podawanego metyloprednizolonu na parametry układu

FARMAKOTERAPIA W PSYCHIATRII I NEUROLOGII, 2002, 2, 160-165
Katarzyna Kurowska, Dagmara Mirowska, Anna
Członkowska
Wpływ dożylnie
podawanego metyloprednizolonu
na parametry układu immunologicznego
u chorych na stwardnienie rozsiane w trakcie rzutu
II Klinika Neurologiczna Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie
Katedra i Zakład Farmakologii Doświadczalnej i Klinicznej Akademii Medycznej w Warszawie
Streszczenie
Podawanie glikokortykosteroidów jest najczęściej stosowaną metodą leczenia rzutów stwardnienia
rozsianego. Nie do końca jednak został wyjaśniony mechanizm ich działania w zaostrzeniach choroby. Celem naszej pracy była ocena parametrów profilu immunologicznego (odsetka limfocytów B, T
i ich subpopulacji, monocytów oraz wydzielanej przez nie cytokin IL-6 i IL-S) we kIwi obwodowej.
Za pomocą cytometrii przepływowej zbadano krew obwodową 10 chorych w trakcie stosowania
preparatu Solu-Medrol. Obserwowano istotną statystycznie poprawę stopnia niesprawności mierzonej w skali EDSS. Odnotowano także istotny wzrost odsetka limfocytów B oraz spadek limfocytów T supresorowych. Wyniki badania wskazują, że GS wpływają nie tylko na poprawę stanu
klinicznego, ale także wywierają wpływ na parametry profilu immunologicznego krwi obwodowej.
Summary
Glicocortycosteroids (GS) are the most common therapy of multiple sclerosis relapses, however
mechanism ofbeneficial effect is not fully known. The aim of our study was to evaluate the changes
of immunological profile (percentage of lymphocytes B, T and monocytes, and produced by this
cells IL-6 and IL-S) during intravenous administration of Solu-Medrol. Using two-colour flow
cytometry we have studied peripherial blood of 10 patients during exacerbation. We have observed
statistically significant improvment of distabiIity measured with EDSS. StatisticaIly significant
increase in Iymphocyte B percentage and decrease in supressor T celi s was also noted. Results of
our study indicate that GS therapy affects not only clinical state but also parameters ofperipherial
blood immune profile.
Wstęp
Stwardnienie rozsiane (s.r.) jest przewlekłą chorobą demielinizacyjną ośrodko­
wego układu nerwowego (oun) o złożonej etiologii, w której prawdopodobnie dużą
rolę odgrywają zaburzenia o charakterze autoinununologicznym, prowadzące do
niszczenia osłonek mielinowych włókien nerwowych.
W patogenezie s.r. dominuje odpowiedź immunologiczna typu komórkowego,
a przede wszystkim aktywacja limfocytów T CD4+ (głównie subpopulacji Thl).
Mechanizm ten jednak nie został jak dotąd bliżej wyjaśniony. Dzięki aktywacji
we krwi obwodowej, co wydaje się czynnikiem niezbędnym dla zapoczątkowania
procesu autoinununologicznego w s.r., limfocyty T stają się zdolne do przechodzenia do oun. Proliferacja limfocytów i wydzielanie przez nie cytokin o działaniu
WPŁYW DOŻYLNIE PODAWANEGO METYLOPREDNIZOLONU
161
prozapalnym, metaloproteaz oraz zwiększenie ekspresji cząstek adhezyjnych powoduje bowiem uszkodzenie bariery krew-mózg i ułatwienie przenikania przez
nią następnych komórek. W obrębie oun dalsza aktywacja i penetracja autoreaktywnych komórek T jest możliwa pod warunkiem ponownego pobudzenia przez
swoisty dla nich antygen (znajdujący się na komórkach prezentujących antygen,
np. komórkach mikrogleju). W kolejnym etapie dochodzi do aktywacji i "wciąg­
nięcia" w toczący sięjuż proces zapalny innych komórek: limfocytów B, cytotoksycznych limfocytów T, komórek mikro gleju i astrocytów. Efektem jest synteza
i wydzielanie cytokin prozapalnych: IFN -y, IL-1, IL-6, IL-8 i TNF -ex:, a także
innych chemokin, przeciwciał i enzymów proteolitycznych. (Bar, Oliviera i wsp.
