ćwiczenie 204

ĆWICZENIE 204
WPŁYW pH NA ROZPUSZCZALNOŚĆ BIAŁEK
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie punktu izoelektrycznego białka mleka, czyli
kazeiny, poprzez wyznaczenie pH roztworu, w którym to białko ma najmniejszą
rozpuszczalność.
Białka są to naturalne związki wielkocząsteczkowe zbudowane z reszt aminokwasowych
połączonych wiązaniami peptydowymi. Makrocząsteczki białek mając polarne wiązania
peptydowe oraz posiadając w łańcuchach bocznych grupy polarne np. –NH2, -COOH, OH, łatwo ulegają hydratacji w roztworach wodnych wykazując cechy koloidów.
Równoczesna obecność w cząsteczkach aminokwasów i białek kwasowej grupy
karboksylowej i zasadowej grupy aminowej sprawia, że są one związkami amfolitycznymi,
których charakter uzależniony jest od stężenia jonów wodorowych w roztworze.
W środowisku zasadowym następuje dysocjacja grup karboksylowych białka, co powoduje
ujemne naładowanie cząsteczek, natomiast w środowisku kwaśnym zachodzi przyłączanie
protonów do grup aminowych, w wyniku czego cząsteczki białka stają się naładowane
dodatnio.
H+
NH 3+ - CH - COOI
R
jon amfoteryczny
NH 3+ - CH - COOH
I
R
kation
OHNH 2 - CH - COOI
R
anion
Istnieje takie pH roztworu, przy którym cząsteczki aminokwasów i białek zachowują się tak
jak gdyby były obojętne (nie wędrują w polu elektrycznym). W rzeczywistości występują
one w postaci jonu amfoterycznego (jonu obojnaczego), którego ładunek sumaryczny dla
całej cząsteczki białka równy jest zeru, czyli ilość ładunków dodatnich jest równa ilości
ładunków ujemnych. Takie pH roztworu nosi nazwę punktu izoelektrycznego białka.
W tym stanie trwałość koloidu jest najmniejsza i białko ulega koagulacji. Koagulacja jest
to proces rozdzielania się faz rozproszonej i rozpraszającej układu koloidalnego.
Substancja wytrącająca się z roztworu (zolu) nosi nazwę żelu. Proces odwrotny –
2
przejście żelu w zol – jest nazywany peptyzacją. Dla hydrofilowych koloidów białkowych
przy pH mniejszym od punktu izoelektrycznego cząsteczki nabierają charakteru coraz
silniej zjonizowanego kwasu wielokationowego. W roztworach o pH większym od punktu
izoelektrycznego cząsteczka białka zachowuje się jak kwas, oddając protony H + i stając
się coraz silniej zjonizowaną zasadą wieloanionową. Przy wysokim pH wszystkie grupy
karboksylowe są zdysocjowane, a grupy aminowe są niesprotonowane, przy niskim zaś
pH sytuacja jest odwrotna, cofnięta jest dysocjacja grup kwasowych, a grupy aminowe
występują w postaci jonów NH3+. Ładunek cząsteczki białka zależy więc od pH roztworu.
Punkt izoelektryczny dla różnych białek jest inny, np. dla pepsyny wynosi 1,0; dla albuminy
z jaj – 4,6; kazeiny – 4,7; globuliny mleka – 5,2; hemoglobiny – 6,8; trypsyny – 10,5.
Punkt izoelektryczny białka można wyznaczyć doświadczalnie. Jedna z metod oparta jest
na oznaczeniu rozpuszczalności białka w buforze o różnym pH.
W celu wyznaczenia punktu izoelektrycznego kazeiny przygotowuje się szereg probówek
z buforem octanowym o określonych wartościach pH i dodaje do nich jednakową ilość
roztworu kazeiny. Wartość pH roztworu buforowego w probówce, w której wystąpił
najobfitszy
osad
(najmniej
białka
pozostało
w
roztworze)
odpowiada
punktowi
izoelektrycznemu. Dla bardziej precyzyjnego wyznaczenia tego punktu zawartość białka
rozpuszczonego
w
poszczególnych
probówkach
oznacza
się
kolorymetrycznie
wykorzystując reakcję biuretową. Jest to jedno z najczęściej wykonywanych oznaczeń
ilościowych i jakościowych białek. Biuret powstaje przy ogrzewaniu mocznika w temp.
