells in vitro. J Immunol 1999; 162: 245-53. 219. Tuo W, MacMillan H, Günter N, Bazer FW, Brown WC. Upregulation of interleukin-4 and IFN-gamma expression by IFN-tau, a member of the type I IFN family. J Interferon Cytokine Res. 1999 Feb; 19 (2): 179-87. 220. Vander Wielen AL, King GJ. Intraepithelial lymphocytes in the bovine uterus during the oestrous cycle and early gestation. J Reprod Fertil. 1984 Mar; 70 (2): 457-62. 221. Walczak R, Śniadek P, Dziuban JA, Kluger J, Chełmońska-Soyta A. Supravital fluorometric apoptosis detection in a single mouse embryo using lab-on-a-chip. Lab Chip. 2011, 11, 3263-8 222. Walczak R. Lab-on-a-chip fluorescence detection with image sensor and software-based image conditioning. Bulletin of the Polish Academy of Science Technical Science. 2011; 59 (2): 157-65 223. Walker AM, Kimura K, Roberts RM. Expression of bovine interferon-tau variants according to sex and age of conceptuses. Theriogenology. 2009 Jul; 72 (1): 44-53. 224. Walsh SW, Williams EJ, Evans AC. A review of the causes of poor fertility in high milk producing dairy cows. Anim Reprod Sci 2011; 123: 127-38. 225. Wang B, Goff AK. Interferon-tau stimulates secretion of macrophage migration inhibitory factor from bovine endometrial epithelial cells. Biol Reprod 2003; 69:1690-6. 226. Waters WR, Nonnecke BJ, Olsen SC, Palmer MV. Effects of pre-culture holding time and temperature on interferon-gamma responses in whole blood cultures from Mycobacterium bovis-infected cattle. Vet Microbiol. 2007 Jan; 119 (2-4): 277-82. 227. Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? Immunol Today 1993; 14: 353-6. 228. Wessely R. Interference by interferons: Janus faces in vascular proliferative diseases. Cardiovasc Res 2005; 66: 433-43. 229. Williams DL, Lo JL, Amborski GF. Enrichment of T lymphocytes from bovine peripheral blood mononuclear cells using an immuno-affinity depletion technique ("panning"). Vet Immunol Immunopathol. 1986 Feb; 11 (2): 199-204. 230. Wilson R, Jenkins C, Miller H, McInnes IB, Moore J, McLean MA, Walker JJ. Abnormal cytokine levels in non-pregnant women with a history of recurrent miscarriage. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004 Jul; 115 (1): 51-4. 231. Winkelman GL, Roberts RM, James Peterson A, Alexenko AP, Ealy AD. Identification of the expressed forms of ovine interferon-tau in the periimplantation conceptus: sequence relationships and comparative biological activities. Biol Reprod. 1999 Dec; 61 (6): 1592-600. 232. Woclawek Potocka I, Brzezicka E, Skarzynski DJ. Lysophosphatic acid modulates prostaglandin secretion in the bovine endometrial cells differently on Days 8-10 of the estrous cycle and early pregnancy. Journal of Reproduction and Development; 2009; 55(4): 393-399. ________________________________________________________________________ 98 ___________________________________________________________________________ 233. Wood GW. Is restricted antigen presentation the explanation for fetal allograft survival? Immunol Today. 1994 Jan; 15 (1): 15-8. 234. Xavier F, Lagarrigue S, Guillomot M, Gaillard-Sanchez I. Expression of c-fos and jun protooncogenes in ovine trophoblasts in relation to interferon-tau expression and early implantation process. Mol Reprod Dev 1997; 46: 127-37. 235. Xiao CW, Liu JM, Sirois J, Goff AK. Regulation of cyclooxygenase-2 and prostaglandin F synthase gene expression by steroid hormones and interferon-tau in bovine endometrial cells. Endocrinology 1998; 139: 2293-9. 236. Xiao CW, Murphy BD, Sirois J, Goff AK. Down-regulation of oxytocin-induced cyclooxygenase-2 and prostaglandin F synthase expression by interferon-tau in bovine endometrial cells. Biol Reprod. 1999 Mar;60(3): 656-63. 237. Xu N, Takahashi Y, Matsuda F, Sakai S, Christenson RK, Imakawa K. Coactivator CBP in the regulation of conceptus IFNtau gene transcription. Mol Reprod Dev 2003; 65: 23-9. 