1999, Franchimont, Louis i wsp. 1998, Oliveri, Valentino i wsp. 1998).
We krwi obwodowej chorych na s.r. stwierdza się zwiększone stężenie i wzrost
produkcji niektórych cytokin, np.: IFN-y, TNF-ex:, TNF-p, IL-6 i IL-8.
IL-6 jest cytokiną produkowaną przede wszystkim przez monocyty i makrofagi, ale także fibroblasty, komórki śródbłonka, limfocyty T i B, keratynocyty,
chondrocyty, komórki owodni, komórki rezydujące w oun (w tym astrocyty
i komórki mikrogleju).
Głównymi czynnikami indukującymi produkcję tej interleukiny są IL-I, interferony, TNF, LPS i wirusy. IL-6 hamuje zwrotnie wydzielanie TNF. IL-6 należy
do grupy czynników aktywujących geny dla białek ostrej fazy.
Działanie IL-6 jest wielokienmkowe: pobudza syntezę białek ostrej fazy
w wątrobie, podtrzymuje przeżywanie niektórych neuronów, w oddziaływaniu na
limfocyty B stymuluje tenninalne różnicowanie w kierunku komórek uwalniają­
cych immunoglobuliny różnych klas, uczestniczy też w aktywacji rozpoznających
antygen limfocytów T i ich różnicowaniu w kierunku limfocytów T cytotoksycznych. Rola IL-6 w patogenezie s.r nie jest jednoznacznie określona. Interleukina
ta prawdopodobnie pobudza syntezę przeciwciał przeciwwirusowych, sprzyja
procesom regeneracji neuronów poprzez działanie przeciwzapalne (hamowanie
syntezy TNF-ex:, IL-beta1a, indukowanie antagonistów receptorów dla IL-1).
IL-6 może ponadto chronić komórki oligodendrogleju przed działaniem TNF-ex:.
Wydaje się również, Że IL-6 mOŻe pobudzać sekrecję autoprzeciwciał przeciwmielinowych oraz indukować ich działanie remielinizacyjne (Navikas, Matusevicius
i wsp. 1996, Alenka, Rabatic i wsp. 1999, Gagro, Rabatic i wsp. 1999).
IL-8 jest chemokiną produkowaną głównie przez makrofagi i monocyty. Jej
wydzielanie wzmagają zarówno IL-1, jak i TNFex:. Jednym z czynników regulujących ekspresję genu dla IL-8 jest receptor dla glikokortykosteroidów.
Oddziaływanie IL-8 na neutrofile obejmuje chemotaksję (przyciąganie do
miejsca reakcji zapalnej czy immunologicznej, pobudzanie ich właściwości bakteriobójczych), degranulację i uwolnienie enzymów lizosomalnych oraz działanie
cytotoksyczne. Interleukina ta stymuluje przechodzenie krążących limfocytów T
przez wysoki śródbłonek naczyń żylnych pozawłosowatych, indukuje uwalnianie
przez bazofile niektórych mediatorów reakcji anafilaktycznej (np.: histaminy,
leukotrienu B4). IL-8 indukuje szybki napływ neutrofili do ognisk zapalnych
w oun i natychmiastową egzocytozę proteaz prowadząc do uszkodzenia struktur
162
K. KUROWSKA, D. MIROWSKA, A.
CZŁONKOWSKA
białkowych.