180oC. Barwną reakcję biuretową dają wszystkie peptydy i białka zawierające co najmniej
dwa połączone ze sobą wiązania peptydowe w cząsteczce. Wolne aminokwasy nie dają
zabarwienia w reakcji biuretowej.
Literatura dodatkowa
1. A. Basiński – Zarys fizykochemii koloidów.
2. L. Kłyszejko-Stefanowicz – Ćwiczenia z biochemii.
3. J. Perkowski, W . Świątkowski, S. Tilk – Ćwiczenia laboratoryjne z chemii
fizycznej.
3
Wykonanie ćwiczenia
1. Do 10 suchych probówek odmierzyć (stosując pipety o pojemności 2 ml) podane
w tabeli ilości mianowanych roztworów kwasu octowego i octanu sodu. Roztwory
octanu sodu przechowywane są w lodówce.
Nr probówki
Kwas octowy 1 M
ml
Octan sodowy 1 M
ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2. Do każdej probówki dodać po 2 ml roztworu kazeiny rozpuszczonej w 0,1 M roztworze
octanu sodowego. Roztwór dobrze wymieszać i pozostawić na okres 5 min.
3. Przenieść roztwory do probówek wirówkowych i odwirować wytrącony osad białka.
Wirowanie prowadzić przez 5 min przy 12 tys. obrotów. Ułożenie probówek w wirówce
musi być symetryczne, a obroty należy zwiększać stopniowo poprzez obrót pokrętła
transformatora. Przed rozpoczęciem wirowania pokrętło musi być w pozycji zerowej
(maksymalnie w lewo). W czasie pracy wirówki nie wolno otwierać pokrywy.
4. Po odwirowaniu z każdej probówki pobrać znad osadu 2 ml roztworu i dodać go do
wcześniej przygotowanych probówek zawierających po 4 ml odczynnika biuretowego.
Roztwory wymieszać i pozostawić na 30 min.
5. Przygotować odnośnik do pomiarów kolorymetrycznych (ślepa próba) poprzez
zmieszanie 2 ml wody i 4 ml odczynnika biuretowego (wspólny dla wszystkich osób
wykonujących ćwiczenie).
4
6. Włączyć fotokolorymetr na 10 min przed wykonaniem pomiarów.
7. Zmierzyć absorbancję dla poszczególnych roztworów przy długości fali 530 nm
względem odnośnika przygotowanego wcześniej (pkt 5), dla którego wartość
absorbancji nastawić na zero.
8. Wyniki wszystkich pomiarów zapisać w tabeli.
Nr próby
Absorbancja
Zawartość białka
g/dm3
pH roztworu
buforowego
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
9. Z krzywej wzorcowej opisanej równaniem y = 32,2 x – 0,30, gdzie y oznacza
zawartość białka
w g/l,
a
x oznacza
wartość absorbancji odczytanej dla
poszczególnych roztworów wyliczyć stężenie białka w roztworze. Jeśli zmierzona
absorbancja roztworu była niższa od 0,01 zawartość białka przyjąć równą 0.
Opracowanie wyników
1. Obliczyć pH roztworów buforowych w poszczególnych probówkach wykorzystując
równanie Hendersona-Hasellbacha:
pH = pKa + log
[ CH3COO-]
____________________
[CH3COOH]
gdzie: pKa = - log Ka = 4,76, Ka jest stałą dysocjacji kwasu octowego (1,753 x 10-5
w temperaturze 25oC). W obliczeniach należy również uwzględnić stężenie octanu
sodu dodawanego z kazeiną.
2. Sporządzić wykres funkcji: stężenie białka [g/l] = f [ pH roztworu]
3. Z wykresu wyznaczyć punkt izoelektryczny kazeiny.