238. Yamaguchi H, Ikeda Y, Moreno JI, Katsumura M, Miyazawa T, Takahashi E, Imakawa K, Sakai S, Christenson RK. Identification of a functional transcriptional factor AP-1 site in the sheep interferon tau gene that mediates a response to PMA in JEG3 cells. Biochem J 1999a; 340: 767-73. 239. Yamaguchi H, Ikeda Y, Taylor A, Katsumura M, Miyazawa T, Takahashi E, Imakawa K, Sakai S. Effects of PMA and transcription factors on ovine interferon-tau transactivation in various cell lines. Endocr J. 1999b; 46: 383-8. 240. Yamaguchi H, Katsumura M, Imakawa K, Sakai S, Christenson RK. Analysis of possible silencer elements of ovine interferon-tau gene. Endocr J 2000; 47:137-42. 241. Yang QE, Johnson SE, Ealy AD. Protein kinase C delta mediates fibroblast growth factor-2-induced interferon-tau expression in bovine trophoblast. Biol Reprod 2011; 84: 933-43. 242. Yankey SJ, Hicks BA, Carnahan KG, Assiri AM, Sinor SJ, Kodali K, Stellflug JN, Stellflug JN, Ott TL. Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred, nonpregnant ewes. J Endocrinol. 2001 Aug; 170 (2): R7-11. 243. Yao N, Wan PC, Hao ZD, Gao FF, Yang L, Cui MS, Wu Y, Liu JH, Liu S, Chen H, Zeng SM. Expression of interferon-tau mRNA in bovine embryos derived from different procedures. Reprod Domest Anim. 2009 Feb; 44 (1): 132-9. 244. Żółkowski J, Przysucha T. Praktyczne porady dla hodowców bydła. Wydawnictwo SGGW, Warszawa, 2005: 115 ________________________________________________________________________ 99 ___________________________________________________________________________ VIII. Streszczenie Głównym założeniem pracy było opracowanie metody oceny aktywności biologicznej IFN-τ produkowanego przez zarodki bydlęce metodą IVM-IVF (in vitro Maturation - in vitro Fertilisation) na podstawie jego antyproliferacyjnego oddziaływania wobec limfocytów krwi obwodowej bydła, jako techniki która w przyszłości będzie mogła służyć do kwalifikacji zarodków do zabiegu embiotransferu. W pracach pilotażowych użyto roIFN-tau. Wykazano, że populacją docelową dla ro-IFN-τ są limfocyty T z receptorem TCRγδ+. Ocenę efektywności antyproliferacyjnej oparto o technikę cytometrii i metodę mikromiareczkowania kolorymetryczną z MTT. Hamowanie proliferacji limfocytów TCRγδ+ przez ro-IFN-τ okazało się być bardzo czułym wskaźnikiem jego aktywności. Antyproliferacyjne efekt ro-IFN-τ zależał od jego stężenia a przy niskich jego wartościach efekt ten był liniowy. W celu ograniczenia wpływu osobniczej wrażliwości limfocytów na działanie IFN-tau opracowano metodę kontroli aktywności antyproliferacyjnej IFN-tau wobec krikonserwowanych limfocytów krwi obwodowej wyselekcjonowanego zwierzęcia. Zawarty w supernatantach znad hodowli zarodków IFN-τ wykazywał antyproliferacyjną aktywność wobec kriokonserwowanych limfocytów krwi obwodowej, w tym wobec limfocytów z receptorem TCRγδ,+ jednak efekt nie zależał od jego stężenia.. W celu ostatecznej weryfikacji przydatności opracowanego testu, w przyszłości należy dopracować sposób przygotowania prób do badań, w tym ograniczenia (eliminacji) wpływu czynników zawartych w medium hodowlanym, sprawdzić zdolność hamowania proliferacji supernatantów znad hodowli pojedynczych zarodków oraz co najważniejsze sprawdzić czy zdolność hamowania proliferacji przez IFN-tau pochodzenia zarodkowego ma wpływ na wyniki embriotransferu. Przedstawiona w pracy metoda jest całkowicie nieinwazyjna i nie wyklucza stosowania innych testów oceny zarodków a konieczna do badań objętość materiału jest stosunkowo mała. Dodatkowym efektem prowadzonych badań było opracowanie prostej, taniej i stosunkowo szybkiej techniki oceny proliferacji przy zastosowaniu cytometrii przepływowej. Słowa kluczowe: interferon tau, limfocyty, zarodki bydlęce, ocena zarodków, MTT, cytometria przepływowa ________________________________________________________________________ 100