Astrocyty i mikro glej zdrowej tkanki mózgowej posiadają niewielkie
ilości receptorów dla IL-8. Badania przeprowadzone (post mortem) na mózgach
pacjentów chorujących na s.r. wykazały znaczny wzrost ekspresji receptorów dla
IL-8. Przypuszcza się, że ta chemokina może odgrywać znaczącą rolę w promowaniu reakcji zapalnej rozwijającej się w oun. Zmniejszenie jej wydzielania przez
komórki należące do układu immunologicznego, głównie granulocyty w trakcie
podawania metylprednizolonu mogłoby być jednym z elementów wyjaśniających
pozytywny wpływ leku na przebieg zaostrzenia s.r. (Eleovara, Lalla i wsp. 1998,
Gagro, Rabatic i wsp 1999, Hesselenger, Horuk i wsp. 1999).
Stosowanie w leczeniu rzutu s.r. dużych dawek glikokortykosteroidów (GS),
podawanych dożylnie przez kilka dni (3-5), jest powszechnie stosowaną metodą.
Spośród GS najczęściej podawany jest metyloprednizolon (Gasperini, Pozzili
i wsp. 1998, Hawkins, Wolinsky i wsp. 2001, Leussink, Jung i wsp. 2001).
Spośród mechanizmów działania glikokrtykosteroidów (GS), które zostały potwierdzone w badaniach na modelach zwierzęcych, a mogą mieć znaczenie w leczeniu rzutów s.r. uważa się:
l. Zmniejszenie ekspresji antygenów MHC (głównego układu zgodności tlcankowej człowieka) klasy II na powierzchni makrofagów i ograniczenie
wytwarzania leukotrienów i prostaglandyn, co powoduje zwężenie naczyń
włosowatych, ogranicza obrzęk, odkładanie depozytów fibryny oraz migrację komórek reakcji zapalnej do otaczających tkanek, a także zahamowanie
degranulacji tych komórek.
2. Redystrybucję limfocytów T, apoptozę dojrzałych form limfocytów oraz
zahamowanie ich aktywacji.
3. Ograniczenie wytwarzania interleukin o działaniu prozapalnym, np. IL-l,
IL-2, IL-8.
4. Zahamowanie aktywności komórek śródbłonka, szczególnie w kontekście
ekspresji na ich powierzchni cząstek adhezyjnych oraz ekspresji receptorów dla cząstek adhezyjnych na powierzchni limfocytów T.
5. Ograniczenie syntezy immunoglobulin, za wyjątkiem IgE.
Wszystkie powyższe elementy odgrywają znaczącą rolę w stabilizacji uszkodzonej bariery krew-mózg i zahamowaniu napływu komórek immunologicznych
do oun, oraz w tworzeniu się miejscowej reakcji zapalnej (Elovaara, Lalla i wsp.
1998, Franchimont, Louis i wsp. 1998, Hesselenger, Horuk i wsp. 1999, Lessiuk,
Jung i wsp. 2001).
Celem naszego badania było określenie wpływu dożylnie podawanego metyloprednizolonu na rozkład podstawowych fenotypów komórkowych (limfocytów
i monocytów) krwi obwodowej oraz wydzielanych przez te komórki IL-6 i IL-8.
Materiał
Do badania zostali włączeni chorzy na s.r. (spełniający kryteria rozpoznania
według McDonalda) leczeni w II Klinice Neurologicznej IPiN z powodu zaostrzenia s.r. Średnia wieku w badanej grupie wynosiła 32 lata ± 11 ,21 (najmłodszy
WPŁYW DOŻYLNIE PODAWANEGO METYLOPREDNIZOLONU
163
pacjent miał 21 lat, najstarszy SO lat). Czas trwania choroby wynosił średnio
2,8S±3,S3. Zbadano S kobiet i S mężczyzn. Połowa z chorych otrzymała SOO mg
metyloprednizolonu (preparat SoluMedrol) a druga połowa 1000 mg leku na
dawkę stosowanego przez S kolejnych dni we wlewie dożylnym.
Żadna z osób badanych nie przyjmowała leków zmieniających naturalny
przebieg choroby (interferony, glatiamer, cytostatyki lub immunoglobuliny podawane dożylnie)
Metoda
Do oceny parametrów profilu immunologicznego wykorzystana została krew
pobrana na heparynę (probówki Primavette a 7,S mI, Sarstedt, Niemcy)
w ilości ok. S,O mI przed leczeniem oraz w 7 dobie od momenhl rozpoczęcia terapii.
Po wstępnym przygotowaniu materiału (izolacja metodą wirowania w gradiencie
stężeń lub lizowanie krwinek czerwonych) według odpowiednich procedur dostarczonych przez producenta (Becton Dickinson, USA), poszczególne markery
powierzchniowe oraz interleukiny wewnątrzkomórkowe zostały zidentyfikowane
za pomocą antyludzkich przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z barwnikami
fluorescencyjnymi (fikoerytryną - PE lub izotiocyjanianem fluoresceiny - PITC).
Przy użyciu gotowych kompletów przeciwciał należących do zestawu Simultest IMK Lymphocyte® (Becton Dickinson, USA) z pełnej krwi oznaczono następujące fenotypy komórkowe: CD3+CD 19- (limfocyty T), CD3-CD 19+ (limfocyty B), CD3+CD4+ (limfocyty Th), CD3+CD8+ (limfocyty Ts), CD3-CDS6+CDI6+
(komórki NK).
Ponadto za pomocą odpowiednio dobranych zestawów przeciwciał, oznaczone zostały w wyizolowanych limfocytach, monocytach i garnulocytach
wewnątrzkomórkowe interleukiny: CD3+IL-6 (IL-6 wytwarzana przez limfocyty T), CDI4+IL-6 (lL-6 wytwarzana przez monocyty) CD19+IL-6 (lL-6 wytwarzana przez limfocyty B), CD4S+IL-6 - IL-6 wytwarzana przez granulocyty,
CD3+IL8 (IL-8 wytwarzana przez limfocyty T), CD14+IL-8 (IL-8 wytwarzana
przez monocyty), CD19+IL8 (IL-8 wytwarzana przez limfocyty B), CD4S+IL-8
(IL-8 wytwarzana przez granulocyty).
Oznaczanie zarówno poszczególnych populacji komórkowych, jak i komórek
wytwarzających interleukiny zostało uzupełnione o kontrolę pozytywną i negatywną, umożliwiając właściwe odczytanie i interpretację uzyskanych wyników
(zestawy kontrolne dla IL-6 i IL-8: HiCK 3, 4, zestawy przeciwciał dla antygenów
powierzchniowych: kontrola pozytywna umożliwiająca precyzyjne ustawienie
bramki w celu oddzielenia populacji limfocytów i monocytów w obrazie cytometrycznym - CD 14+CD4S+ oraz kontrola izotypowa negatywna - IgG l IgG2a).
Analizę cytometryczną przeprowadzono za pomocą dwukolorowej cytometrii
przepływowej wykorzystując aparat Vantage (Becton Dickinson, USA) stosując
program komputerowy CellQuest (Becton Dickinson, USA).
Uzyskane wyniki zostały poddane ocenie statystycznej przy pomocy Testu
Wilcoxona dla dwóch próbek zależnych. Za istotne statystycznie uznano p<O,OS.
żylna
164
K. KUROWSKA, D. MIROWSKA, A.
CZŁONKOWSKA
Wyniki
W trakcie podawania GS odnotowano poprawę stopnia niesprawności u wszystkich zbadanych osób. Przed leczeniem EDSS mieścił się w granicach 2,0-5,0
(średnio 3,45±0,92), po leczeniu obejmował zakres 1,0-4,0 (średnio 2,40±0,93)
(p<0,05).
W zakresie parametrów profilu immunologicznego obserwowano istotne statystycznie zmiany odsetka komórek o fenotypie CD 19+CDJ-, CD3+CDS-ł- oraz trend
zmian w zakresie komórek CDI4+IL-S.
Przed leczeniem odsetek limfocytów B wynosił średnio 1O,07±2,20, po 7 dniach
17,OS± 5,54 (p=0,03). Odsetek limfocytów T supresorowych przed leczeniem
osiągał wartość 27,2±4,S, po 7 dniach podawania GS 24,44±5,49 (p=0,04).
Odsetek monocytów wytwarzających IL-S, który przed terapią wynosił
71,37± 16,06 zmniejszył się do 56,64± 19,96 (p=O,OS).
W zakresie pozostałych parametrów nie obserwowano istotnych statystycznie zmian.
Omówienie
Poprawa w zakresie EDSS u wszystkich chorych na s.r. w naszym badaniu jest
istotnym potwierdzeniem dotychczas publikowanych wyników (Olivieri i wsp.,
1995, Uitdehaag i Barkhof, 1995, Brusaferri i Candelise, 2000, Sharrack i wsp.,
2000). Jak do tej pory podawanie dożylnie metyloprednisolonu jest najczęściej
stosowaną formą leczenia rzutów choroby (Hawkins, 200 l).
Rezultaty naszego badania wskazują także, że GS wywierają wpływ na parametry profilu immunologicznego oceniane we krwi obwodowej. Wzrost odsetka
limfocytów B wydaje się być korzystny ze względu na pośredni wzrost ekspresji
receptorów dla czynników różnicowania (przekształcenie w komórkę produkująca immunoglobuliny), a co za tym idzie wzrost odporności (Jakóbisiak, Gaciąg
i wsp. 1995). Jak wiadomo rzut s.r. jest zwykle związany ze spadkiem odporności
organizmu i częściej występuje w miesiącach wiosennych i jesiennych, kiedy
wzrasta narażenie na infekcje. Wzrost odsetka limfocytów B jest jednak trudny do
wytłumaczenia w aspekcie działania GS, gdyż w badaniach na modelach zwierzę­
cych GS ograniczają produkcję przeciwciał (za wyjątkiem klasy IgE) (Jakóbisiak,
Gaciąg i wsp, 1995).
Spadek w zakresie odsetka limfocytów Ts związany jest prawdopodobnie
z mechanizmem redystrybucji i zahamowania ich aktywacji pod wpływem leczenia GS, co zostało udowodnione w modelach doświadczalnych (Ellovaara, Lalla
i wsp. 1995, Lessiuk, Jung i wsp. 200 l) i jest korzystne w aspekcie złagodzenia
odpowiedzi immunologicznej towarzyszącej rzutowi. Szczególnie interesujący
wydaje się jednak spadek odsetka monocytów wytwarzających IL-8. Wiadomo,
że jest ona w znacznym stopniu odpowiedzialna za migrację komórek zapalnych
do oun i uszkodzenia struktur białkowych (Muller-Lander, Jones i wsp. 1996,
Cross, Woodroofe 1999). W badaniach patomorfologicznych mózgów pacjentów,
WPŁYW DOŻYLNIE PODAWANEGO METYLOPREDNIZOLONU
165
którzy zmarli W przebiegu s.r. stwierdzano znaczny wzrost ekspresji receptorów
dla IL-8 (Hesselenger i Horuk, 1999). W tym aspekcie zmniejszenie krążących
monocytów zdolnych do wytwarzania IL-8 w trakcie leczenia GS może mieć
szczególne znaczenie dla procesu zdrowienia.
W zakresie uzyskanych wyników wydaje się, że glikokortykosteroidy w s.r.
wywierają korzystny wpływ w zakresie parametrów reakcji immunologicznej, odgrywającej rolę w procesie tworzenia się ognisk demielillizacyjllych.
Piśmiennictwo
1. Bar-Or A., Oliviera M.L. i wsp.: Molecular pathogenesis ofmultiple sc1erosis, J. Neuroimmunol. 1999, 100,252-259.
2. Brusaferri F., Candelise L.: Steroids for multiple sclerosis and optic neuritis: a meta-analysis of
randomized controlled clinical trial, 1. Neuro!. 2000, 247, 435-442.
3. Cross Ak, Woodroofe Mn: Chemokine modulation of matrix metalloproteinase and TI production in adult rat brain microglia and a human microline in vitro, Glia 1999 Dec; 28(3): 183-189.
4. Elovaara L, Lalla M. i wsp.: Methyloprednisolone reduces adhesion molecules in blood and
cerebrospinal fluid in patients with MS, Neurology, 1998,51,1703-1707.
5. Franchimont D., Louis i wsp.: Effects of dexamethasone on hte profile 01' cytokine secretion in
human whole blood cell culture, J. Neuroimmunol. 1998,59-65.
6. Gagro A., Rabatic S. i wsp.: Detection of intraccllular cytokines by flow cytometry, Centr.
EuropJournal ofNeurology, 1999,24,125-131.
7. Gasperini C., Pozzil1i C.C. i wsp.: Effect of steroids on GD-enhancing lesions before and
during recombinant beta interferon-la treatment in relapsing remitting multiple sc1erosis,
Neurology, 1998,50,403-406.
8. Hawkins C.P., Wolinsky 1.S. i wsp.: Treatment of aeute relapses, w: Principles of treatments in
multiple sclerosis, Oxford, 2001, 14-22.
9. Hesselenger J., Horuk R.: Chemokine and che mok in e receptor expression in the cetral nervous
system, Jour. Neurovirol. Feb 1999,5(1), 13-26
10. Jakóbisiak M., Gaciąg Z. i wsp.: Immunologia, 1995, wyd. II, 159-160,258-264.
11. Leussink V., Jung S. i wsp.: High-dose metyloprednisolone therapy in Multiple Sclerosis induces apoptosis in peripherial blood leukocytes, Arch. Neurology, Vol 58, Jan 2001, 91-97.
12. Martin R., Hohlfeld R.: Current immunotherapy ofmultiple sclerosis, Clin. Immunother. 1996,
5, sup!. 1,12-21.
13. McDonald et al.: Recommended Diagnostic Criteria for MS, Ann. Neuro!. 2001; 50: 121-127.
14. Muuler-Lander U., Jones n. i wsp.: Enhaced expression of chemotactic receptors in multiple
sc1erosis lesions., Jour. Neurol Sci 1996, Dec; 144(1-2):135-141.
14.0liveri R.L., Valentino P. i wsp.: Randomized trial comparing two different high doses ofmethylprednisolone in MS. A c1inical and MRI study, Neurology, 1998,50,1833-1836.
15. Rudic R.A., Cohen J.A. i wsp.: Management ofmultiple sc1erosis, New Engl. J. Med. 1997,
337,1604-1612.
16. Sharrack B., Hughes R.A.C i wsp.: The effect of oral and intravenous methylprednisolone
treatment on subsequent relapse rate in multiple sclerosis, 1. Neurol. Sci. 2000, 173, 73-77.
17. Tselis A.C., Lisak R.P.: Multiple sclerosis. Therapeutic update, Arch. Nem·ol. 1999,56,277-280.
18. Uitdehaag B., Barkhof F.: Methyloprednisolone for acute relapses of Multiple Sclerosis, can
oral replace intravenous administration?, CNS Drugs, Oct 1998, \0(4),233-237.
19. Van Oosten B.W., Truyen L. i wsp.: Choosing drug therapy for multiple sc1erosis, Drugs, 1998,
56, 555-569.
20. Żeromski J., Dworacki G.: Ocena immunofenotypu komórek limfoidalnych przy pomocy cytometrii przepływowej - uwagi praktyczne i zastosowanie kliniczne, Centr.-Europ. 1. Immunol.
1996,21,99-106.